CN112189624A - 一种利用受体基因沉默技术构建和鉴定女性ad模型的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用催产素受体基因沉默技术构建女性AD模型的方法及鉴定方法，通过构建并筛选得到AAV9‑Oxtr‑RNAi载体，利用脑立体定位将AAV9‑Oxtr‑RNAi病毒注射大鼠基底核区，根据脑部感染病理状态，结合临床女性因雌激素下降引起的老年痴呆症状进行检测评估，将大鼠随机分为sham组、con‑shRNA对照组、OXTR‑shRNA组，采用行为学Morris水迷宫实验和明暗箱实验检测大鼠的学习记忆能力；Elisa试剂盒检测大鼠脑组织皮质雌激素（Estrogen，E2）水平和乙酰胆碱神经递质（acetylcholine,Ach）水平变化；结合免疫荧光技术，观察脑基底核胆碱能神经元纤维投射区海马的传入神经纤维分别与OTR、ChAT的共定位及表达情况，可更好地探索和研究女性阿尔茨海默病的发病机制及其病理变化提供依据。
Description
技术领域
本发明涉及受体基因沉默技术领域，具体涉及一种利用受体基因沉默技术构建和鉴定女性AD模型的方法。
背景技术
阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种慢性进行性神经系统变性疾病，为常见的痴呆类型，其发病率逐年增加。目前，我国AD患者达到600万-1000万人，已是继心血管疾病和肿瘤之后的老年人死亡的第三大病因。胆碱能损伤是AD发病机制的核心，表现为神经元突触功能异常、锥体神经细胞丢失以及乙酰胆碱大量降解等，进而引起和促进一系列病理变化，最终导致AD复杂多样的病理特征和临床表现。因此临床上用于治疗AD的一线药物主要是拟胆碱药物，但其治疗效果并不理想，仅对1/3患者有改善，且不能完全控制疾病的发展，其长期效用也需进一步证实。由此可见，开发不仅能够对胆碱能神经元有调节作用，而且对多个AD特征的病理变化也有作用的新药将具有重要的现实意义和广阔的应用前景。
最新流行病学调查表明：1990-2014年65岁以上老年痴呆患病率为3%-8%，随着年龄组越高，患病率越高。60-64岁、65-69岁患病率男性高于女性，70-74岁、75-79岁、80-84岁、85岁以上患病率女性高于男性。研究发现，绝经早期开始给予雌激素补充治疗，持续5年时间，女性患AD的风险下降30％左右，连续使用10年以上，该风险降低更显著，尤其对于一些语言能力障碍、认知能力差的妇女有明显的效果。可见，AD高发群体为高龄老人和女性群体，除了女性平均寿命较长的原因外，绝经后妇女体内雌激素水平迅速下降也与AD之间存在某种联系。雌激素作为神经系统中一种重要的信号分子，不仅影响神经系统的结构和功能，还具有促进神经元存活、生长、修复、再生和神经突触可塑性等重要作用。胆碱能损伤是AD发生的关键机制，是神经元凋亡等其他AD发病机制的重要基础，最新的研究证实胆碱能和雌激素在脑内形成网络作用，通过各自信号通路发生相互作用改善AD病理状态。因此，寻找特异性的干扰胆碱能和雌激素相关信号通路的动物模型，可能成为防治女性老年痴呆的关键，也将成为医学界研究的热点趋势。
近年来研究发现，雌激素与胆碱能通路并不是简单运作的，它们之间存在着催产素，使得雌激素通路和胆碱能通路密切的相互联系，形成“串话”（Crosstalk）。一方面，雌激素调控催产素（oxytocin，OT）在下丘脑室旁核（paraventricular nucleus，PVN）神经细胞的合成；雌激素参与调节催产素受体（oxytocin receptor，OTR）在靶区域的表达，进而影响社会认知行为。OT通过与OTR结合发挥作用，OTR在脑内的表达又随雌激素水平升高而增加。由此可见，雌激素对催产素通路的调控是正调控效应。另一方面，不仅在以胆碱能神经元为主的基底前脑Meynert基底核（nucleus basalis of Meynert，NBM）中有大量催产素受体，而且在与学习记忆密切相关的胆碱能投射靶区海马和皮质也有催产素能神经纤维的传入。
