CN109738506B - 一种成熟脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种成熟脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法，涉及酒配方技术领域，其包括如下步骤：步骤Ⅰ、确定自噬相关蛋白A存在乙酰化修饰，先进行培养脂肪细胞，并诱导其分化为成熟脂肪细胞，后给予去乙酰化酶抑制剂处理。该成熟脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法，在预测的基础上进行乙酰化位点鉴定并得出乙酰化修饰点的具体位置，通过对乙酰化修饰位点重新定位与评估，使乙酰化修饰位点的鉴定更准确、更可信，因而可极大地提高检索结果的可信度，随后又进行乙酰化位点功能研究，且研究过程是采用病毒感染的方式，因而可在一定程度上缩短研究实验所消耗的时间，方法可靠，具有良好的重复性。
Description
技术领域
本发明涉及酒配方技术领域，具体为一种成熟脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法。
背景技术
蛋白质乙酰化是在乙酰基转移酶的作用下，在蛋白质赖氨酸残基上添加乙酰基的过程，是细胞控制基因表达，蛋白质活性或生理过程的一种机制。
乙酰化是保障蛋白质活性所必须的且具有高度调控作用的蛋白质翻译后修饰，它能发生在核心组蛋白、将近40种转录因子和30多种其他蛋白质靶标中，从细菌到人类，蛋白质乙酰化不仅对细胞核功能发挥起关键作用，而且对各种胞质代谢也具有重要调控作用，包括细胞骨架动力学、能量代谢、内吞作用和自体吞噬，甚至包含跨膜信号的传导，对于乙酰化位点的识别将是理解乙酰化分子机制的基础。
对脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究在生物学中具有重要意义，是人类对生命认知的进一步体现，因而生物学界逐渐出现了多种关于脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法，然而，目前脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法大多是直接对脂肪细胞进行染色处理，再通过显微镜等设备进行观察，不仅未进行判断脂肪细胞中是否存在乙酰化修饰，同时也未进行乙酰化位点的预测，导致蛋白乙酰化位点的研究过程中过于盲目，容易浪费掉研究人员的宝贵时间，同时还降低了实验结果的可信度，因此亟需一种成熟脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法来解决上述问题。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种成熟脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法，解决了目前脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法大多是直接对脂肪细胞进行染色处理，再通过显微镜等设备进行观察，不仅未进行判断脂肪细胞中是否存在乙酰化修饰，同时也未进行乙酰化位点的预测，导致蛋白乙酰化位点的研究过程中过于盲目，容易浪费掉研究人员的宝贵时间，同时还降低了实验结果可信度的问题。
(二)技术方案
为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：一种成熟脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法，包括如下步骤：
步骤Ⅰ、确定自噬相关蛋白A存在乙酰化修饰
先进行培养脂肪细胞，并诱导其分化为成熟脂肪细胞，后给予去乙酰化酶抑制剂处理，最后采用免疫沉淀的方法确定蛋白A存在乙酰化修饰。
步骤Ⅱ、质谱分析或软件预测蛋白A可能的乙酰化位点
步骤Ⅲ、乙酰化位点鉴定
工具细胞：用293T细胞进行乙酰化位点鉴定，构建乙酰化位点突变的质粒，转染293T细胞，采用免疫沉淀的方法观察位点突变后蛋白A的乙酰化水平变化。
成熟脂肪细胞：构建乙酰化位点突变的慢病毒，感染成熟脂肪细胞，采用免疫沉淀的方法观察位点突变后蛋白A的乙酰化水平变化。
步骤Ⅳ、乙酰化位点功能研究
自噬相关蛋白A的功能是研究其对自噬的影响，后续对各条通路针对不同动物模型、疾病具体进行研究。
自噬相关蛋白A的过表达慢病毒和乙酰化位点突变的过表达慢病毒分别感染成熟脂肪细胞。
透射电镜观察自噬小体的变化。
同时感染GFP-LC3慢病毒，共聚焦荧光显微镜观察GFP-LC3点状聚集的情况。
Western blot检测自噬标志蛋白LC3的表达变化。
给予羟氯喹处理后，再次通过Western blot检测自噬标志蛋白LC3的表达变化，即是利用自噬通量的方法检测对自噬的影响。
优选的，所述脂肪细胞采用3T3-L1细胞系。
优选的，所述乙酰化酶抑制剂采用尼克酰胺(NAM)和制滴菌素A(TSA)。
