PL171788B1

PL171788B1 - wykazujacego aktywnosc wiazania receptora ludzkiego czynnika wzrostupochodzacego z plytek PL PL PL

Info

Publication number: PL171788B1
Application number: PL92303989A
Authority: PL
Inventors: David Wolf; James E Tomlinson
Original assignee: Cor Therapeutics Inc
Priority date: 1991-12-02
Filing date: 1992-12-01
Publication date: 1997-06-30
Also published as: NO942032D0; JPH07501702A; NO942032L; AU675924B2; EP0619836A1; AU3236493A; CA2124957A1; EP0619836A4; NZ246256A; WO1993011223A1; RU94046397A

Abstract

1. Sposób wytwarzania rozpuszczalnego polipeptydu wykazujacego aktywnosc wiazania receptora ludzkiego czynnika wzrostu pochodzacego z plytek, znamienny tym, ze a) hoduje sie linie komórkowa, w której zachodzi ekspresja rozpuszczalnego polipeptydu, mozliwego do otrzymania dzieki mutagenezie delecyjnej, z uzyciem antysensownego oli- gomeru mutagenezy wybranego z grupy obejmujacej p?3, p?4, p?5, p?103, p? 104 i p?105 i b) wyodrebnia sie rozpuszczalny polipeptyd od linii komórkowej, przy czym rozpuszczalny polipeptyd ma stala dysocjacji 0,2 nM lub mniejsza i ma co najmniej jedna domene Ig. PL PL PL

Description

Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania rozpuszczalnego polipeptydu wykazującego aktywność wiązania ludzkiego czynnika wzrostu pochodzącego z płytek w szczególności, wynalazek dotyczy wytwarzania linii komórkowych oraz sposobów przy użyciu tych linii komórkowych, które umożliwiają wysokowydajne wytwarzanie rozpuszczalnych fragmentów oczyszczonego receptora pochodzącego z płytek czynnika wzrostu, wykazujących funkcje wiązania ligandu.

Polipeptydowe czynniki wzrostu są mitogenami, które dzia^aj^ na komórki przez specyficzne wiązanie do receptorów umiejscowionych na błonie komórkowej. Pochodzący z płytek czynnik wzrostu (PDGF) stymuluje zróżnicowaną grupę reakcji biochemicznych np. zmiany przepływu jonów, aktywację różnych kinaz, zmianę kształtu komórki, transkrypcję różnych genów i modulowanie czynności enzymatycznych związanych z metabolizmem fosfolipidów. Zob. np. Bell i in. (1989) Circulation Research 65:1075-1065. Czynnik wzrostu pochodzący z płytek jest czynnikiem polipeptydowym, który oddziałuje z receptorem związanym z błoną, receptorem pochodzącego z płytek czynnika wzrostu (PDGF-R). Receptor ma miejsce wiązania, które wiąże ligandy PDGF.

Z anormalnych oddziaływań receptor-ligand wynikają szczególne stany patologiczne. Specyficzność wiązania pozwala na zastosowanie jednego partnera wiążącego, by określić, jakościowo lub ilościowo, obecność innego i by wykryć anormalne oddziaływania. Takie odczynniki diagnostyczne byłyby przydatne.

Ekspresji receptorów pochodzących z płytek czynnika wzrostu dokonywano w różnych komórkach. Zob. np. Orchansky i in. (1988) J. Biol. Chem. 263:15159-15165; Duaniin. (1991) J. Biol. Chem. 266:413-418; Heidaran i in. (1990) J. Biol. Chem. 265:18741-18744; ClaessonWelsh i in. (1988) Mol. and Celi. Biol. 8:3476-3486; i Escobedo i in. (1988) T_ Biol. Chem. 263:1482-1487.

171 788

Chociaż inni opisywali dokonywanie ekspresji receptorów PDGF lub ich fragmentów w komórkach, fragmenty wiążące ligand wszystkie charakteryzowały się w przybliżeniu nienaruszonymi pozakomórkowymi obszarami receptora. W wielu przypadkach byłby przydatny mniejszy i rozpuszczalny segment wiążący ligand. Np. rozpuszczalny fragment wiążący ligand może służyć jako antagonista, by modulować efekt ligandów PDGF. Będą przydatni antagoniści rozpuszczalni i mniejsi niż oryginalny receptor. Fizjologiczna biodostępność małych rozpuszczalnych antagonistów będzie lepsza niż naturalnego, nienaruszonego receptora. Nienaruszony receptor jest proteiną związaną z błonąi w typowym przypadku nie cyrkulowałby we krwi. Rozpuszczalne fragmenty antagonisty np. które są krótsze niż miejsce wiążące rodzimego receptora, będą w typowym przypadku wytwarzane w większych ilościach przy niższych kosztach. Ponadto, mniejszy rozpuszczalny peptyd będzie z większym prawdopodobieństwem zdolny do osiągnięcia w organizmie obszarów odległych i o upośledzonym krążeniu.

Zatem istnieje potrzeba istnienia wysokoefektywnego sposobu wytwarzania oczyszczonego obszaru wiążącego ligand, oraz rozpuszczalnych cząsteczek, które wykazują aktywność wiązania PDGF. Pożądane są fragmenty mniejsze niż nienaruszony pozakomórkowy obszar każdego receptora. Bardzo pożądane jest ekonomiczne i wysokowydajne wytwarzanie protein wiążących ligand PDGF, np.fragmentów zawierających obszary decydujące o wiązaniu ligandu. Niniejszy wynalazek spełnia te oraz inne potrzeby.

Niniej szy wynalazek dostarcza linie komórkowe oraz sposoby wysokowydajnego wytwarzania rozpuszczalnych peptydów, które wiążą pochodzący z płytek czynnik wzrostu (PDGF). Opisano linie komórkowe wydzielające fragmenty pozakomórkowego obszaru receptora PDGF (PDGF-R) lub pokrewne peptydy, które wykazują aktywność wiązania ligandu PDGF. Wiele z tych fragmentów pochodzi z delecji segmentów pozakomórkowego obszaru, które nie przyczyniają się do powinowactwa lub specyficzności wiązania ligandu. Dostarczone są również sposoby stosowania tych linii komórkowych do wytwarzania polipeptydów wiążących się z PDGF, np. z ludzkich receptorów.

Figura 1 podaje strategię mutagenezy delecyjnej in vitro rozpuszczalnych pozakomórkowych obszarów hPDGF-R, ukierunkowaną na oligonukleotydy. Wiele spośród tych konstruktów będzie rozpuszczalnymi peptydami lub mogą one być do takich zmodyfikowane.