发明内容
本发明的目的在于通过高效AAV9-Oxtr-RNAi 构建SD大鼠基底核区神经元催产素受体腺相关病毒载体（rAVV2-EGFP-OTR shRNA）动物模型，检测其病理形态以及脑内关键递质变化等，更好地探索和研究女性阿尔茨海默病的发病机制及其病理变化提供基础。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种利用受体基因沉默技术构建女性AD模型的方法，包括以下步骤：
（1）随机选取50只雌性大鼠，将其分成sham组、con-shRNA对照组、OXTR-shRNA组，OXTR-shRNA组分为低剂量模型组、中剂量模型组、高剂量模型组，每组10只；
（2）动物麻醉后，在大鼠脑立体定位仪上固定，常规头皮消毒后，暴露前囟并标记前囟位置，根据Paxinos和Watson的《大鼠脑立体定位图谱》确定的基底前脑坐标点（AP：-1.0mm，L：±2.7mm，V：7.8mm）调整好钻孔位置，用三棱针在进针处钻孔；
（3）微量进样器抽取0.2μl空病毒载体rAAV2-EGFP以5nl/s的速度单侧注入con-shRNA对照组的基底前脑；微量进样器抽取0.2μl（C=0.558 v.g/ml；C=1.116v.g/ml，C=2.232v.g/ml）病毒质粒rAAV2-EGFP-OTR shRNA以5nl/s的速度分别单侧注入低剂量模型组、中剂量模型组、高剂量模型组的基底前脑，注射完后留针5min；
（4）大鼠分别于注射病毒第二周、第三周、第四周、第五周取脑和血清，用于后期实验研究。
进一步的，所述大鼠为6月龄SPF级雌性SD大鼠。
一种利用受体基因沉默技术鉴定女性AD模型的方法，包括以下步骤：
（1）Morris水迷宫实验：
S1：Morris水迷宫的装置：所述装置包括记录系统、直径180cm、高50cm的圆形水池以及直径12cm，高30cm的平台，水池平均分为四象限，注内壁为黑色，将平台放入其中1个象限中；
S2：适应性训练：为让大鼠适应，在测试进行的前1天，便要将大鼠放在平台上1min，然后从不同象限入水训练2次，每次120s；找不到站台的大鼠，则人为引导其至站台，保持20s；
S3：定位航行试验：测试第1-5天，平台没于水面下1-2cm，大鼠每天测试120sX4次，大鼠120s未找到平台，则将其置于平台停滞20s，同时记录大鼠逃避潜伏期、游泳的路程、游泳速度；
S4：空间探索试验：第6天，撤掉平台，入水点则设定在原平台的对侧，记录大鼠在120s内停滞在原平台象限的时间、越过原平台位置的次数和其游泳路程；
（2）明暗箱实验：
所述明暗箱实验的装置包括观察装置、视频采集卡、避暗视频分析软件及主控箱，所述观察装置由隔音箱及避暗组件构成，大鼠的观察装置为250×250mm，小鼠的观察装置为125×125mm，所述避暗组件由由2个小室组成，之间用拱门相通，一个小室（明箱）以强白光照射，但不通电，另一个小室（暗室）微弱的红光，但是底部通电间，根据大鼠喜欢在暗箱活动，记录大鼠去暗箱的探究潜伏期以及次数，判断实验鼠记忆障碍情况。
（3）脑组织样品处理：
S1：行为学测试结束后，禁食12h，每组随机抽3-4只大鼠来制备组织切片标本，用剂量为0.3g/kg的4%水合氯醛来麻醉大鼠，经眼球取血，静置2小时，4℃、1000rpm、离心20mi后再分装血清，之后保存在-80℃冰箱；
S2：扎破右心耳，从心尖处朝向主动脉弓方向灌注0.9%生理盐水，在流出液体并澄清后用福尔马林冲洗，断头分离脑待用；
（4）ELISA法检测学习记忆相关递质Ach和E2的含量
（5）免疫荧光法检测脑组织海马区OTR和ChAT蛋白表达
S1：将冰冻切片于 PBS 中室温平衡 15min，然后置于 2mol/L，盐酸溶液中，37℃恒温摇床孵育 30min，再于 0.1mol/L硼酸溶液中孵育 2 次，每次 5min，TBS 漂洗；
S2：用 10%封闭驴血清孵育 60min，加一抗，4℃孵育过夜，然后吸出抗体，TBS 漂洗；
