JP2013519379A - ポリペプチド発現細胞の同定及び単離の方法 - Google Patents

ポリペプチド発現細胞の同定及び単離の方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、新規ポリペプチド類及びポリペプチド類を含む細胞に関する。ポリペプチド類及び細胞は、特異的生物機能を有するタンパク質を生成する細胞を同定及び／又は単離するための方法に使用される。特に、本方法は、抗原特異的モノクロナール抗体を生成する細胞を同定、選択、及び単離するために使用されることができる。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年２月１２日に提出した米国仮出願第６１／３０４，２５１号及び２０１１年１月３１日に提出した米国仮出願第６１／４３７，８８９号に基づく優先権を享受するものであり、各仮出願は、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。
本発明の分野は、概して、新規ポリペプチド類及びポリペプチド類を含む細胞に関連する。本発明はまた、ポリペプチド類を発現する細胞を同定及び／又は単離する方法において、ポリペプチド類を使用することに関する。本方法は、抗原特異的モノクロナール抗体を生成する細胞を同定及び単離するために使用してもよい。
１９７０年代にモノクロナール抗体の技術が開発されて以来、モノクロナール抗体は次第に治療薬剤の中で重要なクラスとなった。ハイブリドーマ技術は今でも、モノクロナール抗体生成のために最も一般的に使用されている方法である。モノクロナール抗体は、正常な抗体生成Ｂ細胞を不死の骨髄腫細胞又はその他の不死細胞と融合させることにより作られるハイブリドーマ細胞から分泌される。モノクロナール抗体開発法には、通常、対象の抗原に結合する抗体を生成するハイブリドーマを同定するため、数サイクルの上清スクリーニングが含まれる。
対象の抗原に対するモノクロナール抗体を生成するハイブリドーマの同定は、典型的には、ＥＬＩＳＡスクリーニングにより達成される。ハイブリドーマライブラリーから無作為に抽出したハイブリドーマクローンのプールにより生成される上清液をスクリーンすることは可能だが、本方法には限界がある。なぜなら、個別クローンを単離するためには、その後、ポジティブプール（複数を含む）の希釈液を制限しなければならず、それから、全クローンを再スクリーンする必要がある。ある場合においては、ハイブリドーマは、スクリーン対象の個別クローンを大量に生成する第一ステップとして希釈液を制限することによりクローン化される。希釈ステップを制限することを含む任意の方法には問題がある。なぜなら、その方法では時間がかかり、かつ多くの労力を要するからだ。さらに、ある状況においては、所望のクローンがハイブリドーマライブラリー中に占める割合は極端に少なく、そのため希少クローンの同定が困難である。加えて、ＥＬＩＳＡスクリーニング方式は、単一の抗原との結合活動を同定するのであって、モノクロナール抗体が２つ以上の抗原と結合するかどうかを判断するためには、異なる個別抗原に対し、ＥＬＩＳＡスクリーニングを複数回連続して実施しなければならない。
抗体を生成する細胞が、抗体産生細胞自体が直接同定できるようにする様式（例えば、細胞の表面）で抗体を保有するならば、有利となるであろう。この戦略は、なぜファージディスプレイ技術が成功しているのかを示す１つの理由である。事実、正常なＢ細胞は膜結合免疫グロブリンを作り、この分子は、抗原との結合に反応してシグナルを発するＢ細胞受容体複合体のコア構成要素である。天然膜結合抗体の存在は、以前より、ハイブリドーマを直接単離する試みにおいて使用されてきた（Ｐａｒｋｓら １９７９、ＰＮＡＳ，７６：１９６２−１９６６を参照のこと）。しかし、膜結合抗体のレベルが極端に低いため、本方法には限界がある。この目標の推進のため、他にも複数の技法が開発されてきた。そのうちの１つの方法として、ビオチン化アガロース微小滴で細胞を包み、その後ひき続きアビジン及びビオチン化抗マウスＩｇＧで懸濁液滴をインキュベートする、「分泌物捕捉記録網（ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｃａｐｔｕｒｅ ｒｅｐｏｒｔ ｗｅｂ（ＳＣＲＷ））」がある。アビジンは、細胞が分泌した抗体を捕捉する滴内に捕捉場所を形成するために、ビオチン化アガロースとビオチン化抗マウス抗体との間のブリッジとして機能する。これら抗体含有微小滴は、レポーター（例えば、蛍光標識抗原）との結合能力についてスクリーニングが可能であり、この液滴は、フローサイトメトリにより単離することができる（Ｋｅｎｎｅｙら、１９９５、ネイチャーバイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）８：７８７−９０； Ｇｒａｙら、１９９５、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：１５５−６３を参照のこと）。他の方法は、分泌されたタンパク質又は細胞表面の抗体を一時的に捕捉する能力に基づいている。「捕捉された」タンパク質又は抗体は、レポーター分子（例えば、蛍光標識抗原）の結合により細胞の表面上で検出され得、また、例えばフローサイトメトリにより単離され得る（例えば、米国特許第６，９１９，１８３号及び第７，１６６，４２３号、米国特許出願第２０１０／０００９８６６号を参照のこと）。
これら技法にはそれぞれ限界がある。アガロース微小滴技法は、技術的に困難であり、アガロース微小滴を生成するための特別な装置が必要である。さらに、細胞はカプセル化過程に対し感受性が高い。細胞表面捕捉法では、対象のハイブリドーマ細胞により生成された抗体と他のハイブリドーマ細胞により生成された抗体の区別は十分ではない。隣接する細胞間で対象の抗体又はタンパク質を融合することは問題となり得る。例えば、抗体は、それを生成する細胞上の捕捉分子から分離することがあり得、異なる抗体を生成する細胞に拡散し、捕捉されることもあり得る。よって、場合によっては、本方法では、発現細胞から離れたタンパク質又は抗体への拡散を削減するために高粘度媒体が必要とされる。さらに、ハイブリドーマにより生成される抗体の全てが、実際に細胞表面上で捕捉されるのではなく、こうした過剰抗体は媒体に分泌され、そこで、無作為抽出された他のハイブリドーマ細胞上で捕捉分子に容易に結合し得る。従って、抗原特異的モノクロナール抗体を生成する細胞を同定及び選択するための新規の方法及び／又は改良された方法が必要とされている。
本発明は、新規のポリペプチド類及びポリペプチド類を含む細胞、並びに、ポリペプチド類を生成する細胞を同定及び／又は選択するために、ポリペプチド類、細胞及び細胞ライブラリーの利用法について詳述するものである。特に、本発明は、抗原特異的モノクロナール抗体を生成する細胞の同定及び単離のために使用され得る。本発明は、単一の抗原結合部位を含む膜結合ヘテロ二量体分子が、細胞表面に発現される方式を提供する。単一の抗原結合部位は、細胞により生成される抗体の結合特異性を表す。ヘテロ二量体分子は、分泌された抗体を「結合」しないため、１つの細胞が別の細胞の表面上で結合又は存在することにより生成される抗体に関しては、問題は限定的であるか、又は全く問題ない。本明細書に記載の本方法及びコンストラクトは、「Ｍｅｍｂｒａｎｅ−ＭＡｂ」又は「Ｍｅｍｂｒａｎｅ−ＭＡｂ技法」及び「Ｍｅｍｂｒａｎｅ−ＭＡｂコンストラクト」と称される。新規のポリペプチドコンストラクトは、免疫グロブリンタンパク質又は非免疫グロブリンタンパク質由来の二量体形成ドメイン及び膜貫通領域を含むポリペプチドを含む。ある実施形態では、新規のポリペプチドコンストラクトには、免疫グロブリンタンパク質又は非免疫グロブリンタンパク質由来の二量体形成領域及び膜貫通領域を含むポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態では、新規のポリペプチドコンストラクトには、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリン重鎖定常領域、及び免疫グロブリンタンパク質又は非免疫タンパク質由来の膜貫通領域が含まれる。いくつかの実施形態では、新規のポリペプチドコンストラクトには、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリン重鎖定常領域及びＧＰＩ（グリコシルホスファチジルイノシトール）膜アンカーが含まれる。細胞が、ポリペプチドと、例えば、免疫グロブリン重鎖の双方を発現する場合、ポリペプチド類は、細胞の表面に発現される一価抗体を含む、ヘテロ二量体分子を生成するために結合する。ヘテロ二量体分子は、抗体結合タンパク質ではなく、それ自体は、分泌される抗体と結合もせず、又は捕捉もしない。Ｍｅｍｂｒａｎｅ−ＭＡｂ戦略の非限定的実施例を図１Ｃに示した。これを従来のハイブリドーマ技法（図１Ａ）及び表面捕捉法（図１Ｂ）の例と比較する。
１つの態様では、本発明は、第２のポリペプチドを有するヘテロ二量体分子を形成でき、第１のポリペプチドが膜結合性であり、ヘテロ二量体分子が細胞の表面上に発現される、ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドには、（ａ）二量体形成ドメインを含む細胞外部分、及び（ｂ）膜貫通部が含まれる。いくつかの実施形態では、二量体形成ドメインには、Ｆｃ領域、免疫グロブリン定常領域、ロイシンジッパー、又はイソロイシンジッパーが含まれるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、二量体形成ドメインは、通常二量体構造若しくは多量体構造を形成する受容体、インテグリン、又は任意の分子から採取したのでもよい。二量体形成ドメインは、例えば、免疫グロブリン、ＬＦＡ−１、ＧＰＩＩＩｂ／ＩＩＩａ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、ＩＬ−８受容体、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ＦＯＳ、Ｊｕｎ、ＮＦｋＢ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＣＤ４、Ｂｃｌ−２、Ｍｙｃ及びＭｅｔから採取したのでもよい。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドには、（ａ）免疫グロブリン重鎖定常領域を含む細胞外部位、及び（ｂ）膜貫通部が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドには、（ａ）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリン重鎖定常領域を含む細胞外部位、及び（ｂ）非免疫グロブリン膜貫通部が含まれる。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域には、少なくともヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの部位が含まれる。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域にはＦｃ領域が含まれる。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、若しくはＩｇＭ抗体又はそのサブタイプ由来である。ある実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２抗体由来である。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域は、マウス免疫グロブリン重鎖定常領域である。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域は、ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域である。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域には、配列番号２、配列番号４、配列番号６、又は配列番号８が含まれる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチド類には膜貫通部が含まれる。いくつかの実施形態では、膜貫通部には、免疫グロブリンタンパク質又は非免疫グロブリンタンパク質由来の膜貫通ドメインの少なくとも一部が含まれる。いくつかの実施形態では、膜貫通部はヒトタンパク質由来である。ある実施形態では、膜貫通部はマウスタンパク質由来である。いくつかの実施形態では、膜貫通部は、Ｂ細胞免疫グロブリンタンパク質由来である。いくつかの実施形態では、膜貫通部は、マウスＢ細胞免疫グロブリンタンパク質由来である。いくつかの実施形態では、膜貫通部は、ヒトＢ細胞免疫グロブリンタンパク質由来である。いくつかの実施形態では、膜貫通部は、ＣＤ４、ＣＤ８、クラスＩＭＨＣ、クラスＩＩＭＨＣ、ＣＤ１９、Ｔ細胞受容体α及びβ鎖、ＣＤ３、ｚｅｔａ鎖、ＩＣＡＭ１（ＣＤ５４）、ＩＣＡＭ２、ＩＣＡＭ３、ＩＣＡＭ４、ＩＣＡＭ５、ＣＤ２８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ２から成る群から選択されるタンパク質由来である。ある実施形態では、膜貫通部は、ＣＤ４タンパク質由来である。ある実施形態では、膜貫通部は、マウスＣＤ４タンパク質由来である。ある実施形態では、膜貫通部は、ヒトＣＤ４タンパク質由来である。ある実施形態では、膜貫通部には、配列番号１３又は１６が含まれる。いくつかの実施形態では、膜貫通部には、細胞内領域（ＩＣＤ）がさらに含まれる。いくつかの実施形態では、膜貫通部には、配列番号１４、配列番号１５、又は配列番号１７が含まれる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチド類には、ＧＰＩ膜アンカーが含まれる。いくつかの実施形態では、ＧＰＩ膜アンカーは、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５８及びＣＤ５９から成る群から選択されるタンパク質から得られる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチド類には、検出又は「レポーター」分子が含まれる。いくつかの実施形態では、この検出又はレポーター分子は、蛍光タンパク質、生物発光タンパク質、又はその変異体である。ある実施形態では、検出又はレポーター分子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はその変異体である。
よって、いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチド類には、ＩｇＧ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン及び膜貫通ドメインが含まれる。ある実施形態では、ポリペプチドには、ＩｇＧ−ＣＨ２−ＣＨ３定常領域、膜貫通ドメイン、及びＧＦＰが含まれる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチド類は膜結合性であり、及び免疫グロブリン重鎖定常領域は細胞の表面上に発現されている。いくつかの実施形態では、ポリペプチドには免疫グロブリン重鎖可変領域が含まれない。ある実施形態では、ポリペプチドには、抗原結合部位が含まれない。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、第２のポリペプチドとヘテロ二量体分子を形成することができる。ある実施形態では、第２のポリペプチドには、免疫グロブリンＦｃ領域が含まれる。ある実施形態では、第２のポリペプチドには、免疫グロブリン重鎖が含まれる。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドにはさらに、免疫グロブリン軽鎖が含まれる。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドには、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖の双方を有する単鎖免疫グロブリンが含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、第２のポリペプチドと少なくとも１つのジスルフィド結合を形成することができる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドには、配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号２８が含まれる。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドには、配列番号２２、配列番号２３、又は配列番号２６が含まれる。ある実施形態では、本発明のポリペプチドには、配列番号３０、配列番号３１、又は配列番号３２が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは配列番号９、配列番号１１、又は配列番号２９を含む配列によりコードされる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２４、配列番号２５、又は配列番号２７を含む配列によりコードされる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載の任意のポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載の任意のポリペプチドを生成する。
別の態様では、本発明は、ヘテロ二量体のポリペプチド分子を提供する。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体のポリペプチド分子には、（ａ）（ｉ）二量体形成ドメインを含む細胞外部分及び（ｉｉ）膜貫通部の両者を含んだ第１のポリペプチド、並びに（ｂ）二量体形成ドメインを含んだ第２のポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体分子には、免疫グロブリン重鎖を含む第１のポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体分子には、免疫グロブリン重鎖を含む第２のポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドに免疫グロブリン軽鎖がさらに含まれる。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドには、免疫グロブリン重鎖と免疫グロブリン軽鎖の双方を有する単鎖免疫グロブリンが含まれる。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、第２ポリペプチドと少なくとも１つのジスルフィド結合を形成する。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の任意のポリペプチド類を含む抗体分子を提供する。いくつかの実施形態では、抗体分子はヘテロ二量体分子である。ある実施形態では、抗体分子にはさらに、（ａ）免疫グロブリン重鎖、及び（ｂ）免疫グロブリン軽鎖が含まれる。いくつかの実施形態では、抗体分子にはさらに、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を有する単鎖免疫グロブリンが含まれる。いくつかの実施形態では、抗体分子のポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖−軽鎖のペアのＦｃ領域と少なくとも１つのジスルフィド結合を形成する。いくつかの実施形態では、抗体分子には単一抗原結合部位（例えば、一価の）が含まれる。
１つの態様では、本発明は、本明細書に記載の任意のポリペプチド類をコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドには、配列番号９、配列番号１１、又は配列番号２９が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドには、配列番号２４、配列番号２５、又は配列番号２７が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはベクターに含まれる。いくつかの実施形態では、宿主細胞にはポリヌクレオチド又はベクターが含まれる。いくつかの実施形態では、宿主細胞には、本明細書に記載の任意のポリペプチド又は抗体分子が含まれる。
１つの態様では、本発明は、宿主細胞及び本明細書に記載のポリペプチドを含む宿主細胞を生成する方法を提供する。いくつかの実施形態では、宿主細胞を生成する方法には、（ａ）免疫グロブリン重鎖定常領域を含む細胞外部分及び（ｂ）膜貫通部の両者を含んだポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで細胞を形質移入することが含まれる。いくつかの実施形態では、形質移入された細胞はポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、細胞は一時的に形質移入される。別の実施形態では、細胞は安定的に形質移入される。いくつかの実施形態では、本方法には、ポリペプチド発現を検出することがさらに含まれる。ある実施形態では、本方法には、細胞の表面上のポリペプチド発現を検出することがさらに含まれる。いくつかの実施形態では、本方法には、細胞の表面上のポリペプチド発現を検出することがさらに含まれる。他の実施形態では、本方法には、細胞の表面上にポリペプチドを発現する細胞を単離することがさらに含まれる。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物の細胞（例えば、ヒト細胞又はマウス細胞）である。いくつかの実施形態では、細胞は融合パートナー細胞株である。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の方法により生成される宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、細胞には、本明細書に記載の任意のポリペプチド類をコードするポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、細胞には、本明細書に記載の任意のポリペプチド類が含まれる。ある実施形態では、細胞は、（ａ）免疫グロブリン重鎖定常領域を含む細胞外部分、及び（ｂ）膜貫通部の両者を含んだポリペプチドを発現する。
別の態様では、本発明の細胞は、膜結合性ヘテロ二量体分子を生成するために使用してもよい。いくつかの実施形態では、細胞には、（ａ）（ｉ）免疫グロブリン重鎖定常領域を含む細胞外部分、及び（ｉｉ）膜貫通部の両者を含んだ膜結合性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びに（ｂ）少なくとも１つの追加ポリペプチドをコードする、少なくとも１つの追加ポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、追加ポリペプチドには、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリン重鎖定常領域が含まれる。いくつかの実施形態では、追加ポリペプチドにはＦｃドメインが含まれる。いくつかの実施形態では、追加ポリペプチドには、免疫グロブリン重鎖及び／又は免疫グロブリン軽鎖が含まれる。いくつかの実施形態では、加ポリペプチドには抗体が含まれる。いくつかの実施形態では、追加ポリペプチドには単鎖抗体が含まれる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加ポリペプチドには、無作為抽出のポリペプチド類が含まれる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加ポリペプチドは、変異誘発されたポリペプチド類が含まれる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加ポリペプチドには、ポリペプチド類のライブラリーが含まれる。いくつかの実施形態では、追加ポリペプチド類は細胞から分泌される。他の実施形態では、膜結合性ポリペプチドは、膜結合性ヘテロ二量体分子を形成するために、追加ポリペプチドと少なくとも１つのジスルフィド結合を形成する。
１つの態様では、本発明は、細胞の表面上に膜結合性ヘテロ二量体分子を発現するハイブリドーマ細胞の製造方法を提供する。いくつかの実施形態では、ハイブリドーマ細胞の製造方法には、細胞を抗体産生細胞と融合させることが含まれ、細胞には、（ａ）免疫グロブリン重鎖定常領域を含む細胞外部分、及び（ｂ）膜貫通部の両者を含んだ、膜結合性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、融合されたハイブリドーマ細胞は、細胞の表面上にヘテロ二量体抗体分子を発現する。いくつかの実施形態では、抗体産生細胞は、抗体産生細胞集団である。いくつかの実施形態では、抗体産生細胞は、未処理動物由来である。いくつかの実施形態では、抗体産生細胞は、免疫化動物由来である。いくつかの実施形態では、抗体産生細胞には、Ｂ細胞、プラズマ細胞、ハイブリドーマ、骨髄腫、及び組換え細胞が含まれるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、抗体産生細胞には複数のポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、複数のポリヌクレオチドは、複数のポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、複数のポリペプチドには、免疫グロブリン重鎖定常領域が含まれる。いくつかの実施形態では、複数のポリペプチドには、免疫グロブリン重鎖及び／又は免疫グロブリン軽鎖が含まれる。いくつかの実施形態では、複数のポリペプチドには、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を有する単鎖免疫グロブリンが含まれる。いくつかの実施形態では、複数のポリペプチドには、無作為抽出されたポリペプチドライブラリーが含まれる。いくつかの実施形態では、複数のポリペプチドにはＤＮＡライブラリーが含まれる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡライブラリーは、未処理動物の細胞から生成される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡライブラリーは、免疫化動物の細胞から生成される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡライブラリーは、ｃＤＮＡライブラリーである。いくつかの実施形態では、融合細胞には、複数のヘテロ二量体抗体分子を発現するハイブリドーマ細胞集団が含まれる。
１つの態様では、本発明は、ハイブリドーマ又は本明細書に記載の任意の方法により作られたハイブリドーマライブラリーを提供する。
別の態様では、本発明は、細胞ライブラリー及び本明細書に記載のポリペプチド類を含む細胞ライブラリーの製造方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞ライブラリーの製造方法には、細胞を複数のポリヌクレオチドで形質移入することが含まれ、細胞には、（ａ）免疫グロブリン重鎖定常領域、及び（ｂ）膜貫通部の両者を含んだポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、形質移入された細胞は、形質移入された複数の細胞の表面上にヘテロ二量体分子を発現する。いくつかの実施形態では、複数のポリヌクレオチドは複数のポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、複数のポリペプチドの各ポリペプチドには、免疫グロブリンＦｃ領域が含まれる。いくつかの実施形態では、複数のポリペプチドには、複数の無作為抽出ポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態では、複数のポリペプチドの各ポリペプチドには、（ａ）免疫グロブリンＦｃ領域、及び（ｂ）無作為抽出ポリペプチドが含まれる。他の実施形態では、複数のポリペプチドに、免疫グロブリン重鎖及び／又は免疫グロブリン軽鎖が含まれる。他の実施形態では、複数のポリペプチドに、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を有する単鎖免疫グロブリンが含まれる。いくつかの実施形態では、複数のポリヌクレオチドにはＤＮＡライブラリーが含まれる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡライブラリーは、未処理動物の細胞から生成される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡライブラリーは、免疫化動物の細胞から生成される。他の実施形態では、ＤＮＡライブラリーは、無作為抽出された複数のポリペプチドをコードする。他の実施形態では、ＤＮＡライブラリーは、複数のポリペプチドをコードし、各ポリペプチドには、（ａ）免疫グロブリンＦｃ領域、及び（ｂ）無作為抽出ポリペプチドが含まれる。
１つの態様では、本発明は、本明細書に記載の任意の方法により作られる細胞ライブラリーを提供する。
別の態様では、本発明は、特異的抗体を生成する細胞を同定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、特異的抗体を生成する細胞を同定する方法には、（ａ）免疫グロブリン重鎖定常領域を含む細胞外部分、及び（ｂ）膜貫通部の両者を含んだポリペプチド含有細胞を抗体産生細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞集団を生成することが含まれる。いくつかの実施形態では、ハイブリドーマ細胞は、細胞の表面上にヘテロ二量体分子を発現する。いくつかの実施形態では、本方法には、ハイブリドーマ細胞集団を検出分子（例えば、対象の標的）と接触させることが含まれる。いくつかの実施形態では、本方法には、検出分子と結合するハイブリドーマ細胞を同定することが含まれる。いくつかの実施形態では、本方法には、検出分子と結合する細胞を単離することが含まれる。いくつかの実施形態では、抗体産生細胞は未処理動物由来である。いくつかの実施形態では、抗体産生細胞は免疫化動物由来である。いくつかの実施形態では、抗体産生細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、抗体産生細胞は、マウス細胞である。ある実施形態では、抗体産生細胞は、Ｂ細胞、プラズマ細胞、ハイブリドーマ、骨髄腫、又は組換え細胞である。いくつかの実施形態では、抗体産生細胞には、複数のポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態では、抗体産生細胞には、複数のポリヌクレオチドが含まれる。実施形態では、複数のポリヌクレオチドは、免疫グロブリン重鎖、及び／又は免疫グロブリン軽鎖を含む複数のポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、複数のポリヌクレオチドは、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を有する単鎖免疫グロブリンを含む複数のポリペプチドをコードする。他の実施形態では、複数のポリヌクレオチドにはＤＮＡライブラリーが含まれる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡライブラリーは未処理動物の細胞から生成される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡライブラリーは、免疫化動物の細胞から生成される。
いくつかの実施形態では、抗体産生細胞から作られる抗体は、組換え抗体、モノクロナール抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体又は抗体断片である。いくつかの実施形態では、抗体産生細胞が作る抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭ抗体又はそのサブタイプである。
