CN113571163A - 一种构建全脑神经元网络连接图谱的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及神经科学技术领域，具体涉及一种构建全脑神经元网络连接图谱的方法。本发明提供的构建全脑神经元网络连接图谱的方法包括：将荧光标记物注射至脑区，进行脑坐标定位，对目标脑区进行示踪病毒的立体定位微量注射，在病毒表达期后，取脑组织样本，将所述脑组织样本制备为脑组织切片，对所述脑组织切片进行连续扫描成像，获得全脑图像，使用交互式WholeBrain框架对所述全脑图像进行数据统计和分析，获得所述目标脑区与全脑范围连接的图谱。本发明对于全脑连接图谱构建的整个流程提供了详细系统的方法，为全脑连接图谱的构建提供了有效、便捷的方法，极大地提高了全脑连接图谱构建的工作效率和准确性。
Description
技术领域
本发明涉及神经科学技术领域，具体涉及一种构建全脑神经元网络连接图谱的方法。
背景技术
大脑是自然界中最复杂的系统之一，根据研究人员的估计，人脑大约有860亿个神经元和大量的神经胶质细胞，它们形成了高度复杂的大脑结构网络。这个庞大而复杂的网络是大脑中认知表达和信息处理的生理基础。大脑中的大量不同类型的神经元以及数以万亿的突触连接(Azevedo FA,Carvalho LR,Grinberg LT,et al.Equal numbers ofneuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain.J Comp Neurol.2009.513(5):532-41.Herculano-Houzel S.Thehuman brain in numbers:a linearly scaled-up primate brain.Front HumNeurosci.2009.3:31.Koch C,Reid RC.Neuroscience:Observatories of themind.Nature.2012.483(7390):397-8.)并非离散的孤立的结构单元或者化学物质的集合体(Lehrer J.Neuroscience:Making connections.Nature.2009.457(29):524-27.)，它们彼此纵横交错、互相连接形成复杂的统一体，将大脑在时空尺度上的连接形成动态的复杂功能网络，实现大脑从解剖上的结构网络扩展到大脑的功能网络。结构和功能是密不可分的，结构是功能的基础，功能是结构的表征。绘制全脑拓扑图有助于获得全脑的神经网络连接结构。
由于示踪等技术限制等方面的原因，以往人们对神经系统的连接的研究多局限在某一个脑区，或者一群神经元与另一个或几个脑区之间的连接，并没有严格意义上的全脑范围的连接，因而对脑结构和功能了解较为片面，限制了对脑的正常运行机制和发病机理进行全面准确的判断。近年来，世界各国的神经科学家越来越充分地认识到构建全脑网络结构的重要性，绘制全脑神经连接的图谱已成为国际生命科学和未来发展研究的重点。全脑的连接图谱对于分析脑部疾病的形成以及分析大脑的工作机制，发病机理和预防至关重要，绘制全脑图谱对科学领域和生命健康具有重要意义。
精准地标记神经环路是了解大脑功能的关键。用于神经网络示踪的传统方法包括染料、Golgi染色等(朱贺,徐丽丽,李丽,马克涛,赵磊,司军强.常用神经示踪剂及其示踪特点研究进展.神经损伤与功能重建.2009.4(04):288-290.)，这些方法虽然可以显示神经元的形态和投射，但均具有标记效率不高，非特异性方向和传递过程中信号严重衰减的缺点。随着技术的进步许多用途广泛的，高度敏感的，并能选择性地进行顺行示踪、逆行标记的示踪物质被应用到神经系统连接的研究中，这在神经解剖学的发展中起到了巨大的推动作用。近十多年来，病毒是使用最多的示踪剂，病毒载体能够很好地标记神经元环路。病毒能在宿主神经元中扩增，并能实现特异性细胞类型标记，这是病毒用作示踪剂的独特功能。根据不同要求可以选择敏感性强并能选择性地进行顺行、逆行标记的示踪物质，来更好地研究脑区的神经环路，绘制出详细的神经网络拓扑图。