S3：加荧光标记的二抗，37℃恒温摇床上孵育 1h，TBS 漂洗，将切片贴在载玻片上，盖上盖玻片封好；
S4：免疫荧光的结果判读：通过DAPI 进行染色，染色后出来的细胞核可以在紫外光的激发下显色为蓝色，阳性结果的表达情况为相应的荧光素标记的结果为红色光或者粉色光。
进一步的，所述水迷宫定位航行实验，数据采用一般线性模型（General LinearModel）中重复测量的方差分析（Repeated Measures ANOVA）进行处理，分析1-5天各组逃避潜伏期数据的统计学差异；采用LSD（Least-significant Difference）法进行组间两两比较（Post Hoc Multiple Comparison）；穿越平台次数、平台象限活动时间和ELISA数据用GraphPad Prism6统计软件分析处理，采用 表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05差异有统计学意义。
进一步的，所述Morris水迷宫实验中的S5中，每只大鼠进行实验前应更换透明玻璃圆桶内的实验用水，避免粪便气味等对实验结果的影响，在实验结束后，给实验鼠擦拭，电暖气烘干放回鼠笼。
本发明的有益效果：（1）Morris水迷宫实验结果显示，采用shRNA干扰大鼠基底前脑OTR基因后，OTR-shRNA鼠出现学习记忆障碍，明暗箱实验结果提示，在单次电击刺激训练中（1day），正常组与OTR-shRNA组大鼠探究暗箱的潜伏期无明显变化，经电刺激后，OTR-shRNA组大鼠探究暗箱的潜伏期最短，OTR-shRNA鼠出现短暂记忆障碍。Elisa结果显示，与正常对照组比较，OXTR-shRNA组皮质中E2与Ach水平显著降低，免疫荧光染色结果显示OXTR-shRNA组大鼠海马神经元OTR、ChAT表达明显减少，提示OTR shRNA基因大鼠模型具有AD特点；（2）成功构建介导 sh RNA 表达的重组腺相关病毒系统，建立了一种有效的大鼠基底前脑OXTR敲减动物模型，为更好地探索和研究女性阿尔茨海默病的发病机制及其病理变化提供基础。
附图说明
图1为脑立体定位手术示意图；
图2为脑基底核区注射2周、3周、4周、5周病毒后的感染情况；
图3为OTR-shRNA 大鼠皮质中雌激素水平的检测结果图；
图4为OTR-shRNA大鼠皮质中乙酰胆碱递质水平的检测结果图；
图5为OTR-shRNA大鼠1-5天水迷宫学习记忆变化；
图6为明暗箱法检测OTR-shRNA大鼠学习记忆情况；
图7为 OTR-shRNA大鼠海马区ChAT免疫荧光染色；
图8为OTR-shRNA大鼠海马OTR免疫荧光染色。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例：
如图1所示，一种利用受体基因沉默技术构建女性AD模型的方法，包括以下步骤：
（1）随机选取50只雌性大鼠，将其分成sham组、con-shRNA对照组、OXTR-shRNA组，OXTR-shRNA组分为低剂量模型组、中剂量模型组、高剂量模型组，每组10只；
（2）动物麻醉后，在大鼠脑立体定位仪上固定，常规头皮消毒后，暴露前囟并标记前囟位置，根据Paxinos和Watson的《大鼠脑立体定位图谱》确定的基底前脑坐标点（AP：-1.0mm，L：±2.7mm，V：7.8mm）调整好钻孔位置，用三棱针在进针处钻孔；
（3）微量进样器抽取0.2μl空病毒载体rAAV2-EGFP以5nl/s的速度单侧注入con-shRNA对照组的基底前脑；微量进样器抽取0.2μl（C=0.558 v.g/ml；C=1.116v.g/ml，C=2.232v.g/ml）病毒质粒rAAV2-EGFP-OTR shRNA以5nl/s的速度分别单侧注入低剂量模型组、中剂量模型组、高剂量模型组的基底前脑，注射完后留针5min；
（4）大鼠分别于注射病毒第二周、第三周、第四周、第五周取脑和血清，用于后期实验研究。
进一步的，所述大鼠为6月龄SPF级雌性SD大鼠。
一种利用受体基因沉默技术鉴定女性AD模型的方法，包括以下步骤：