Stosowane skróty:

PR - IDGF⁷R; ·. nienaruzzony

P = PDGF-R; obszar pozakomórkowy

TM = transmembrana

K = kinaza

S = sekwencja sygnałowa

Figura 2 przedstawia strukturę plazmidu pochodzącego z pcDL-Sa296 stosowanego do ekspresji różnych polipeptydów delecyjnych.

Figura 3 przedstawia strukturę plazmidu pBJA pochodzącego z pcDLa296. Zob. Takabe i in. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472, którą to publikację załączono do treści niniejszego zgłoszenia jako odsyłacz.

1. pcDL-SRo.296 przecięto Xhol.

2. Polilinker (Xhol - Xbal - Sfil - Notl - EcoRI - EcoRV - HmdIII - Ciał - Sali) jest wstawiony do wektora przecięcia Xhol.

3. Sall jest zgodny z miejscem Xhol; i tworzy zarówno miejsce Sall jak i Xhol.

4. Nie występuje już węzeł cięcia i składania SV40 16s.

Opis korzystnych wykonań.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, dostarczone są nowe komórki dla wytwarzania rozpuszczalnych polipeptydów, które wiążą ligandy pochodzącego z płytek czynnika wzrostu (PDGF), oraz kompozycje zawierające takie fragmenty. Komórki te zawierają sekwencje kwasu nukleinowego kodujące żądane fragmenty polipeptydowe. Komórki dokonują ekspresji kwasów nukleinowych, wytwarzając tym samym znaczne ilości tych fragmentów. W korzystnych wykonaniach, fragmenty są zwykle wydzielane do pożywki i dostępne dla oczyszczenia.

171 788

Kompozycje te są zdolne w szczególności do wiązania się do ligandów pochodzącego z płytek czynnika wzrostu (PDGF), cechując się powinowactwem oraz specyficznością..

Fragmenty polipeptydowe znajdą zastosowanie jako kompozycje diagnostyczne oraz terapeutyczne. Np. będą one przydatne jako antagoniści ligandów PDGF, lub jako reagenty dla jakościowej lub ilościowej próby ligandu PDGF. Komórki można także zastosować w sposobach wytwarzania dużych ilości wiążących polipeptydów, np. jako źródła wyjściowego materiału dla procesów oczyszczania.

Analogi proteiny PDGF są nazywane Ugandami PDGF. Ligandy te w typowym przypadku są agonistami PDGF-R. Ligandy PDGF będą zwykle typu protein, lecz mogą być innymi związkami, wykazującymi cechy strukturalne ważne w oddziaływaniu z receptorami.

I. Linie komórkowe

Komórki według niniejszego wynalazku są w typowym przypadku zdolne do trwałego wytwarzania drogą hodowli polipeptydu wiążącego ligand PDGF. Komórki te zwykle będą eukariotyczne, np. ze ssaka, który dostarcza komórek, którymi się łatwo manipuluje. Korzystnymi wykonaniami są komórki gryzoni np. myszy, chomika lub szczura. Korzystne będąkomórki, które będą przetwarzać lub modyfikować rozpuszczalne proteiny sposobami analogicznymi jak w przypadku ludzkich protein. Szczególnie ważne sąglikozylacja i inne modyfikacje protein.

W niektórych wykonaniach, komórki oraz konstrukty DNA są wyprowadzone z linii komórek ludzkich. Szczególnie korzystne linie komórkowe obejmują pAl-5, która zawiera wektor ekspresji dla wytwarzania fragmentu polipeptydowego PDGF-R typu B, oraz linię pAaRF, która zawiera wektor ekspresji dla wytwarzania fragmentu polipeptydowego PDGF-R typu A. Każda z tych linii komórkowych skutecznie dokonuje ekspresji odpowiednich fragmentów polipeptydu.

W niniejszym zgłoszeniu sądostarczone nowe linie komórkowe dla dokonywania ekspresji fragmentów pozakomórkowego obszaru receptora pochodzącego z płytek czynnika wzrostu. Fragmenty te wykazują nieoczekiwane właściwości, po części, ponieważ odkryto, że delecje różnych części pozakomórkowego obszaru PDGF-R nie wpływają na wiązanie ligandu. Zidentyfikowano poszczególne segmenty pozakomórkowego obszaru receptora, które nie przyczyniają się znacząco do powinowactwa lub specyficzności wiązania ligandu. Delecja tych ubocznych segmentów pozakomórkowego obszaru PDGF-R zwiększa rozpuszczalność skróconego polipeptydu i zmniejsza jego immunogenność. Ponadto, bardziej wydajne wytwarzanie oraz niższe koszty dają znaczne korzyści handlowe.

Produkty komórkowe będąw typowym przypadku rozpuszczalnymi fragmentami polipeptydów receptora ludzkiego PDGF. Będą wytwarzane fragmenty receptorów typu A lub typu B. Wskutek ich pochodzenia z organizmu człowieka, fragmenty wprowadzone do osobników ludzkich powinny wykazywać niską immunogenność oraz funkcję jako bardziej skuteczne odczynniki terapeutyczne. Ich homologia z naturalnymi proteinami ludzkimi powinna zmniejszyć prawdopodobieństwo niekorzystnych reakcji oraz efektów ubocznych wynikających z podawania leczniczego.

Obszary wiązania ligandu (LBRs) są określone, w części, przez ich wpływ na powinowactwo lub specyficzność wiązania do ligandów PDGF. Naturalny, rodzimy PDGF-R o pełnej długości wiąże się ze swoim naturalnym ligandem przy Kd około 0,2 nM. Zob. np. Duan i in. (1991) J. Biol. Chem. 266:413-418, którą to pracę załączono do treści niniejszego zgłoszenia jako odsyłacz. Obszar wiązania ligandu jest segmentem polipeptydowym, którego obecność znacząco wpływa na wiązanie ligandu, np. absolutne powinowactwo i specyficzność. Wpływ na powinowactwo będzie zwykle wyrażać się czynnikiem co najmniej około dwa, w typowym przypadku co najmniej około 4, w bardziej typowym przypadku co najmniej około 8, akorzystnie co najmniej około 12 lub więcej. Miary specyficzności są trudniejsze do ujęcia ilościowego, lecz będą w typowym przypadku ocenione przez porównanie względnego powinowactwa do ligandów wykazujących podobne cechy strukturalne.

Przygotowanie komórek ssaków według niniejszego wynalazku można wykonać standardowymi sposobami transformowania wielu różnych typów komórek ssaków odpowiednimi

171 788 wektorami ekspresyjnymi. Zob. np. Ausubel i in. (1987 oraz suplementy) Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing/Wiley Interscience, New York, który dołączono do treści niniejszego zgłoszenia jako odsyłacz. Właściwy wybór kombinacji właściwości komórkowych oraz właściwości wektora ekspresyjnego może doprowadzić do ulepszonych metod wytwarzania żądanego fragmentu receptora pochodzącego z płytek czynnika wzrostu.