早期传统的示踪在技术方面存在一定的局限性，对脑区的连接研究只能进行一定程度的定性分析，只能观测到目标脑区对某一目标脑区是否有投射，通过肉眼判断大致的投射量，而无法实现定量比较，由此阻碍了对目标脑区与全脑的环路连接的全面解析。传统的人工方法是根据每一个脑片图像与脑图谱(Franklin KB,Paxions G.The Mouse BrainIn Stereotaxic Coordinates.Third edition.Academic Press.2007.)的相应层面手工划分脑区，进行统计。基于脑图谱的定量分析在使用过程中也会遇到问题，因为个体大小形态的差异，注射部位损伤后修复，灌流速度的影响，脱水程度的不同，每一批脑样本的组织形态变异并不完全一致，与标准图谱的匹配上会存在一定的差异，因此或多或少会影响定量分析的最终结果，特别是对于一些脑深部与侧脑室临近区域，可能会存在与标准图谱明显不匹配的现象。近年来发展起来的交互式全脑分区图谱(WholeBrain，http://wholebrainsoftware.org/)(Fürth D,Vaissière T,Tzortzi O,et al.An interactiveframework for whole-brain maps at cellular resolution.Nat Neurosci.2018.21(1):139-149.)，可以进一步去除脱水、固定等步骤导致的组织变形带来的影响，更进一步促进了定量分析的准确性和便捷性。
目前，虽然现有技术中已报道了一些研究目标脑区的神经环路的方法，但是这些方法在准确性，工作效率和质量上仍有待提高。
发明内容
本发明的目的是提供一种构建全脑神经元网络连接图谱的方法。
为实现上述目的，本发明经过反复实验结合交互式全脑分区图谱(WholeBrain))开发了一套绘制目标脑区与全脑范围的连接的拓扑图的方法。
具体地，本发明提供以下技术方案：
本发明提供一种构建全脑神经元网络连接图谱的方法，该方法包括：
将荧光标记物注射至脑区，进行脑坐标定位，
对目标脑区进行示踪病毒的立体定位微量注射，
在病毒表达期后，取脑组织样本，
将所述脑组织样本制备为脑组织切片，
对所述脑组织切片进行连续扫描成像，获得全脑图像，
使用交互式WholeBrain框架对所述全脑图像进行数据统计和分析，获得所述目标脑区与全脑范围连接的图谱。
优选地，在进行脑坐标定位时，使用的荧光标记物为荧光染料羰化青Dil。
在摸索脑坐标的准确位置时，选用合适的染料标记脑区至关重要，传统的方法是用墨汁注射到脑区，然后将脑取出，冷冻之后手动切片观察坐标的位置是否准确，但是，对于比较小、比较深的目标脑区，手切准确性较低，导致脑坐标的误差较大。此外，如果用冰冻切片机切片的话，不进行固定，脑组织将粘糊在切片上，影响观察，但采用墨汁注射标记，在灌流固定时注射部位的墨汁被冲刷洗掉，无法观察到被标记的脑区，因此墨汁注射无法进行灌流固定。本发明尝试采用可靠的荧光标记物进行脑坐标的定位，再进行灌流固定，然后制作脑组织的冰冻切片，荧光显微镜下观察坐标位置是否准确。本发明对不同的荧光染料进行筛选和对比，发现采用荧光染料羰化青(1,1′Dioctadecyl3,3,3′,3′tetramethylindocarbocyanine perchlorate,Dil)进行脑坐标摸索和灌流固定的效果均较优，且该染料的用量少，少量染料就可获得很好的染色效果，被标记处清晰，操作方便，不溶于水，更适于进行灌流后固定，然后利用冰冻切片观察脑坐标的位置，提高了脑坐标定位的准确性，提高了全脑神经元连接网络图谱的准确性。