いくつかの実施形態では、検出分子（例えば、対象の標的）は、タンパク質又はその断片である。いくつかの実施形態では、検出分子は対象の抗原である。いくつかの実施形態では、検出分子は標識化されている。ある実施形態では、検出分子と結合する細胞は、フローサイトメトリにより同定される。いくつかの実施形態では、検出分子と結合する細胞は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により単離される。
いくつかの実施形態では、特異的抗体を生成する細胞を同定する本方法には、（ａ）免疫グロブリン重鎖定常領域を含む細胞外部分、及び（ｂ）膜貫通部の両者を含んだポリペプチド含有細胞を、少なくとも１つのポリヌクレオチドで形質移入させることが含まれる。いくつかの実施形態では、形質移入された細胞は、細胞の表面上にヘテロ二量体分子を発現する。いくつかの実施形態では、本方法には、形質移入された細胞を検出分子（例えば、対象の標的）と接触させることが含まれる。いくつかの実施形態では、本法には、検出分子と結合する細胞を同定することが含まれる。いくつかの実施形態では、本方法には、検出分子と結合する細胞を単離することが含まれる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドに複数のポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、複数のポリヌクレオチドは、免疫グロブリン重鎖、及び／又は免疫グロブリン軽鎖を含む複数のポリペプチドをコードする。他の実施形態では、複数のポリヌクレオチドには、ＤＮＡライブラリーが含まれる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡライブラリーは、未処理動物の細胞から生成される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡライブラリーは、免疫化動物の細胞から生成される。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドが、組換え抗体、モノクロナール抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、又は抗体断片であるポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドが、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭ抗体又はそのサブタイプであるポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、検出分子（例えば、対象の標的）は、タンパク質又はその断片である。いくつかの実施形態では、検出分子は対象の抗原である。いくつかの実施形態では、検出分子は標識化されている。ある実施形態では、検出分子と結合する細胞は、フローサイトメトリにより同定される。いくつかの実施形態では、検出分子と結合する細胞は、ＦＡＣＳにより単離される。
いくつかの実施形態では、特異的抗体を生成する細胞を同定する本方法には、抗体産生細胞を含む細胞ライブラリーを、（ａ）免疫グロブリン重鎖定常領域を含む細胞外部分、及び（ｂ）膜貫通部の両者を含んだポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質移入することが含まれる。いくつかの実施形態では、形質移入された細胞は、細胞の表面上にヘテロ二量体分子を発現する。いくつかの実施形態では、本方法には、形質移入された細胞を検出分子（例えば、対象の標的）と接触させることが含まれる。いくつかの実施形態では、本方法には、検出分子と結合する細胞を同定することが含まれる。いくつかの実施形態では、本方法には、検出分子と結合する細胞を単離することが含まれる。いくつかの実施形態では、細胞ライブラリーはハイブリドーマライブラリーである。いくつかの実施形態では、細胞ライブラリーには、未処理動物由来の細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、細胞ライブラリーには、免疫化動物由来の細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、細胞ライブラリーにはヒト細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、細胞ライブラリーにはマウス細胞が含まれる。ある実施形態では、細胞ライブラリーには、Ｂ細胞、プラズマ細胞、ハイブリドーマ、骨髄腫、又は組換え細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、細胞ライブラリーには、複数のポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態では、細胞ライブラリーには、複数のポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、複数のポリヌクレオチドは、免疫グロブリン重鎖、及び／又は免疫グロブリン軽鎖を含む複数のポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、複数のポリヌクレオチドは、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を有する単鎖免疫グロブリンを含む複数のポリペプチドをコードする。他の実施形態では、複数のポリヌクレオチドは、ＤＮＡライブラリーを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡライブラリーは、未処理動物の細胞から生成される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡライブラリーは、免疫化動物の細胞から生成される。
いくつかの実施形態では、細胞ライブラリーにより作られる抗体は、組換え抗体、モノクロナール抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、又は抗体断片である。いくつかの実施形態では、細胞ライブラリーにより作られる抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭ抗体又はそのサブタイプである。
いくつかの実施形態では、検出分子は、タンパク質又はその断片である。実施形態では、検出分子は対象の抗原である。いくつかの実施形態では、検出分子は標識化されている。ある施形態では、検出分子と結合する細胞は、フローサイトメトリで同定される。いくつかの実施形態では、検出分子と結合する細胞は、ＦＡＣＳにより単離される。
１つの態様では、本発明は、各細胞に、（ａ）本明細書に記載の任意の膜結合性ポリペプチドから成る第１のポリペプチド、及び（ｂ）免疫グロブリン重鎖を含む第２のポリペプチドが含まれる、細胞ライブラリーを提供する。いくつかの実施形態では、これら２つのポリペプチドは、ヘテロ二量体分子を形成し得る。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体分子は、細胞の表面上に発現される。いくつかの実施形態では、各細胞にはさらに、免疫グロブリン軽鎖が含まれる。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドには、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を有する単鎖免疫グロブリンが含まれる。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体分子には、単一の抗原結合部位が含まれる。
いくつかの実施形態では、本発明は、各細胞に（ａ）本明細書に記載の任意の膜結合性ポリペプチドから成る第１のポリペプチド、及び（ｂ）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリン重鎖定常領域を含む第２のポリペプチドが含まれる、細胞ライブラリーを提供する。いくつかの実施形態では、これら２つのポリペプチドはヘテロ二量体分子を形成し得る。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体分子は、細胞の表面上に発現される。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドには、（ａ）免疫グロブリンＦｃ領域、及び（ｂ）無作為抽出ポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドには、（ａ）ジスルフィド結合を形成し得る領域及び（ｂ）無作為抽出ポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドには、（ａ）ジスルフィド結合を形成し得る領域、及び（ｂ）変異誘発されたポリペプチドが含まれる。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の任意の細胞ライブラリーのスクリーニング法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞ライブラリーのスクリーニング法には、細胞ライブラリーを検出分子（例えば、対象の標的）と接触させることが含まれる。いくつかの実施形態では、本方法には、検出分子と結合する細胞を同定することが含まれる。いくつかの実施形態では、本方法には、検出分子と結合する細胞を単離することが含まれる。いくつかの実施形態では、検出分子は、タンパク質又はその断片である。いくつかの実施形態では、検出分子は対象の抗原である。いくつかの実施形態では、検出分子は、小分子化合物である。ある実施形態では、検出分子は標識化されている。いくつかの実施形態では、細胞はフローサイトメトリで同定される。ある実施形態では、細胞はＦＡＣＳで単離される。
別の態様では、本発明は、抗体のスクリーニング法を提供する。いくつかの実施形態では、特異的抗体のスクリーニング法には、本明細書に記載の細胞又は細胞ライブラリーを検出分子（例えば、対象の標的）と接触させることが含まれる。いくつかの実施形態では、特異的抗体のスクリーニング法には、検出分子と結合する細胞を同定することが含まれる。いくつかの実施形態では、特異的抗体のスクリーニング法には、検出分子と結合する細胞を単離することが含まれる。いくつかの実施形態では、特異的抗体のスクリーニング法には、検出分子により同定される細胞由来の抗体を単離することが含まれる。いくつかの実施形態では、検出分子は、タンパク質又はその断片である。いくつかの実施形態では、検出分子は対象の抗原である。いくつかの実施形態では、検出分子は小分子化合物である。ある実施形態では、検出分子は標識化されている。ある実施形態では、細胞はフローサイトメトリで同定される。ある実施形態では、細胞はＦＡＣＳにより単離される。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の任意の方法により生成され、同定され、及び／又は単離される抗体を提供する。
他のハイブリドーマ戦略と比較した膜ＭＡｂ技法の概略図。図１Ａは、モノクロナール抗体がハイブリドーマから分泌されることを示した典型的ハイブリドーマを表している。図１Ｂは、その細胞表面に抗体結合性タンパク質又は「捕捉タンパク質」（例えば、Ｆｃ受容体又はタンパク質Ａ）を発現するハイブリドーマを表している。概略図は、モノクロナール抗体がハイブリドーマから分泌されることを示している。しかし、ハイブリドーマは、細胞によって分泌される抗体だけでなく、他の細胞によっても生成される抗体と結合し得る抗体結合性タンパク質を細胞表面に有する。図１Ｃは、膜ＭＡｂ戦略の非限定的実施形態の１つを表している。ハイブリドーマは、免疫グロブリン重鎖−軽鎖のペアと共有結合した膜結合性ポリペプチドを含むヘテロ二量体分子を発現する。免疫グロブリン重鎖−軽鎖のペアは、細胞により生成されるモノクロナール抗体の代表的な単一抗原結合部位を形成する。 融合に利用するための膜ＭＡｂポリペプチドを発現する細胞の生成。マウスのハイブリドーマ融合パートナー細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４は、膜ＭＡｂ（ｍＩｇＧ１）コンストラクトで安定的に形質移入された。得られた細胞株は、指定されたＳＰ２／０−ＭＴであった。図２Ａは、アイソタイプの負の制御抗体（左のパネル）及び抗体ＦＬＡＧ抗体（右のパネル）を用い、ＳＰ２／０−ＭＴ細胞上に膜ＭＡｂ（ｍＩｇＧ１）コンストラクトが細胞表面発現することに関するフローサイトメトリの結果を示している。膜ＭＡｂ（ｍＩｇＧ１）コンストラクトは、抗ＦＬＡＧ抗体によりポリペプチドを検出し得るＦＬＡＧタグを有している。図２Ｂは、ＳＰ２／０−ＭＴ細胞株の５つのサブクローン上に膜ＭＡｂ（ｍＩｇＧ１）コンストラクトが細胞表面発現することに関するフローサイトメトリの結果を示している。 複数の標的と結合する抗体を生成するハイブリドーマを同定する、膜ＭＡｂ技法の利用。ＳＰ−２／０細胞を、マウスＦＺＤ５及びＦＺＤ８で免疫したマウスから単離した細胞と融合させることにより作製された膜ＭＡｂハイブリドーマライブラリーのフローサイトメトリプロットが提示されている。細胞は、標識化ＦＺＤ５及びＦＺＤ８タンパク質でインキュベートされ、解析された。組換えＦＺＤ５タンパク質は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８で標識化され、組換えＦＺＤ８はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７で標識化された。ＦＺＤ５及びＦＺＤ８双方への結合を示すハイブリドーマ細胞が同定された（「ＦＺＤ５／８ＤＰ」と標識された枠で囲まれた領域；ＤＰ＝二重ポジティブ） ＤＤＲ２に対する抗体を生成する細胞を同定するための膜ＭＡｂ技法の利用。膜ＭＡｂ（ｍＩｇＧ１）コンストラクトを既存のＤＤＲ２ハイブリドーマライブラリーに形質移入することにより作製される、膜ＭＡｂハイブリドーマライブラリーのフローサイトメトリプロットが提示されている。細胞は、標識化ＤＤＲ２タンパク質及び抗ＦＬＡＧ抗体でインキュベートされ、解析された。組換えＤＤＲ２タンパク質は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８で標識化され、抗ＦＬＡＧ抗体は、フィコエリトリン（ＰＥ）で標識化された。「ＤＤＲ２Ｐｏｓ」と標識された枠で囲まれた領域には、ＤＤＲ２及び抗ＦＬＡＧ抗体への結合を示すハイブリドーマ細胞が存在する。 ２９３−ｈＭＴ安定クローンのフローサイトメトリ解析。ＨＥＫ−２９３細胞は、膜ＭＡｂ（ｈＩｇＧ２）−ＧＦＰコンストラクトで安定的に形質移入された。１４個のクローンに対し、ＧＦＰ発現のスクリーニングが行われた。 膜ＭＡｂコンストラクトを用いた細胞別抗体ディスプレイの概略図。図６Ａは、膜ＭＡｂ（ｈＩｇＧ２）及び膜ＭＡｂ（ｈＩｇＧ２）−ＧＦＰコンストラクトを表している。図６Ｂは、本明細書でＭＡｂＬｉｂコンストラクトと称される単鎖抗体ベクターを表している。抗体ライブラリー産生を促進するため、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、独自の制限部位に隣接する。図６Ｃは、ＨＥＫ−２９３細胞の表面に発現する膜ＭＡｂ（ｈＩｇＧ２）−ＧＦＰ分子を表している。図６Ｄは、ＨＥＫ−２９３細胞の表面上のヘテロ二量体分子の非制限的実施形態を示している。ヘテロ二量体分子は、単鎖抗体分子と結合する膜ＭＡｂ（ｈＩｇＧ２）−ＧＦＰタンパク質である。 ＨＥＫ−２９３細胞の表面上のヘテロ二量体抗体分子の発現解析。様々な濃度の抗ＤＬＬ４抗体ｓｃ２１Ｍ１８プラスミドＤＮＡが、ＨＥＫ−２９３細胞に膜ＭＡｂ（ｈＩｇＧ２）−ＧＦＰコンストラクト（−Ｘ−）を形質移入するために用いられた。対照は、非形質移入細胞（−◆−）、ｓｃ２１Ｍ１８ＤＮＡのみで形質移入された細胞（−▲−）、及び膜ＭＡｂ（ｈＩｇＧ２）−ＧＦＰ ＤＮＡのみで形質移入された細胞（−■−）である。細胞を４８時間インキュベートし、収穫し、ＦＡＣＳにより抗体特異的抗原（ｈＤＬＬ４−Ｆｃ）でスクリーンした。結果は、蛍光強度中央値（ＭＦＩ）として提示されている。 抗体分子のディスプレイを調節するための担体プラスミド利用の解析。抗ＤＬＬ４抗体プラスミドＤＮＡを、無関係の抗体プラスミドＤＮＡ（ｓｃ１８Ｒ５）の過剰量と様々な割合で混合し、ＨＥＫ−２９３細胞を形質移入するために使用した。細胞を４８時間インキュベートし、収穫し、ＦＡＣＳによりスクリーンした。表面上の抗ＤＬＬ４抗体のスクリーニングに関して、ｈＤＬＬ４−ｒＦＣを抗原として用い（−◆−）、ｈＪａｇ−ｒＦＣタンパク質を対照として用いた（−■−）。結合された抗原はＰＥ標識化抗ラビットＦｃ抗体で検出し、また対照としてのみ使用された（−▲−）。表面上の抗ＤＬＬ４抗体を発現する細胞の割合は、ＦＡＣＳにより判断された。 抗ＤＬＬ４抗体を発現する細胞の選択及び濃縮。ＨＥＫ−２９３細胞を、抗ＤＬＬ４抗体プラスミドＤＮＡと無関係の抗体プラスミドＤＮＡを１：１００，０００（ｓｃ２１Ｍ１８：ｓｃ１８Ｒ５）の割合で混ぜ合わせた混合物で形質移入した。細胞に対し４ラウンドのソーティングを行った。表面上に抗ＤＬＬ４抗体を発現する細胞の割合は、ラウンド毎にＦＡＣＳにより判断された。
本発明は、細胞の表面上にヘテロ二量体分子を形成し得るポリペプチド類を含む、新規の膜結合性ポリペプチド類を提供する。また、関連するポリペプチド類及びポリヌクレオチド類、並びにポリペプチド類及びポリヌクレオチド類を含む細胞及び細胞ライブラリーも提供される。ポリペプチド類を含む宿主細胞の製造方法及び特定の個別細胞を同定及び単離するためのこれら細胞の利用方法がさらに提供される。また、細胞により生成される抗体、又は本方法により生成、単離、及び／若しくは同定される抗体も提供される。
膜Ｍａｂ（ｍＩｇＧ１）、膜Ｍａｂ（ｈＩｇＧ２）、及び膜Ｍａｂ（ｈＩｇＧ２）−ＧＦＰを含む、新規の膜結合性ポリペプチド類をコードするヌクレオチドを含むコンストラクトが生成された（実施例１）。新規の膜結合性ポリペプチド類を発現する細胞が産生された。細胞株ＳＰ２／０−ＭＴは、膜ＭＡｂ（ｍＩｇＧ１）コンストラクトをＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞、すなわちマウス融合パートナー細胞株に形質移入することにより生成された（実施例２）。細胞株２９３−ｈＭＴは、膜Ｍａｂ（ｈＩｇＧ２）−ＧＦＰコンストラクトをＨＥＫ２９３細胞、すなわちヒト胚腎臓由来細胞株に形質移入することにより生成された（実施例５）。ＳＰ２／０−ＭＴ細胞は、細胞表面上にヘテロ二量体抗体分子を発現するハイブリドーマライブラリーを生成する免疫化動物由来の細胞と融合させるのに使用された。これらの膜結合性抗体分子は、標的抗原に特異的に結合する抗体を生成する細胞を検出し、単離するために使用された（実施例３）。新規のポリペプチド膜Ｍａｂ（ｍＩｇＧ１）をコードするポリヌクレオチドは、確立されたハイブリドーマライブラリーに形質移入され、得られた細胞は、その表面上のヘテロ二量体抗体分子を発現するために提示された。膜結合性抗体分子が、標的抗原に特異的に結合する抗体を生成する細胞を検出し、単離するために使用された（実施例４）。ハイブリドーマ融合法と形質移入法の両方を用いて、膜ＭＡｂ技法を行った結果、無作為に選択されたクローン（プラス０．６％及び８％）と比較して、単離された抗原特異的正のクローンの割合（プラス９１％及び８４％）が劇的に増加した。膜Ｍａｂ（ｈＩｇＧ２）−ＧＦＰコンストラクトを、抗ＤＬＬ４抗体をコードするＤＮＡでＨＥＫ２９３細胞に形質移入した。フローサイトメトリの解析により、ＤＬＬ４抗原に結合する形質移入された細胞の表面上にヘテロ二量体分子が存在することが示された（実施例７）。膜ＭＡｂ技法を用いた検証試験により、抗ＤＬＬ４抗体を含むヘテロ二量体分子を発現する細胞は、異なる抗体が大量の過剰物に発現される細胞集団から選択され得ることが示された（実施例９）。
Ｉ．定義
本発明の理解を促進するために、以下にいくつかの用語と表現を定義する。
本明細書で使用する「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１つの抗原認識部位又は抗原結合部位を通じて、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、又はそれらの組み合わせ等の標的を認識し、特異的に結合する免疫グロブリン分子を指している。本明細書で使用される「抗体」という用語には、インタクトなポリクロナール抗体、インタクトなモノクロナール抗体、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２及びＦｖ断片）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）突然変異体、全体にわたり免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖が含まれる単鎖免疫グロブリン分子、少なくとも２つのインタクト抗体から生成される二重特異的抗体等の多重特異的抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原認識部位を含む融合タンパク質、及び抗体が所望の生物活性を示す限り抗原認識部位を含む、任意の他の修飾免疫グロブリン分子が包含される。さらに、「抗体」という用語には、ただ１つの結合部位を有する一価抗体分子が含まれる。抗体は、免疫グロブリンの主要な５種類のクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ抗体又はそのサブタイプ（例えば、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡｌ及びＩｇＡ２）のいずれかであり得、それぞれα、Δ、ε、γ、及びμと称される各抗体の重鎖定常ドメインの同一性に基づいている。
本明細書で使用する「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を指している。「Ｆｃ領域」は、ネイティブ配列Ｆｃ領域又はＦｃ可変領域であってもよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は可変的であってもよいが、免疫グロブリンのＦｃ領域には通常、２つの定常ドメイン、すなわちＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、及び少なくともヒンジ領域の一部が含まれる。
「抗体断片」という用語は、インタクト抗体の一部、及びインタクト抗体の抗原決定可変領域を指している。抗体断片の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２及びＦｖ断片、直線抗体、ｓｃＦｖ抗体、及び抗体断片から形成される多重特異的抗体が含まれるが、これに限定されない。
抗体の「可変領域」という用語は、抗体軽鎖の可変領域又は抗体重鎖の可変領域で、いずれか片方又はそれら組み合わせを指している。重鎖及び軽鎖の可変領域は、「高度可変領域」としても知られている、３つの相補性決定領域（ＣＤＲｓ）によりつながる４つの枠組み領域から成る。各鎖のＣＤＲｓは、枠組み領域により近接した位置に置かれ、他の鎖のＣＤＲｓと共に、抗体の抗原結合性部位の形成に寄与する。決定性ＣＤＲｓには少なくとも２つの技法が存在する。すなわち、（１）種間配列変異性に基づく方式（すなわち、Ｋａｂａｔら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、米国国立衛生研究所、メリーランド州ベテスダ）、及び（２）抗原抗体複合体の結晶学研究に基づく方式（Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら、１９９７、分子生物学誌（Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ．）２７３：９２７−９４８）である。さらに、ＣＤＲｓ決定を行う当技術分野において、これら二つの方式を組み合わせて使用することもできる。
「モノクロナール抗体」という用語は、高度特異的認識に関与する均質な抗体集団及び単一の抗原決定基又はエピトープの結合を指している。これは、通常、異なる抗原決定基に対し向けられる異なる抗体の混合物を含むポリクローナル抗体と対照的である。「モノクロナール抗体」という用語は、インタクトなモノクロナール抗体及び全長モノクロナール抗体の双方、並びに、抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２及びＦｖ断片）、ｓｃＦｖ変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、及び抗原認識部位を含む任意の他の修飾免疫グロブリン分子を包含する。「モノクロナール抗体」は、ハイブリドーマ生成、ファージ選択、組換え発現、及び形質移入動物を含むがこれに限定されない、任意の数の技法により作製される抗体のことを指している。
「ヒト化抗体」という用語は、最小限非ヒト（例えば、マウスの）配列を含む特異的免疫グロブリン鎖、キメラ免疫グロブリン、又はその断片である、非ヒト（例えば、マウスの）抗体のフォームを指している。
「ヒト抗体」という用語は、ヒトにより生成される抗体、又は当技術分野で知られている任意の技法を用いて作製される、ヒトが生成する抗体に相応するアミノ酸配列を有する抗体を指している。ヒト抗体に関するこの定義には、インタクト抗体若しくは全長抗体、その断片、及び／又は少なくとも１つのヒト重鎖ポリペプチド及び／若しくはヒト軽鎖ポリペプチド、例えば、マウス軽鎖ポリペプチド及びヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体等の抗体が含まれる。
「キメラ抗体」という用語は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が、２又はそれ以上の種由来である抗体を指している。典型的には、軽鎖と重鎖双方の可変領域は、所望の特異性、近似性、及び／又は機能性を有する１種類の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ラビット）由来の抗体の可変領域に相応し、一方、定常領域は、種における免疫反応の誘導を避けるために、別の種（通常はヒト）由来の抗体の配列と相同である。
「エピトープ」及び「抗原決定基」は、本明細書においては同義で使用され、特定の抗体により認識され、特異的に結合することができる抗原の部分を指している。抗原がポリペプチドの場合、エピトープは、連続するアミノ酸（しばしば「直線エピトープ」と称される）とタンパク質の三次フォールディング（しばしば「コンフォメーション性エピトープ」と称される）により並置される非連続アミノ酸の双方から形成され得る。連続アミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、タンパク質変性の際に保持されるが、三次フォールディングにより形成されるエピトープは、典型的にはタンパク質変性時に消失する。エピトープには、典型的には、独自の空間コンフォメーションの中の少なくとも３個のアミノ酸、より通常としては、少なくとも５個又は８〜１０個のアミノ酸が含まれる。
本明細書で使用される「非免疫グロブリン」という用語は、抗体免疫グロブリン鎖ではないポリペプチドを指している。本明細書で使用される「非免疫グロブリン」には、免疫グロブリンスーパーファミリーの他のメンバーも包含される。
「特異的結合」及び「特異的に結合すること」という用語は、結合剤又は抗体が、無関係のタンパク質等の代替物質とよりも頻繁に、より迅速に、より長い間、より類似して、又はこれらの幾つかの組み合わせで、エピトープ又はタンパク質と反応又は結合するという意味である。ある実施形態では、「特異的結合」とは、例えば、抗体が約０．１ｍＭ又はそれ以下のＫＤを有するタンパク質と結合する、だが、より通常としては、約１μＭ未満のＫＤを有するタンパク質と結合するという意味である。ある実施形態では、「特異的結合」とは、抗体が、少なくとも約０．１μＭ若しくはそれ以下、少なくとも約０．０１μＭ若しくはそれ以下、又は少なくとも約１ｎＭ若しくはそれ以下のＫＤを有するタンパク質に結合するという意味である。異種の相同なタンパク質間の配列同一性の故に、特異的に結合することには、１より多くの種（例えば、マウスＦＺＤ及びヒトＦＺＤ）における特定のタンパク質を認識する抗体が含まれ得る。同様に、ポリペプチド配列の特定の領域における異なるタンパク質間の相同性の故に、特異的に結合することには、１より多くのタンパク質（例えば、ヒトＦＺＤ５及びヒトＦＺＤ８）を認識する抗体（又は他のポリペプチド若しくは薬品）が含まれ得る。第１の標的に特異的に結合する抗体又は結合部分は、第２の標的に特異的に結合するかもしれないし、しないかもしれないことが理解される。そのように、「特異的に結合すること」は、排他的結合、すなわち、単一の標的への結合が（含まれ得るとしても）必ずしも求められるわけではない。よって、抗体は、ある実施形態では、１より多くの標的と特異的に結合してもよい。ある実施形態では、複数の標的が、抗体上の同じ抗原結合部位と結合することもあり得る。例えば、抗体は、ある実施形態では、２つの同一の抗原結合部位を含み、それぞれ２又はそれ以上のタンパク質上の同じエピトープと特異的に結合することもある。一般に、結合という表現は特異的に結合するという意味であるが、必ずしもそうではない。
「ポリペプチド」及び「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書において同義に使用されており、任意の長さのアミノ酸ポリマーを指している。ポリマーは、直線状でも分枝状でもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸により介在されてもよい。用語はまた、天然に修飾されたアミノ酸ポリマー又は介在により修飾されたアミノ酸ポリマー、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は標識化合物との結合等、他の任意の操作若しくは修飾を包含する。また、例えば、１又はそれ以上のアミノ酸類似体（例えば、非天然アミノ酸を含む）含有ポリペプチド、並びに当技術分野で知られている他の修飾物も定義内に含まれる。本発明のポリペプチドの少なくとも一部は抗体に基づいているため、ある実施形態では、ポリペプチドは単鎖又は結合鎖として発生し得ると理解される。
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、本明細書では同義に使用され、任意の長さのヌクレオチドポリマーを指しており、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチド類は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド若しくは塩基、及び／若しくはこれらの類似体、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡポリメラーゼによりポリマーにより組み入れられ得る任意の基板であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びその類似体等の修飾ヌクレオチドを含んでもよい。ヌクレオチド構造への修飾は、もしあれば、ポリヌクレオチド集合の前又は後に取り入れてもよい。ヌクレオチド類の配列は、非ヌクレオチド成分により介在されてもよい。ポリヌクレオチドは、標識成分との結合等により、集合後にさらに修飾されてもよい。
「高度ストリンジェンシー条件」は、以下により同定されてもよい。すなわち、（１）洗浄のための低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃で０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％の硫酸ドデシルナトリウムを使用する；（２）ハイブリダイゼーションの間、ホルムアミド等の変性剤を使用する。例えば、０．１％のウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドンを含む５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド／７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含み、ｐＨ６．５の５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファを４２℃で使用する；又は（３）４２℃で５０％のホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５Ｍ塩化ナトリウム、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハート液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％デキストラン硫酸を用い、０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）の中で４２℃で洗浄し、５５℃で５０％ホルムアミドで洗浄し、その後、５５℃でＥＤＴＡを含有する０．ｌｘＳＳＣから成る高度ストリンジェンシー洗浄を行った。