（1）Morris水迷宫实验：
S1：Morris水迷宫的装置：所述装置包括记录系统、直径180cm、高50cm的圆形水池以及直径12cm，高30cm的平台，水池平均分为四象限，注内壁为黑色，将平台放入其中1个象限中；
S2：适应性训练：为让大鼠适应，在测试进行的前1天，便要将大鼠放在平台上1min，然后从不同象限入水训练2次，每次120s；找不到站台的大鼠，则人为引导其至站台，保持20s；
S3：定位航行试验：测试第1-5天，平台没于水面下1-2cm，大鼠每天测试120sX4次，大鼠120s未找到平台，则将其置于平台停滞20s，同时记录大鼠逃避潜伏期、游泳的路程、游泳速度；
所述水迷宫定位航行实验，数据采用一般线性模型（General Linear Model）中重复测量的方差分析（Repeated Measures ANOVA）进行处理，分析1-5天各组逃避潜伏期数据的统计学差异；采用LSD（Least-significant Difference）法进行组间两两比较（Post HocMultiple Comparison）；穿越平台次数、平台象限活动时间和ELISA数据用GraphPadPrism6统计软件分析处理，采用 表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05差异有统计学意义；
S4：空间探索试验：第6天，撤掉平台，入水点则设定在原平台的对侧，记录大鼠在120s内停滞在原平台象限的时间、越过原平台位置的次数和其游泳路程；
（2）明暗箱实验：
所述明暗箱实验的装置包括观察装置、视频采集卡、避暗视频分析软件及主控箱，所述观察装置由隔音箱及避暗组件构成，大鼠的观察装置为250×250mm，小鼠的观察装置为125×125mm，所述避暗组件由由2个小室组成，之间用拱门相通，一个小室（明箱）以强白光照射，但不通电，另一个小室（暗室）微弱的红光，但是底部通电间，根据大鼠喜欢在暗箱活动，记录大鼠去暗箱的探究潜伏期以及次数，判断实验鼠记忆障碍情况；
（3）脑组织样品处理：
S1：行为学测试结束后，禁食12h，每组随机抽3-4只大鼠来制备组织切片标本，用剂量为0.3g/kg的4%水合氯醛来麻醉大鼠，经眼球取血，静置2小时，4℃、1000rpm、离心20mi后再分装血清，之后保存在-80℃冰箱；
S2：扎破右心耳，从心尖处朝向主动脉弓方向灌注0.9%生理盐水，在流出液体并澄清后用福尔马林冲洗，断头分离脑待用；
（4）ELISA法检测学习记忆相关递质Ach和E2的含量
操作步骤参照上海酶联生物公司的大鼠E2、Ach ELISA试剂盒说明书；
（5）免疫荧光法检测脑组织海马区OTR和ChAT蛋白表达：
S1：将冰冻切片于 PBS 中室温平衡 15min，然后置于 2mol/L，盐酸溶液中，37℃恒温摇床孵育 30min，再于 0.1mol/L硼酸溶液中孵育 2 次，每次 5min，TBS 漂洗；
S2：用 10%封闭驴血清孵育 60min，加一抗，4℃孵育过夜，然后吸出抗体，TBS 漂洗；
S3：加荧光标记的二抗，37℃恒温摇床上孵育 1h，TBS 漂洗，将切片贴在载玻片上，盖上盖玻片封好；
S4：免疫荧光的结果判读：通过DAPI 进行染色，染色后出来的细胞核可以在紫外光的激发下显色为蓝色，阳性结果的表达情况为相应的荧光素标记的结果为红色光或者粉色光。
具体的，鉴定方法的鉴定结果：
（1）OTR shRNA 大鼠模型的构建及注射基底核区荧光检测：
如图2所示，选择脑基底核区注射病毒后的2-5周进行观察，由rAVV2-EGFP-OTR shRNA注射基底核区荧光检测可以看出，第三周中剂量组病毒表达理想，感染率明显增加，此时为通过催产素受体基因沉默建造阿尔茨海默症模型的最佳模型；第四周，第五周时病毒大量感染，催产素受体基因表达可能大幅下降，此时造模周期时间太长，产生脑内应激反应较大，学习记忆能力出现不可逆的下降，所以对其继续进行研究的意义和价值不大。图中，A.阴性对照病毒剂量 1.116 v.g/ml；B.低剂量:0.558 v.g/ml；C.中剂量:1.116 v.g/ml；D.高剂量:2.232v.g/ml。