以上所述的构建全脑神经元网络连接图谱的方法中，在获得脑组织切片后，利用连续荧光自动切片扫描系统将所述脑组织样本的全部脑组织切片按照由前至后的顺序进行自动扫描成像，得到所述脑组织样本的全脑图像。
以上所述的构建全脑神经元网络连接图谱的方法中，使用交互式WholeBrain框架对所述全脑图像进行数据统计和分析包括：对每个脑组织切片上示踪病毒标记的神经元数目进行计数，得到每个脑区中每个标记单元格的像素位置的原始数据。
此外，使用交互式WholeBrain框架对所述全脑图像进行数据统计和分析还包括：将每一层面图像的神经元坐标原始数据转换为R数据，然后将其与对应的鼻尾位置的对齐的相应层面图像注册到艾伦(Allen)标准脑全脑图集中在WholeBrain框架中进行进一步分析，根据WholeBrain框架编辑图集后的脑区的轮廓获得神经元所在的脑区，统计每个脑区中示踪病毒标记的神经元数目。
传统的神经元的注册和映射方法在很大程度上仍依赖于人工检查或注册，并且无法扩展用于分析大型数据集或将多个项目集成到一个数据库中。WholeBrain计算框架是一种交互式全脑分区方法，可实现全脑范围内标记神经元的自动分割，而与成像方法无关。该计算框架提供了广泛的工具：强大的图像处理方法，用于在标准化的大脑图集中映射标记的神经元；以及框架——用于生成神经解剖数据的交互式表示形式。基于该计算框架，可以对数据进行分析并将其显示在不变大小的全脑鼠图集中，从而可以快速进行数据比较，可以量化和空间映射全脑实验的多维数据，并可以在一个标准化的解剖学参考图集中比较整个实验的结果。
本发明使用WholeBrain框架进行数据统计和分析，基于WholeBrain框架中尺度不变的交互式鼠大脑图集，以细胞分辨率自动分区。在自动分区的情况下，当发现脑组织切片形变严重时，可通过肉眼识别实际脑组织切片上的一些显著标志，将图谱上的坐标点进行调整使其与实际脑组织切片一致，然后通过线性变化，对整个脑组织切片的分区进行调整。调整之后，该系统可以实现在细胞和亚细胞分辨率下自动对小鼠大脑进行大规模制图、分析。本发明的数据统计和分析方法利用常见的基础结构快速可视化和共享全脑数据分析大脑环路的结构和功能，有效提高了全脑神经元网络连接图谱构建的效率和准确性。
此外，传统的脑图谱比对只能通过肉眼将实验样本与标准脑图谱进行比对，根据确定不变的一些特定标志，例如纤维，脑室，凹陷等，可以实现较为精准的分区，但是效率很低，因此，难以进行高通量的定量分析。本发明利用Allen标准脑全脑图谱实现了大脑分区的电子化，通过将电子图与像非电子化的脑图谱比对，可以快速实现脑区划分，从而在多个个体间快速进行全脑范围内神经环路的定量比对。
以上所述的方法中，示踪病毒为顺行示踪病毒rAAV和/或逆行示踪病毒retro-AAV。
具体地，可根据分析的需要，使用顺行或者逆行示踪病毒，若观察某脑区的上游输入脑区，可在该脑区注射顺行示踪病毒rAAV；若观察某脑区的下游输出脑区，可在该脑区注射逆行示踪病毒retro-AAV。
优选地，示踪病毒的立体定位注射采用玻璃电极进行。使用玻璃电极进行示踪病毒的注射有利于提高注射的精准性。
所述玻璃电极具有可供注射使用的尖端，尖端直径为10-20μm。
所述玻璃电极优选为将内径为0.33mm的毛细玻璃电极用电极拉制仪拉制成尖端口径合适的电极。
在立体定位微量注射中，目标脑区三维坐标为将小鼠脑颅骨前囟点作为参照点，利用Franklin&Paxinos标准脑图谱确定。
在示踪病毒注射后，经病毒的表达期后，取脑组织样本。具体地，取脑组织样本后，先将脑组织样本在3-5％的PFA溶液中于2-4℃固定10-14h，漂洗固定后的样本，利用18-22％的蔗糖溶液对漂洗后的样本进行脱水，再利用28-32％的蔗糖溶液继续进行脱水，将脱水后的脑组织进行脑组织切片的制备。