２又はそれ以上の核酸又はポリペプチドとの関係で使われる「同一性」又は「同一性割合」という用語は、配列の同一性の一部として任意の保存的アミノ酸置換を考慮せずに最大一致性と比較及び調節（必要であればギャップを導入）するにあたり、同一のヌクレオチド類又はアミノ酸残基と同じ、又は特定の割合を有する２又はそれ以上の配列又は部分配列を指している。「同一性の割合」は、配列比較ソフトウェア若しくはアルゴリズムを使って、又は目視により測定してもよい。アミノ酸配列又はヌクレオチド配列のアラインメントを得るために使用され得る様々なアルゴリズム及びソフトウェアは、当業者に周知である。これらには、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ、ＢｅｓｔＦｉｔ、及びＧＣＧプログラムが含まれるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明の２つの核酸又はポリペプチドは実質的に同一であり、つまり、配列比較アルゴリズムを使って、又は目視により測定し、最大一致性と比較及び調節した場合、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、またいくつかの実施形態では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のヌクレオチド又はアミノ酸残基が同一であるという意味である。いくつかの実施形態では、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約４０〜６０、少なくとも約６０〜８０長の残基又はそれらの間の任意の整数値である配列の領域にまたがって同一性が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも約９０〜１００残基等６０〜８０残基よりも長い領域にまたがって同一性が存在し、いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列のコード領域等、比較対象の配列全長にわたり、配列は実質的に同一である。
「保存的アミノ酸置換」とは、１つのアミノ酸残基を類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基と置換することである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野において同定されており、例えば、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラ酸、グルタミン酸）、非電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）等が含まれる。例えば、チロシンのフェニルアラニンの置換は、保存的置換と考えられる。ポリペプチド及び本発明の抗体の配列における保存的置換は、ポリペプチド又はアミノ酸配列を含む抗体の抗原への結合、すなわち、ポリペプチド又は抗体が結合する１又はそれ以上のタンパク質への結合を排除しないことが好ましい。抗原結合を排除しないヌクレオチド及びアミノ酸の保存的置換の同定方法は、当技術分野において周知である。
「ベクター」という用語は、宿主細胞の１又はそれ以上の対象遺伝子又は対象配列を送達でき、好ましくは発現できるコンストラクトを指している。ベクターの例として、ウイルスベクター、裸のＤＮＡ若しくはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミド若しくはファージベクター、陽イオン濃縮剤と結合するＤＮＡ若しくはＲＮＡ発現ベクター、及びリポソームにカプセル化されたＤＮＡ若しくはＲＮＡ発現ベクターであるが、これに限定されない。
本明細書で使用する「形質移入」という用語は、細胞による異質ＤＮＡの取り込みを表すために使われる。外因性ＤＮＡが細胞膜内に導入された時、細胞は「形質移入」された。
単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、又は組成物とは、天然では見つからないフォームのポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、又は組成物のことである。単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞又は組成物には、もはや天然で見つからないフォームになるまで精製されたものが含まれる。ある実施形態では、単離された抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、又は組成物は、実質的に純粋である。
本明細書で使用する「実質的に純粋」という用語は、少なくとも５０％純粋（すなわち、不純物がない）、より好ましくは少なくとも９０％純粋、より好ましくは少なくとも９５％純粋、より好ましくは少なくとも９８％純粋、より好ましくは少なくとも９９％純粋である物質を指している。
本明細書で使用する「動物」は、マウス、ラット、ハムスター、他の齧歯類、ラビット、ヤギ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、ヒト等の任意の動物（例えば、哺乳動物）を指しているが、これに限定されない。
本明細書で「Ａ及び／又はＢ」等の表現に使用される「及び／又は」という用語は、Ａ及びＢの両方、Ａ（のみ）及びＢ（のみ）を含むことを意図している。
本開示及び特許請求の範囲で使用する、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の言及が含まれる。
本明細書において、実施形態が「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語で記載される場合は常に、「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」及び／又は「本質的に〜から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」に関して記載されるその他の類似の実施形態もまた提供されると理解される。
ＩＩ．ポリペプチド類及びポリヌクレオチド類
本発明は、膜結合性であり及び細胞の表面上に発現する細胞外部分を含む新規のポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドには、（ａ）二量体形成ドメインを含む細胞外部分、及び（ｂ）膜貫通部が含まれる。本明細書で使用される二量体形成ドメインは、２つのポリペプチド間の相互作用を促進することができる任意のドメインである。好適な二量体形成ドメインには、疎水性基が通常の間隔で存在し、各タンパク質の疎水性基との相互作用により二量体の形成を可能とする、両親媒性αへリックスを有するタンパク質のものが含まれる。好適な二量体形成ドメインには、ジスルフィド結合形成を通じて二量体形成を可能とするシステイン残基を有するタンパク質のも含まれる。二量体形成ドメインには、免疫グロブリン定常領域、ロイシンジッパー、イソロイシンジッパー、及びＧＣＮ４ジッパーが含まれるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、ポリペプチドには（ａ）免疫グロブリン重鎖定常領域を含む細胞外部分、及び（ｂ）膜貫通部が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドには、（ａ）二量体形成領域を含む細胞外部分、及び（ｂ）ＧＰＩアンカー部分が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドには、（ａ）免疫グロブリン重鎖定常領域を含む細胞外部分、及び（ｂ）ＧＰＩアンカー部分が含まれる。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域には、ＣＨ２、ＣＨ３及び／又はＣＨ４から選択される少なくとも１つの定常ドメインが含まれる。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域には、少なくともヒンジ領域の一部が含まれる。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域には、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインが含まれる。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域には、ヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３が含まれる。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域にはＦｃ領域が含まれる。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域には、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ抗体又はそのサブタイプから得られる。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２から得られる。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域は、ＩｇＧ２から得られる。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域は、ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域から得られる。他の実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域は、マウス免疫グロブリン重鎖定常領域から得られる。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドには抗体可変領域は含まれない。いくつかの実施形態では、ポリペプチドには抗原結合部位が含まれない。
ポリペプチドは、ポリペプチド又はＧＰＩ膜アンカーの膜貫通部により、細胞膜に、少なくとも部分的にアンカーされる。いくつかの実施形態では、膜貫通部は、タイプＩ膜貫通タンパク質から得られる。タイプＩ膜貫通タンパク質は、Ｎ末端が膜の外に存在するよう配置されている。タイプＩ膜貫通タンパク質はシングルパスでもよく、つまり、膜貫通タンパク質は１度だけ膜を貫通するという意味であり、又はマルチパスでもよく、つまり膜貫通タンパク質が複数回膜を貫通するという意味である。膜貫通部は、免疫グロブリンタンパク質及び非免疫グロブリンタンパク質を含むがこれに限定されない、多様なソースから得てもよい。いくつかの実施形態では、膜貫通部は、ＣＤ４、ＣＤ８、クラスＩ ＭＨＣ、クラスＩＩ ＭＨＣ、ＣＤ１９、Ｔ細胞受容体α及びβ鎖、ＣＤ３、ｚｅｔａ鎖、ＩＣＡＭ１（ＣＤ５４）、ＩＣＡＭ２、ＩＣＡＭ３、ＩＣＡＭ４、ＩＣＡＭ５、ＣＤ２８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ２等を含むがこれに限定されない、免疫グロブリンスーパーファミリーの一部であるタンパク質から採取される。いくつかの実施形態では、膜貫通部は、ヒトタンパク質から得られる。いくつかの実施形態では、膜貫通部はマウスタンパク質から得られる。いくつかの実施形態では、膜貫通部はヒトＣＤ４から得られる。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドにはさらに、少なくとも細胞内領域の一部が含まれる。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、膜貫通部の採取元と同じタンパク質から得られる。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、膜貫通部の採取元のタンパク質とは異なるタンパク質から得られる。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは修飾される。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、ドメインの正常な機能が除去される又は不活性化されるよう修飾される。修飾には、タンパク質結合部位の除去、活性部位の除去又は阻害、及びリン酸化部位の除去又は阻害が含まれるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、ポリペプチドには、ヒトＣＤ４由来の膜貫通部及び細胞内ドメイン領域が含まれる。他の実施形態では、ポリペプチドには、ヒトＣＤ４由来の膜貫通部及び細胞内ドメイン領域が含まれ、細胞内ドメインは修飾されている。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、ｌｃｋタンパク質結合部位を除去するよう修飾されている。
いくつかの実施形態では、膜貫通部又は細胞内ドメインを有する膜貫通部は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号１７から成る群から選択される。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインを有する膜貫通部は、配列番号１５である。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドはＧＰＩ膜アンカーにより細胞膜にアンカーされる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、典型的な疎水性Ｃ末端アミノ酸残基がプロペプチドから切断され、ポリペプチドのＣ末端がグリコシルホスファチジルイノシトールと共有結合的に結合しているＧＰＩリンクにより、細胞膜にアンカーされる。ＧＰＩの疎水性脂質部分は、細胞膜でポリペプチドを保有する。いくつかの実施形態では、ＧＰＩリンクを担う分子の疎水性Ｃ末端は、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、及びその他の類似のタンパク質から得られる。
本発明のポリペプチド類は膜結合性であり、細胞の表面上に発現される免疫グロブリン重鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは第２のポリペプチドと結合し、ヘテロ二量体分子を形成することができる。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドには免疫グロブリン重鎖が含まれる。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドには、単鎖分子として、免疫グロブリン長鎖及び免疫グロブリン軽鎖が含まれる。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン軽鎖は免疫グロブリン重鎖と結合する。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドには、免疫グロブリン長鎖−軽鎖のペアが含まれる。本明細書で使用する「免疫グロブリン長鎖−軽鎖のペア」には、１つのポリペプチドに免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖の両方を含む単鎖免疫グロブリンが含まれる。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン重鎖−軽鎖のペアには、単一の抗原結合部位が含まれる。いくつかの実施形態では、膜結合性ポリペプチドは免疫グロブリン重鎖−軽鎖のペアと結合し、１つの抗原結合部位を含むヘテロ二量体抗体分子を形成する。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体抗体分子は一価抗体である。
本発明のポリペプチド類は、非共有結合性結合又は共有結合性結合を含むがこれに限定されない、任意の数の手段により、第２のポリペプチドと結合してもよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、イオン性結合等、非共有結合性結合により第２のポリペプチドと結合する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ジスルフィド結合等、共有結合性結合により第２のポリペプチドと結合する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、第２のポリペプチドと少なくとも１つのジスルフィド結合を形成する。他の実施形態では、ポリペプチドは、第２のポリペプチドと２つのジスルフィド結合を形成する。他の実施形態では、ポリペプチドは、第２のポリペプチドと３又は４のジスルフィド結合を形成する。他の実施形態では、ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖−軽鎖のペアの免疫グロブリン重鎖定常領域と少なくとも１つのジスルフィド結合を形成し、ヘテロ二量体抗体分子を形成することができる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは第２ポリペプチドとジスルフィド結合を形成し、ヘテロ二量体分子を形成することができる。設計により、ポリペプチドは通常、すでにヘテロ二量体分子又はホモ二量体分子の一部であるポリペプチドとジスルフィド結合を形成することができる。ポリペプチドは通常、分泌された抗体分子とジスルフィド結合を形成することができない。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは分泌された抗体とジスルフィド結合を形成しない。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドを含むヘテロ二量体分子は、抗体と結合しない。ある実施形態では、本発明のポリペプチドを含むヘテロ二量体分子は、分泌された抗体と結合しない。
いくつかの実施形態では、本発明は、（ａ）ＣＨ２及びＣＨ３を含む免疫グロブリン重鎖定常領域、及び（ｂ）膜貫通部の両者を含んだポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では。ポリペプチドには、（ａ）ＣＨ２及びＣＨ３を含むヒトＩｇＧ２重鎖定常領域、及び（ｂ）ヒトＣＤ４膜貫通部が含まれる。ある実施形態では、ポリペプチドには、（ａ）ＣＨ２及びＣＨ３を含む免疫グロブリン重鎖定常領域、（ｂ）膜貫通部、及び（ｃ）蛍光分子が含まれる。ある実施形態では、ポリペプチドには、（ａ）ＣＨ２及びＣＨ３を含む免疫グロブリン重鎖定常領域、（ｂ）ＣＤ４膜貫通部、及び（ｃ）蛍光分子が含まれる。ある実施形態では、ポリペプチドには、（ａ）ＣＨ２及びＣＨ３を含むヒトＩｇＧ２重鎖定常領域、（ｂ）ヒトＣＤ４膜貫通部、及び（ｃ）蛍光分子が含まれる。ある実施形態では、蛍光分子はＧＦＰである。
いくつかの実施形態では、本発明は、（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、又は配列番号８を含む免疫グロブリン重鎖定常領域、及び（ｂ）配列番号１３又は配列番号１６を含む膜貫通部を含んだポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドには、配列番号２を含む免疫グロブリン重鎖定常領域及び配列番号１６を含む膜貫通部が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドには、配列番号２を含む免疫グロブリン重鎖定常領域及び配列番号１７を含む膜貫通部が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドには、配列番号２を含む免疫グロブリン重鎖定常領域及び配列番号１３を含む膜貫通部が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドには、配列番号２を含む免疫グロブリン重鎖定常領域及び配列番号１５を含む膜貫通部が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドには、配列番号４を含む免疫グロブリン重鎖定常領域及び配列番号１６を含む膜貫通部が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドには、配列番号４を含む免疫グロブリン及び配列番号１７を含む膜貫通部が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドには、配列番号４を含む免疫グロブリン重鎖定常領域及び配列番号１３を含む膜貫通部が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドには、配列番号４を含む免疫グロブリン重鎖定常領域及び配列番号１５を含む膜貫通部が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドには、配列番号６を含む免疫グロブリン重鎖定常領域及び配列番号１６を含む膜貫通部が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドには、配列番号６を含む免疫グロブリン重鎖定常領域及び配列番号１７を含む膜貫通部が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドには、配列番号６を含む免疫グロブリン重鎖定常領域及び配列番号１３を含む膜貫通部が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドには、配列番号６を含む免疫グロブリン重鎖定常領域及び配列番号１５を含む膜貫通部が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドには、配列番号８を含む免疫グロブリン重鎖定常領域及び配列番号１６を含む膜貫通部が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドには、配列番号８を含む免疫グロブリン重鎖定常領域及び配列番号１７を含む膜貫通部が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドには、配列番号８を含む免疫グロブリン重鎖定常領域及び配列番号１３を含む膜貫通部が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドには、配列番号８を含む免疫グロブリン重鎖定常領域及び配列番号１５を含む膜貫通部が含まれる。
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、又は配列番号８に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、又は配列番号１７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。ある実施形態では、ポリペプチドには、配列番号２、配列番号４、配列番号６、又は配列番号８に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、又は配列番号１７に対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドには、配列番号２に対して少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号１４又は配列番号１５に対して少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドには、配列番号４に対して少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸、及び配列番号１４又は配列番号１５に対して少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドには、配列番号６に対して少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸、及び配列番号１４又は配列番号１５に対して少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドには、配列番号８に対して少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸、及び配列番号１４又は配列番号１５に対して少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列が含まれる。
ある実施形態では、ポリペプチドには、配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号２８に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列が含まれる。ある実施形態では、ポリペプチドには、配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号２８に対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列が含まれる。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号２８を含むポリペプチドを提供する。
本発明のポリペプチド類には、タンパク質の輸送を指示するシグナル配列が含まれる。シグナル配列（シグナルペプチド又はリーダー配列とも称される）は、初期ポリペプチドのＮ末端に位置している。それらは、小胞体に対するポリペプチドを標的とし、タンパク質は、目的地、例えば、細胞小器官の内空、内膜、細胞の外膜、又は細胞分泌物等の目的地別に分別される。シグナル配列の多くは、タンパク質が小胞体に輸送された後に、シグナルペプチダーゼによりタンパク質から切断される。シグナル配列のポリペプチドからの切断は、通常アミノ酸配列の特定の部位において発生し、またシグナル配列内のアミノ酸残基に依存する。通常は、１つの特定の切断部位が存在するが、２つ以上の切断部位が、シグナルペプチダーゼにより認識及び／又は使用されることもあり、その結果、ポリペプチドのＮ末端が不相同となる。例えば、シグナル配列内の異なる切断部位を利用することで、その結果、異なるＮ末端アミノ酸で発現されるポリペプチドが生成され得る。従って、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドには、異なるＮ末端を有するポリペプチドの混合物が含まれてもよい。いくつかの実施形態では、Ｎ末端の長さは、アミノ酸が１個、２個、３個、４個、又は５個であることにより異なる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは実質的に相同、すなわち、ポリペプチドが同じＮ末端を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドシグナル配列には、１又はそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０等）アミノ酸置換及び／又は欠失が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのシグナル配列には、１つの切断部位が優位となるようにすることができ、よって１種類のＮ末端を有する実質的に相同なポリペプチドを生じる、アミノ酸置換及び／又は欠失が含まれる。シグナルペプチダーゼ切断部位を予測する様々なアルゴリズム及びソフトウェアは、当技術分野において知られており、また一般に利用可能である（例えば、ＳｉｇｎａｌＰソフトウェア）。
ある実施形態では、ポリペプチドには、配列番号２２、配列番号２３、又は配列番号２６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列が含まれる。ある実施形態では、ポリペプチドには、配列番号２２、配列番号２３、又は配列番号２６に対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列が含まれる。いくつかの実施形態では、（シグナル配列切断前の）ポリペプチドには、配列番号２２、配列番号２３、又は配列番号２６が含まれる。
ある実施形態では、ポリペプチドには、配列番号３０、配列番号３１、又は配列番号３２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列が含まれる。ある実施形態では、ポリペプチドには、配列番号３０、配列番号３１、又は配列番号３２に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドには配列番号３２が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、本質的に配列番号３２から成る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドには配列番号３０が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、本質的に配列番号３０から成る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドには配列番号３１が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは本質的に配列番号３１から成る。あるアミノ酸配列から「本質的に成る」、又はあるアミノ酸配列から「本質的に成っている」ポリペプチドには、１又はそれ以上の（例えば、１、２、３、４又はそれ以上）追加アミノ酸が含まれる。但し、追加アミノ酸は、ポリペプチドの機能に物質的影響を与えない。あるアミノ酸から「本質的に成る」、又はあるアミノ酸から「本質的に成っている」ポリペプチドは、いくつかの実施形態では、１又はそれ以上の（例えば、１、２、３、４又はそれ以上）のアミノ酸により還元されてもよい。但し、欠失アミノ酸は、ポリペプチドの機能に物質的影響を与えない。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の任意のポリペプチドを含む抗体分子を提供する。いくつかの実施形態では、抗体分子はさらに、免疫グロブリン重鎖を含む第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、抗体分子にはさらに免疫グロブリン軽鎖が含まれる。いくつかの実施形態では、抗体分子にはさらに、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を有する単鎖免疫グロブリンを含む第２のポリペプチドが含まれる。ある実施形態では、抗体には、単一の抗体結合部位（すなわち、一価抗体）が含まれる。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の任意のポリペプチドを含むヘテロ二量体分子を提供する。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体分子にはさらに、二量体形成ドメインを含む第２のポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドには免疫グロブリン定常領域が含まれる。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドには免疫グロブリン重鎖が含まれる。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドには免疫グロブリン軽鎖が含まれる。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドには、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を有する単鎖免疫グロブリンが含まれる。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体分子には、単一の抗体結合部位（すなわち、一価抗体）が含まれる。ある実施形態では、本発明は、（ａ）二量体形成ドメインを含む細胞外部分、及び膜貫通部を含んだ第１のポリペプチド、並びに（ｂ）二量体形成ドメインを含む第２のポリペプチドの両者を含んだヘテロ二量体分子を提供する。ある実施形態では、第１及び第２の二量体形成ドメインは同じである。ある実施形態では、第１及び第２の二量体形成ドメインは異なる。