Dostępne są różne metody dokonywania wysokiego poziomu ekspresji określonych protein. Można zastosować metody amplifikacji podobne do metod przy użyciu reduktazy dehydrofolanowej. Zob. np. Kaufman i in. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:1750-1759. Można również zastosować inne dobrze znane techniki ekspresji wysokiego poziomu.

Komórki te są szczególnie wybrane dla wysokiego poziomu ekspresji żądanych fragmentów receptora. Dane są linie komórkowe będące wynikiem transformacji przy użyciu wektorów kodujących żądane peptydy. Różne wyizolowane transformanty będą miały różne ilości egzemplarzy oraz miejsca integracji dając w rezultacie inne poziomy ekspresji. Korzystne szczepy komórkowe będą mieć zintegrowany DNA w pozycjach oraz ilościach dających szczególnie wysoką ekspresję fragmentu receptora.

Co się tyczy konstruktów, p Δ l do ΡΔ9 odnoszą się do konstruktów DNA receptora typu B wstawionych do miejsc klonowania w wektorach ekspresyjnych. Konstrukt ΡΔ l wstawiony do wektora pBJ jest oznaczany przez pBJPΔ. Wektor jest przenoszony do tła konkretnej komórki i różne transformanty klonalne są izolowane oraz oznaczane np. p Δ l-1, pΔ l-2 itd. Każdy wyizolowany klon różni się od innych numerem kopii sekwencji oraz miejscami integracji, co daje zmienność w poziomach ekspresji. pΔ l-5 jest szczególnie przydatnym wykonaniem linii komórkowej dokonującym ekspresji wysokich poziomów obszarów wiązania ligandu typu B.

Linia komórkowa p/\«.RF dokonuje ekspresji całego pozakomórkowego obszaru receptora ludzkiego PDGF typu A. Kodującą sekwencję DNA wprowadzono do pBJ-1. Komórki CHO przekształcono otrzymanym konstruktem DNA oraz wybrano zarówno do ekspresji neoplazmidu jak i do wytwarzania fragmentu receptora typu A.

II. Sposoby.

Niniejszy wynalazek dostarcza również sposobów wytwarzania opisanych fragmentów. W szczególności, dostępne są hodowle komórkowe dla ekspresji opisanych kwasów nukleinowych. Zwykle fragmenty te są wydzielane, tym samym znacznie upraszczając oczyszczanie fragmentów receptora. Komórki nie muszą być zniszczone, a zanieczyszczenie komórek jest doprowadzone do minimum. Zatem komórki te będzie można oddzielić od wydzielonych produktów za pomocą technik fizycznych z równoczesnym umożliwieniem odzyskania nienaruszonych komórek. Zob. np. Ausubel i in. (1987 i suplementy) Current Protocols in Molecular Biology. Greene/Wiley-Interscience, New York, zwłaszcza dział 10:Vii.

Zwykle będą wydzielane rozpuszczalne proteiny i będą podatne na odzyskanie z pożywki. Dla oddzielenia w pożywkach rozpuszczalnych protein od komórek będądostępne różne techniki np. sączenie lub odwirowywanie. Hodowle komórkowe dołączone do stałych substratów będą zwykle łatwo oddzielalne od pożywki przez sączenie lub odwirowywanie, podczas gdy kultury zawiesinowe “kruchych” komórek będą zwykle poddawane odwirowywaniu.

Będzie się stosować standardowe metody oczyszczania protein np. chromatografię, odwirowywanie, wytrącanie, elektroforezę metody immunopowinowactwa oraz inne techniki dobrze znane specjalistom w zakresie chemii protein i enzymologii. Zob. np. Deutscher i in. (1990) Protein Purification, w Methods in Enzymology:, oraz Ausubel i in. (1987 i suplementy) Current Protocols in Molecular Biology.

Szczególnie przydatne odczynniki do oczyszczania obejmują odczynniki powinowactwa np. bądź kolumny powinowactwa PDGF-ligand lub kolumny immunopowinowactwa. Kolumna powinowactwa PDGF-ligand będzie łatwo przygotowana przy użyciu sklonowanej sekwencji PDGF-ligand lub analogu dla wyizolowania produktu proteiny, oraz przyłączenia do stałego substratu. Kolumna immunopowinowactwa będzie łatwo przygotowana przez dołączenie immunoglobulin przygotowanych względem peptydów PDGF-R, albo wytworzonych przez komórki według niniejszego wynalazku, lub innymi sposobami.

171 788

Przeciwciała monoklonalne specyficzne względem receptora PDGF o powinowactwach wiązania 10⁶ M'¹, korzystnie 10⁷do 10¹ °, lub silniejszych, będąw typowym przypadku wykonane za pomocą standardowych procedurjak opisano np. w: Harlow i Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Laboratory (1988); lub Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed.) Academic Press, New York (1986), które dołączono jako odsyłacz do treści niniejszego zgłoszenia. W skrócie przedstawia się to tak, że odpowiednie zwierzęta będą immunizowane; po odpowiednim okresie czasu, śledziony takich zwierząt są wycinane i poszczególne komórki śledziony poddawane fuzji, w typowym przypadku do immortalizowanych komórek szpiczaka. Produkty fuzji są poddawane odpowiednim warunkom selekcji i klonalnie rozdzielane. Roztwory każdego klonu są badane na specyficzność przeciwciała względem wiązania żądanego obszaru antygenu.

Inne odpowiednie techniki obejmują ekspozycję in vitro limfocytów na polipeptydy antygeniczne lub alternatywnie na wybór bibliotek przeciwciał w fagu lub podobnych wektorach. Zob. Huse i in. (1989) “Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobin Repertoire in Phage Lambda”. Science 246:1275-1281; oraz Ward i in. (1989) “Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherischia coli” Nature 341:544-546; każdą z tych pozycji załączono do treści niniejszego zgłoszenia jako odsyłacz. Polipeptydy i przeciwciała według niniejszego wynalazku można stosować po modyfikacji lub bez modyfikacji.

Odpowiedni odczynnik powinowactwa np. PDGF lub przeciwciało będzie zwykle dołączony do substratu stałego. Typowe substraty obejmują, matryce chromatograficzne np. CNBr-sefarozę, kulki szklane oraz tworzywa sztuczne. Zwykle połączenie będzie kowalencyjne, chociaż w pewnych warunkach mogą być wystarczające metody przyłączania niekowalencyjnego.