本发明所使用的脑组织切片为冰冻切片。冰冻切片可使用冰冻切片机进行制备。
本发明进一步提供所述构建全脑神经元网络连接图谱的方法在全脑神经网络分析或神经元之间的连接关系分析中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明提供的构建全脑神经元网络连接图谱的方法对于定位脑坐标、示踪病毒标记神经元、图像对齐、图像数据统计和分析等全脑连接图谱构建的整个流程提供了详细系统的方法，为全脑连接图谱的构建提供了有效、便捷的方法。同时，该方法极大地提高了全脑连接图谱构建的工作效率和准确性。
附图说明
图1为本发明实施例1中小鼠脑区的解剖位置，其中，A为脑区解剖位置的冠状面展示，前囟，前0.02mm，B为脑区的解剖位置的矢状面展示，中线，侧0.84mm(Franklin&Paxinos标准脑图谱，第三版)；图中，A：anterior，D：dorsal，L：lateral，M：medial，P：posterior，V：ventral。
图2为本发明实施例1中立体定位注射流程，其中，A为微量注射电极，B为微量注射气泵，C为固定小鼠，D为颅骨调平，E为开颅，F为吸取病毒，G为病毒注射。
图3为本发明实施例4中针对一个脑组织样本，自动连续的扫描成像获取的用于统计全脑输入神经元的图像。
图4为本发明实施例4中数据收集过程，其中，A为自动连续的扫描成像，B为手动从前向后对齐过程，C为利用ImageJ软件手动计数过程；空心圆圈代表用逆行病毒标记的神经元。
图5为本发明实施例4中使用交互式WholeBrain框架和脑切片配准的示意图，其中，A为将Allen Atlas注册到一个脑切片，B为手动调整以使AllenAtlas分割区域与切片图像脑区配准对齐；调整前后神经元所在的脑区发生了改变，黑色点代表神经元。
图6为本发明实施例4中在WholeBrain的交互式框架中，脑切片图像的注册和配准过程，其中，A为将Allen Atlas加载到WholeBrain框架中一个脑片的示例，指示脑外围轮廓，心室，前连合等脑区线的轮廓(参见右侧放大图)均位于该部分的精确边界之外，B-D为脑片和Allen Atlas标准脑的配准过程，暗灰色线上的编号点表示根据Allen Atlas上的轮廓位置可进行调整的锚点，B为调整脑外围轮廓过程，C为调整之后的图集的整体外围轮廓与该区域的轮廓很好地匹配，D为调整脑区轮廓过程，表示侧脑室轮廓线条与该区域的确切侧脑室轮廓相去甚远(参见右放大图)，手动更改指示横断面脑区位置界标的轮廓线(如侧脑室，前连合等)，E为调整后的各个脑区轮廓与图像横断面的轮廓非常匹配，包括指示侧脑室的线(参见右放大图)。
图7为本发明实施例4中注册分割结果比较中神经元胞体在调整前后的不同区域分割结果的比较，其中，A为自动注册的结果，B为手动配准的结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中使用的实验动物如下：以C57BL/6J品系实验小鼠为研究对象，小鼠体重保持在25-30g范围内，处于8-10周的年龄，性别均为雄性。
实施例1脑立体定位微量注射
1、选用适合灌流的荧光标记物摸索脑坐标
小鼠脑区的解剖位置如图1所示。采用荧光染料羰化青(1,1′Dioctadecyl3,3,3′,3′tetramethylindocarbocyanine perchlorate,Dil)作为荧光标记物用于脑坐标的摸索，具体如下：