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体分子には、（ａ）（ｉ）第１の二量体形成ドメインを含む細胞外部分及び（ｉｉ）膜貫通部の両者を含んだ第１のポリペプチド、並びに（ｂ）第２の二量体形成ドメインを含む第２のポリペプチドの両者が含まれる。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体分子には、免疫グロブリン定常領域を有する第１の二量体形成ドメインが含まれる。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体分子には、免疫グロブリン重鎖定常領域である第１の二量体形成ドメインが含まれる。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体分子には、免疫グロブリン定常領域である第２の二量体形成ドメインが含まれる。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体分子には、免疫グロブリン重鎖定常領域である第２の二量体形成ドメインが含まれる。ある実施形態では、ヘテロ二量体分子には、本明細書に記載の任意のポリペプチドを含む第１のポリペプチドが含まれる。
本明細書に記載のポリペプチドは、当技術分野で知られている好適な任意の方法により生成され得る。係る方法は、直接タンパク質合成法からポリペプチド配列をコードするＤＮＡ配列の構成及び好適な宿主における配列の発現にまで及ぶ。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ配列は、対象のワイルドタイプタンパク質をコードするＤＮＡ配列を単離又は合成することにより、組換え技術を使って構成され得る。任意選択的に、配列を部位特異的変異誘発により変異誘発させ、その機能変異体を提供することもできる。
いくつかの実施形態では、対象のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成機を用いて化学合成により構成してもよい。オリゴヌクレオチド類は、所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づき、また対象の組換えポリペプチドが生成される宿主において好まれるコドンを選択することにより設計され得る。標準方法を適用して、対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を合成することができる。例えば、完全アミノ酸配列を利用して、逆翻訳された遺伝子を構成することができる。いくつかの実施形態では、特定のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡオリゴマーを合成することができる。例えば、所望のポリペプチドの部分をコードする複数の小オリゴヌクレオチドを合成し、その後結紮することができる。個別オリゴヌクレオチドは、典型的には、相補的集合の５'又は３'オーバーハングを含んでいる。
（組み換え技術、化学合成、又はその他の方法により）いったん集合すると、対象の特定のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、発現ベクターに挿入され、所望の宿主におけるポリペプチドの発現に適切な発現制御配列に作動可能に連結され得る。ヌクレオチド配列、マッピング制限、及び／又は好適な宿主における生物活性ポリペプチドの発現により、妥当な集合であることが確認され得る。当技術分野において知られているように、宿主の形質移入遺伝子の高度な発現レベルを得るためには、遺伝子は、選択された発現宿主において機能的な転写及び翻訳発現制御配列に作動可能に連結されていなければならない。
ある実施形態では、組換え発現ベクターは、本明細書に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡを増幅及び発現するために使用される。例えば、組換え発現ベクターは、ポリペプチドをコードし、哺乳類、微生物、ウイルス又は昆虫遺伝子由来の好適な転写又は翻訳制御要素と作動可能に連結している合成的又はｃＤＮＡ由来のＤＮＡ断片を有する複写可能なＤＮＡコンストラクトであり得る。転写ユニットには、通常、（１）遺伝子発現の役割を担う制御要素又は要素類、例えば、転写プロモーター及び／又はエンハンサー、（２）ｍＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳される構造的配列又はコード配列、及び（３）適切な転写及び翻訳開始配列及び終了配列の集合が含まれる。制御要素には、転写を制御するためのオペレーター配列が含まれ得る。通常は、複写元が与える宿主における複写能力、及び形質転換体の認識を促進するための選択遺伝子を追加的に組み入れることもできる。ＤＮＡ領域は、互いに機能的に関連している場合、「作動可能に連結されて」いる。例えば、単一のペプチド（分泌リーダー）に対するＤＮＡは、もしポリペプチド分泌に関与する前駆体として発現されるなら、ＤＮＡと作動可能に連結されている。もし配列の転写を制御するならば、プロモーターはコード配列に作動可能に連結している。又は、もし翻訳を許可するよう位置づけられているなら、リボソーム結合部位はコード配列に作動可能に連結されている。酵母発現系での利用を意図された構造的要素には、宿主細胞による翻訳後タンパク質の細胞外分泌を可能とするリーダー配列が含まれる。代替的に、組換えタンパク質がリーダー配列又は輸送配列なしに発現される場合、それにはＮ末端メチオニン残基が含まれ得る。この残基はその後、最終生成物を提供するために、発現組換えタンパク質から任意選択的に切断され得る。
発現ベクター及び制御要素の選択は、宿主の選択に依存する。多様な発現宿主／ベクター組換えを利用することが可能である。真核性宿主に有益な発現ベクターには、例えば、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス及びサイトメガロウイルスの発現制御配列を含むベクターが含まれる。バクテリア宿主に有益な発現ベクターには、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９並びにそれらの誘導体を含む大腸菌由来のプラスミド等の既知のバクテリアプラスミド、及びＭ１３並びに他の繊維状一本鎖ＤＮＡファージ等のより広範な宿主のプラスミドが含まれる。
真核性宿主の発現ベクターの中には、宿主ゲノムに統合される能力を有するものもあり、また、真核性宿主の発現ベクターの中には、染色体外存在物として核に固着するものもある。いくつかの実施形態では、エピソームベクターには、１細胞につき複数の複製を形質移入し、その結果、対象のポリヌクレオチドは高度に発現し、及び／又は形質移入はより効率的となる等の利点がある。
本明細書に記載のポリペプチドの発現に好適な宿主細胞には、適切なプロモーターの制御下にある原核生物、酵母、又は昆虫や高等真核細胞が含まれる。原核生物には、グラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば、大腸菌又は桿菌が含まれる。より高度な真核性細胞には、下記の哺乳動物由来の樹立細胞株が含まれる。無細胞翻訳系を利用することも可能である。
様々な哺乳動物又は昆虫細胞の培養系を利用して、組換えポリペプチドを発現させる。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞の組換えタンパク質の発現が好まれる。なぜなら、係るタンパク質は通常正しく折りたたまれ、適切に修飾され、完全に機能的であるからだ。好適な哺乳動物宿主細胞株の例として、ＣＯＳ−７（サル腎臓由来）、Ｌ−９２９（マウス線維芽細胞由来）、Ｃ１２７（マウス乳腺腫瘍由来）、３Ｔ３（マウス線維芽細胞由来）、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣由来）、ＨＥＫ−２９３（ヒト胎児腎臓由来）、ＨｅＬａ細胞（ヒト癌由来の子宮頸部）及びＢＨＫ（ハムスター腎線維芽細胞由来）細胞株が含まれるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、細胞株の変異体を使用してもよい。例えば、２９３Ｔ細胞は、ＳＶ４０複製起点を含む形質移入されたプラスミドのエピソーム複製を可能にする、ＳＶ４０ラージＴ−抗原を発現するＨＥＫ−２９３細胞である。哺乳動物の発現ベクターには、複製起点、発現する遺伝子に接続する好適なプロモーター及びエンハンサー、並びに他の５'又は３'隣接の非転写配列等の非転写要素、並びに、必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、並びに転写終結配列等の５'又は３'非翻訳配列が含まれる。いくつかの実施形態では、バキュロウイルス系が、昆虫細胞における異種タンパク質の生成に使用される。これら方法及び技法は当業者の間で周知である（例えば、ＬｕｃｋｏｗとＳｕｍｍｅｒｓ、１９８８、バイオテクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、６：４７を参照のこと）。
ある実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは単離されている。ある実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは実質的に純粋である。
宿主細胞により発現させられるタンパク質は、任意の好適な方法に従って生成され得る。係る方法には、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティカラムクロマトグラフィー、サイズ排除カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、又は任意のその他の標準的なタンパク質精製技術が含まれる。ヘキサ−ヒスチジン、マルトース結合ドメイン、インフルエンザコート配列及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ等の親和性タグは、適切なアフィニティーカラムに通すことによって容易に精製できるタンパク質に結合し得る。単離されたタンパク質はまた、タンパク質分解、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、核磁気共鳴及びＸ線結晶構造解析等の技法を用いて物理的に特徴付けることができる。
いくつかの実施形態では、組換えタンパク質を培養培地に分泌する発現系の上清は、まず、市販のタンパク質濃縮度フィルタ、例えば、アミコン又はミリポア社製Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを用いて濃縮することができる。濃縮工程に続いて、濃縮物を好適な精製マトリックスに適用させることができる。いくつかの実施形態では、陰イオン交換樹脂、例えば、ペンダントジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックス又は基質を用いることができる。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、又はその他一般的にタンパク質精製に用いられるタイプであり得る。いくつかの実施形態では、陽イオン交換ステップを用いることができる。好適な陽イオン交換体には、スルホプロピル基又はカルボキシメチル基を含む様々な不溶性マトリックスが含まれる。いくつかの実施形態では、セラミックハイドロキシアパタイト等のハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）媒体を利用することもできるがこれに限定されない。いくつかの実施形態では、疎水性のＲＰ−ＨＰＬＣ媒体、例えば、ペンダントメチル又は他の脂肪族基を有するシリカゲルを利用した、１つ又は複数の逆相ＨＰＬＣステップを、タンパク質をさらに精製するために用いることができる。上記の精製手順の一部又は全てを様々な組み合わせで利用し、均一な組換えタンパク質を提供することができる。
ある実施形態では、本発明は、免疫グロブリン重鎖定常領域及び膜貫通部を含んだポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。ある実施形態では、本発明は、免疫グロブリン重鎖定常領域及びＧＰＩ膜部分を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という表現には、ポリペプチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチド、並びに追加のコード配列及び／又は非コード配列を含むポリヌクレオチドが包含される。本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ形式又はＤＮＡ形式であり得る。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡが含まれ、二本鎖又は一本鎖であり得、及び一本鎖であれば、コード鎖又は非コード（アンチセンス）鎖であり得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドには、配列番号１０を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドには、配列番号１２を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドには、配列番号２８を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドには、配列番号２２、配列番号２３、又は配列番号２６を含むポリペプチドを（シグナル配列有り又は無しで）コードするポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドには、配列番号３０を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドには、配列番号３１を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドには、配列番号３２を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドには、配列番号３０のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドには、配列番号３１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドには、配列番号３２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。
いくつかの実施形態では、いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドには、配列番号９、配列番号１１、又は配列番号２９のポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドには、配列番号２４、配列番号２５、又は配列番号２７のポリヌクレオチドが含まれる。ある実施形態では、ポリヌクレオチドには、配列番号９、配列番号１１、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、又は配列番号２９のポリヌクレオチドに対して、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、及びいくつかの実施形態では、少なくとも９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する配列を持つポリヌクレオチドが含まれる。
また、配列番号９、配列番号１１、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、又は配列番号２９に対しハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションは、高度ストリンジェンシー条件下で行われる。
ある実施形態では、ポリヌクレオチドには、例えば、宿主細胞由来のポリペプチドの発現及び／又は分泌を支援するポリヌクレオチドに対する同じ読み枠で融合された成熟ポリペプチドのコード配列が含まれる。例えば、リーダー又はシグナル配列は、細胞表面へのポリペプチド輸送制御の配列として機能し、もしポリペプチドが分泌タンパク質であるなら、細胞からの分泌物として機能する。リーダー配列（又はシグナル配列）を有するポリペプチドはプレタンパク質であり、ポリペプチドの成熟形態を生成するために宿主細胞により切断されたリーダー配列を有する。ポリヌクレオチドはまた、成熟タンパク質に加え、追加の５'アミノ酸残基であるプロタンパク質をコードすることができる。プロ配列を有する成熟タンパク質がプロタンパク質であり、タンパク質の不活性形態である。いったんプロ配列が切断されると、活性成熟タンパク質が残る。
ある実施形態では、ポリヌクレオチドには、例えば、発現ポリペプチドの精製及び／又は同定を可能にするマーカー又はタグ配列と同じ読み枠に融合された成熟ポリペプチドのコード配列が含まれる。いくつかの実施形態では、バクテリア宿主が使用される場合、マーカー配列は、成熟ポリペプチドの精製を行うためにｐＱＥ−９ベクターにより供給されるヘキサ−ヒスジンタグであり得る。他の実施形態では、哺乳動物宿主が用いられる場合（例えば、ＣＯＳ−７細胞）マーカー配列は、インフルエンザ血球凝集素タンパク質由来のヘマグルチニン（ＨＡ）タグであり得る。いくつかの実施形態では、マーカー配列は「ＦＬＡＧ」、すなわち、他のアフィニティタグと組み合わせて使用し得るペプチド配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１７）である。
本発明はさらに、例えば、ポリペプチド類の断片、類似体、及び／又は誘導体をコードする前記のポリヌクレオチド類の変異体に関する。
ある実施形態では、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、及びいくつかの実施形態では、少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド類を含むポリヌクレオチド類を提供する。
本明細書で使用する、参照のヌクレオチド配列に対して、例えば、少なくとも９５％「同一性」であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドという表現は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列に対して同一であることを意味するよう意図されている。但し、この場合、ポリヌクレオチド配列には、参照ヌクレオチド配列のヌクレオチド１００個毎に最大５つの点突然変異を含み得るとする。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列に対し少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るとは、参照配列のヌクレオチドの最大５％までは、欠失若しくは他のヌクレオチドとの置換が可能であり、又は参照配列の合計ヌクレオチドのうち最大５％までは参照配列に挿入できるということである。参照配列のこのような突然変異は、参照ヌクレオチド配列の５'末端又は３'末端部又はそれらの間のいずれかで、参照配列のヌクレオチド間で個別に、又は参照配列内の１又はそれ以上の近接基のいずれかに散在して、発生し得る。
ポリヌクレオチド変異体は、コード領域、非コード領域、又はそれら両方にオルタネーションを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド変異体には、「サイレント」置換、挿入又は欠失を生じさせるオルタネーションが含まれるが、コードされたポリペプチドの特性又は活性を変えることはない。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド変異体には、遺伝子コードの縮重のため「サイレント」置換が含まれる。ポリヌクレオチド変異体は、多様な理由により、例えば、特定の宿主のコドン発現を最適化する（例えば、ヒトｍＲＮＡのコドンを大腸菌等のバクテリア宿主に好まれるコドンに変更する）ために生成され得る。
ある実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは単離されている。ある実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、実質的に純粋である。
本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むベクター及び細胞もまた提供される。いくつかの実施形態では、発現ベクターには、ポリヌクレオチド分子が含まれる。いくつかの実施形態では、宿主細胞には、ポリヌクレオチド分子を含む発現ベクターが含まれる。いくつかの実施形態では、宿主細胞には、ポリヌクレオチド分子が含まれる。いくつかの実施形態では、宿主細胞には、ポリヌクレオチド分子によりコードされたポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ポリヌクレオチド分子によりコードされたポリペプチドを生成する。
ＩＩＩ．細胞
本発明はまた、本明細書に記載のポリペプチドを発現する細胞を提供し、細胞を生成する方法を提供する。本明細書に記載の細胞を作るために使用される細胞（例えば、宿主細胞）には、全哺乳動物の細胞、細胞株及び細胞培養が含まれる。いくつかの実施形態では、細胞は、マウス、ラット若しくはその他の齧歯動物、又はヒト若しくはサル等の霊長類由来である。いくつかの実施形態では、細胞はマウスの細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はヒトの細胞である。他の実施形態では、細胞は哺乳動物の生殖細胞又は全身細胞である。他の実施形態では、細胞は初代細胞培養又は不死化細胞株である。哺乳動物の細胞は、典型的には細胞培養で成長させられる。いくつかの実施形態では、細胞は堅い表面に付着する。他の実施形態では、細胞は懸濁液中で成長させられる。
多様な宿主細胞に関して、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド及び／又はベクターで形質移入してもよい。いくつかの実施形態では、細胞は、ＳＰ２／０、ＳＰ２／０−Ａｇｌ４、ＮＳ／０、ＹＢ２／０、Ｋ６Ｈ６／Ｂ５、ＮＳ−１、ＦＯ、Ｙ３／Ａｇ１．２．３、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、他の骨髄腫、ハイブリドーマ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）、ＣＶ−１細胞、３Ｔ３細胞、Ｌ細胞、ＴＣ７細胞、及びヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ−２９３と２９３Ｔ）を含むがこれに限定されない、不死化真核細胞となる。いくつかの実施形態では、細胞は、融合パートナー細胞株として知られている。いくつかの実施形態では、細胞は、効率的に融合し、抗体の高度発現を支援し、及び選択媒体に対して感受的である、不死化細胞株である。これらの細胞株には、Ｓｐ２／０、ＳＰ２／０−Ａｇｌ４、ＹＢ２／０、Ｋ６Ｈ６／Ｂ５、ＮＳ−１、ＦＯ、Ｙ３／Ａｇ１．２．３、及びＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３が含まれ得るが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、細胞は免疫グロブリンを発現しない骨髄腫である。いくつかの実施形態では、細胞は、ハイブリドーマ又はハイブリドーマライブラリーである。ある実施形態では、細胞はヒト細胞である。ある実施形態では、細胞は、ＨＥＫ−２９３細胞又はその変異体（例えば、２９３Ｔ細胞）である。ある実施形態では、細胞はＣＨＯ細胞である。ある実施形態では、細胞はマウス細胞である。ある実施形態では、細胞はＳＰ２／０又はその変異体（例えば、ＳＰ２／０−Ａｇ１４）である。
本発明のポリペプチドを発現する細胞は、当業者に知られている多様な方法により製造してもよい。本明細書に記載のポリヌクレオチド、ベクター及び／又はコンストラクトは、多様な方法により好適な宿主細胞に導入してもよい。一般に、本発明のポリペプチドを発現する哺乳動物細胞を得るためには、ベクターによる形質移入又は感染が用いられる。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、形質移入により細胞に導入される。いくつかの実施形態では、形質移入は一時的発現であり、通常は限られた期間に形質移入されたポリペプチドを発現する。他の実施形態では、形質移入は安定的な形質移入であり、形質移入されたポリペプチドを恒常的に発現する。いくつかの実施形態では、安定的な形質移入は、インプットＤＮＡの細胞ゲノムへの統合に付随する。いくつかの実施形態では、安定的な形質移入は、インプットＤＮＡのエピソーム維持及び複製を生じさせる。
ＤＮＡは、従来の形質移入の技法により真核性細胞に導入され得る。「形質移入」という用語は、当業者の間で周知の、宿主細胞に異質なポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）を導入するための多様な技法を指している。これら技法には、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、及びマイクロインジェクションが含まれるが、これに限定されない。宿主を形質移入するこれらの方法及びその他の方法については、多くの標準的研究マニュアルに記載されている。いくつかの実施形態では、細胞は、
リポソーム媒介トランスフェクション、又は「リポフェクション」を用いて、形質移入することができる。リポフェクションは、脂質ベースの形質移入技術であり、核酸が脂質ベースの形質移入試薬と結合し、その結果、核酸を凝縮し保護する。リポフェクションの主な長所は、高度な効率性、全てのタイプの核酸を広範囲の細胞タイプに形質移入し得る能力、使用の容易性、再現性及び低い毒性である。さらに、リポフェクションには、一時的形質移入、安定的形質移入、同時形質移入、連続的形質移入、又は複数の形質移入が含まれるが、これに限定されない全ての形質移入の適用に適している。
いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載のポリペプチドを発現するポリヌクレオチドで安定的に形質移入される。哺乳類動物細胞の安定的形質移入に関しては、使用される発現ベクター及び形質移入技術次第では、ＤＮＡをゲノムに統合するのは細胞の小断片のみである場合がある。哺乳動物細胞をエピソームベクターで形質移入すれば、細胞のより大きな断片であってもＤＮＡを組み入れ、維持するかもしれない。これら細胞を同定し、選択するために、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質耐性）をコードする遺伝子は、通常、対象の遺伝子（複数を含む）と共に、宿主細胞に導入される。様々な選択可能なマーカーには、Ｇ４１８、ハイグロマイシン及びメトトレキサート等の薬剤への耐性を与えるものが含まれる。選択可能なマーカーをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドをコードするのと同じベクターで宿主細胞に導入され得るか、又は別のベクターで導入され得る。導入されたポリヌクレオチドで安定的に形質移入された細胞は、薬剤選択により同定され得る（例えば、選択可能なマーカーの遺伝子を組み入れた細胞は生存するが、一方で、他の細胞は死滅する）。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ベクターにより細胞に導入される。ベクターは、染色体外要素として独立して複製されてもよく又はされないかもしれない、ビリオン又はウイルス様粒子を収量するウイルスゲノム由来であり得る。所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むビリオン粒子は、感染により宿主細胞の中に導入され得る。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは細胞ゲノムに統合される。哺乳動物細胞の形質転換を導くウイルスベクターには、ＳＶ４０ベクター、及びパピローマウイルス、アデノウイルス、エプスタイン − バーウイルス、ワクシニアウイルス、並びにラウス肉腫ウイルス等のレトロウイルスに基づくベクター、又はモロニーマウス白血病ウイルス等のマウス白血病ウイルスが含まれるが、これに限定されない。
また、本明細書に記載のポリペプチドを発現する細胞を生成する方法が提供される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド又は本明細書に記載のポリペプチドをコードするベクターで細胞を形質移入することが含まれる、細胞産生方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、形質移入された細胞はポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、細胞は一時的に形質移入される。いくつかの実施形態では、細胞は安定的に形質移入される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、細胞のゲノムに統合される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドをコードする形質移入されたポリヌクレオチドは、細胞内で安定的に発現する。他の実施形態では、ポリペプチドは、形質移入された細胞の表面上で発現する。
いくつかの実施形態では、本方法にはさらに、ポリペプチドの発現を検出することが含まれる。形質移入された細胞は、当技術分野において知られている任意の方法により、ポリペプチドの発現をアッセイし得る。使用されるアッセイには、Ｂｉａｃｏｒｅ分析、フローサイトメトリ、ＦＡＣＳ解析、免疫蛍光法、免疫細胞化学、ウェスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、"サンドイッチ"イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体などの技術を使用して、アッセイ、免疫ラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、及びプロテインＡイムノアッセイ等の技法を用いた競争的及び非競争的アッセイ系が含まれるが、これに限定されない。係るアッセイは、当技術分野においては日常的に行われており、周知のことである（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 第１巻、 Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。
いくつかの実施形態では、本方法には、細胞表面上のポリペプチド発現を検出することが含まれる。いくつかの実施形態では、細胞は検出分子と接触する。いくつかの実施形態では、検出分子は、免疫グロブリン重鎖定常領域に対する抗体である。いくつかの実施形態では、検出分子は標識化されている。いくつかの実施形態では、検出分子は、蛍光団又は発色団で標識化されている。いくつかの実施形態では、本方法には、フローサイトメトリを用いたポリペプチドの発現を検出することが含まれる。いくつかの実施形態では、本方法には、フローサイトメトリを用いた検出分子と結合する細胞を同定することが含まれる。本明細書で使用されている「検出分子」という表現には、検出分子集団が含まれるがこれに限定されない。例えば、検出分子は抗体の溶液、又はタンパク質若しくはタンパク質断片の溶液でもよい。同様に、「検出分子により結合された細胞」という表現には、多数の検出分子と結合する細胞が含まれるが、これに限定されない。