优选的，所述免疫沉淀法是采用蛋白A的抗体将经乙酰化酶抑制剂处理后的成熟脂肪细胞进行沉淀，并用通用乙酰化抗体进行杂交以确定蛋白A存在乙酰化修饰。
优选的，所述蛋白A可能的乙酰化位点在进行预测时，从UniProt、CPLM和NCBI蛋白质数据库中收集原核生物蛋白质乙酰化数据作为参照。
优选的，所述软件预测是采用MATLAB软件和C#编程语言的预测软件平台ProAcePred，且所述预测软件平台ProAcePred在用户提交至少一条原核蛋白质序列，即可自动给出其蛋白质潜在的乙酰化位点信息，实现对蛋白A乙酰化位点的高通量预测。
优选的，所述质谱分析是利用开源免费软件ProteoWizard将质谱采集的原始数据转化为可视化的mgf格式的数据。
(三)有益效果
本发明的有益效果在于：
1、该成熟脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法，通过质谱分析或软件预测蛋白A可能的乙酰化位点，所得出的预测数据图再与UniProt、CPLM和NCBI等蛋白质数据库中所收集原核生物蛋白质乙酰化数据进行比对，因而可进一步确定蛋白A可能的乙酰化位点的主要存在区域，不需要繁琐的基因突变技术手段即可快速、高效、准确地得到蛋白A可能的乙酰化修饰位点信息，在预测的基础上进行乙酰化位点鉴定并得出乙酰化修饰点的具体位置，通过对乙酰化修饰位点重新定位与评估，使乙酰化修饰位点的鉴定更准确、更可信，因而可极大地提高检索结果的可信度，随后又进行乙酰化位点功能研究，且研究过程是采用病毒感染的方式，因而可在一定程度上缩短研究实验所消耗的时间，方法可靠，具有良好的重复性。
2、该成熟脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法，通过设置乙酰化酶抑制剂，乙酰化酶抑制剂有干扰与蛋白A去乙酰化酶的功能，还能够增加细胞内蛋白A的乙酰化程度，通过采用免疫沉淀(IP)，免疫沉淀(IP)是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白A的一种方法，可通过产生的沉淀物进行判定蛋白A中是否存在乙酰化修饰。
3、该成熟脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法，通过进行乙酰化位点鉴定，成熟脂肪细胞被慢病毒感染后，采用免疫沉淀的方法观察位点突变后蛋白A的乙酰化水平变化，并采用工具细胞的转染试验作为参考，进而可得出乙酰化位点的鉴定结果，通过利用Western blot进行两次检测自噬标志蛋白LC3的表达变化，因此可利用自噬通量的方法检测对自噬的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：一种成熟脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法，包括如下步骤：
步骤Ⅰ、确定自噬相关蛋白A存在乙酰化修饰
先进行培养脂肪细胞，并诱导其分化为成熟脂肪细胞，后给予去乙酰化酶抑制剂处理，所述乙酰化酶抑制剂采用尼克酰胺(NAM)和制滴菌素A(TSA)，最后采用免疫沉淀的方法确定蛋白A存在乙酰化修饰，所述免疫沉淀法是采用蛋白A的抗体将经乙酰化酶抑制剂处理后的成熟脂肪细胞进行沉淀，并用通用乙酰化抗体进行杂交以确定蛋白A存在乙酰化修饰。
步骤Ⅱ、质谱分析或软件预测蛋白A可能的乙酰化位点，所述质谱分析是利用开源免费软件ProteoWizard将质谱采集的原始数据转化为可视化的mgf格式的数据
步骤Ⅲ、乙酰化位点鉴定
工具细胞：用293T细胞进行乙酰化位点鉴定，构建乙酰化位点突变的质粒，转染293T细胞，采用免疫沉淀的方法观察位点突变后蛋白A的乙酰化水平变化，所述蛋白A可能的乙酰化位点在进行预测时，从UniProt、CPLM和NCBI蛋白质数据库中收集原核生物蛋白质乙酰化数据作为参照，所述软件预测是采用MATLAB软件和C#编程语言的预测软件平台ProAcePred，且所述预测软件平台ProAcePred在用户提交至少一条原核蛋白质序列，即可自动给出其蛋白质潜在的乙酰化位点信息，实现对蛋白A乙酰化位点的高通量预测。
成熟脂肪细胞：构建乙酰化位点突变的慢病毒，感染成熟脂肪细胞，采用免疫沉淀的方法观察位点突变后蛋白A的乙酰化水平变化。
步骤Ⅳ、乙酰化位点功能研究
自噬相关蛋白A的功能是研究其对自噬的影响，后续对各条通路针对不同动物模型、疾病具体进行研究。
自噬相关蛋白A的过表达慢病毒和乙酰化位点突变的过表达慢病毒分别感染成熟脂肪细胞，所述脂肪细胞采用3T3-L1细胞系。
透射电镜观察自噬小体的变化。
同时感染GFP-LC3慢病毒，共聚焦荧光显微镜观察GFP-LC3点状聚集的情况。
Western blot检测自噬标志蛋白LC3的表达变化。
给予羟氯喹处理后，再次通过Western blot检测自噬标志蛋白LC3的表达变化，即是利用自噬通量的方法检测对自噬的影响。
实施例1：
基于Thermo公司LTQ Orbitrap XL质谱数据的蛋白乙酰化修饰位点的鉴定，其步骤是：