Skoro jest przygotowany odpowiedni odczynnik powinowactwa lub kombinacja odczynników powinowactwa, roztwory zawierające rozpuszczalne fragmenty będą przepuszczone przez odczynnik powinowactwa na specyficzność wiązania i wymywania. Etapy te można przeplatać z innymi etapami oczyszczania lub zatężania. Szczególnie przydatny sposób oczyszczania fragmentu obejmuje substrat immunopowinowactwa z przeciwciałami monoklonalnymi. Fragmenty receptora są dołączone do unieruchomionych przeciwciał w kolumnie i wymywane przy wysokim pH. Mogą być również włączone dodatkowe etapy specyficznego usuwania zidentyfikowanych składników zanieczyszczających np. przez techniki usuwania przez powinowactwo.

Wyizolowane fragmenty rozpuszczalnych peptydów można zastosować do różnych celów np. jako odczynniki diagnostyczne lub jako odczynniki terapeutyczne. Komórki będąprzydatne do przeniesienia do zwierzęcia, np. do myszy, lub do utworzenia hodowli w odpowiednim naczyniu do implantacji, które umożliwi rozprzestrzenienie się produktu do ciała organizmu gospodarza. Opisano odpowiednie przyrządy do tworzenia hodowli komórkowych, które można implantować u osobnika by wydzielać terapeutyczne produkty komórkowe, np: w opisach patentowych USA 4806 355,4 402 694 oraz 3 °93 831.

Część eksperymentalna

W ogólności, standardowe techniki technologii rekombinacyjnego DNA opisano w różnych publikacjach np. Sambrook i in., (1988) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory; Ausubel i in. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, t. 1 i 2 oraz suplementy; oraz Wu i Grossman (red.) (1987) Methods in Enzymology, Vol. 53 (Recombinant DNA Part D); wszystkie wymienione pozycje dołączono do treści niniejszego zgłoszenia jako odsyłacze.

I. Ludzki oł^i^s^^zir poizikomórkowy

Równoważne techniki konstrukcji, ekspresji oraz określenia fizjologicznego wpływu, charakteryzujących się odcięciem lub delecją, analogów rozpuszczalnych pozakomórkowych fragmentów receptora z ludzkiego receptora można zrealizować przy użyciu kwasu nukleinowego, polipeptydu i innych odczynników dostarczonych w niniejszym zgłoszeniu.

A. Segmenty typu B

171 788

Konstrukty polipeptydów receptora typu B wykonano jak następuje:

Fragment cDnA (EcoRI-HindIII o 3,9 kb) z ludzkiego hPDGF-R typu B subklonowano w miejscu EcoRI-HindIII M13 Mp 18 dla wytworzenia wektora Mp 18PR. Odnośnie technik zob. Maniatis i in. (1982) Molecular Cloning: Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., który załączono jako odsyłacz do treści niniejszego zgłoszenia. Weryfikację subklonowania wykonano przez analizę poprzez trawienie enzymem restrykcyjnym oraz sekwencjonowanie zakończenia łańcucha dideoksy, jak opisali Sanger i in. (1977) Proc. Nat’l Aca. Sci. USA 74:5463. Mutagenezę in vitro ukierunkowanąna oligonukleotydy wykonano według sposobu opisanego przez Kunkela i in. (1987) Methiods in Enzymol., 154:367. Strategia delecyjnej mutagenezy Mp j 8PR n vtr.ro ukierunkowanej na. ołg^oiu^łib^cty^d^y jest wyłożona na fig. 1.

W skrócie, zaprojektowano szereg rligrnukleotydów by utworzyć zagnieżdżony zbiór rozpuszczalnych pozakomórkowych obszarów receptora hPDGF typu B przez mutagenezę delecyjną. Poddano delecji nienaruszone domeny. Domeny te oznaczono jako Domena 1 do Domena 5 (D1-D5), odpowiednie dla ekspresji w odpowiednim eukariotycznym układzie ekspresyjnym. Przykładowe oligonukleotydy mutageniczne podano w tablicy 1. Te oligonukleotydy są komplementarne do obszarów receptora ludzkiego PDGF rozpinających różne określone domeny IdG-podobne. Zob. np. Williams (1989) Science 243:1564-1570, załączone do treści niniejszego zgłoszenia jako odsyłacz.

Tablica 1

OLIGOMERY MUTAGENEZY LUDZKIEGO PW^^-R TYPU B

[N.8. są one komplementarne ; dane 3' -5’ ]

ΡΔ1

3'-AT— TGA GGA ACG GGA AAT TCA TCG AAG GAC ATC CCC CGAa5’ (sekwencja nr 1 )

ΡΔ2

3'-GGA AGC TGG ATG TCT AGT TCC TCG AAG GAC ATC CCC CGA C-5 ’ (lek^^r^cja nr: 2)

ΡΔ3

3*-TAG TGG CCC CAA CTC TCG CCG ATC GAA GGA CAT CCC CCG AC-5' (sekwencja nr: 3)

ΡΔ4

3'-ATG TCT GAG GTC CAC AGT CA— ATC GAA GGA CAT CCC CCG CC-5’ (sekwencja nr: 4)

ΡΔ5 ¹ -GAG ATG TAG AAA CAC GGG CTA GGG ATC GAA GGA CAT CCC CCG AC-5' (sekwencja nr: 5)

ΡΔ6

3'-GTC TAG AG— GTC CCG GAC CAG TGG CAC CCG AAG GAG GGA TTA -TA-5’ (sekwencja nr: 6)

ΡΔ7 3'-—TC TAG AG— -TC CCC- GAC CCC TAG TTG CCC ACA CAC TTG CC— CCC —TC-5' (sekwencja nr: 7)

PCS

3'-—TC TAG AA— GTC CC— GAC CAG ATG CAC GCC GAG GAC CCT CCC —AC-5’ (sekwencja nr: 8)

ΡΔ9

3’-ATC TAA AGA ATC AAG —AC CC- CAG GCT CCC GAC CTC GAT TCA-5’ (sekwencja nr: 9)

Otrzymane konstrukty są oznaczone jak wskazano w tablicy 2. Antysensowną nić zastosowano w pełnym zakresie do mutagenezy. Mutageneza PA 1, pA2, PA3, PA4 oraz PA5 wykorzystywała Mp 18PRjako szablon a mutageneza PA6, PA7, PA8 oraz PA9 wykorzystywała Mp 18 PA 1 jako szablon. PA 1, oligomer 41 bp, wprowadził kodon kończący TAG po lizynie 499 (K499)

171 788 z D5 i usunął transmembranę (TM) jak również całą wewnątrzkomórkową, domenę kinazy (K), wytwarzającąMp 18 PAl (zob. fig. 1).