フローサイトメトリ及びＦＡＣＳは、当業者の間で知られている技法である。フローサイトメトリは、細胞から特定のマルチパラメータデータを生成させるため、光散乱、蛍光色素分子の光励起及び発光の原則を利用する。１つ１つの細胞がセンシングポイントを介してストリームの中を流れる時、機器が細胞の測定を行う。フローサイトメトリを用いて、蛍光活性化細胞選別又はＦＡＣＳにより細胞集団の精製又は個別細胞の単離を行うことができる。いくつかの実施形態では、細胞は、毎秒１０〜２０，０００個の速さで分析される。いくつかの実施形態では、細胞は、毎秒１，０００〜１０，０００個の速さで分析される。いくつかの実施形態では、細胞は、毎秒１００〜１０００個の速さで分析される。いくつかの実施形態では、約１×１０６〜１×１０８個の細胞が分析される。いくつかの実施形態では、約１×１０６個の細胞が分析される。ある実施形態では、約５×１０６個の細胞が分析される。いくつかの実施形態では、約１×１０７個の細胞が分析される。いくつかの実施形態では、約２．５×１０７個の細胞が分析される。いくつかの実施形態では、細胞は分析され、ソートされる。いくつかの実施形態では、約２．５×１０７個の細胞が、ＦＡＣＳ機器にかけられ、解析され得る。標的細胞を約８つの９６ウェルプレートのウェルにソートし、６００〜７００の個別クローンを単離することは可能である。よって、フローサイトメトリの利用により、大量の細胞を迅速にスクリーニングすることができる。同様に、ＦＡＣＳを利用することで、大量の細胞を検出及びソートすることが可能となり、個別の細胞を迅速に単離することができる。
いくつかの実施形態では、細胞製造法には、本明細書に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はベクターで細胞を形質移入することが含まれる。いくつかの実施形態では、形質移入された細胞は、ポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、本方法には、細胞表面上のポリペプチド発現を検出することが含まれる。いくつかの実施形態では、本方法には、ポリペプチドを発現する細胞を選択することが含まれる。いくつかの実施形態では、細胞は検出分子と接触する。いくつかの実施形態では、検出分子は、免疫グロブリン重鎖定常領域に対する抗体である。いくつかの実施形態では、検出分子は対象の標的（例えば、タンパク質又はその断片）である。いくつかの実施形態では、検出分子は標識化されている。いくつかの実施形態では、検出分子は、蛍光団及び発色団で標識化されている。いくつかの実施形態では、本方法には、フローサイトメトリにより検出分子と結合する細胞を同定することが含まれる。いくつかの実施形態では、本方法には、ＦＡＣＳにより検出分子と結合する細胞を単離することが含まれる。
よって、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は本明細書に記載の任意の方法で生成される。いくつかの実施形態では、細胞には、本明細書に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターが含まれる。いくつかの実施形態では、細胞には、本明細書に記載のポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態では、細胞には、免疫グロブリン重鎖定常領域及び非免疫グロブリン膜貫通部を含んだポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは膜結合性であり、細胞の表面上に発現する。
本発明はまた、ヘテロ二量体分子を生成する細胞を提供する。ヘテロ二量体分子は膜結合性であり、細胞の表面で発現し、細胞から分泌されない。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体分子には、本明細書に記載のポリペプチドが含まれ、さらに少なくとも１つの追加ポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態では、追加ポリペプチドには、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリン重鎖定常領域が含まれる。いくつかの実施形態では、追加ポリペプチドには、免疫グロブリンＦｃ領域が含まれる。いくつかの実施形態では、追加のポリペプチドには、免疫グロブリン重鎖が含まれる。ある実施形態では、少なくとも１つの追加ポリペプチドには、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖が含まれる。ある実施形態では、少なくとも１つの追加ポリペプチドには、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を有する単鎖免疫グロブリンが含まれる。いくつかの実施形態では、追加ポリペプチドは抗体である。
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体分子は、共有結合的に第２のポリペプチドと結合する膜結合性ポリペプチドであり、膜結合性ポリペプチドには、（ａ）免疫グロブリン重鎖定常領域、及び（ｂ）膜貫通部が含まれる。いくつかの実施形態では、膜結合性ポリペプチドは、ジスルフィド結合を形成することにより第２のポリペプチドと結合する。いくつかの実施形態では、膜結合性ポリペプチドは、第２のポリペプチドと少なくとも１つのジスルフィド結合を形成し、ヘテロ二量体分子を形成する。
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体分子は免疫グロブリン重鎖と共有結合的に結合する膜結合性ポリペプチドであり、膜結合性ポリペプチドには、（ａ）免疫グロブリン重鎖定常領域、及び（ｂ）膜貫通部が含まれる。いくつかの実施形態では、膜結合性ポリペプチドは、ジスルフィド結合を形成することにより免疫グロブリン重鎖と結合する。いくつかの実施形態では、膜結合性ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖と少なくとも１つのジスルフィド結合を形成する。いくつかの実施形態では、重鎖可変領域と軽鎖可変領域が単一の抗原結合部位を形成するよう、免疫グロブリン重鎖は免疫グロブリン軽鎖とペアになる。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン重鎖は、免疫グロブリン重鎖と免疫グロブリン軽鎖双方を有する単一の免疫グロブリンの一部である。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体分子は、一価の抗体分子である。いくつかの実施形態では、細胞表面上に発現するヘテロ二量体分子は、分泌抗体と結合しない。
よって、いくつかの実施形態では、細胞には、（ａ）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリン重鎖定常領域及び非免疫グロブリン膜貫通部の両者を含んだポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び（ｂ）少なくとも１つの追加ポリペプチドをコードする少なくとも１つの追加ポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加ポリペプチドには、免疫グロブリン重鎖、及び／又は免疫グロブリン軽鎖が含まれる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加ポリペプチドには、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を有する単鎖免疫グロブリンが含まれる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加ポリペプチドは抗体である。いくつかの実施形態では、追加ポリペプチドは、細胞から分泌され得る抗体である。ある実施形態では、細胞の表面に発現する本発明のポリペプチド類は、分泌抗体と結合しない。
本発明はまた、本明細書に記載のポリペプチド及び／又はヘテロ二量体分子を発現するハイブリドーマ細胞及びハイブリドーマ製造方法を提供する。いくつかの実施形態では、ハイブリドーマ細胞の製造方法には、本発明のポリペプチドを発現する細胞を抗体産生細胞と融合させることが含まれる。いくつかの実施形態では、融合されたハイブリドーマ細胞は、細胞表面上にヘテロ二量体抗体分子を発現する。抗体産生細胞は、Ｂ細胞、プラズマ細胞、骨髄腫、ハイブリドーマ、及び組換え細胞を含むがこれに限定されない、抗体分子を生成することができる、又は生成している任意の細胞である。いくつかの実施形態では、抗体産生細胞により、細胞が発現するポリペプチドでヘテロ二量体分子を形成する免疫グロブリン重鎖が融合細胞に寄与することとなる。いくつかの実施形態では、抗体産生細胞により、抗原結合部位を形成するために免疫グロブリン重鎖と結合する免疫グロブリン軽鎖が融合細胞に寄与することとなる。いくつかの実施形態では、抗体産生細胞により、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を有し、発現するポリペプチドでヘテロ二量体分子を形成する単鎖免疫グロブリンが、融合細胞に寄与することとなる。いくつかの実施形態では、抗体産生細胞はマウス細胞である。いくつかの実施形態では、抗体産生細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、抗体産生細胞は、抗体産生細胞集団である。いくつかの実施形態では、抗体産生細胞は、免疫化動物から単離された細胞である。いくつかの実施形態では、抗体産生細胞は、未処理動物から単離された細胞である。他の実施形態では、抗体産生細胞には、複数のポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、複数のポリヌクレオチドは、免疫グロブリン重鎖を含む複数のポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、複数のポリヌクレオチドは免疫グロブリン軽鎖を含む複数のポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、複数のポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を有する単鎖免疫グロブリンを含む複数のポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、複数のポリペプチドには、ＤＮＡライブラリーが含まれる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡライブラリーは、免疫化動物の細胞から生成される。他の実施形態では、ＤＮＡライブラリーは、未処理ライブラリーである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡライブラリーは、ｃＤＮＡライブラリーである。いくつかの実施形態では、本方法により、複数のヘテロ二量体抗体分子を発現するハイブリドーマ細胞集団（例えば、ライブラリー）が製造される。本明細書に記載の方法により製造されるハイブリドーマ又はハイブリドーマライブラリーもまた提供される。
本発明はまた、本明細書に記載のポリペプチドを含むヘテロ二量体分子を発現する細胞ライブラリーの製造方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞ライブラリーの製造方法には、複数のポリペプチドをコードする複数のポリヌクレオチドで、本発明のポリペプチドを発現する細胞を形質移入することが含まれる。いくつかの実施形態では、形質移入された細胞はヘテロ二量体分子を発現する。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体分子は、形質移入された細胞の表面上に発現する。いくつかの実施形態では、複数のポリヌクレオチドが、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリン重鎖定常領域を含む複数のポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、複数のポリヌクレオチドは、免疫グロブリンＦｃ領域を含む複数のポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、複数のポリヌクレオチドは、免疫グロブリン重鎖を含む複数のポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、複数のポリヌクレオチドが、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を含む複数のポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、複数のポリヌクレオチドが、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を有する単鎖免疫グロブリンを含む複数のポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、複数のポリヌクレオチドが、複数のポリペプチドをコードし、各ポリペプチドには、（ａ）免疫グロブリンＦｃ領域、及び（ｂ）無作為抽出ポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態では、複数のポリヌクレオチドにはＤＮＡライブラリーが含まれる、いくつかの実施形態では、ＤＮＡライブラリーは、免疫化動物の細胞から生成される。他の実施形態では、ＤＮＡライブラリーは、未処理動物の細胞から生成される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡライブラリーは未処理ライブラリーである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡライブラリーは、ｃＤＮＡライブラリーである。ある実施形態では、ＤＮＡライブラリーは、無作為抽出ポリペプチドライブラリーをコードする。本明細書に記載の任意の方法により作られる細胞ライブラリーもまた提供される。
本発明はまた、本発明の新規ポリペプチドを発現する細胞を提供し、また抗体を生成する。本発明のポリペプチド、抗体、及び／又は本明細書に記載のヘテロ二量体分子を発現するこれら細胞の製造方法もまた提供される。いくつかの実施形態では、抗体産生細胞は、本明細書に記載の任意の新規ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質移入される。いくつかの実施形態では、形質移入された細胞は、細胞表面上にヘテロ二量体分子を発現する。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体分子にはポリペプチド及び免疫グロブリン重鎖が含まれる。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン重鎖は免疫グロブリン軽鎖と結合し、単一の抗原結合部位を形成する。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン重鎖は単鎖免疫グロブリンの一部である。いくつかの実施形態では、抗体産生細胞はハイブリドーマライブラリーである。いくつかの実施形態では、抗体産生細胞はハイブリドーマである。
本発明はまた、本明細書に記載の新規ポリペプチドを含む細胞ライブラリーを提供する。いくつかの実施形態では、細胞ライブラリーの各細胞には、（ａ）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリン重鎖定常領域及び膜貫通部の両者を含んだ第１のポリペプチド、並びに（ｂ）免疫グロブリン重鎖を含む第２のポリペプチドが含まれ、これら２つのポリペプチドはヘテロ二量体分子を形成することができる。いくつかの実施形態では、これら２つのポリペプチドは、共有結合的に結ばれている。いくつかの実施形態では、これら２つのポリペプチドは、少なくとも１つのジスルフィド結合を形成する。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体分子は細胞表面上で結合する。いくつかの実施形態では、各細胞はさらに免疫グロブリン軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドは単鎖免疫グロブリンである。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体分子は単一の抗原結合部位を含む。
本発明はまた、抗体ではないポリペプチドを同定及び／又は選択する方法を提供する。ポリペプチドには、細胞表面受容体若しくはその断片、可溶性受容体又はその断片、細胞表面リガンド又はその断片、及び可溶性リガンド又はその断片が含まれるが、これに限定されない。ポリペプチドは、タンパク質が変異誘発したもの又は誘導体化したものが含まれ得る。ポリペプチドには、無作為抽出ポリペプチド、例えば、無作為抽出されたポリペプチドライブラリーが含まれ得る。
いくつかの実施形態では、細胞ライブラリーの各細胞には、（ａ）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリン重鎖定常領域を含む第１のポリペプチド、及び（ｂ）第２のポリペプチドが含まれる。ある実施形態では、これら２つのポリペプチドが共有結合的につながる。いくつかの実施形態では、これら２つのポリペプチドは、少なくとも１つのジスルフィド結合を形成する。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドには、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリン重鎖定常領域が含まれ、これら２つのポリペプチドはヘテロ二量体分子を形成することができる。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドには、免疫グロブリンＦｃ領域が含まれる、いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドには、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を有する単鎖免疫グロブリンが含まれる。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドには、無作為抽出ポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドには、（ａ）免疫グロブリンＦｃ領域及び（Ｂ）無作為抽出ポリペプチドが含まれる。
無作為抽出ポリペプチド又は無作為ポリペプチドライブラリー（及びそれらをコードするポリヌクレオチド）は、完全に無作為抽出であるか、又は無作為化による偏向を生じているかのいずれかである。ヌクレオチド及び／又はペプチドの化学合成を含むがこれに限定されない、当業者に周知の任意の方法を用いて、無作為抽出ポリペプチド又は無作為ペプチドライブラリ―を生成することができる（例えば、米国特許出願第２００３／０１７０７５３号及び国際出願第ＷＯ ００／２０５７４号を参照のこと）。
本明細書に記載の細胞ライブラリーは、特定のポリペプチドを生成する細胞からスクリーンされ得る。よって、本明細書に記載の細胞ライブラリーを検出分子と接触させることを含む細胞ライブラリーのスクリーニング法も、本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、本方法にはさらに、検出分子と結合する細胞を同定することも含まれる。いくつかの実施形態では、本方法にはさらに、検出分子と結合する細胞を単離することも含まれる。検出分子には、タンパク質、炭水化物、小分子、及びその変異体が含まれるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、検出分子はタンパク質又はその断片である。いくつかの実施形態では、検出分子には対象の抗原が含まれる。いくつかの実施形態では、検出分子は、細胞の細胞表面受容体、抗体、リガンド又はその断片である。いくつかの実施形態では、検出分子は標識化されている。いくつかの実施形態では、検出分子は、蛍光団、発色団又は磁気化合物である。いくつかの実施形態では、検出分子と結合する細胞は、フローサイトメトリにより同定される。いくつかの実施形態では、検出分子と結合する細胞は、ＦＡＣＳにより単離される。
ＩＶ．抗体又はポリペプチドを同定、選択及び／又は単離する方法
対象の抗原に対するモノクロナール抗体を生成するハイブリドーマ細胞の同定は、典型的には、細胞上清のＥＬＩＳＡスクリーニングにより達成される。上清は、単一細胞（制限希釈）クローニング技法により単離される無作為細胞により生成され得る。又は、上清はハイブリドーマライブラリー由来のハイブリドーマ細胞のプールにより生成され得、それにより任意のＥＬＩＳＡポジティブプール由来の細胞は、単一細胞クローニングによりサブクローンされ、単離されなければならない。これらの方法には多くの限界が存在する。まず第一に、ＥＬＩＳＡポジティブクローンを見つけるために、「単一細胞」培養液を含む大量のプレートをスクリーンしなければならない。ハイブリドーマプールスクリーニングの場合、対象のハイブリドーマの純粋クローンを単離するために、各ＥＬＩＳＡポジティブクローンをさらに制限希釈クローンにより分離しなければならない。これら両方法とも非常な労力を要し、時間がかかる。さらに、いくつかの実施形態では、ハイブリドーマライブラリーのうち所望のクローンが占める割合は極端に低く、そのため希少クローンの同定が困難である。その上、ＥＬＩＳＡスクリーニング方式は、単一の抗原への結合活動を同定する。個別ハイブリドーマクローンが、２以上の抗原、複数、連続的ＥＬＩＳＡと結合できるモノクロナール抗体を生成するかどうかを評価する必要がある。
本発明の新規ポリペプチド、細胞、及び細胞ライブラリーは、対象の抗原又は標的に特異的な抗体を生成する細胞を同定及び単離する方法において用いられ得る。いくつかの実施形態では、特異的抗体を生成する細胞を同定する方法には、本明細書に記載の新規ポリペプチドを含む細胞を、ハイブリドーマ細胞集団を生成する抗体産生細胞と融合させることが含まれる。いくつかの実施形態では、ハイブリドーマ細胞は、細胞表面上にヘテロ二量体抗体分子を発現する。いくつかの実施形態では、本方法には、ハイブリドーマ細胞集団を検出分子と接触させることが含まれる。いくつかの実施形態では、本方法には、検出分子と結合するハイブリドーマ細胞を同定することが含まれる。いくつかの実施形態では、本方法には、検出分子と結合する細胞を単離することが含まれる。いくつかの実施形態では、検出分子は対象の標的である。いくつかの実施形態では、検出分子は、タンパク質又はその断片である。いくつかの実施形態では、検出分子は標識化されている。
いくつかの実施形態では、抗体分子を生成するハイブリドーマ細胞は、当業者の間で「パニング」として知られているアフィニティ選択の形式を用いて同定される。細胞を検出分子（例えば、対象の抗原）でインキュベートし、検出分子により同定された細胞を単離する。単離された細胞由来の免疫グロブリンＤＮＡを増幅し、細胞に再導入する。再び細胞を検出分子でインキュベートし、検出分子と結合した細胞を単離する。１又はそれ以上の選択ラウンドにより、対象の標的に対する所望の特異性を有する抗体又はその断片を選択、濃縮することができる。よって、所望の抗体分子を発現する希少細胞を、大量かつ高度に多様化した集団から選択することが可能である。
本明細書に記載の通り、いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドには、ＣＨ２及びＣＨ３を含む免疫グロブリン重鎖定常領域及び膜貫通部の両者が含まれる。ポリペプチドは、抗体産生細胞が発現する免疫グロブリン重鎖−軽鎖のペアと共有結合的に連結し、細胞表面に発現されるヘテロ二量体抗体分子を形成することができる。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体抗体分子は、単一の抗原結合部位を含み及び一価抗体である。個別細胞上にあるヘテロ二量体分子の単一の抗原結合部位は、個別細胞により生成及び分泌された抗体の結合特異性を表している。よって、対象の特異的抗原に結合するヘテロ二量体抗体分子を有する細胞を同定することにより、同じ結合特異性を有する分泌抗体をも生成する細胞の単離が可能となる。
抗体産生細胞は、天然で抗体（例えば、Ｂ細胞）を生成する細胞であろうと、又は、組換え手段（例えば、形質移入された細胞）により抗体を作る細胞であろうと、抗体を産生する細胞であればいかなる細胞であってもよい。よって、いくつかの実施形態では、抗体産生細胞は、Ｂ細胞、プラズマ細胞、骨髄腫、又は組換え細胞である。いくつかの実施形態では、抗体性細胞は、マウス細胞である。いくつかの実施形態では、抗体産生細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、抗体産生細胞は、抗体産生細胞集団である。いくつかの実施形態では、抗体産生細胞は、免疫化動物由来である。いくつかの実施形態では、抗体産生細胞は、未処理動物由来である。
いくつかの実施形態では、抗体産生細胞には、複数のポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、複数のポリヌクレオチドは、免疫グロブリン重鎖を含む複数のポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、複数のポリヌクレオチドは、免疫グロブリン軽鎖をさらに含む複数のポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、複数のポリヌクレオチドは、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を有する単鎖免疫グロブリンを含む複数のポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、複数のポリヌクレオチドには、ＤＮＡライブラリーが含まれる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡライブラリーは、免疫化動物の細胞から生成される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡライブラリーは、未処理動物の細胞から生成される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡライブラリーは、未処理ライブラリーである。他の実施形態では、ＤＮＡライブラリーは、ｃＤＮＡライブラリーである。
本明細書で提供される方法では、抗体産生細胞により生成される抗体のタイプは制限されない。よって、いくつかの実施形態では、抗体産生細胞により作られる抗体は、組換え抗体、モノクロナール抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、又は抗体断片である。いくつかの実施形態では、抗体産生細胞により作られる抗体は、モノ特異的抗体又はマルチ特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）である。いくつかの実施形態では、抗体産生細胞により作られる抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭ抗体又はそのサブタイプである。いくつかの実施形態では、抗体産生細胞により作られる抗体は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２抗体である。いくつかの実施形態では、抗体産生細胞により作られる抗体は、ＩｇＧ２抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はマウス抗体である。いくつかの実施形態では、抗体産生細胞により作られる抗体は、ヒト化抗体である。他の実施形態では、抗体はヒト抗体である。
いくつかの実施形態では、特異的抗体を生成する細胞の同定方法には、少なくとも１つの追加ポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを有する、本明細書に記載の新規のポリペプチドを含む細胞を形質移入することが含まれる。いくつかの実施形態では、形質移入された細胞は、細胞表面上にヘテロ二量体抗体分子を発現する。いくつかの実施形態では、本方法には、形質移入された細胞を検出分子と接触させることが含まれる。いくつかの実施形態では、本方法には、検出分子と結合する形質移入された細胞を同定することが含まれる。いくつかの実施形態では、本方法には、検出分子と結合する細胞を単離することが含まれる。いくつかの実施形態では、検出分子は対象の標的である。いくつかの実施形態では、検出分子は、タンパク質又はその断片である。いくつかの実施形態では、検出分子は標識化されている。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドには、複数のポリペプチドをコードする複数のポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、複数のポリヌクレオチドは、免疫グロブリン重鎖を含む複数のポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、複数のポリヌクレオチドは、免疫グロブリン軽鎖をさらに含む複数のポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、複数のポリヌクレオチドは、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を有する単鎖免疫グロブリンを含む複数及び／又はポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、複数のポリヌクレオチドには、ＤＮＡライブラリーが含まれる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡライブラリーは、免疫化動物の細胞から生成される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡライブラリーは、未処理動物の細胞から生成される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡライブラリーは未処理ライブラリ―である。他の実施形態では、ＤＮＡライブラリ―は、ｃＤＮＡライブラリーである。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、組換え抗体、モノクロナール抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、又はその断片である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、モノ特異的抗体又はマルチ特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）であるポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭ抗体又はそのサブタイプであるポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２抗体であるポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、ＩｇＧ２抗体であるポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、マウス抗体であるポリペプチドをコードする。少なくとも１つのポリヌクレオチドは、ヒト化抗体であるポリペプチドをコードする。他の実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、ヒト抗体であるポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、特異的抗体を生成する細胞の同定方法には、本明細書に記載の任意の新規ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はベクターで、抗体産生細胞を含む細胞ライブラリーを形質移入することが含まれる。いくつかの実施形態では、形質移入された細胞は、細胞表面上にヘテロ二量体抗体分子を発現する。いくつかの実施形態では、本方法には、形質移入された細胞を検出分子に接触させることが含まれる。いくつかの実施形態では、本方法には、検出分子と結合する形質移入された細胞を同定することが含まれる。いくつかの実施形態では、本方法には、検出分子と結合する形質移入された細胞を単離することが含まれる。いくつかの実施形態では、検出分子は対象の標的である。いくつかの実施形態では、検出分子は、タンパク質又はその断片である。いくつかの実施形態では、検出分子は標識化されている。