按照下述2中立体定位注射的具体操作步骤中(1)-(5)的方法将小鼠麻醉固定，之后按照步骤(6)吸取病毒的方式吸取Dil溶液，按照步骤(7)的方法注射Dil，注射Dil之后不用静置，取下小鼠，立即心脏灌流，按照鼠脑组织样本的处理过程进行灌流，由于Dil不溶于水，因此灌流过程中不会被冲散，能够很好的固定在注射区域，灌流之后按照鼠脑组织切片的制备过程制备冰冻切片，此过程只保留目标脑区的层面脑片。使用Dil染料的最大优点为：在切片过程中，由于Dil呈粉红色，因此在切片过程中肉眼就很容易观察到切的层面，方便留取脑片，不至于切得过多错过目标脑区，也不至于切得过少、留取过多非目标脑区，这是其他染料不具备的特点。本发明采用染料注射后冰冻切片，然后显微镜下观察摸索的坐标的位置是否准确，很大程度提高了目标脑区的位置的准确性。传统的墨水等染料，易溶于水，注射之后不能灌流固定，不进行固定导致不能用冰冻切片机切片以观察注射位置(若未经固定即冰冻切片，会导致若切片薄、温度稍高即会糊在切片上，若切片太厚，则会错过脑片很多层面，影响目标脑区的准确性)。
该染料用于脑坐标的摸索具有用量少的优势，少量染料即可获得很好的染色效果，被标记处清晰，操作方便，不溶于水，可以进行灌流后固定，然后使用冰冻机切片制备切片，在荧光显微镜下观察脑坐标的位置，提高了坐标的准确性，进而提高了整个全脑连接图谱构建的准确性。
2、示踪病毒的立体定位注射
立体定位注射时小鼠脑目标脑区三维坐标的确定：将小鼠脑颅骨前囟点(Bregam点)作为参照点，利用Franklin&Paxinos标准脑图谱(Franklin KB,Paxions G.The MouseBrain In Stereotaxic Coordinates.Third edition.Academic Press.2007.)来确定目标脑区的三维坐标，距离中线侧向距离坐标(M/L)，距离前囟距离坐标(A/P)，距离颅骨表面深度距离坐标(D/V)。
立体定位注射的具体操作步骤如下：
(1)准备微量注射装置：首先检查立体定位注射仪的各个配件是否完好，检查气压微量注射泵气源是否充足，压力是否在合适范围内。打开数显立体定位注射仪、微量注射泵、以及加热垫电源。调节立体定位仪的三维操作臂，将所有刻度线都归至零位。触摸已经预热的加热垫，确保温度在合37℃左右。
玻璃电极的制备：将内径为0.33mm的毛细玻璃电极用电极拉制仪拉制成尖端口径合适的电极用于微量注射。
取出事先拉制好的玻璃电极，确保电极内部无杂质，保证其通畅。用尖镊子将拉好的玻璃电极尖端剪去一小段，注意保留玻璃电极的尖端直径在合适的范围(一般约10-20μm)。尖端过细或者过粗都会产生不利的影响：如果过细，则在进针时很可能导致玻璃电极的弯曲或者损坏，而在注射时可能出现玻璃电极堵塞问题；如果过粗，在拔针时，在目标脑区中的病毒可能会沿着针道回漏，甚至蔓延到上方临近的脑区造成非特异性标记。将玻璃电极夹持器固定在立体定位仪上面，将玻璃电极和夹持器连接牢固，确保两者之间密闭不漏空气，注意安装过程中不要碰断玻璃电极。
(2)小鼠麻醉：首先给小鼠腹腔注射地塞米松注射液20μl/10g(2mg/ml)，发挥抗炎的作用，30分钟后腹腔注射5％水合氯醛溶液(注射剂量0.1ml/10g)，紧接着腹腔注射0.03ml阿托品注射液(0.1mg/ml)，以减少咽喉部分泌物，防止小鼠在麻醉过程中因咽喉部分泌物过多而发生窒息。等待小鼠完全进入到深度麻醉状态后，通过碘伏棉球对其头部皮毛进行擦拭，在湿润完全后将两耳与两眼间的毛发进行削减，使得其头皮暴露。
(3)小鼠头部固定：将头皮已经暴露的麻醉小鼠放在已经预热的恒温加热垫上，温度控制在37.0±0.2℃。在固定头部之前，采用镊子将小鼠舌头轻轻拉至一侧。小鼠的双侧眼睛涂上医用凡士林，防止光线照射过久导致小鼠视力受损伤以及长时间麻醉引发的结膜干燥受损。然后将小鼠口中门齿固定在鼻夹上，并将鼻夹拧紧。为了保证头部上扬，则需要将鼻夹位置调节到最高的位置。在具体操作过程中，需要先将一侧耳杆设置在鼠脑中的某个位置，接着适当调整鼻夹，在耳杆插入到小鼠一侧耳孔进行拧紧，接着按照相同的方式在另一侧拧紧耳杆。