Tat^lica 2

Konstrukty ekspresji ludzkiego PDGF-R typu B

Rozpuszcza 1 nu

Zw i azanu z. b łona pBJPR pBJPΔ1 pBJPΔ2

PBJPΔ3 pBJPΔ4 pBJPΔ5 pBJPΔ6

PBJPA7 pBJPAS pBJPΔ9

Konstrukty receptora ludzkiego PDGF były następnie subklonowane w miejscu EcoRIHind III pBJ1 (pochodzenia pCDL-SRa296), jak opisano w pracy Tanabe i in. (1988) Molec. Celi Biol. 8:466, i współtransfekowane pSV2NEO, jak opisano w pracy Southern i Berga (1982) J. Mol. Appl. Gen, 1:327, do komórek jajowych chomika chińskiego (CHO). Zob. fig. 2 oraz 3.

Funkcję oczyszczonych lub półoczyszczonych konstruktów pokazano jak następuje:

Próbkę 0,33 nM ligandu PDGF BB wstępnie inkubowano przez 1 godzinę w 4°C przy następujących warunkach:

1. przeciwciało monoklonalne do ludzkiego PDGF (to przeciwciało rozpoznaje ludzkie PDGF AA, PDGF BB oraz PDGF AB);

2. 18 nM (60-krotny nadmiar molowy w stosunku do PDGF BB) receptora ludzkiego PDGF typu B;

3. roztwór soli, w którym są receptor i przeciwciało, buforowany fosforanem; lub

4. sam ligand bez żadnych dodatków.

W powtórzonym zestawie eksperymentów, 0,33 nM PDGF AA inkubowano przy trzech spośród powyższych warunków preinkubacji, np. 2, 3 i 4 powyżej. Receptor ludzkiego PDGF typu B nie rozpoznaje w dostrzegalnym stopniu PDGF AA, lecz ligand ten będzie wciąż aktywował związany z komórką ludzki receptor PDGF typu A z komórek NIH3T3 i jest tym samym kontrolą specyficzności receptora ludzkiego PDGF typu B oraz zależnej od PDGF BB aktywacji względem niespecyficznego ogólnego efektu komórkowego, np., cytotoksyczności.

Wstępnie inkubowane materiały zajęły końcową, objętość 0,5 ml. Umieszczono je w jednym zagłębieniu każdej z płytek do hodowli tkankowej z sześcioma zagłębieniami zawierającymi zlewającą się warstwę “wygłodzonych” (nieaktywnych) komórek NIH3T3 surowicy, które schłodzono do 4°C. Komórki i mieszaniny inkubacyjne mieszano, np. kołysząc, w 4°C przez 2 godz. Następnie przemyto je dwukrotnie roztworem soli buforowanym fosforanem w temperaturze 4°C. Dodano czterdzieści pl 125 mM Tris(hydroksymetylo)aminometanu (Tris), pH 6,8, 20% gliceryny (objętościowo), 2% siarczanu dodecylosodowego (SDS) (wagowo-objętościowo), 2% 2-merkaptoetanolu (objętościowo) oraz 0,001% błękitu bromofenolowego (znanego jako bufor próbny SDS) na zagłębienie do mikromiareczkowania, a następnie dodano

171 788 do komórek 40 pl 100 mM Tris, pH 8,0, 30 mM pirofosforanu sodowego, 50 mM fluorku sodowego, 5 mM kwasu etylenodwuaminotetraoctowego (EDTA), 5 mM kwasu etylenobis(oksyetylenonitrylio)tetraoctowego, 1% SDS (wagowo-objętościowo), 100 mM ditiotreitolu, 2 mM fenylometylosulfonylofluorku (PMSF) oraz 200 pM wanadanu sodowego. Komórki solubilizowano i do solubilizatu dodano jeszcze 40 pl próbnego bufora SDS. Otrzymaną mieszaninę utrzymywano w stanie wrzenia przez 5 minut i załadowano do pojedynczego zagłębienia z próbką żelu (zel poliakryloamidowy z 7,5% siarczanem dodecylowo-sodowym). Proteiny komórkowe rozdzielono przez elektroforezę.

Rozdzielone proteiny przeniesiono do nitrocelulozy przez elektrotransfer, a otrzymany “Western blot” inkubowano przy trzech zmianach 0,5% chlorku sodowego (wagowo-objętościowo), 5 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej, 50 mM Tris, pH 7,5, (mianowany bufor blokujący) przez 20 minut każde w temperaturze pokojowej. Rozcieńczone w stosunku 1/1000 PY20 (dostępne w handlu przeciwciało monoklonalne do fosfotyrozyny [ICN]) w buforze blokującym inkubowano z plamą przez noc w 4°C. Plamę przemywano 3 razy każdorazowo przez 20 minut w buforze blokującym w temperaturze pokojowej. Plamę inkubowano 4 pCi/40 ml ¹²⁵I-proteiny A [Amersham] w buforze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i przemyto 3 razy każdorazowo przez 20 minut w temperaturze pokojowej w buforze blokującym. Plamę eksponowano na film rentgenowski przez 48 godzin zjednym ekranem wzmacniającym przy -70°C i wywołano przy użyciu standardowych odczynników.

B. Sekwencja typu A

Podobne manipulacje można wykonać przy użyciu bądź oligonukleotydów mutagenicznych lub primerów PCR opartych na sekwencjach przedstawionych w tablicy 3. Odpowiednie oligonukleotydy są użyte do skonstruowania konstruktów typu A, jak wymieniono w tablicy 4, które mogąbyć testowane co do ich funkcj i za pomocąróżnych formató wjak opisano w próbach typu B wyszczególnionych powyżej.

Tablica 3

PROPONOWANE OLIGOMERY MUTAGENEZY LUDZKIEGO PDGF-R TYPU A

[N. B są one komplementarne ; dane 3*-5’ ]

ΡΔ101

3’-CGA GGG TGG GAC GCA AGA CTT ATT GAC CGC CTA AGC TCC CC-5’ (sekwencja nr: 10)

PA102

3'-CTT GAC AAT TGA GTT CAA GGA ATT GAC CGC CTA AGC TCC CC-5* (sekwencja nr: 11)

ΡΔ103 *-TAA AGA CAG GTA CTC TTT CCA ATT GAC CGC CTA AGC TCC CC-5’ (sekwencja nr· 12)

ΡΔ1 04

3*-ATA CGA AAT TTT CGT TGT AGT ATT GAC CGC CTA AGC TCC CC-5¹(sekwer^^^ja nr: 13)

ΡΔ105 3'-TAA	ATG TAG	ATA CAC	GGT	CCG	GGT	ATT	GA C	GC C	TAA	AGC	TCC
CC-5 '	(sekwencja	nr· 14)
ΡΔ106 3’-TCG	GAT TAG	GAG ACG	GTC	GAA	CTA	CAT	CGG	AAA	CAT	GGA	GAT
CCT-5’	(sekwencja	nr: 15)
ΡΔ107
3 ' -TCG	GAT TAG GAG ACG i	GTC	GAA	CTC	GAC	CTA	GAT	CTT	TAC	CTT

CGA GAA-5’ (sekwencja nr: 16)