（2）OTR-shRNA 大鼠皮质雌激素水平的影响
如图3清楚的显示，OXTR-shRNA大鼠皮质中雌激素的水平显著下降，与Sham组和con-shRNA组比较有显著差别（P<0.05），说明OTR-shRNA大鼠可引起脑内雌激素水平下降，提示该动物模型可很好的模拟临床出现由雌激素水平下降导致女性AD的病理生理状态。
（3）OTR-shRNA 大鼠皮质区Ach神经递质水平的影响
如图4所示，单因素方差分析，组间两两比较显示，OTR-shRNA组皮质中Ach浓度、和正常组比较有明显的减少，且差异有统计学的意义（P<0.05），提示OTR-shRNA 大鼠脑皮质区出现与学习记忆密切相关的乙酰胆碱神经递质减退症。
（4）OTR-shRNA模型大鼠行为学检测：
如图5所示，逃避潜伏期（Escape latency）经重复测量方差分析，实验动物的逃避潜伏期随着训练天数的增加呈现缩短趋势，OTR-shRNA组第3-5天逃避潜伏期比正常组延长，差异有统计学意义（第5天：P<0.05）；提示OTR-shRNA组实验鼠表现出AD学习记忆能力障碍的状态。
从图6可以看出，在单次电击刺激训练中（1day），三组大鼠去暗箱的潜伏期无明显变化，大鼠经训练后，在记忆保持测试中（2 day），模型组(OTR-shRNA组)的潜伏期最短。说明，OTR-shRNA大鼠的刺激记忆能力有损害，提示OTR-shRNA大鼠作为AD动物模型的可行性。
（5）免疫荧光检测ChAT、OTR在海马CA1区的表达情况
图7为各组大鼠海马ChAT免疫荧光染色结果。结果显示ChAT主要分布在细胞浆和细胞膜。OTR-shRNA组ChAT粉红色荧光强度较对照组弱，荧光范围小。
图8为各组大鼠海马OTR免疫荧光染色结果。OTR-shRNA组OTR红色荧光强度较对照组弱，荧光范围小。提示OXTR基因沉默后，影响学习记忆密切的海马区的OTR的表达。
综上所述，本发明的Morris水迷宫实验结果显示，采用shRNA干扰大鼠基底前脑OTR基因后，可致大鼠认知出现障碍，Elisa结果显示，与正常对照组比较，OXTR-shRNA组皮质中E2与Ach水平显著降低，免疫荧光染色结果显示OXTR-shRNA组大鼠海马神经元OTR、ChAT表达明显减少，提示OTR shRNA基因大鼠模型具有AD特点；成功构建介导 sh RNA 表达的重组腺相关病毒系统，建立了一种有效的大鼠基底前脑OXTR敲减动物模型，为更好地探索和研究女性阿尔茨海默病的发病机制及其病理变化提供基础。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (5)
1.一种利用受体基因沉默技术构建女性AD模型的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）随机选取50只雌性大鼠，将其分成sham组、con-shRNA对照组、OXTR-shRNA组，OXTR-shRNA组分为低剂量模型组、中剂量模型组、高剂量模型组，每组10只；
（2）动物麻醉后，在大鼠脑立体定位仪上固定，常规头皮消毒后，暴露前囟并标记前囟位置，根据Paxinos和Watson的《大鼠脑立体定位图谱》确定的基底前脑坐标点（AP：-1.0mm，L：±2.7mm，V：7.8mm）调整好钻孔位置，用三棱针在进针处钻孔；
（3）微量进样器抽取0.2μl空病毒载体rAAV2-EGFP以5nl/s的速度单侧注入con-shRNA对照组的基底前脑；微量进样器抽取0.2μl（C=0.558 v.g/ml；C=1.116v.g/ml，C=2.232v.g/ml）病毒质粒rAAV2-EGFP-OTR shRNA以5nl/s的速度分别单侧注入低剂量模型组、中剂量模型组、高剂量模型组的基底前脑，注射完后留针5min；
（4）大鼠分别于注射病毒第二周、第三周、第四周、第五周取脑和血清，用于后期实验研究。