いくつかの実施形態では、細胞ライブラリーは、Ｂ細胞、プラズマ細胞、ハイブリドーマ、骨髄腫、又は組換え細胞である。いくつかの実施形態では、細胞ライブラリーは、ハイブリドーマライブラリーである。いくつかの実施形態では、細胞ライブラリーにはマウス細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、細胞ライブラリーにはヒト細胞が含まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、特異的抗体を分泌するが、細胞表面上にも分泌抗体の結合特異性を表す単一の抗原結合部位を含む一価のヘテロ二量体抗体分子を発現する、細胞又はハイブリドーマを生成する。このヘテロ二量体抗体分子、従って抗体産生細胞は、検出分子を用いて同定され得る。いくつかの実施形態では、検出分子は対象の抗原である。いくつかの実施形態では、検出分子は、タンパク質又はその断片である。いくつかの実施形態では、検出分子は標識化されている。いくつかの実施形態では、検出分子は、蛍光団、発光団又は磁気化合物で標識化されている。いくつかの実施形態では、検出分子と結合する細胞は、フローサイトメトリで同定される。いくつかの実施形態では、検出分子と結合する細胞は、ＦＡＣＳにより単離される。
本発明の新規ポリペプチド、細胞、及び細胞ライブラリーは、対象の抗原又は標的に特異的な抗体のスクリーニング法で使用され得る。いくつかの実施形態では、特異的抗体のスクリーニング法には、本明細書に記載の細胞又は細胞ライブラリーをスクリーニングすることが含まれる。いくつかの実施形態では、細胞（例えば、細胞ライブラリー）は、細胞表面上にヘテロ二量体分子を発現する。本明細書に記載の通り、細胞表面上に発現するヘテロ二量体分子には、細胞により生成される抗体の結合部位と同じ結合部位が含まれる。いくつかの実施形態では、特異的抗体のスクリーニング法には、細胞を検出分子と接触させることが含まれる。検出分子と結合するヘテロ二量体分子を発現する細胞は、検出分子に特異的な抗体分子を発現する。いくつかの実施形態では、スクリーニング法には、検出分子に結合する細胞を同定することが含まれる。いくつかの実施形態では、スクリーニング法には、検出分子と結合する細胞を単離することが含まれる。いくつかの実施形態では、スクリーニング法には、検出分子と結合する細胞によって生成される抗体を単離することが含まれる。いくつかの実施形態では、検出分子は対象の標的である。いくつかの実施形態では、検出分子はタンパク質又はその断片である。いくつかの実施形態では、検出分子は標識化されている。
いくつかの実施形態では、膜ＭＡｂ技法を用いた特異的抗体のスクリーニングには、増幅後の反復的な選択ラウンドが含まれる。例えば、細胞（例えば、２９３−ｈＭＴ細胞又は２９３Ｔ−ｈＭＴ細胞）は、ライブラリーＤＮＡで形質移入される。任意の１つの形質移入に用いられるＤＮＡの量及び細胞の数は、ライブラリー及び／又はライブラリーの多様性に依存する。いったん形質移入されたら、細胞は、２４〜４８時間インキュベートされ、培養される。その後、細胞を収穫し、洗浄し、標的分子（例えば、対象の抗原）でスクリーンする。スクリーニング分子は、直接標識化される場合もあり、又は標識化された第２の分子により検出される場合もある。標識化された細胞は、当業者に周知の方法、例えば、ＦＡＣＳ又は磁気ビーズを用いることで、解析及び／又はソートされる。ソートされた細胞由来のプラスミドＤＮＡは、抽出され、増幅される。プラスミドＤＮＡは、任意の周知の方法により抽出、精製されてもよい。例えば、フェノール／クロロホルム混合物と、その後エタノール沈殿を用いて、プラスミドＤＮＡを抽出することができる。その後、精製されたプラスミドを用いて、バクテリアを形質転換し、単離されたＤＮＡを増幅することができる。又は、ＤＮＡを細胞から単離し、当業者に周知のＰＣＲ法により特定の領域を増幅してもよい。ＰＣＲ生成物を、バクテリアを形質転換し、プラスミドを増幅するために用いられる宿主プラスミドに戻しサブクローン化する。いずれかの方法を用いて得られた、第１選択から増幅されたライブラリアウトプットを用いて、新鮮な細胞（例えば、２９３−ｈＭＴ又は２９３Ｔ−ｈＭＴ細胞）を形質移入し、その後、同じ標的又は抗原を使って選択ラウンドを実施する。このようにして、対象の標的又は抗原に特異的に結合する抗体集団が濃縮されるまで、複数回の選択ラウンドを行う。
いったんライブラリーが特異的抗体分子集団を濃縮すると、ＤＮＡは単離され、バクテリアを形質転換するために用いられる。単一のコロニーが選ばれ、プラスミドＤＮＡが単離される。可溶性抗体の生成のため、クローンプラスミドを用いて、哺乳動物細胞（例えば、親ＨＥＫ−２９３又は親２９３Ｔ細胞）の形質移入が行われる。その結果得られた抗体は、その後、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ及び／又はＢｉａｃｏｒｅにより所望の標的に特異的に結合するかどうか試験される。
プラスミドで哺乳動物細胞を一時的に形質移入すると、通常は、細胞毎にプラスミドの複製が複数生じる。細胞毎の複製数は、１００〜１０，０００の範囲であり得る。細胞毎の絶対数は、トランスフェクションプロトコル、トランスフェクション試薬、プラスミドの品質、プラスミドのサイズ、及び細胞密度等の多様な要素に依存するが、これに限定されない。細胞表面に表示された抗体のライブラリーを生成するにあたり、細胞内に導入された抗体コードプラスミド（又はＡｂライブラリープラスミド）の量を調節することが望ましい。いくつかの実施形態では、細胞のＡｂライブラリープラスミドのプラスミド複製数を調節するために、別の「担体」プラスミドを使用してもよい。担体プラスミドをＡｂライブラリープラスミドと混ぜ合わせ、利用可能な「プラスミドスペース（ｐｌａｓｍｉｄ ｓｐａｃｅ）」の一部を利用する。よって、いくつかの実施形態では、細胞により利用されるＡｂライブラリープラスミドの数を調節するために、担体プラスミドをＡｂライブラリープラスミドと異なる割合で混ぜ合わせ、その後、細胞に形質移入する。
いくつかの実施形態では、宿主細胞の表面上のポリペプチド発現を調節する方法には、（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ、及び（ｂ）無関係ＤＮＡの過剰量を宿主細胞に形質移入することが含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ヘテロ二量体抗体分子である。よって、いくつかの実施形態では、宿主細胞の表面上のヘテロ二量体抗体分子の発現を調節する方法には、（ａ）ＤＮＡコード免疫グロブリン、及び（ｂ）無関係ＤＮＡの過剰量を宿主細胞に形質移入することが含まれる。いくつかの実施形態では、無関係ＤＮＡに対し免疫グロブリンをコードするＤＮＡの割合は、１：１０〜１：１，０００，０００である。いくつかの実施形態では、無関係ＤＮＡに対し免疫グロブリンをコードするＤＮＡの割合は、１：１０、１：１００、１：１０００、１：１０，０００、１：１００，０００、１：１，０００，０００、又はこれらの間の任意の割合である。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、プラスミドＤＮＡであり、無関係ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡである。いくつかの実施形態では、宿主細胞には、本明細書に記載の任意のポリペプチド又はポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンには、免疫グロブリン重鎖が含まれる。いくつかの実施形態では、抗体には、免疫グロブリン軽鎖が含まれる。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンは、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を有する単鎖抗体分子である。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、ＤＮＡライブラリーである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡライブラリーは、免疫化動物の細胞から生成される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡライブラリーは、未処理動物の細胞から生成される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡライブラリーは、ｃＤＮＡライブラリーである。いくつかの実施形態では、本方法にはさらに、宿主細胞を検出分子と接触させることが含まれる。いくつかの実施形態では、本方法には、検出分子と結合する宿主細胞を同定することが含まれる。いくつかの実施形態では、本方法には、検出分子と結合する宿主細胞を単離することが含まれる。
本発明はまた、本明細書に記載の任意の方法により同定、選択、及び／又は単離された細胞により精製される抗体も提供する。本発明はまた、本明細書に記載の任意の方法により単離された細胞により精製された抗体も提供する。
Ｖ．抗体
本明細書に記載の通り、本発明の新規のポリペプチド及び細胞は、対象の標的（例えば、抗原）を特異的に結合させる抗体を同定、選択及び／又は単離するために用いてもよい。いくつかの実施形態では、細胞表面上に発現するヘテロ二量体抗体分子には、単一の抗原結合部位を形成する免疫グロブリン重鎖−軽鎖のペアが含まれる。単一の抗原結合部位は、細胞により生成、分泌される抗体の抗原結合部位と同一であり、及び／又はそれを表している。
本明細書で提供するポリペプチド、細胞及び方法は、生成する抗体のタイプに制限されない。いくつかの実施形態では、抗体はモノクロナール抗体である。モノクロナール抗体は、当業者に周知のハイブリドーマ法を用いて製造することができる（例えば、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ） ２５６：４９５を参照のこと）。いくつかの実施形態では、マウス、ハムスター、又は他の適切な宿主動物は、関連抗原を複数の皮下注射、腹腔内注射又は静脈内注射により免疫する（例えば、精製されたペプチド断片、全長組換えタンパク質、融合タンパク質等）。抗原は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、又は血清アルブミン等の担体タンパク質に、任意選択的に結合させることができる。抗原は（担体タンパク質の有無に関わらず）、滅菌生理食塩水で希釈され、通常は、安定なエマルジョンを形成するためのアジュバント（例えば、完全又は不完全フロイントアジュバント）と組み合わされる。いくつかの実施形態では、免疫抗原はヒトタンパク質又はその一部であり得る。いくつかの実施形態では、免疫抗原はマウスタンパク質又はその一部であり得る。いくつかの実施形態では、マウスはヒト抗原で免疫化されている。いくつかの実施形態では、マウスはマウス抗原で免疫化されている。いくつかの実施形態では、単離されたリンパ球はｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫化され得る。いくつかの実施形態では、単離されたリンパ球は非特異的に活性化される。いくつかの実施形態では、単離されたリンパ球は、マウスリンパ球である。いくつかの実施形態において、単離されたリンパ球はヒトリンパ球である。
免疫化及び／又は活性化に続き、ハイブリドーマを生成するために、例えば、ポリエチレングリコールを用いて、好適な細胞株でリンパ球を単離及び融合する。ハイブリドーマを生成するために使用される細胞株には、本明細書に記載の新規のポリペプチドを発現する任意の細胞株が含まれてもよい。いくつかの実施形態では、ハイブリドーマ細胞は、当業者の間で知られている特別な媒体を利用して選択する。いくつかの実施形態では、選択された抗原に対抗するモノクロナール抗体を生成するハイブリドーマは、免疫沈降、イムノブロッティング、及びｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイ（例えば、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））等の多様な技法により同定してもよいが、これに限定されない。他の実施形態では、細胞は、本明細書に記載の任意の方法を用いて、ヘテロ二量体抗体分子の一部として細胞表面上に発現する抗原結合部位に基づき直接選択される。ハイブリドーマは、標準的な方法を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ培養で（Ｇｏｄｉｎｇ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社、１９８６）、又は動物の腹水としてｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで増殖することができる。モノクロナール抗体は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析等、当分野における標準的方法に従って、培養培地又は腹水から精製され得るが、これらに限定されない。
代わりに、当業者に知られている組換えＤＮＡ技法を用いて、モノクロナール抗体を製造することもできる（米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）。いくつかの実施形態では、モノクロナール抗体をコードするポリヌクレオチドは、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ等の技法を使って、成熟したＢ細胞又はハイブリドーマ細胞から単離される。単離されたポリヌクレオチドの配列は、従来のシークエンシング技法を使って決定され得る。重鎖及び軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドは、好適な発現ベクターにクローンされ得る。これら発現ベクターは、大腸菌、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ）、又は、別の手段では免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞等の宿主細胞に形質移入される場合、モノクロナール抗体を生成する。いくつかの実施形態では、重鎖及び軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドは、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン及び膜貫通部を含む免疫グロブリン重鎖含有ポリペプチドを発現する、本発明の細胞に形質移入される。
組換えモノクロナール抗体、又はその断片もまた、所望の種のＣＤＲｓを発現するファージディスプレイライブラリーから単離され得る（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３４８：５５２−５５４； Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９１、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３５２：６２４−６２８；及びＭａｒｋｓら、１９９１、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ、２２２：５８１−５９７を参照のこと）。
モノクロナール抗体をコードするポリヌクレオチドをさらに組換えＤＮＡ技法を用いて修飾し、代替抗体を生成することができる。いくつかの実施形態では、例えば、マウスモノクロナール抗体の軽鎖及び重鎖の定常ドメインを、１）例えば、ヒト抗体のこれら領域と置換しキメラ抗体を生成する、又は２）非免疫グロブリンポリペプチドと置換し融合抗体を生成することは可能である。いくつかの実施形態では、定常領域はトランケート又は除去され、モノクロナール抗体の所望の抗体断片を生成する。可変領域の部位特異的又は高密度突然変異誘発を使用して、モノクローナル抗体の特異性、親和性及び／又は他の生物学的特性を最適化することができる。いくつかの実施形態では、ＣＤＲｓの部位特異的な変異誘発を使用して、モノクローナル抗体の特異性、親和性及び／又は生物学的特性を最適化することができる。
いくつかの実施形態では、抗体はヒト化抗体である。典型的に、ヒト化抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲｓ）の残基を、当業者に知られている方法を用いて、所望の特異性、親和性及び／又は機能性を有する非ヒト種（例えば、マウス、ラット、ラビット、ハムスター）のＣＤＲｓの残基で置換したヒト免疫グロブリンである。いくつかの実施形態では、ヒト免疫グロブリンのＦｖ枠組み領域（ＦＲ）残基を、所望の特異性、親和性及び／又は機能性を有する非ヒト免疫グロブリンの相応する枠組み領域残基で置換する。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体はさらに、Ｆｖ枠組み領域において、及び／又は特異性、親和性及び／又は機能性を精錬し、最適化する、置換された非ヒト残基内において、追加の残基置換基で修飾され得る。一般に、ヒト化抗体には、非ヒト免疫グロブリンに相応するＣＤＲｓの全て、又は実質的に全てを含む、少なくとも１つ、典型的には２つ又は３つの可変ドメインの実質的に全てが含まれ、一方で、枠組み領域の全て、又は実質的に全ては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のそれである。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体にはまた、免疫グロブリン定常領域又はドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれが含まれる。ある実施形態では、係るヒト化抗体は治療的に利用される。その理由は、ヒト対象に投与する時、抗原性及びＨＡＭＡ（ヒト抗マウス抗体）反応を低下させる場合があるためである。当業者であれば、既知の技法に従って、免疫原性の低下した機能性ヒト化抗体を得ることができる（例えば、米国特許第５，２２５，５３９号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、及び第５，６９３，７６２号を参照のこと）。
ある実施形態では、抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で知られている様々な技法を使って直接製造することができる。標的抗原に対抗する抗体を生成する、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫化された又は免疫化された個体から単離された、不死化ヒトＢリンパ球を生成することが可能である。代わりに、ヒト抗体を、ヒト抗体を発現するファージライブラリから選択することもできる（例えば、Ｖａｕｇｈａｎら、１９９６、ネイチャー バイオテクノロジー（Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．）、１４：３０９−３１４； Ｓｈｅｅｔｓら、１９９８，米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ）、９５：６１５７−６１６２； ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍとＷｉｎｔｅｒ， １９９１、分子生物学誌（Ｊ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ）、２２７：３８１；及びＭａｒｋｓら、１９９１、分子生物学誌（Ｊ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ）、２２２：５８１を参照のこと）。抗体ファージライブラリの生成及び利用の技法についてはまた、米国特許第５，９６９，１０８号、第６，１７２，１９７号、第５，８８５，７９３号、第６，５２１，４０４号、第６，５４４，７３１、第６，５５５，３１３号、第６，５８２，９１５号、第６，５９３，０８１号、第６，３００，０６４号、第６，６５３，０６８号、第６，７０６，４８４号、及び第７，２６４，９６３号、並びにＲｏｔｈｅら、２００８、分子生物学誌（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏ．）、３７６：１１８２−１２００に記載されている。親和性成熟戦略及び鎖シャッフリング戦略については、当技術分野で知られており、これらを高度親和性ヒト抗体を生成するために利用してもよい（Ｍａｒｋｓら、 １９９２、バイオテクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１０：７７９−７８３）。
ヒト抗体はまた、予防接種時に、内因性免疫グロブリン産生不在下でヒト抗体の全レパートリーを生成できる、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニックマウスで製造され得る。この方式は、米国特許第５，５４５，８０７号、第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、及び第５，６６１，０１６号に記載されている。
ある実施形態では、抗体は二重特異的抗体である。二重特異的抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープを特異的に認識し、結合することができる。異なるエピトープは、同じ分子内か、また異なる分子上のいずれかに存在し得る。ある実施形態では、抗体は、第１抗原標的を発現する細胞に対する細胞防衛メカニズムに集中するため、白血球上のエフェクター分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、又はＢ７）、又はＦｃ受容体（例えば、ＣＤ６４、ＣＤ３２、又はＣＤ１６）等の第１抗原標的並びに第２抗原標的を特異的に認識し、結合する。いくつかの実施形態では、抗体を用いて、細胞傷害性薬物を特定の標的抗原を発現する細胞に向かわせることができる。これらの抗体は、抗原結合アーム、及び細胞傷害性薬物又はＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、若しくはＴＥＴＡ等の放射性核種のキレート剤を保有する。
二重特異性抗体の製造技法は、当業者の間で知られており、例えば、Ｍｉｌｌｓｔｅｍら、１９８３、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３０５：５３７−５３９；Ｂｒｅｎｎａｎら、１９８５、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２９：８１；Ｓｕｒｅｓｈら、１９８６、酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ）、１２１：１２０； Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９９１、欧州生物学機構誌（ＥＭＢＯ Ｊ．）、１０：３６５５−３６５９； Ｓｈａｌａｂｙら、１９９２、実験医学誌（Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．）、１７５：２１７−２２５； Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、１９９２、米国免疫学誌（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ）、１４８：１５４７−１５５３； Ｇｒｕｂｅｒら、１９９４、米国免疫学誌（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、１５２：５３６８；及び米国特許第５，７３１，１６８号を参照のこと。二重特異性抗体は、インタクトな抗体又は抗体断片であり得る。２より多くの原子価を有する抗体も考慮される。例えば、三重特異性抗体を産生することも可能である（Ｔｕｔｔら、１９９１、米国免疫学誌（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、１４７：６０）。よって、ある実施形態では、抗体は多重特異的である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、単一の遺伝子コンストラクトから生成される単鎖免疫グロブリンである（例えば、Ｌｅｅら、１９９９、分子免疫学誌（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、３６：６１−７１を参照のこと）。単鎖免疫グロブリンには、その全体にわたり、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖の両方が含まれる。例えば、軽鎖のカルボキシル末端を、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーペプチドを介して、重鎖のアミノ酸末端に接合させる。その中で、軽鎖には可変領域及び定常領域が含まれ、重鎖には可変領域及びＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３が含まれる。これらの単鎖免疫グロブリンは、二量体抗体分子を形成する。
ある実施形態では、本明細書に記載の抗体又は他のポリペプチドは、モノ特異的であってもよい。
ある実施形態では、抗体は抗体断片である。抗体断片は、インタクト抗体とは異なる機能又は能力を有する場合がある。例えば、抗体断片の腫瘍浸透が増加することもあり得る。抗体断片の生成として、インタクト抗体のタンパク質分解消化を含むがこれに限定されない、様々な技法が知られている。いくつかの実施形態では、抗体断片には、抗体分子のペプシン消化により生成されるＦ（ａｂ'）２断片が含まれる。いくつかの実施形態では、抗体断片には、Ｆ（ａｂ'）２断片のジスルフィド架橋を還元することにより生成されるＦａｂ断片が含まれる。他の実施形態では、抗体断片には、パパイン及び還元剤で抗体分子を処理することにより生成されるＦａｂ断片が含まれる。ある実施形態では、抗体断片は、組換えで生成される。いくつかの実施形態では、抗体断片には、Ｆｖ又は単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片が含まれる。Ｆａｂ、Ｆｖ及びｓｃＦｖ抗体断片は、大腸菌又はその他の宿主からの発現、分泌が可能であり、そのため断片の大量生成が可能となる。いくつかの実施形態では、抗体断片は、本明細書に記載の抗体ファージライブラリーから単離する。例えば、本方法を用いてＦａｂ発現ライブラリーを構成し（Ｈｕｓｅら、１９８９、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２４６：１２７５−１２８１）、タンパク質又は誘導体、断片、類似体又はその相同体に対し所望の特異性を有するモノクロナールＦａｂ断片を迅速かつ有効的に同定できるようにする。いくつかの実施形態では、抗体断片は、米国特許第５，６４１，８７０号に記載の直線抗体断片である。ある実施形態では、抗体断片は、モノ特異的又は二重特異的である。ある実施形態では、抗体は、ｓｃＦｖである。所定の標的抗原に特異的な単鎖抗体の生成に、多様な技法を用いることができる（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。
半減期の血清を増加させるためには、特に抗体断片の場合には、抗体を修飾することがさらに望ましくなり得る。これは、例えば、エピトープに結合するサルベージ受容体を、抗体断片の適切な領域の突然変異による抗体断片に組み入れることにより、又は、エピトープをペプチドタグに組み入れて後、抗体断片の末端又は中間のいずれかに融合させることにより（例えば、ＤＮＡ又はペプチド合成によって）達成され得る（例えば、米国特許第６，０９６，８７１号及び第６，１２１，０２２号を参照のこと）。
本発明の目的のためには、修飾抗体又はその断片には、それが結合する特異的抗原との結合をもたらす任意のタイプの可変領域が含まれ得ると理解されるべきである。この点に関して、可変領域は、体液性応答をマウントし、所望の抗原に対する免疫グロブリンを生成するために誘導され得る、任意の哺乳動物タイプ由来であってもよい。それゆえ、修飾抗体の可変領域は、例えば、ヒト、マウス、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、アカゲザル等）又はラビットオリジンのものであり得る。いくつかの実施形態では、修飾された免疫グロブリンの可変及び定常領域双方ともヒトである。他の実施形態では、互換性のある抗体の可変領域（通常は、非ヒトのソースから抽出）は、結合特性を改善するために、又は分子の免疫原性を低減するために、設計又は特異的に仕立てることが可能である。この点において、本発明に有益な可変領域はヒト化され、そうでなければ、インポートされたアミノ酸配列を含めることにより変更される。
ある実施形態では、重鎖及び軽鎖双方における可変領域は、１又はそれ以上のＣＤＲｓの少なくとも部分的置換により、及び、必要であれば部分的枠組み領域置換及び配列修飾により変更される。ＣＤＲｓは、枠組み領域由来の抗体と同じクラス又はサブクラスも含め、それら抗体から得てもよいが、ＣＤＲｓは、異なるクラスの抗体、好ましくは、異種の抗体由来となると想定される。１つの可変ドメインの抗原結合能力を別のドメインに移すために、全ＣＤＲｓをドナー可変領域の全ＣＤＲｓと置き換える必要性はない場合がある。むしろ、抗原結合部位の活性を維持するのに必要なこれら残基を移すことだけが必要であると言える。
可変領域の変更にも関わらず、当業者であれば、本発明の修飾抗体には、未処理又は未変更の定常領域を含むほぼ同様の免疫原性の抗体と比較して、腫瘍局在の増加、腫瘍浸透の増加、血清半減期の減少、又は血清半減期の増加等、所望の生化学特性を提供するために、１又はそれ以上の定常領域の少なくとも一部が削除され、そうでなければ変更される抗体（例えば、全長抗体又はその抗原結合性断片）が含まれると理解するであろう。いくつかの実施形態では、修飾抗体の定常領域には、ヒト定常領域が含まれる。定常領域に対する修飾には、１又はそれ以上のドメインの１又はそれ以上のアミノ酸の追加、欠失又は置換が含まれる。本明細書で開示される修飾抗体には、３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２若しくはＣＨ３）のうち１若しくはそれ以上、及び／又は軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）に対する変更若しくは修飾が含まれ得る。いくつかの実施形態では、１又はそれ以上のドメインは、修飾抗体の定常領域から部分的に又は全体が削除される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２ドメイン全体が除去される（ΔＣＨ２コンストラクト）。いくつかの実施形態では、省略された定常領域ドメインは、定常領域が無い場合典型的に分子柔軟性を一部もたらす、短いアミノ酸スペーサー（例えば、１０ａａ残基）に置き換えられる。
ある実施形態では、修飾抗体は、ＣＨ３ドメインを抗体のヒンジ領域に直接融合させるよう設計されている。他の実施形態では、ペプチドスペーサーは、ヒンジ領域と修飾されたＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメインの間に挿入される。例えば、コンストラクトは、ＣＨ２ドメインが削除され、残りのＣＨ３ドメイン（修飾又は未修飾）が５〜２０個のアミノ酸スペーサーでヒンジ領域に接合するよう発現されてもよい。定常ドメインの制御因子はフリーかつアクセス可能のままであり、又はヒンジ領域は柔軟なままであるよう、係るスペーサーを追加してもよい。しかし、アミノ酸スペーサーは免疫原性であり、コンストラクトに対して望ましくない免疫反応を誘発する場合のあることに留意されたい。従って、ある実施形態では、コンストラクトに追加する任意のスペーサーは、修飾抗体の所望の生物学的品質を維持するよう、比較的に非免疫原性的となる。
いくつかの実施形態では、修飾抗体は、定常領域の部分的欠失、又は単一の場合も含め、少数のアミノ酸の置換のみを有するのでもよい。例えば、ＣＨ２ドメインの選択された領域における単一アミノ酸の突然変異は、Ｆｃ結合を実質的に低減し、よって、腫瘍局在及び／又は腫瘍浸透を増加させるのに十分である。同様に、調節対象の特異的エフェクター機能（例えば、相補的Ｃ１ｑ結合）を制御する、１又はそれ以上の定常領域ドメインの一部を単純に除去することが望ましい場合もある。定常領域の係る部分的除去は、対象の定常領域ドメインインタクトに関連する、抗体の選択特性（血清半減期）を改良する可能性がある。さらに、先にも示唆したように、開示された抗体の定常領域を、結果的に得られるコンストラクトのプロファイルを強化する１又はそれ以上のアミノ酸の突然変異又は置換を介して修飾してもよい。この点に関して、修飾抗体の配置及び免疫病原性プロファイルを実質的に維持しながら、保存的結合部位（例えば、Ｆｃ結合）により提供される活動を破壊できる場合もある。ある実施形態では、修飾抗体には、エフェクター機能の低減又は増加等、所望の特性を強化するために、又はより多くの細胞毒若しくは炭水化物付着部位を提供するために、定常領域に対する１又はそれ以上のアミノ酸の追加が含まれる。