ΡΔ108 3 »-TCG	GAT TAG GAG	GCG	GTC	gga aag	TAA	CTT	TAG TTT	GGG	TGG
AAG-5^ł	(sekwencja nr	H)
P Δ109 3 *-TCG	GAT TAG GAG ACG	GTC	GAG	AGT AGG	TAA	GAC	CTG AGC	CAG	- 5‘

(sekwencja nr: 18 )

171 788

Tablica 4

Proponowane konstrukty ekspresji ludzkiego PDGF-R typu A

Rozpuszcza lnu

Zw i ązanu z. b 1 onn oARSR pARSA1 pARSA2 pARSA3

PARSA4

PARSA5

PARSA6 pARSA7 pARSAS

PARSA9

C. Próba płytkowa PDGF

Polistyrenowe płytki do mikromiareczkowania (Immulon, Dynatech Laboratories) pokryto fragmentem pozakomórkowego obszaru ludzkiego receptora PDGF typu B (opisanego powyżej) przez inkubowanie w przybliżeniu 10-100 ng tej oczyszczonej proteiny na zagłębienie w 100 pl 25 mM Tris, 75 mM NaCl, pH 7,75 przez 12 go 18 godz. w 4°C.

Proteinę poddano ekspresji w transfekowanych komórkach CHO i zebrano w pożywce nie zawierającej surowicy (Gibco MEMa) przy stężeniu 0,2 - 1 pg/ml, przy całkowitym stężeniu protein od 150-300 pg/ml. Fragment obszaru pozakomórkowego ludzkiego receptora PDGF typu B zatężono i częściowo oczyszczono przez przepuszczenie pożywki przez układ aglutynina zarodka pszenicy-sefaroza w 4°C (przy 48 ml/godz) w obecności 1 mM PMSF. Po obfitym przemywaniu, proteinę wymyto w 0,3 M N-acetyloglukozaminy, 25 mM Hepes, 100 mM NaCl, 1 mM PMSF, pH 7,4. Tę część następnie zastosowano do Sephacryl-u S-200 HR (Pharmacia) zrównoważonego w 0,15 M wodorowęglanu amonowego, pH 7,9. Frakcje zawierające receptor (310 ng/pl) wykryto przez SDS-PAGE i “Western blotting” z poliklonalnym przeciwciałem królika, wykonanym standardowymi sposobami, wobec segmentu Domeny 1 (D1) z zewnętrznego obszaru receptora. Te frakcje (3-10 ng/pl) zastosowano do pokrycia zagłębień do mikromiareczkowania, jak opisano powyżej. Następnie z zagłębień usunięto zawartość, raz przemyto 200 pl każdego z wymienionych: 0,5% żelatyny (Bio-Rad, klasa EIA), 25 mM Hepes, 100 mM NaCl, pH 7,4, i inkubowano przez 1-2 godz. w 24°C ze 150 pl tego samego roztworu. Z zagłębień usunięto zawartość i przemyto dwukrotnie 0,3 % żelatyny, 25 mM Hepes, 100 mM NaCl, przy pH 7,4 (każdorazowo 150 pl). W każdym zagłębieniu umieszczono 90 pl roztworu 0,3% żelatyny (w zagłębieniach stosowanych do badania wiązania niespecyficznego umieszczono 80 pl, a następnie 10 pl 0,01 mg/ml nieznaczonego PDGF w 0,3% roztworze żelatyny). PDGF BB (Amgen) jodynowano w 4°C aż do 52000 CPM/ng za pomocą di jodo-odczynnika Boltona-Huntera (Amersham) i dodano w przybliżeniu 40000 CPM na zagłębienie w 10 pl, zawierających 0,024% BSA, 0,4% żelatyny, 20 mM Hepes, 80 mM NaCl, 70 mM kwasu octowego, pH 7,4. Płytkę inkubowano przez 2-3 godz. w 24°C, po czym zagłębienia przemyto trzykrotnie każdorazowo 150 pl z 0,3% żelatyny, 25 mM Hepes, 100 mM NaCl (pH 7,4). Pozostającą radioaktywność związaną solubilizowano z zagłębienia w 200 pl 1% SDS, 0,5% BSA i zliczono w liczniku gamma. Niespecyficzne wiązanie oznaczono w obecności 150-krotnego nadmiaru nieznaczonego PDGF BB (Amgen); wyniosło ono około 7% całkowitego związanego ¹²⁵I-PDGF.

171 788

Podobne próby będąmożliwe przy użyciu fragmentów receptora typu A. Jednak fragmenty receptora typu A są bardziej czułe na obecność innych protein niż fragmenty typu B, i wydaje się, że wymagają różnego od żelatyny odczynnika pokrywającego zagłębienie. Hemoglobinę podstawia się w miejsce żelatyny przy jednej części na 1000.

Niniejsze próby wymagają mniej niż 500 ng/zagłębienie rozpuszczalnej formy receptora, którą poddano ekspresji w transfekowanych komórkach CHO, i częściowo oczyszczono przez chromatografię na zasadzie swoistej sorpcji oraz chromatografii żelowej. Przy użyciu jodowanego PDGF-BB, specyficzne wiązanie mniej niż 10 pg ligandu można wykryć przy objętości próby 100 pg/zagłębienie. Przy 4°C, wiązanie ¹²⁵I-PDGF BB do unieruchomionego receptora jest nasycalne i ma wysokie powinowactwo. Kd otrzymane za pomocą analizy Scatcharda wyniosło około 1 nM przy 1,4 x 10¹⁰ miejsc na zagłębienie. Wiązanie niespecyficzne, oznaczone w obecności 100-krotnego nadmiaru zimnego PDGF BB, odpowiadało jedynie 5-10% całkowitego wiązania. Wiązanie było także specyficzne ze względu na izofermę ligandu, aż do takiego stopnia, gdy nadmiarowy zimny PDGF AA nie inhibitował wiązania ⁿ⁵I-PDGF BB. Ponadto, zewnętrzny obszar receptora PDGF typu B w roztworze współzawodniczy z jego unieruchomioną formą względem wiązaniajodowanego PDGF BB (IC₅₀=5 nM). ¹²⁵I-PDGF BB związane po 4 godz. w 4°C jedynie powoli dysocjuje w buforze wiążącym (t^j > 6 godz.), lecz jest całkowicie wypierane przez dodanie 150-krotnego nadmiaru nieznaczonego PDGF BB (t^ < 1 godz.).

D. Oczyszczanie fragmentów hPDGF-R

Fragment ludzkiego PDGF-R typu B przygotowano z komórek ujawnionych w niniejszej pracy. Wydzielone fragmenty oczyszczono za pomocą chromatografii na zasadzie swoistej sorpcji aglutyniny zarodków pszenicy oraz chromatografii sortowania według wymiarów S200. Czystość określono przez SDS-PAGE i oceniono na około 70%.