2.根据权利要求1所述的一种利用受体基因沉默技术构建女性AD模型的方法，其特征在于：所述大鼠为6月龄SPF级雌性SD大鼠。
3.一种利用受体基因沉默技术鉴定女性AD模型的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）Morris水迷宫实验：
S1：Morris水迷宫的装置：所述装置包括记录系统、直径180cm、高50cm的圆形水池以及直径12cm，高30cm的平台，水池平均分为四象限，注内壁为黑色，将平台放入其中1个象限中；
S2：适应性训练：为让大鼠适应，在测试进行的前1天，便要将大鼠放在平台上1min，然后从不同象限入水训练2次，每次120s；找不到站台的大鼠，则人为引导其至站台，保持20s；
S3：定位航行试验：测试第1-5天，平台没于水面下1-2cm，大鼠每天测试120sX4次，大鼠120s未找到平台，则将其置于平台停滞20s，同时记录大鼠逃避潜伏期、游泳的路程、游泳速度；
S4：空间探索试验：第6天，撤掉平台，入水点则设定在原平台的对侧，记录大鼠在120s内停滞在原平台象限的时间、越过原平台位置的次数和其游泳路程；
（2）明暗箱实验：
所述明暗箱实验的装置包括观察装置、视频采集卡、避暗视频分析软件及主控箱，所述观察装置由隔音箱及避暗组件构成，大鼠的观察装置为250×250mm，小鼠的观察装置为125×125mm，所述避暗组件由由2个小室组成，之间用拱门相通，一个小室（明箱）以强白光照射，但不通电，另一个小室（暗室）微弱的红光，但是底部通电间，根据大鼠喜欢在暗箱活动，记录大鼠去暗箱的探究潜伏期以及次数。
（3）脑组织样品处理：
S1：行为学测试结束后，禁食12h，每组随机抽3-4只大鼠来制备组织切片标本，用剂量为0.3g/kg的4%水合氯醛来麻醉大鼠，经眼球取血，静置2小时，4℃、1000rpm、离心20mi后再分装血清，之后保存在-80℃冰箱；
S2：扎破右心耳，从心尖处朝向主动脉弓方向灌注0.9%生理盐水，在流出液体并澄清后用福尔马林冲洗，断头分离脑待用；
（4）ELISA法检测学习记忆相关递质Ach和E2的含量
（5）免疫荧光法检测脑组织海马区OTR和ChAT蛋白表达：
S1：将冰冻切片于 PBS 中室温平衡 15min，然后置于 2mol/L，盐酸溶液中，37℃恒温摇床孵育 30min，再于 0.1mol/L硼酸溶液中孵育 2 次，每次 5min，TBS 漂洗；
S2：用 10%封闭驴血清孵育 60min，加一抗，4℃孵育过夜，然后吸出抗体，TBS 漂洗；
S3：加荧光标记的二抗，37℃恒温摇床上孵育 1h，TBS 漂洗，将切片贴在载玻片上，盖上盖玻片封好；
S4：免疫荧光的结果判读：通过DAPI 进行染色，染色后出来的细胞核可以在紫外光的激发下显色为蓝色，阳性结果的表达情况为相应的荧光素标记的结果为红色光或者粉色光。
4.根据权利要求3所述的一种利用受体基因沉默技术鉴定女性AD模型的方法，其特征在于：所述水迷宫定位航行实验，数据采用一般线性模型（General Linear Model）中重复测量的方差分析（Repeated Measures ANOVA）进行处理，分析1-5天各组逃避潜伏期数据的统计学差异；采用LSD（Least-significant Difference）法进行组间两两比较（Post HocMultiple Comparison）；穿越平台次数、平台象限活动时间和ELISA数据用GraphPadPrism6统计软件分析处理，采用 表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05差异有统计学意义。
5.根据权利要求3所述的一种利用受体基因沉默技术鉴定女性AD模型的方法，其特征在于：所述Morris水迷宫实验中的S4中空间探索试验：第6天，撤掉平台，入水点则设定在原平台的对侧，记录大鼠在120s内停滞在原平台象限的时间、越过原平台位置的次数和其游泳路程。
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