定常領域はいくつかのエフェクター機能を媒介することは、当技術分野で知られている。例えば、（抗原に結合した）ＩｇＧ抗体又はＩｇＭ抗体のＦｃ領域に対する補体Ｃ１コンポーネントの結合は、補体系を活性化する。補体の活性化は、細胞の病原体のオプソニン化及び溶解において重要である。補体の活性化はまた炎症反応を刺激し、自己免疫過敏症にも関与し得る。さらに、抗体のＦｃ領域は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する細胞に結合し得る。ＩｇＧ抗体（γ受容体）、ＩｇＥ（ε受容体）、ＩｇＡ（α受容体）及びＩｇＭ（μ受容体）を含む異なるクラスの抗体に特異的なＦｃ受容体が多数存在する。細胞表面上で抗体がＦｃ受容体に結合することで、貪食、抗体被覆粒子の破壊、免疫複合体のクリアランス、キラー細胞による抗体被覆された標的細胞の溶解（ＡＤＣＣ）、炎症媒介物の放出、胎盤通過、及び免疫グロブリン産生の制御等を含む、数多くの重要かつ多様な生物反応を引き起こす。
ある実施形態では、抗体は、逆に、投与された抗体の生物学的プロファイルに影響を与える、変更されたエフェクター機能を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、（点突然変異又はその他の手段を介した）定常領域ドメインの除去又は不活性化は、循環修飾抗体のＦｃ受容体への結合を低減し、よって、腫瘍局在及び／又は浸透を増加させる場合がある。他の実施形態では、定常領域修飾が、抗体の血清半減期を増加又は低減する。いくつかの実施形態では、ジスルフィド連結又はオリゴ糖部分を削除し、強化された腫瘍局在及び／又は浸透を可能にするために、定常領域は修飾される。
ある実施形態では、抗体は１又はそれ以上のエフェクター機能を有しない。いくつかの実施形態では、抗体は、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）活動及び／又は補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）活動を有しない。ある実施形態では、抗体は、Ｆｃ受容体及び／又は補体要因に結合しない。ある実施形態では、抗体はエフェクター機能を有しない。
本発明はさらに、本明細書に記載のキメラ抗体、ヒト化及びヒト抗体、又はそれらの断片と実質的に相同な変異体及び等価物を包含する。これらは、例えば保存的置換突然変異、すなわち類似のアミノ酸による１つ又はそれ以上のアミノ酸の置換を含み得る。
実施例１
免疫グロブリン定常領域ＣＤ４コンストラクトの生成
コンストラクトは、単一の配列、ＦＬＡＧエピトープタグ、マウスＩｇＧ１のヒンジ領域及びＣＨ２とＣＨ３ドメイン、並びに膜ＭＡｂ（ｍＩｇＧ１）と称されるヒトＣＤ４の膜貫通ドメイン（ＴＭ）及び細胞内ドメイン（ＩＣＤ）を含むようデザインされた。第２のコンストラクトは、シグナル配列、ＦＬＡＧエピトープタグ、ヒトＩｇＧ２のヒンジ領域及びＣＨ２とＣＨ３ドメイン、並びに膜ＭＡｂ（ｈＩｇＧ２）と称されるヒトＣＤ４の膜貫通ドメイン（ＴＭ）及び細胞内ドメイン（ＩＣＤ）を含むようデザインされた。第３のコンストラクトは、単一の配列、ＦＬＡＧエピトープタグ、ヒトＩｇＧ２のヒンジ領域及びＣＨ２とＣＨ３ドメイン、ヒトＣＤ４の膜貫通ドメイン（ＴＭ）及び細胞内ドメイン（ＩＣＤ）、並びに膜ＭＡｂ（ｈＩｇＧ２）−ＧＦＰ（図６Ａ）と称されるＣ末端の緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含むようデザインされた。
各コンストラクトで使用されるヒンジ領域の部分は、軽鎖のペアリングに関与するシステインの残基Ｃ末端を含むようデザインされた。膜ＭＡｂ（ｍＩｇＧ１）コンストラクトは、シグナル配列−ＦＬＡＧ−ｍＩｇＧ１（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）−ｈＣＤ４（ＴＭ／ＩＣＤ）の順番でデザインされた。これらは、配列番号２４（ヌクレオチド配列）及び配列番号２２（シグナル配列を有するアミノ酸配列）に示されている。膜ＭＡｂ（ｈＩｇＧ２）コンストラクトは、シグナル配列−ＦＬＡＧ−ｈＩｇＧ２（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）−ｈＣＤ４（ＴＭ／ＩＣＤ）の順番でデザインされた。これらは、配列番号２５（ヌクレオチド配列）及び配列番号２３（シグナル配列を有するアミノ酸配列）に示されている。膜ＭＡｂ（ｈＩｇＧ２）−ＧＦＰコンストラクトは、シグナル配列−ＦＬＡＧ−ｈＩｇＧ２（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）−ｈＣＤ４（ＴＭ／ＩＣＤ）−ＧＦＰの順番でデザインされた。これらは、配列番号２７（ヌクレオチド配列）及び配列番号２６（シグナル配列を有するアミノ酸配列）に示されている。膜ＭＡｂ（ｈＩｇＧ２）コンストラクト及び膜ＭＡｂ（ｈＩｇＧ２）−ＧＦＰコンストラクトは、ｌｃｋタンパク質結合部位を除去するために、ＣＤ４細胞内ドメインに修飾部を有するようデザインされた。コンストラクトは、化学合成により生成され、標準的技法により哺乳動物の発現ベクタープラスミドヘクローンされた。
実施例２
細胞株の生成
マウスのハイブリドーマ融合パートナー細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４を、実施例１に記載の膜ＭＡｂ（ｍＩｇＧ１）コンストラクトで形質移入した。２×１０６ＳＰ２／０細胞を、Ａｍａｘａ（登録商標） ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎキットＶ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて、製造者によるプログラムＬ−０１３のマニュアルに従って、２μｇの膜ＭＡｂ（ｍＩｇＧ１）で形質移入した。２４時間後、細胞を、０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８選択の下に置き、培養液で増殖した。形質移入から２週間後に、膜ＭＡｂ（ｍＩｇＧ１）コンストラクトの細胞表面発現のＦＡＣＳ解析により細胞の特徴が明らかにされた。これらの細胞は、指定されたＳＰ２／０−ＭＴであった。５×１０６の形質移入された細胞を蛍光標識化抗ＦＬＡＧ抗体又はアイソタイプ負の制御抗体（１０μｇ／ｍｌ）で、３０分間氷上でインキュベートした。細胞は洗浄され、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳに再懸濁され、フローサイトメトリで解析された。図２Ａは、負の制御抗体（左のパネル）を伴ったフローサイトメトリの結果、及び抗ＦＬＡＧ抗体（右のパネル）で検出した膜ＭＡｂ（ｍＩｇＧ１）ポリペプチドを発現する細胞の数を示している。
膜ＭＡｂ（ｍＩｇＧ１）コンストラクトを発現する細胞をＦＡＣＳでソートし、ウェル毎に１つの細胞を入れ、全部で９６のウェルプレートに入れ、０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８による選択の下で、培養液で増殖した。１０日後、各ウェルの細胞クローンを、先に記載のフローサイトメトリで、膜ＭＡｂ（ｍＩｇＧ１）コンストラクトの発現について解析し、５個のサブクローンを選択した。図２Ｂに示す通り、サブクローンＳＰ２／０−ＭＴ．３が、膜ＭＡｂ（ｍＩｇＧ１）コンストラクトの最も高い発現レベルを有していたことが観察された。
実施例３
ハイブリドーマを単離するための膜ＭＡｂ技法の利用
マウスＦｒｉｚｚｌｅｄ５（ＦＺＤ５）及びマウスＦｒｉｚｚｌｅｄ８（ＦＺＤ８）のｆｒｉドメインの組換えポリペプチド断片が、抗体生成の抗原として利用するために生成された。標準的ＤＮＡ組換え技術を使用して、ＦＺＤ５（配列番号１９）のアミノ酸２７〜１５７及びＦＺＤ８（配列番号２０）のアミノ酸２８〜１５８をコードするポリヌクレオチドを単離した。ポリヌクレオチドをＮ末端ヒスチジンタグとインフレームで連結させ、昆虫細胞のバキュロウイルス媒介発現のための転送プラスミドベクターにクローンした。形質移入、感染、及び細胞培養の標準的プロトコールを用いて、相応するＦＺＤポリペプチドを発現する組換え昆虫細胞を生成した。
マウス（ｎ＝３）を、標準的技法を用いて、ＦＺＤ５及びＦＺＤ８抗原タンパク質双方で免疫化した。抗原認識のための最初の免疫化から約７０日後に、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ解析を用いて、個別マウス由来の血液をスクリーンした。最後の抗原ブーストに、最も高い抗体力価を有する２匹の動物を選択し、その後、脾臓細胞を単離した。単離された脾細胞は、標準的なハイブリドーマ融合技術を用いて、実施例２に記載されたＳＰ２／０−ＭＴ細胞株と融合させた。その結果得られたハイブリドーマライブラリーを５４Ｌ１と名付けた。
ライブラリー５４Ｌ１を、標識化ＦＺＤ５ポリペプチド及び標識化ＦＺＤ８ポリペプチドでスクリーンした。標識化ＦＺＤ５に関しては、製造者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）のマニュアルに従って、染料対タンパク質の割合を１５：１で、マウスＨｉｓタグ化ｆｒｉドメインＦＺＤ５をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８染料に結合した。標識化されたＦＺＤ８に関しては、製造者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）のマニュアルに従って、染料対タンパク質の割合を１５：１で、マウスＨｉｓタグ化ｆｒｉドメインＦＺＤ８をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７染料に結合した。１×１０７細胞／ｍｌの割合のハイブリドーマ細胞を、室温で３０分間、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８標識化ＦＺＤ５（１０μｇ／ｍｌ）及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７標識化ＦＺＤ８（１０μｇ／ｍｌ）でインキュベートした。細胞を洗浄し、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳで再懸濁し、フローサイトメトリで解析した（図３）。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８標識化ＦＺＤ５及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７標識化ＦＺＤ８の両方に結合した個別ハイブリドーマ細胞をＦＡＣＳによりソートし、ウェル毎に１つの細胞を入れ、全部で９６のウェル組織培養プレートに入れた。対照として、５４Ｌ１ライブラリー由来の個別細胞を無作為にソートし、ウェル毎に１つの細胞を入れ、全部で９６のウェル組織培養プレートに入れた。プレートを１０日間インキュベートし、ハイブリドーマ細胞を増殖させ、ＦＺＤ５タンパク質とＦＺＤ８タンパク質双方に結合できる抗体の存在について、各ウェルの上清をスクリーンした。
ＦＡＣＳによるスクリーニングに関して、ＨＥＫ−２９３細胞を、ＦＺＤ５又はＦＺＤ８の全長ｃＤＮＡクローンをコードする発現ベクター及びトランスフェクションマーカーＧＦＰで同時形質移入した。形質移入の２４〜４８時間後、ＨＥＫ−２９３細胞を回収し、抗ＦＺＤ５／８ハイブリドーマ上清又は制御ＩｇＧで氷上インキュベートした。細胞を洗浄し、結合された一次抗体を、蛍光発色団と結合する抗マウス第二次抗体で検出した。その後、未処理のＦＺＤ５及び／又はＦＺＤ８の細胞表面発現を特異的に認識する抗体を同定するために、標識化された細胞をＦＡＣＳで解析した。
ＳＰ２／０−ＭＴ融合パートナー細胞株及び膜ＭＡｂ技法を利用した結果、ＦＺＤ５及びＦＺＤ８を結合できた５７６個のクローンのうち５２６個（９１％）を選択した。その一方、無作為抽出したクローンの対照ライブラリースクリーニングの結果、ＦＺＤ５及びＦＺＤ８を結合できた１７０５個のクローンのうちわずか１１個を選択した（０．６％）（表１を参照のこと）。よって、膜ＭＡｂ技法を利用した結果、ＦＺＤ５及びＦＺＤ８に特異的なハイブリドーマの同定が劇的に増加した。
Figure 2013519379
図３で示すように、ライブラリー５４Ｌ１のごくわずかな細胞のみが、ＦＺＤ５、ＦＺＤ８、又はＦＺＤ５及びＦＺＤ８の両方と結合した状態で表された。膜ＭＡｂ技法により、ＦＺＤ５及びＦＺＤ８双方と結合する抗体を生成する細胞を直接同定、選択することができる。ＦＺＤ５のみ又はＦＺＤ８のみと結合する抗体を生成する細胞もまた膜ＭＡｂ技法により選択され得ることは、当業者には明確であるはずだ。
実施例４
ハイブリドーマを単離するための膜ＭＡｂ技法の利用
ヒトＤＤＲ２の細胞外ドメインの組換えポリペプチド断片は、抗体生成の抗原として利用するために生成された。標準的なＤＮＡ組換え技術を利用して、ＤＤＲ２のアミノ酸１〜３９９（配列番号２１）をコードするポリヌクレオチドを単離した。このポリヌクレオチドをＮ末端のヒスチジンタグにインフレームで連結し、昆虫細胞のバキュロウイルス媒介発現のための転送プラスミドベクターにクローンした。標準的な形質移入、感染、細胞培養プロトコールを利用して、相応するＤＤＲ２ポリペプチドを発現する組換え昆虫細胞を生成した。
マウス（ｎ＝３）を、標準的技法を用いて、精製されたＤＤＲ２抗原タンパク質で免疫化した。抗原認識のための最初の免疫化から約７０日後に、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ解析を用いて、個別マウス由来の血液をスクリーンした。最後の抗原ブーストに、最も高い抗体力価を有する２匹の動物を選択し、その後、脾臓細胞を単離し、標準的なハイブリドーマ融合技術により、ＤＤＲ２ハイブリドーマライブラリーを生成するために使用された。
ＤＤＲ２ライブラリーの一部を膜ＭＡｂ（ｍＩｇＧ１）コンストラクト（実施例１に記載）で形質移入した。ライブラリーを、Ａｍａｘａ（登録商標） ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎキットＶ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて、製造者のプログラムＬ−０１３用マニュアルに従い形質移入した。３×１０７個の細胞を、３０μｇの膜ＭＡｂ（ｍＩｇＧ１）コンストラクト（「膜ＭＡｂライブラリー」）で形質移入した。２４時間後、形質移入された細胞を、標識化されたＤＤＲ２ポリペプチドでスクリーンした。標識化ＤＤＲ２に関しては、（上記で製造された）ＤＤＲ２ポリペプチドを、製造者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）のマニュアルに従って、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８カルボン酸スクシンイミジルエステル染料に、染料対タンパク質の割合を１５：１で結合させた。１×１０７細胞／ｍｌの膜ＭＡｂライブラリーを、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８標識化ＤＤＲ２（２０μｇ／ｍｌ）及びＰＥ標識化抗ＦＬＡＧ抗体（１０μｇ／ｍｌ）で、３０分間氷上でインキュベートした。細胞を洗浄し、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳで再懸濁し、フローサイトメトリで解析した。図４に示されているように、ライブラリーのごくわずかな細胞のみが、ＤＤＲ２及び抗ＦＬＡＧ抗体と結合した状態で表された。
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８標識化ＤＤＲ２及びＰＥ標識化抗ＦＬＡＧ抗体と結合した個別ハイブリドーマ細胞をＦＡＣＳによりソートし、ウェル毎に１つの細胞を入れ、全部で９６のウェル組織培養プレートに入れた。対照として、同じライブラリーから無作為抽出した個別細胞を９６ウェル組織培養プレートのウェルに入れた。これらのプレートを１０日間インキュベートし、ハイブリドーマ細胞を増殖させ、その後、全長ＤＤＲ２タンパク質と結合できる抗体の存在について、各ウェルの上清をスクリーンした。
ＦＡＣＳによるスクリーニングに関しては、ＨＥＫ−２９３細胞を、ＤＤＲ２の全長ｃＤＮＡクローン及びトランスフェクションマーカーＧＦＰをコードする発現ベクターで同時形質移入した。形質移入の２４〜４８時間後に、ＨＥＫ−２９３細胞を回収し、抗ＤＤＲ２ハイブリドーマ上清又は制御ＩｇＧで、氷上インキュベートした。細胞を洗浄し、結合された一次抗体を、蛍光発色団と結合する抗マウス第二次抗体で検出した。その後、未処理のＤＤＲ２の細胞表面発現を特異的に認識する抗体を同定するために、標識化された細胞をＦＡＣＳで解析した。
膜ＭＡｂ技法を利用した結果、ＤＤＲ２と結合できた１６８個のクローンのうち１４１個（８４％）を選択した。一方、無作為に抽出したクローンの対照ライブラリーをスクリーンした結果、ＤＤＲ２と結合できた２０２個のクローンのうちわずか１６個を選択した（８％）（表２を参照のこと）。よって、膜ＭＡｂ技法を利用した結果、抗原特異的抗体を生成する細胞の同定が劇的に増加した。
Figure 2013519379
実施例５
２９３−ｈＭＴ細胞株の生成
膜ＭＡｂ（ｈＩｇＧ２）−ＧＦＰポリペプチドを安定的に発現する細胞株を生成させるために（実施例１に記載、図６Ｃに表示）、ＨＥＫ−２９３細胞を膜ＭＡｂ（ｈＩｇＧ２）−ＧＦＰコンストラクトで安定的に形質移入した。５×１０６個のＨＥＫ−２９３細胞を、ＦｕＧＥＮＥトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ、インディアナポリス、インディアナ州）を用いて、製造者のマニュアルに従い、８μｇの膜ＭＡｂ（ｈＩｇＧ２）−ＧＦＰコンストラクトで形質移入した。２４時間後、細胞を０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８選択の下に置き、培養液で増殖した。形質移入から２週間後に、膜ＭＡｂ（ｈＩｇＧ２）−ＧＦＰコンストラクト発現のＦＡＣＳにより細胞の特徴が明らかにされた。形質移入された細胞のサブクローンもＧＦＰ発現についてスクリーンし、図５が示すように、フローサイトメトリの結果１０個のクローンが明らかになった。
実施例６
単一の遺伝子抗体コンストラクト及びライブラリー
抗体軽鎖の定常領域のカルボキシル末端が、（ＧＧＧＧＳ）６ペプチドリンカーを介して重鎖可変領域のアミノ末端と連結している、単一タンパク質又は単一鎖抗体（ｓｃＡｂ）コンストラクトとして、親抗体スキャフォールドを設計した。ヒンジ領域のシステイン残基を保有し、２つの重鎖間又は１つの重鎖と膜ＭＡｂコンストラクトの間のジスルフィド結合を可能とした。単一の遺伝子抗体の軽鎖は、可変領域とヒト定常領域をコードする。単一の遺伝子抗体の重鎖は、可変領域並びにヒトＩｇＧＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインをコードする。発現ベクターは、単鎖抗体を生成するよう構成されており、本明細書ではＭＡｂＬｉｂコンストラクトと称される。ベクターは、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域が、各軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域の除去と新たな別の可変領域の挿入を可能にする、独自の制限部位に互いに隣接するように（図６Ｂに表示）設計された。ＭＡｂＬｉｂコンストラクトを用いて、多様な単鎖抗体（ｓｃＡｂ）ライブラリーを生成し得る。
軽鎖及び重鎖可変領域を、当業者に周知の方法により、ヒトｃＤＮＡからＰＣＲで増幅した。制限部位ＥｃｏＲｖ又はＢｓｉＷＩを含むプライマーを用いて、軽鎖可変領域にＰＣＲ反応を生じさせた。制限部位ＭｆｅＩ又はＢｌｐＩを含むプライマーを用いて、重鎖可変領域にＰＣＲ反応を生じさせた。軽鎖可変領域を含むＰＣＲ生成物を精製し、ＥｃｏＲｖ及びＢｓｉＷＩで消化させ、同様に消化された親ＭＡｂＬｉｂベクター（上記の）にクローンした。このようにして、多様な軽鎖可変領域を有するｓｃＡｂライブラリーが作られた。その後、重鎖可変領域を含むＰＣＲ生成物を精製し、ＭｆｅＩ及びＢｌｐＩで消化させ、多様な重鎖可変領域を含む、同様に消化されたｓｃＡｂライブラリーにクローンした。このようにして、多様な軽鎖可変領域及び重鎖可変領域双方を有するｓｃＡｂライブリーが作られた。軽鎖可変領域を挿入する前に、重鎖可変領域を親ＭＡｂＬｉｂベクターに挿入してもよいことは、当業者には周知のことであると思われる。
実施例７
ＨＥＫ−２９３細胞の表面上のヘテロ二量体抗体分子発現
細胞表面上にヘテロ二量体抗体分子が形成されることを検証するために、ＨＥＫ−２９３細胞を、抗ＤＬＬ４単鎖抗体をコードするＤＮＡ及び膜ＭＡｂ（ｈＩｇＧ２）−ＧＦＰタンパク質をコードするＤＮＡで形質移入した。２１Ｍ１８軽鎖、（ＧＧＧＧＳ）６リンカー、２１Ｍ１８可変重鎖、及びＣＨ１領域をコードする合成ポリヌクレオチドがデザインされた。ポリヌクレオチドを、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ社、カリフォルニア州）により合成し、上記実施例６に記載の単鎖２１Ｍ１８抗体（ｓｃ２１Ｍ１８）をコードするベクターを生成するために（ｓｃ２１Ｍ１８配列番号３３、ヌクレオチド配列；配列番号３４、アミノ酸配列）、ＭＡｂＬｉｂにクローンした。抗ｈＤＬＬ４抗体２１Ｍ１８については、先に、米国特許第７，７５０，１２４号に記載されている。ｓｃ２１Ｍ１８プラスミドＤＮＡを様々な濃度（２５、２５０、２５００及び２５０００ｎｇ／ｍｌ）で形質移入し、４８時間後に細胞を収穫した。対照として、細胞をｓｃ２１Ｍ１８ＤＮＡのみで形質移入（−▲−）、膜ＭＡｂ（ｈＩｇＧ２）−ＧＦＰ ＤＮＡのみで形質移入（−■−）、又は形質移入しなかった（−◆−）。細胞表面上の機能性抗ＤＬＬ４抗体分子の検出に関しては、形質移入された細胞をｈＤＬＬ４−ｒＦｃ融合タンパク質でインキュベートした。結合されたｈＤＬＬ４−ｒＦｃを、ＰＥ標識化抗ラビットＦｃ抗体で検出した。ＦＡＣＳで細胞を解析し、細胞集団の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を決定した。図７に示す通り、抗ＤＬＬ４ｓｃ２１Ｍ１８ＤＮＡ及び膜ＭＡｂ（ｈＩｇＧ２）ＤＮＡ（−Ｘ−）で形質移入された細胞のみが、ＤＬＬ４−ｒＦｃタンパク質に特異的に結合する機能性結合部位を有する膜結合分子を発現した。
実施例８
抗体分子のディスプレイを調節する担体プラスミドの利用
プラスミドを有する哺乳動物細胞を一時的に形質移入すると、通常、細胞毎にプラスミドを多数複製する。細胞毎の複製数は、１００〜１０，０００個の範囲であり得る。細胞毎の絶対数は、トランスフェクションプロトコル、トランスフェクション試薬、プラスミドの品質、プラスミドのサイズ、及び細胞濃度を含む多様な要因に依存するが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、細胞表面にディスプレイされた抗体のライブラリーを生成するにあたり、細胞に導入される抗体コードプラスミド（又はＡｂライブラリープラスミド）の量を調節することが望ましい。細胞のＡｂライブラリープラスミドのプラスミド複製数を調節するために、別の「担体」プラスミドを使用する。担体プラスミドをＡｂライブラリープラスミドと混ぜ合わせ、利用可能な「プラスミドスペース（ｐｌａｓｍｉｄ ｓｐａｃｅ）」の一部を利用する。細胞が利用するＡｂライブラリープラスミドの数を調節するために、担体プラスミドをＡｂライブラリープラスミドと異なる割合で混ぜ合わせ、その後、細胞に形質移入する。
Ａｂコードプラスミドのトランスフェクション及びディスプレイに対する担体プラスミドの効果を試験した。上記の単鎖抗ＤＬＬ４抗体（ｓｃ２１Ｍ１８）を、様々な割合の担体プラスミドで形質移入した。本研究において、担体プラスミドは、無関係の単一タンパク質抗体をコードした（ｓｃ１８Ｒ５）。細胞はまた、膜ＭＡｂ（ｈＩｇＧ２）−ＧＦＰコンストラクトで形質移入された。細胞のＡｂライブラリープラスミドの濃度は、抗ＤＬＬ４抗体分子の表面発現のレベルから推測され得た。約５×１０６個のＨＥＫ−２９３細胞をプラスミドＤＮＡで形質移入し、４８時間後に収穫した。プラスミドＤＮＡは、ｓｃ２１Ｍ１８とｓｃ１８Ｒ５の混合物であり、ｓｃ２１Ｍ１８のｓｃ１８Ｒ５に対する割合は、ｓｃ１８Ｒ５の１〜１０，０００倍過剰の範囲（１、１０、１００、１０００又は１０，０００倍過剰）である。細胞表面の機能性抗ＤＬＬ４抗体分子の検出に関しては、形質移入された細胞を、ｈＤＬＬ４−ｒＦｃ融合タンパク質でインキュベートした。結合されたｈＤＬＬ４−ｒＦｃは、ＰＥ標識化抗ラビットＦｃ抗体で検出した。抗ＤＬＬ４抗体を発現する細胞の割合は、ＦＡＣＳ解析により決定した。細胞はまた、制御抗原で（ｈＪａｇ−ｒＦｃ、−■−）又はＰＥ標識化抗ラビットＦｃ抗体のみ（−▲−）でインキュベートされた。図８に示すように、担体プラスミドＤＮＡの量は、形質移入された細胞の表面上に抗ＤＬＬ４抗体を発現する細胞の割合に明らかに影響を与えていた。
実施例９
抗体ライブラリーのスクリーニング法
膜Ｍａｂ技法及び選択方法を検証するため、本研究は、抗ＤＬＬ４抗体ｓｃ２１Ｍ１８プラスミドＤＮＡを用いて行われた。ｓｃ２１Ｍ１８プラスミドＤＮＡを、ｓｃ１８Ｒ５ＤＮＡが１００，０００倍過剰である、無関係の抗体ｓｃ１８Ｒ５プラスミドＤＮＡと混ぜ合わせた。ＨＥＫ−２９３細胞を、７．５×ｌ０−６μｇのｓｃ２１Ｍｌ８プラスミドＤＮＡ、０．７５μｇのｓｃｌ８Ｒ５プラスミドＤＮＡ、１４．３μｇの担体プラスミド（カナマイシンプラスミド）、及び膜ＭＡｂ（ｈＩｇＧ２）−ＧＦＰをコードする１５μｇのプラスミドで形質移入した。細胞は、４８時間後に収穫された。細胞表面上の機能性抗ＤＬＬ４抗体の検出に関しては、形質移入された細胞をｈＤＬＬ４−ｒＦｃ融合タンパク質でインキュベートした。結合されたｈＤＬＬ４−ｒＦｃをＰＥ標識化抗ラビットＦｃ抗体で検出した。細胞を発現する抗ＤＬＬ４抗体を同定し、単離するために、標識化された細胞をＦＡＣＳで解析し、ソートした。抗原が抗ＤＬＬ４抗体により認識されないため、ｈＪａｇ−ｒＦｃを対照として使用した。ＦＡＣＳによりソートされた細胞からプラスミドＤＮＡを単離し、バクテリアで増幅した。増幅されたプラスミドＤＮＡ（担体プラスミド及びプラスミドをコードする膜ＭＡｂ（ｈＩｇＧ２）−ＧＦＰと結合して）を用いて、新鮮なＨＥＫ−２９３細胞を形質移入し、別の選択ラウンドを行った。この増幅及び選択方法を４回繰り返した。ＦＡＣＳの結果は、図９に示されている。表３には、各選択ラウンド後の抗ＤＬＬ４抗体の発現に対しポジティブな細胞の割合を示している。本研究は、ｓｃ２１Ｍ１８ＤＮＡが無関係の抗体ＤＮＡを背景にして高度に希釈されたという事実にも関わらず、４ラウンド超の選択を通じて、抗ＤＬＬ４抗体を発現する細胞を同定し、濃縮したことを示している。
Figure 2013519379
実施例１０
抗ＶＥＧＦ抗体ライブラリーの生成及び２９３−ｈＭＴ細胞株への形質移入
抗体ライブラリーを、上記の実施例６及び７で述べた所ｓｃ２１Ｍ１８を発現するＭＡｂＬｉｂコンストラクト、並びにヒト血管内皮細胞成長因子（ｈＶＥＧＦ）で免疫化したマウス由来の免疫グロブリンｃＤＮＡを用いて生成した。３つのＢａｌｂ／ｃマウスをｈＶＥＧＦの腹腔内注射により免疫化した。最初の注射では、完全フロイントアジュバントにｈＶＥＧＦが含まれていた。その後の注射には、不完全フロイントアジュバントにｈＶＥＧＦが含まれていた。合計４回の腹腔内注射が、３カ月にわたって行われた。マウスは、静脈の尾静脈注射によりＰＢＳでｈＶＥＧＦの最後の注射を受けた。最後の注射の１週間後、免疫化されたマウスから脾臓とリンパ節が回収された。ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを生成した。マウス重鎖可変領域をコードするＤＮＡをＰＣＲで増幅し、単離し、精製した。ＰＣＲ生成物を、ＭｆｅＩ及びＢｌｐＩで消化し、同様に消化されたｓｃ２１Ｍ１８コンストラクトにクローンし、よって、配列番号３３の重鎖可変領域を、ｈＶＥＧＦ免疫化マウス由来の複数のマウス重鎖可変領域と置き換えた。このライブラリーに関しては、２１Ｍ１８軽鎖は定常に保たれた。
２１Ｍ１８軽鎖を、複数のヒトカッパ鎖可変領域と取り換えること以外は、本明細書に記載のライブラリーと同様に第２のＶＥＧＦライブラリーを構成した。ヒトカッパ鎖可変領域を、ヒトカッパ鎖特異的プライマーを用いて、プールされたヒトｃＤＮＡからＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ生成物を単離し、生成し、ＥｃｏＲＶ及びＢｓｉＷＩで消化し、第１ＶＥＧＦライブラリー由来の、同様に消化されたプラスミドＤＮＡにクローンし、よって、２１Ｍ１８軽鎖可変領域を取り替えた。
２９３−ＭＴ細胞を、２つの抗ＶＥＧＦ抗体ライブラリーで形質移入した。
本明細書に記載の実施例及び実施形態は例示のみを目的としており、その観点から、本技術分野の当業者に対して、様々な修正又は変更に関する提言がなされるであろうこと、またそれらは、本発明の精神及び範囲において含まれるべきであることを理解されたし。
よって、本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、各刊行物、特許又は特許出願があたかも具体的かつ個別的に引用により含まれるべきと示しているのと同程度に、全ての目的のためにその全体を、引用により含めるものとする。

Claims (216)

  1. ポリペプチドであって、
    （ａ）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリン重鎖定常領域を含む細胞外部分、及び
    （ｂ）非免疫グロブリン膜貫通部
    を含むポリペプチド。
  2. 免疫グロブリン重鎖定常領域がさらに、少なくともヒンジ領域の一部を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 免疫グロブリン重鎖定常領域がＦｃ領域を含む、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
  4. 免疫グロブリン重鎖定常領域がＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ，ＩｇＧ、ＩｇＭ抗体又はそれらの任意のサブタイプである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  5. 免疫グロブリン重鎖定常領域がＩｇＧ１又はＩｇＧ２である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  6. 免疫グロブリン重鎖定常領域がヒト免疫グロブリン重鎖定常領域である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  7. 免疫グロブリン重鎖定常領域がマウス免疫グロブリン重鎖定常領域である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  8. 免疫グロブリン重鎖定常領域が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、又は配列番号８を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  9. 膜貫通部が、ＣＤ４，ＣＤ８、クラスＩＭＨＣ、クラスＩＩＭＨＣ、ＣＤ１９、Ｔ細胞受容体α鎖及びβ鎖、ＣＤ３、ｚｅｔａ鎖、ＩＣＡＭ１（ＣＤ５４）、ＩＣＡＭ２、ＩＣＡＭ３、ＩＣＡＭ４、ＩＣＡＭ５、ＣＤ２８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ２から成る群から選択される、膜貫通ドメインの少なくとも一部を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  10. 膜貫通部が配列番号１３又は配列番号１６を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  11. 膜結合性であり、免疫グロブリン重鎖領域が細胞表面上に発現される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  12. 抗原結合部位を有しない、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  13. 第２のポリペプチドを有するヘテロ二量体分子を形成することができる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  14. 第２のポリペプチドが、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリン重鎖定常領域を含む、請求項１３に記載のポリペプチド。