F ragment ludzkiego PDGF-R typu A przygotowano z komórek uj awnionych w niniejszym zgłoszeniu. Wydzielone fragmenty oczyszczono przez chromatografię jonowymienną chromatografię na zasadzie swoistej sorpcji aglutyniny zarodków pszenicy oraz chromatografię sortowania według wymiarów S200. Czystość określono przez DSD-PAGE i oceniono na około 70%.

E. Utworzenie przeciwciał

Przeciwciała przygotowano przy użyciu standardowych technik. Zob. np. Harlow i Lane (1990) Antibodies: A Laboratory Manuał. Cold Spring Harbor Press, New York; oraz Goding (1986) Monoclonal Antibodies. Principles and Practice: obydwie te pozycje załączono do treści niniejszego zgłoszenia jako odsyłacze. Będą utworzone przeciwciała poliklonalne lub monoklonalne.

Dwie myszy Balb/C immunizowano dla przygotowania przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla każdego typu fragmentów receptora: A oraz B. Każdej myszy wstrzyknięto wewnątrzotrzewnowo około 100 pg odpowiedniego oczyszczonego fragmentu receptora. Każdej myszy podano około 100 pg proteiny. Mysz uśmiercono, a śledzionę wydobyto. Śledzionę rozerwano, a komórki poddano fuzji z linią szpiczaka P3X przy użyciu glikolu polietylenowego (PEG). Produkty fuzji komórkowej rozprowadzono do płytek do mikromiareczkowania przy granicznych rozcieńczeniach, by klonalnie wyizolować przeciwciało wytwarzające hybrydomy. Klony wytwarzające przeciwciało zidentyfikowano za pomocąpróby z immunosorbentem powiązanym z enzymem (ELISA).

Wybrane klony wytwarzające przeciwciało wyhodowano w wystarczającej ilości i wprowadzono do otrzewnej myszy dla wytworzenia płynu puchlinowego. W typowym przypadku wstrzykiwano do myszy około 1-1,5 x 10⁶ komórek w 1 ml. Przeciwciała z płynu puchlinowego oczyszczono standardowymi metodami.

Otrzymane przeciwciała zbadano pod kątem ich specyficzności wiązania oraz powinowactwa wiązania. Klon IC705 jest korzystnym przeciwciałem monoklonalnym o specyficzności wiązania fragmentu receptora typu B; a klon 1H-2H8 jest korzystnym przeciwciałem monoklonalnym o specyficzności wiązania fragmentu receptora typu A.

F. Przygotowanie fragmentów przy użyciu komórek i przeciwciał.

171 788

Odpowiednie fragmenty receptora będą łatwo wytworzone przy użyciu komórek ujawnionych w niniejszym zgłoszeniu. Jako przykład, komórki PA 1-5 wyhodowano w bioreaktorach typu “hollow fiber” w 5-Iitrzwej hodowli. Pożywki w postaci roztworu usunięto przez odwirowywanie, a pozostałe komórki usunięto przez sączenie. Pożywki następnie poddano ultrafiltracji i przepuszczono przez 50-cm kolumnę immunopowinowactwa przeciwciało monzkIznaloe-taezyloagaroza. Kolumnę przemyto, a fragmenty związanego receptora wymyto przy wysokim pH. Oczyszczony rozpuszczalny fragment receptora charakteryzował się czystością co najmniej około 97% przy wydajności 50 mg z 5 litrów roztworu komórkowego.

Powyższe badania były możliwe dzięki dostępności preparatów czynnika wzrostu zasadniczo pozbawionych zanieczyszczenia innymi czynnikami wzrostu oraz dzięki zastosowaniu układu ekspresji receptora, w którym wszystkie ze zmierzonych reakcji PDGF mogłyby być przypisane temu pojedynczemu transfekowanemu cDNA receptora.

Wszystkie publikacje i zgłoszenia patentowe w niniejszym zgłoszeniu są załączone jako odsyłacze w tym samym stopniu, jak każda poszczególna publikacja lub zgłoszenie patentowe szczególnie i indywidualnie wskazane jako załączone jako odsyłacze. Po pełnym opisaniu niniejszego wynalazku będzie oczywiste dla specjalistów, ze wiele zmian i modyfikacji można wykonać bez odchodzenia bez ducha i zakresu załączonych zastrzeżeń.

171 788

WYKAZ SEKWENCJI (1) INFORMACJA OG0LNA (i) ZGŁASZAJĄCY ; Wolf, David

Tornlinson, James E (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Sposoby wytwarzania oczyszczonych rozpuszczalnych fragmentów ludzkiego receptora pochodzącego z płytek czynnika wzrostu typu A i typu B.

(iii) LICZBA SEKWENCU1:18 (iv) ADRES DLA KORESPONDENCJI:

(A) ADRESAT: William A. S^ith.

(B) ULICA: Gne Market Plaża, Steuart Tower, Suitę 2000 (C) MIASTO: San Francisco (D) STAC: Cal i forni a (E) KRAJ : USA (F) ZIP: 94105 (v) POSTAĆ CZYTANA PRZEZ KOMPUTER:

(A) TYP CGSNIKA: dysk elastyczny (B) KOMPUTER: kompaaybilny z IEiA PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/AS-DOS (D) SOFTWARE: Patent In Release #1.0, WERSJA #1.25 (vi) BIEŻĄCE DACE DOTYCZĄCE ZGŁOSZENIA (A) CUAER ZGŁOSZENIA: PCT (B) DATA ZGŁOSZENIA:

(C) KLASYFIKACJA:

(V) POPRZEDNIE DACE DOTYCZĄCE ZGŁOSZENIA (A) CUAER ZGŁOSZENIA: US 07/801,794 (b) DATA ZGŁOSZENI A: 2 GRUDZIEŃ 1991 (VI) DACE DOTYCZĄCE PRAWNIKA/AGECTA:

(A) CAZW ISKO: Sm i t h, Willi ani M.