在该实施例1中，LTQ Orbitrap XL质谱采集的数据格式为“.RAW”，可直接使用开源免费软件ProteoWizard将数据转化为标准的mgf格式文件，再进行MASCOT以及pFind数据库检索，并对乙酰化修饰位点进行重新定位，可信度评估以及谱图批量自动导出；
应用本实施例1，对Thermo公司LTQ Orbitrap XL质谱采集的数据进行乙酰化位点评估，同样得到高可信度的乙酰化位点，有效的去除了数据库检索软件带来的假阳性概率。
实施例2：
蛋白乙酰化与肿瘤发展的相关性实验流程：
本实施例2中进行了乳腺癌患者临床样本的检测，结果显示，癌症患者组织中K292位点乙酰化的hsp90明显比正常组织中hsp90乙酰化水平高；
同样，用ack292-hsp90抗体检测小鼠中肿瘤发展过程中的hsp90乙酰化情况，用10％的FBS培养基培养过夜的MDA-MB-231乳腺癌细胞经消化后稀释成含2x107个/ml的细胞悬浮液，Balb/c裸鼠接种2x106个MDA-MB-231细胞，接种肿瘤细胞两周后(肿瘤约长至100mm3)收集小鼠肿瘤样本，用ack292-hsp90抗体检测小鼠肿瘤样本中hsp90中K292位点的乙酰化水平，结果显示，CDC37及活性CDC37在乳腺癌发展过程中的表达水平不随肿瘤的发展而变化，同样，hsp90的表达水平无明显变化，但肿瘤组织中K292位点乙酰化的hsp90随着肿瘤的不断发展，其表达水平不断升高，结果表明，K292乙酰化的hsp90和肿瘤的发展呈现正相关。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种成熟脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤Ⅰ、确定自噬相关蛋白A存在乙酰化修饰
先进行培养脂肪细胞，并诱导其分化为成熟脂肪细胞，后给予去乙酰化酶抑制剂处理，最后采用免疫沉淀的方法确定蛋白A存在乙酰化修饰；
步骤Ⅱ、质谱分析或软件预测蛋白A可能的乙酰化位点
步骤Ⅲ、乙酰化位点鉴定
工具细胞：用293T细胞进行乙酰化位点鉴定，构建乙酰化位点突变的质粒，转染293T细胞，采用免疫沉淀的方法观察位点突变后蛋白A的乙酰化水平变化；
成熟脂肪细胞：构建乙酰化位点突变的慢病毒，感染成熟脂肪细胞，采用免疫沉淀的方法观察位点突变后蛋白A的乙酰化水平变化；
步骤Ⅳ、乙酰化位点功能研究
自噬相关蛋白A的功能是研究其对自噬的影响，后续对各条通路针对不同动物模型、疾病具体进行研究；
自噬相关蛋白A的过表达慢病毒和乙酰化位点突变的过表达慢病毒分别感染成熟脂肪细胞；
透射电镜观察自噬小体的变化；
同时感染GFP-LC3慢病毒，共聚焦荧光显微镜观察GFP-LC3点状聚集的情况；
Western blot检测自噬标志蛋白LC3的表达变化；
给予羟氯喹处理后，再次通过Western blot检测自噬标志蛋白LC3的表达变化，即是利用自噬通量的方法检测对自噬的影响。
2.根据权利要求1所述的一种成熟脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法，其特征在于：所述脂肪细胞采用3T3-L1细胞系。
3.根据权利要求1所述的一种成熟脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法，其特征在于：所述乙酰化酶抑制剂采用尼克酰胺(NAM)和制滴菌素A(TSA)。
4.根据权利要求1所述的一种成熟脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法，其特征在于：所述免疫沉淀法是采用蛋白A的抗体将经乙酰化酶抑制剂处理后的成熟脂肪细胞进行沉淀，并用通用乙酰化抗体进行杂交以确定蛋白A存在乙酰化修饰。
5.根据权利要求1所述的一种成熟脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法，其特征在于：所述蛋白A可能的乙酰化位点在进行预测时，从UniProt、CPLM和NCBI蛋白质数据库中收集原核生物蛋白质乙酰化数据作为参照。
6.根据权利要求1所述的一种成熟脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法，其特征在于：所述软件预测是采用MATLAB软件和C#编程语言的预测软件平台ProAcePred，且所述预测软件平台ProAcePred在用户提交至少一条原核蛋白质序列，即可自动给出其蛋白质潜在的乙酰化位点信息，实现对蛋白A乙酰化位点的高通量预测。
7.根据权利要求1所述的一种成熟脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法，其特征在于：所述质谱分析是利用开源免费软件ProteoWizard将质谱采集的原始数据转化为可视化的mgf格式的数据。
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