  15. 第２のポリペプチドが免疫グロブリンＦｃ領域を含む、請求項１３又は１４に記載のポリペプチド。
  16. 第２のポリペプチドが、無作為抽出されたポリペプチドを含む、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  17. 第２のポリペプチドが免疫グロブリン重鎖を含む、請求項１３に記載のポリペプチド。
  18. 免疫グロブリン重鎖が免疫グロブリン軽鎖と結合する、請求項１７に記載のポリペプチド。
  19. 第２のポリペプチドが、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を有する単鎖免疫グロブリンを含む、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  20. 第２のポリペプチドと少なくとも１つのジスルフィド結合を形成することができる、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  21. ヘテロ二量体抗体分子を形成する免疫グロブリン重鎖−軽鎖のペアと、少なくとも１つのジスルフィド結合を形成することができる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  22. ヘテロ二量体抗体分子が１つの抗原結合部位を含む、請求項１３〜２１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  23. 分泌抗体と結合しない、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  24. 配列番号１０、配列番号１２、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、又は配列番号３２に対し少なくとも８０％相同的な配列を含むポリペプチド。
  25. 配列番号１０、配列番号１２、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、又は配列番号３２を含むポリペプチド。
  26. 配列番号３０、配列番号３１、又は配列番号３２に対し少なくとも８０％相同的な配列を含むポリペプチド。
  27. 配列番号３０、配列番号３１、又は配列番号３２を含むポリペプチド。
  28. 本質的に配列番号３０、配列番号３１、又は配列番号３２から成るポリペプチド。
  29. 配列番号９、配列番号１１、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、又は配列番号２９によりコードされる配列を含むポリペプチド。
  30. 請求項１〜２９のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む抗体分子。
  31. 請求項３０の抗体分子であって、
    （ａ）免疫グロブリン重鎖、及び
    （ｂ）免疫グロブリン軽鎖
    をさらに含む、抗体分子。
  32. ポリペプチドが、免疫グロブリン重鎖−軽鎖のペアのＦｃ領域と少なくとも１つのジスルフィド結合を形成する、請求項３０又は３１に記載の抗体分子。
  33. 単一の抗原結合部位を含む、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の抗体分子。
  34. 請求項１〜２９のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  35. 配列番号９、配列番号１１、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、又は配列番号２９に対し少なくとも８０％相同的である配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチド。
  36. 配列番号９、配列番号１１、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、又は配列番号２９のポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
  37. 請求項３４〜３６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  38. 請求項３４〜３７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞。
  39. 請求項１〜３３のいずれか一項に記載のポリペプチド又は抗体分子を含む宿主細胞。
  40. 請求項３４〜３７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又はベクターで細胞を形質移入することを含む、宿主細胞の製造方法。
  41. 形質移入された細胞がポリペプチドを発現する、請求項４０に記載の方法。
  42. 細胞が一時的に形質移入される、請求項４０又は４１に記載の方法。
  43. 細胞が安定的に形質移入される、請求項４０又は４１に記載の方法。
  44. ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが細胞のゲノムに統合された、請求項４０に記載の方法。
  45. ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが安定的に発現される、請求項４０、４１、４３、又は４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. ポリペプチドが細胞の表面に発現される、請求項４０〜４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 細胞の表面上のポリペプチド発現を検出することを含む、請求項４０〜４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 細胞の表面上にポリペプチドを発現する細胞を単離することを含む、請求項４０〜４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 細胞が哺乳動物細胞である、請求項４０〜４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 細胞がマウス細胞である、請求項４０〜４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 細胞がヒト細胞である、請求項４０〜４９のいずれか一項に記載の方法。
  52. 細胞が融合パートナー細胞株である、請求項４０〜５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 細胞が、Ｓｐ２／０、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４、ＹＢ２／０、Ｋ６Ｈ６／Ｂ５、ＮＳ−１、ＦＯ、Ｙ３／Ａｇ１．２．３、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、ＨＥＫ−２９３、２９３Ｔ、及びＣＨＯから成る群から選択される、請求項４０〜４８のいずれか一項に記載の方法。
  54. 請求項４０〜５３のいずれか一項に記載の方法により作製される宿主細胞。
  55. 請求項３４〜３７に記載のポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞。
  56. 請求項１〜３３のいずれか一項に記載のポリペプチド又は抗体分子を含む宿主細胞。
  57. 請求項１〜３３のいずれか一項に記載のポリペプチド又は抗体分子を発現する宿主細胞。
  58. 少なくとも１つの追加ポリペプチドをさらに含む、請求項５４〜５７のいずれかに記載の宿主細胞。
  59. 少なくとも１つの追加ポリペプチドが、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリン重鎖定常領域を含む、請求項５８に記載の宿主細胞。
  60. 少なくとも１つの追加ポリペプチドが免疫グロブリンＦｃ領域を含む、請求項５８に記載の宿主細胞。
  61. 少なくとも１つの追加ポリペプチドが免疫グロブリン重鎖を含む、請求項５８に記載の宿主細胞。
  62. 少なくとも１つの追加ポリペプチドが免疫グロブリン軽鎖を含む、請求項５８〜６１のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  63. 少なくとも１つの追加ポリペプチドが、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を有する単鎖抗体を含む、請求項５８に記載の宿主細胞。
  64. 少なくとも１つの追加のポリペプチドが抗体である、請求項５８〜６３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  65. ポリペプチドが第２のポリペプチドと少なくとも１つのジスルフィド結合を形成し、ヘテロ二量体分子を形成する、請求項５８〜６４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  66. ポリペプチドが免疫グロブリン重鎖−軽鎖のペアと少なくとも１つのジスルフィド結合を形成し、ヘテロ二量体抗体分子を形成する、請求項５８〜６５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  67. 免疫グロブリン重鎖−軽鎖のペアが単一抗原結合部位を形成する、請求項６６に記載の宿主細胞。
  68. ヘテロ二量体分子が細胞表面上に発現し、単一抗原結合部位を含む、請求項６５〜６７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  69. ヘテロ二量体分子が分泌抗体と結合しない、請求項６５〜６８のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  70. 請求項５４〜５７のいずれか一項に記載の細胞を抗体産生細胞と融合することを含む、ハイブリドーマ細胞の製造方法。
  71. 融合された細胞が細胞表面上にヘテロ二量体抗体分子を発現する、請求項７０に記載の方法。
  72. 抗体産生細胞が抗体産生細胞集団である、請求項７０又は７１に記載の方法。
  73. 抗体産生細胞が免疫化動物由来である、請求項７０〜７２のいずれか一項に記載の方法。
  74. 抗体産生細胞が未処理動物由来である、請求項７０〜７２のいずれか一項に記載の方法。
  75. 抗体産生細胞が、Ｂ細胞、プラズマ細胞、ハイブリドーマ、骨髄腫及び組換え細胞から成る群から選択される、請求項７０〜７４のいずれか一項に記載の方法。
  76. 抗体産生細胞がマウス細胞である、請求項７０〜７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. 抗体産生細胞がヒト細胞である、請求項７０〜７５のいずれか一項に記載の方法。
  78. 抗体産生細胞が複数のポリヌクレオチドを含む、請求項７０〜７７のいずれか一項に記載の方法。
  79. 複数のポリヌクレオチドが免疫グロブリン重鎖を含む複数のポリペプチドをコードする、請求項７８に記載の方法。
  80. 複数のポリヌクレオチドが免疫グロブリン軽鎖を含む複数のポリペプチドをコードする、請求項７８又は７９に記載の方法。
  81. 複数のポリヌクレオチドが、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を有する単鎖抗体分子を含む複数のポリペプチドをコードする、請求項７８又は７９に記載の方法。
  82. 複数のポリヌクレオチドがＤＮＡライブラリーを含む、請求項７８〜８１のいずれか一項に記載の方法。
  83. ＤＮＡライブラリーが免疫化動物の細胞から生成される、請求項８２に記載の方法。
  84. ＤＮＡライブラリーが未処理ライブラリーである、請求項８２に記載の方法。
  85. ＤＮＡライブラリーがｃＤＮＡライブラリーである、請求項８２〜８４のいずれか一項に記載の方法。
  86. 融合細胞が、複数のヘテロ二量体抗体分子を発現するハイブリドーマ細胞集団を含む、請求項７０〜８５のいずれか一項に記載の方法。
  87. 請求項７０〜８６のいずれかに記載の方法により作製されるハイブリドーマ又はハイブリドーマライブラリー。
  88. 請求項５４〜５７のいずれか一項に記載の細胞を、複数のポリペプチドをコードする複数のポリヌクレオチドで形質移入することを含む細胞ライブラリーの製造方法。
  89. 形質移入された細胞がヘテロ二量体分子を発現する、請求項８８に記載の方法。
  90. ヘテロ二量体分子が形質移入された細胞の表面上に発現される、請求項８９に記載の方法。
  91. 複数のポリヌクレオチドが、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリン重鎖定常領域を含む複数のポリペプチドをコードする、請求８８〜９０のいずれか一項に記載の方法。
  92. 複数のポリヌクレオチドが、免疫グロブリンＦｃ領域を含む複数のポリペプチドをコードする、請求項８８〜９０のいずれか一項に記載の方法。
  93. 複数のポリヌクレオチドが、免疫グロブリン重鎖を含む複数のポリペプチドをコードする、請求項８８〜９０のいずれか一項に記載の方法。
  94. 複数のポリヌクレオチドが、免疫グロブリン軽鎖を含む複数のポリペプチドをコードする、請求項８８〜９３のいずれか一項に記載の方法。
  95. 複数のポリヌクレオチドが、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を有する単鎖抗体分子を含む複数のポリペプチドをコードする、請求項８８〜９０のいずれか一項に記載の方法。
  96. 複数のポリヌクレオチドが複数のポリペプチドをコードし、各ポリペプチドに（ａ）免疫グロブリンＦｃ領域及び（ｂ）無作為抽出されたポリペプチドが含まれる、請求項８８〜９０のいずれか一項に記載の方法。
  97. 複数のポリヌクレオチドがＤＮＡライブラリーを含む、請求項８８〜９６のいずれか一項に記載の方法。
  98. ＤＮＡライブラリーが免疫化動物の細胞から生成される、請求項９７に記載の方法。
  99. ＤＮＡライブラリーが未処理ライブラリーである、請求項９７に記載の方法。
  100. ＤＮＡライブライブラリーがｃＤＮＡライブラリーである、請求項９７〜９９のいずれか一項に記載の方法。
  101. ＤＮＡライブラリーが無作為抽出のポリペプチドライブラリーをコードする、請求項９７に記載の方法。
  102. 請求項８８〜１０１のいずれか一項に記載の方法により作製された細胞ライブラリー。
  103. ハイブリドーマ細胞集団を生成するため、請求項５４〜５７のいずれか一項に記載の細胞を抗体産生細胞と融合させることを含む、特異的抗体を生成する細胞の同定方法。
  104. ハイブリドーマ細胞が、細胞表面上にヘテロ二量体抗体分子を発現する、請求項１０３に記載の方法。
  105. ハイブリドーマ細胞集団を検出分子に接触させることを含む、請求項１０３又は１０４に記載の方法。
  106. 検出分子と結合するハイブリドーマ細胞を同定することを含む、請求項１０５に記載の方法。
  107. 検出分子に結合するハイブリドーマ細胞を単離することを含む、請求項１０５又は１０６に記載の方法。
  108. 抗体産生細胞が抗体産生細胞集団である、請求項１０３〜１０７のいずれか一項に記載の方法。
  109. 抗体産生細胞が免疫化動物由来である、請求項１０３〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
  110. 抗体産生細胞が未処理動物由来である、請求項１０３〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
  111. 抗体産生細胞が、Ｂ細胞、プラズマ細胞、ハイブリドーマ、骨髄腫及び組換え細胞から成る群から選択される、請求項１０３〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
  112. 抗体産生細胞がマウス細胞である、請求項１０３〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
  113. 抗体産生細胞がヒト細胞である、請求項１０３〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
  114. 抗体産生細胞が、複数のポリヌクレオチドを含む、請求項１０３〜１１３のいずれか一項に記載の方法。
  115. 複数のポリヌクレオチドが、免疫グロブリン重鎖を含む複数のポリペプチドをコードする、請求項１１４に記載の方法。
  116. 複数のポリヌクレオチドが、免疫グロブリン軽鎖を含む複数のポリペプチドをコードする、請求項１１４又は１１５に記載の方法。
  117. 複数のポリヌクレオチドが、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を有する単鎖抗体分子を含む複数のポリペプチドをコードする、請求項１１４に記載の方法。
  118. 複数のポリヌクレオチドがＤＮＡライブラリーを含む、請求項１１４〜１１７のいずれか一項に記載の方法。
  119. ＤＮＡライブラリーが免疫化動物の細胞から生成される、請求項１１８に記載の方法。
  120. ＤＮＡライブラリーが未処理ライブラリーである、請求項１１８に記載の方法。
  121. ＤＮＡライブラリーがｃＤＮＡライブラリーである、請求項１１８〜１２０のいずれか一項に記載の方法。
  122. 抗体産生細胞により作られる抗体が、組換え抗体、モノクロナール抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、又は抗体の断片である、請求項１０３〜１２１のいずれか一項に記載の方法。
  123. 抗体産生細胞により作られる抗体が、モノ特異的抗体又は二重特異的抗体である、請求項１０３〜１２２のいずれか一項に記載の方法。
  124. 抗体産生細胞により作られる抗体が一価抗体である、請求項１０３〜１２２のいずれか一項に記載の方法。
  125. 抗体産生細胞により作られる抗体が、ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ，ＩｇＧ若しくはＩｇＭ抗体又はそのサブタイプである、請求項１０３〜１２４のいずれか一項に記載の方法。
  126. 抗体産生細胞により作られる抗体が、ＩｇＧ１抗体又はＩｇＧ２抗体である、請求項１０３〜１２４のいずれか一項に記載の方法。
  127. 検出分子がタンパク質又はその断片である、請求項１０５〜１２６のいずれか一項に記載の方法。
  128. 検出分子が対象の抗原である、請求項１０５〜１２７のいずれか一項に記載の方法。
  129. 検出分子が標識化されている、請求項１０５〜１２８のいずれか一項に記載の方法。
  130. 検出分子が蛍光団、発色団又は磁気化合物で標識化される、請求項１２９に記載の方法。
  131. 検出分子と結合する細胞の同定はフローサイトメトリにより行われる、請求項１０６〜１３０のいずれか一項に記載の方法。
  132. 検出分子と結合する細胞の単離はＦＡＣＳにより行われる、請求項１０７〜１３１のいずれか一項に記載の方法。
  133. 少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドで、請求項５４〜５７のいずれか一項に記載の細胞を形質移入することを含む特異的抗体を生成する細胞の同定方法。
  134. 形質移入された細胞が細胞表面上にヘテロ二量体抗体分子を発現する、請求項１３３に記載の方法。
  135. 形質移入された細胞を検出分子に接触させることを含む、請求項１３３又は１３４に記載の方法。
  136. 検出分子と結合する細胞を同定することを含む、請求項１３５に記載の方法。
  137. 検出分子と結合する細胞を単離することを含む、請求項１３５又は１３６に記載の方法。
  138. ポリヌクレオチドの少なくとも１つが、複数のポリペプチドをコードする複数のポリヌクレオチドを含む、請求項１３３〜１３７のいずれか一項に記載の方法。
  139. 複数のポリヌクレオチドが、免疫グロブリン重鎖を含む複数のポリペプチドをコードする、請求項１３８に記載の方法。
  140. 複数のポリヌクレオチドが、免疫グロブリン軽鎖を含む複数のポリペプチドをコードする、請求項１３８又は１３９に記載の方法。
  141. 複数のポリヌクレオチドが、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を有する単鎖抗体分子を含む複数のポリペプチドをコードする、請求項１３８〜１４０のいずれか一項に記載の方法。
  142. 複数のポリヌクレオチドがＤＮＡライブラリーを含む、請求項１３８〜１４１のいずれか一項に記載の方法。
  143. ＤＮＡライブラリーが免疫化動物の細胞から生成される、請求項１４２に記載の方法。
  144. ＤＮＡライブラリーが未処理ライブラリーである、請求項１４２に記載の方法。
  145. ＤＮＡライブラリーがｃＤＮＡライブラリーである、請求項１４２〜１４４のいずれか一項に記載の方法。
  146. 少なくとも１つのポリヌクレオチドが、組換え抗体、モノクロナール抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、又は抗体の断片であるポリペプチドをコードする、請求項１３３〜１４５のいずれか一項に記載の方法。
  147. 少なくとも１つのポリヌクレオチドが、モノ特異的抗体又は二重特異的抗体であるポリペプチドをコードする、請求項１３３〜１４６のいずれか一項に記載の方法。
  148. 少なくとも１つのポリヌクレオチドが、一価抗体であるポリペプチドをコードする、請求項１３３〜１４６のいずれか一項に記載の方法。
  149. 少なくとも１つのポリヌクレオチドが、ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ，ＩｇＧ若しくはＩｇＭ抗体又はそのサブタイプであるポリペプチドをコードする、請求項１３３〜１４８のいずれか一項に記載の方法。
  150. 少なくとも１つのポリヌクレオチドが、ＩｇＧ１抗体又はＩｇＧ２抗体であるポリペプチドをコードする、請求項１３３〜１４９のいずれか一項に記載の方法。
  151. 検出分子がタンパク質又はその断片である、請求項１３５〜１５０のいずれか一項に記載の方法。
  152. 検出分子が対象の抗原である、請求項１３５〜１５１のいずれか一項に記載の方法。
  153. 検出分子が標識化されている、請求項１３５〜１５２のいずれか一項に記載の方法。
  154. 検出分子が蛍光団、発色団又は磁気化合物で標識化されている、請求項１５３に記載の方法。
  155. 検出分子と結合する細胞の同定をフローサイトメトリで行う、請求項１３６〜１５４のいずれか一項に記載の方法。
  156. 検出分子と結合する細胞の単離をＦＡＣＳで行う、請求項１３７〜１５５のいずれか一項に記載の方法。
  157. 請求項３４〜３７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又はベクターで、抗体産生細胞を含む細胞ライブラリーを形質移入することを含む、特異的抗体を生成する細胞の同定方法。
  158. 形質移入された細胞が細胞表面上にヘテロ二量体抗体分子を発現する、請求項１５７に記載の方法。
  159. 形質移入された細胞を検出分子と接触させることを含む、請求項１５７又は１５８に記載の方法。
  160. 検出分子と結合する細胞を同定することを含む、請求項１５９に記載の方法。
  161. 検出分子と結合する細胞を単離することを含む、請求項１５９又は１６０に記載の方法。
  162. 細胞ライブラリーが、Ｂ細胞、プラズマ細胞、ハイブリドーマ、骨髄腫、及び組換え細胞から成る群から選択される、請求項１５１〜１６１のいずれか一項に記載の方法。
  163. 細胞ライブラリーがハイブリドーマライブラリーである、請求項１５１〜１６２のいずれか一項に記載の方法。
  164. 細胞ライブラリーがマウス細胞を含む、請求項１５１〜１６３のいずれか一項に記載の方法。
  165. 細胞ライブラリーがヒト細胞を含む、請求項１５１〜１６３のいずれか一項に記載の方法。
  166. 請求項１０３〜１６５のいずれかに記載の方法により同定される細胞により生成される抗体。
  167. 請求項１０７〜１３２、１３７〜１５６、又は１６１〜１６５のいずれかに記載の方法により単離される細胞により生成される抗体。
  168. 細胞ライブラリーであって、各細胞には、
    （ａ）請求項１〜２９のいずれか一項に記載の第１ポリペプチド、及び
    （ｂ）２本のポリペプチドがヘテロ二量体分子を形成し得る、免疫グロブリン重鎖を含む第２ポリペプチド
    が含まれる、細胞ライブラリー。
  169. ヘテロ二量体分子が細胞表面上に発現される、請求項１６８に記載の細胞ライブラリー。
  170. 各細胞がさらに免疫グロブリン軽鎖を含む、請求項１６８又は１６９に記載の細胞ライブラリー。
  171. 第２のポリペプチドが、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を有する単鎖抗体分子を含む、請求項１６８又は１６９に記載の細胞ライブラリー。
  172. ヘテロ二量体分子が単一抗原結合部位を含む、請求項１６８〜１７１のいずれか一項に記載の細胞ライブラリー。
  173. 細胞ライブラリーであって、各細胞には、
    （ａ）請求項１〜２９のいずれか一項に記載の第１ポリペプチド、及び
    （ｂ）２本のポリペプチドがヘテロ二量体分子を形成し得る、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリン重鎖定常領域を含む第２ポリペプチド、
    が含まれる、細胞ライブラリー。
  174. ヘテロ二量体分子が細胞表面上に発現される、請求項１７３に記載の細胞ライブラリー。
  175. 第２のポリペプチドに免疫グロブリンＦｃ領域が含まれる、請求項１７３又は１７４に記載の細胞ライブラリー。
  176. 第２のポリペプチドに、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を有する単鎖抗体分子を含む、請求項１７３又は１７４に記載の細胞ライブラリー。
  177. 第２のポリペプチドにさらに無作為抽出ポリペプチドが含まれる、請求項１７３に記載の細胞ライブラリー。
  178. 請求項１６８〜１７７のいずれか一項に記載の細胞ライブラリーを検出分子と接触させることを含む、細胞ライブラリーのスクリーニング法。
  179. 検出分子と結合する細胞を同定することを含む、請求項１７８に記載の方法。
  180. 検出分子と結合する細胞を単離することを含む、請求項１７８又は１７９に記載の方法。
  181. 検出分子がタンパク質又はその断片である、請求項１７８〜１８０のいずれか一項に記載の方法。
  182. 検出分子が対象の抗原である、請求項１７８〜１８１のいずれか一項に記載の方法。
  183. 検出分子が細胞表面受容体、リガンド、抗体又はその断片である、請求項１７８〜１８２のいずれか一項に記載の方法。
  184. 検出分子は小分子である、請求項１７８〜１８０のいずれか一項に記載の方法。
  185. 検出分子は標識化されている、請求項１７８〜１８４のいずれか一項に記載の方法。
  186. 検出分子と結合する細胞の同定がフローサイトメトリで行われる、請求項１７９〜１８５のいずれか一項に記載の方法。
  187. 検出分子に結合する細胞の単離がＦＡＣＳで行われる、請求項１８０〜１８６のいずれか一項に記載の方法。
  188. 請求項１７８〜１８７のいずれか一項に記載の方法により同定される細胞。
  189. 請求項１７８〜１８７のいずれかに記載の方法により単離される細胞。
  190. （ａ）免疫グロブリンをコードするＤＮＡ、及び（ｂ）無関係ＤＮＡの過剰量を宿主細胞に形質移入することを含む、宿主細胞の表面上のヘテロ二量体抗体分子の発現調節方法。
  191. 免疫グロブリンをコードするＤＮＡの無関係ＤＮＡに対する割合が、１：１０〜１：１，０００，０００である、請求項１９０に記載の方法。
  192. 免疫グロブリンをコードするＤＮＡがプラスミドＤＮＡであり、無関係ＤＮＡがプラスミドＤＮＡである、請求項１９０〜１９１に記載の方法。
  193. 宿主細胞が請求項１〜２９に記載のポリペプチド又は請求項３４〜３６に記載のポリヌクレオチドを含む、請求項１９０〜１９２のいずれか一項に記載の方法。
  194. 免疫グロブリンが免疫グロブリン重鎖を含む、請求項１９０〜１９３のいずれか一項に記載の方法。
  195. 抗体が免疫グロブリン軽鎖を含む、請求項１９０〜１９３のいずれか一項に記載の方法。
  196. 免疫グロブリンが、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を有する単鎖抗体分子である、請求項１９０〜１９５のいずれか一項に記載の方法。
  197. 免疫グロブリンをコードするＤＮＡがＤＮＡライブラリーである、請求項１９０〜１９５のいずれか一項に記載の方法。
  198. ＤＮＡライブラリーが免疫化動物の細胞から生成される、請求項１９７に記載の方法。
  199. ＤＮＡライブラリーが未処理動物の細胞から生成される、請求項１９７に記載の方法。
  200. ＤＮＡライブラリーがｃＤＮＡライブラリーである、請求項１９７〜１９９のいずれか一項に記載の方法。
  201. 宿主細胞を検出分子と接触させることをさらに含む、請求項１９０〜２００のいずれか一項に記載の方法。
  202. 検出分子と結合する宿主細胞を同定することを含む、請求項２０１に記載の方法。
  203. 検出分子と結合する宿主細胞を単離することを含む、請求項２０１及び２０２に記載の方法。
  204. ヘテロ二量体分子であって、
    （ａ）（ｉ）第１の二量体形成ドメインを含む細胞外部分、及び（ｉｉ）膜貫通部の両者を含んだ第１ポリペプチド、並びに
    （ｂ）第２の二量体形成ドメインを含む第２ポリペプチド
    が含まれる。
  205. 第１の二量体形成領域が免疫グロブリン定常領域である、請求項２０４に記載のヘテロ二量体分子。
  206. 第１の二量体形成ドメインが免疫グロブリン重鎖定常領域である、請求項２０４又は２０５に記載のヘテロ二量体分子。
  207. 第２の二量体形成ドメインが免疫グロブリン定常領域である、請求項２０４〜２０６のいずれか一項に記載のヘテロ二量体分子。
  208. 第２の二量体形成ドメインが免疫グロブリン重鎖定常領域である、請求項２０４〜２０７のいずれか一項に記載のヘテロ二量体分子。
  209. 第１のポリペプチドが請求項１〜２９のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、請求項２０４に記載のヘテロ二量体分子。
  210. 第２のポリペプチドが免疫グロブリン重鎖定常領域を含む、請求項２０４〜２０９のいずれか一項に記載のヘテロ二量体分子。
  211. 第２のポリペプチドが免疫グロブリンＦｃ領域を含む、請求項２０４〜２１０のいずれか一項に記載のヘテロ二量体分子。
  212. 第２のポリペプチドが免疫グロブリン重鎖を含む、請求項２０４〜２１１のいずれか一項に記載のヘテロ二量体分子。
  213. 免疫グロブリン重鎖が免疫グロブリン軽鎖と結合する、請求項２１２に記載のヘテロ二量体分子。
  214. 第２のポリペプチドが免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を有する単鎖免疫グロブリンを含む、請求項２０４〜２１３のいずれか一項に記載のヘテロ二量体分子。
  215. 第１のポリペプチドが第２のポリペプチドと少なくとも１つのジスルフィド結合を形成する、請求項２０４〜２１４のいずれか一項に記載のヘテロ二量体分子。
  216. １つの抗原結合部位を含む、請求項２０４〜２１５のいずれか一項に記載のヘテロ二量体分子。
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