(B) CUAER REJESTRACJI: 30,223 (C) CUAER ODNIESIECIA/REJESTRU: 12418-15 (ix) ICFORAACJA DOTYCZĄCA POŁĄCZEŃ:

(A) TELEFOC: 415-326-2400 (B) TELEFAKS: 415-326-2422

171 788 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR: 1 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 39 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: pojedyńcza nić (D) TOPOLOGIA: lin o owa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NUMER: 1 :

AGCCCCCTAC AGGAAGCTAC TTAAAGGGCA AGGAGTGTG 39 (2) INFORMACJA DLA SEKWEECJI NR: 2 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 39 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: pojedyńcza nić (D) TOPOLOGIA: liniowa (iI) TYP I : DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCCI: SEKWENCJA NUMER: 2 :

AGCCCCCTAC AGGAAGCTAA TTGATCTGTA GGTCGAAGG 39 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR: 3 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 41 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: pojedyńcza nić (D) TOPOLOGIA: Umowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCCI: SEKWENCJA NUMER: 3 :

CAGCCCCCTA CAGGAAGCTA GCCGCTCTCA ACCACGGTGA T 41

171 788 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR: 4 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 41 par zasad (B) TYP: kwas nukleir^<:wy (C) ILOŚĆ NICI: pojedyńcza nić (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NUMER: 4 :

CAGCCCCCTA CAGGAAGCTA GGATGACACC TGGAGTCTGT A 41 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR: 5 :

( I) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(a) DŁUGOŚĆ: 44 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: pojedyńcza nić (D) TOPOLOGIA: lim owa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NUMER: 5 :

GAGCCCCCTA CAGGAAGCTA GGGATCTGGC ACAAAGATGT AGAG 44 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR: 6 :

( i ) CHARAKTERYSTYKA SEKWENC J I :

(a) DŁUGOŚĆ: 45 par zasad (B) TYP: kwas nukleir^o^wy (C) ILOŚĆ NICI: pojedyńcza nić (D) TOPOLOG I A: linu^wa (ii) TYP I : DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NUMER: 6 :

ATGATTAGGG AGGAAGCCCA CGGTGACCAG GCCCTGAGAG ATCTG 45

171 788 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR: 7 :

( i ) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 48 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: pojedyńcza nić (D) TOPOLOGIA: liniowa (II) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NUMER: 7 :

CTGCACTGCG TTCACAGAGA CGTTGATGAC CAGGCCCTGA GAGATCTG 48 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR: 8 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 45 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: pojedyńcza nić (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NUMER: 8 :

CAGCTCTCCC AGGAGCCGCA CGTAGACCAG GCCCTGAGAG ATCTG 45 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR: 9 :

(I) CHARAKTERYSTYKA SEKWENNCI:

(A) DŁUGOŚĆ: 42 par zasad (B) TYP: kwas nuklen^c^wy (C) ILOŚĆ NICI: pojedyńcza nić (D) TOPOLOGIA: lim owa (i i) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (XI) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NUMER: 9 :

ACTTAGCTCC AGCACTCGGA JGAJJAGGCC CTGAGAGATC TG 42

171 788 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR: 10 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENNJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 41 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (J) ILOŚĆ NICI: pojedyńcza nić (D) TOPOLOGIA: liniowa (i i) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (XI) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NUMER: 10 :

CCCCTCGAAT CCGCCAGTTA TTJAGAACGJ AGGGTGGGAG C 41 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR: 11 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCd:

(A) DŁUGOŚĆ: 41 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (J) ILOSĆ NICI: pojedyńcza nić (D) TOPOLOGIA: limowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NUMER: 11 :

JJJJTJGAAT CCGCCAGTTA AGGAACTTGA GTTAACAGTT C 41 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR: 12 :

(I) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 41 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (J) ILOŚĆ NICI: pojedyńcza nić (D) TOPOLOGIA: lin o owa (II) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NUMER: 12 :

CJJCTJGAAT CCGCCAGTTA AJJTTTJTJA TGGACAGAAA T 41

171 788 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR: 13 :

(i) CCACACKEERYTYYA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 41 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) !LOTĆ NICI: pojedyńcza nić (D) TOPOLOG!A: liniowa (ii) YYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NUMER: 13 :

JJJJTCGAAY --^-TTA T—AT-TY—CT YYTAAA—AAT A 41 (S) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR: 14 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 44 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOSĆ NICI: pojedyńcza nic (D) YOPOLOGIA: lino^wa (i i) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) O»IS SEKWENCJI: SEKWENCJA NUMER: 14 :

CJJJY —AAT CJAAJAGTYA AJAYAGAT AT CAAT (S) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR: 15 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 45 par zasad (B) YYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: pojedyńcza nić (D) ^ΡίΝ-ί^-ΙΑ: Urnowa (ii) YYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (Xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NUMER: 15 :

TJJTA—A—GY ACACA-ACTA JAYCAA—JYG —AG,AGGATT AA—CT 45

171 788 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR: 16 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI· (A) DLUGOSC· 49 par zasad (B) TYP· kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI· pojedyncza nić (D) TOPOLOGIA· linu^wa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (X I ) OPIS SEK^^h^CJH SEKWENCJA NUMER· 16 ·

AATATATTAA A^TCTAGAT CATAATACAA TATTGAATAT GA^A^CT 49 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR· 17 · (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI· (A) DŁUGOŚĆ· 45 par zasad (B) TYP· kwas nuklen^c^wy (C) ILOŚĆ NICI· pojedyńcza nić (D) TOPOLOGIA· liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKIs DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA NUMER: 17 :

GAAGGTTTTT TTGATITCAG TTAAAATATA GCAGA^ATT AGGCT 45 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR: 18 · ( i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI· (A) DŁUGOŚĆ· 42 par zasad (B) TYP· kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI· pojedyńcza nić (D) TOPOLOGIA· liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (XI) OPIS SEKWENCJI· SEKWENCJA NUMER· 18 ·

TAAAAATTAA ATAATGTATT AAAGATATAA GA^A^A^ CT

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania rozpuszczalnego polipeptydu wykazującego aktywność wiązania receptora ludzkiego czynnika wzrostu pochodzącego z płytek, znamienny tym, że a) hoduje się linię komórkową, w której zachodzi ekspresja rozpuszczalnego polipeptydu, możliwego do otrzymania dzięki mutagenezie delecyjnej, z użyciem antysensownego oligomeru mutagenezy wybranego z grupy obejmującej pA3, pΔ4, pA5, pA 103, pA 104 i pΔ105 i b) wyodrębnia się rozpuszczalny polipeptyd od linii komórkowej, przy czym rozpuszczalny polipeptyd ma stałą dysocjacji 0,2 nM lub mniejszą i ma co najmniej jedną domenę Ig.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się linię komórkową, w której zachodzi ekspresja receptora ludzkiego czynnika wzrostu pochodzącego z płytek.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako linię komórkową stosuje się linię komórki jajowej chomika chińskiego.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się linię komórkową zawierającą ponadto enzym egzogenny, który posttranslacyjnie modyfikuje rozpuszczalny polipeptyd.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że jako enzym stosuje się enzym glikozylacji.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rozpuszczalny polipeptyd wydziela się do pożywki wzrostu komórek.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że rozpuszczalny polipeptyd wyodrębnia się z pożywki drogą chromatografii opartej na powinowactwie.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że do chromatografii opartej na powinowactwie stosuje się przeciwciało monoklonalne jako reagent chromatografii immunopowinowactwa.