在此过程中需要注意，如果是首次固定小鼠，则小鼠耳孔定位难度较大，必须通过多次练习，在固定完成后先松开鼻夹，将小鼠尾巴缓缓上提，使得其脑部能够在耳杆间转动并且不会滑掉，基于这种方式验证是否正确插入到耳孔中。然后适当调节耳杆位置，保证小鼠头部处于中间位置，将鼻夹调节到最佳位置，目测小鼠脑子大致调制水平位置。剪开头皮之前在头皮下逐层浸润注射30μl 0.5％盐酸利多卡因(5μg/ml)，以减少手术过程中的疼痛感。然后沿着中线将小鼠头皮剪开，确保开口尺寸的合理性，再将目标脑区的颅骨进行暴露，通过棉签清理颅骨表面的筋膜，在清洗之后采用无尘纸进行处理，使颅骨表面干燥。
(4)颅骨调平：在立体定位仪中固定小鼠时，需要避免与玻璃电极接触。然后将玻璃电极移动到Bregam点上方，并调节其与颅骨表面接触，将数显仪上X,Y,Z的坐标值设置为零。继续上调玻璃电极，先向左侧水平方向移动2.0mm的距离，下降玻璃电极至尖端轻触颅骨表面，记录数显仪上Z轴向坐标的数值Z1，然后向右侧水平方向移动2.0mm的距离,下降玻璃电极至尖端轻触颅骨表面，记录数显仪上Z轴向坐标的数值Z2，|Z1-Z2|>0.03mm，则提示左右Z轴向坐标误差较大，需要调节左右耳杆的高度，直至|Z1-Z2|<0.03mm，则认为颅骨左右被调平。注意每一次耳杆高度调节后，必须将玻璃电极尖端移动到Bregam点，然后将数显仪上各个方向坐标重新归零。左右调平后，重新将玻璃电极的尖端移到Bregam点并将数显仪上的X,Y,Z三方向的坐标重新归零。上升玻璃电极，将玻璃电极移动至后囟上方，下降玻璃电极至尖端轻触颅骨表面，记录数显仪上Z轴向坐标的数值Z3，若|Z3|>0.03mm，则提示前后Z轴向坐标不一致，通过调节小鼠鼻夹高度，直至|Z3|<0.03mm。
(5)手术开颅：小鼠颅骨调平后，按照预实验中摸索出的目标脑区相应的坐标，将玻璃电极移到小鼠脑右侧目标脑区上方位置，并将具体的颅骨表面位置进行记录。通过牙科钻适当磨薄目标脑区颅骨，此过程中需要将玻璃电极调节到对应的坐标位置，判断尖端是否处于打磨孔中心，然后对颅骨表面进行清理和干燥处理。
(6)吸取示踪病毒：考虑到在病毒吸取时可能与玻璃电极接触，需要保证在吸取病毒之前，先将注射需使用病毒溶液放置在PCR小管内，并用小架子固定PCR管，然后将玻璃电极移至病毒管上方。吸病毒之前，用注射器推挤出空气来检查玻璃电极是否通畅，是否漏气，然后下将玻璃电极至尖端到PCR管液面以下，对病毒溶液进行吸取，在此过程中实时观测玻璃电极尖端的液面上升状况。
(7)病毒注射：按照相关的坐标，将含有病毒溶液的玻璃电极移动到目标脑区的上方位置，接着对玻璃电极尖端表面的病毒溶液进行擦拭，此过程需要利用通过生理盐水浸润的医用棉签，以保证其清洁性要求。然后通过注射器将目标脑区上方位置的硬脑膜挑开，缓慢下降玻璃电极，当玻璃电极轻轻接触到脑组织表面时，将数显上的Z轴向的数值归零，接着将玻璃电极插入到脑内，在此过程中需要时刻观察是否存在电极尖端的弯曲现象，一旦出现此现象，则需要及时停止插入过程，防止出现玻璃电极的折断，在这种情况下需要重新调节玻璃电极，然后对脑组织表面的残留颅骨以及硬脑膜进行清理，在电极能够正常插入到脑组织中时结束此过程，将玻璃电极下降至目标脑区相对应的深度，静置2分钟，调节微量注射泵控制面板上面的参数(6-10个脉冲，持续时间10-15毫秒，大约20psi)，打开氮气罐(压力0.5MPa)，开始注射病毒，注射过程中密切注意观察玻璃电极中的液面有无下降，液面下降到标记的注射量刻度之后及时关闭注射泵，防止空气打进脑组织。如果发生电极堵塞的情况，则应该去除对应的实验小鼠，并重新设置玻璃电极。
(8)拔针与头皮缝合：在病毒注射结束之后，静置10min，待病毒在注射位点的脑区慢慢吸收一段时间，防止注射之后立即拔针造成病毒的回漏，然后缓慢将玻璃电极拔出。用碘伏棉球清理颅骨，缝合头皮，然后用医用碘伏对伤口进行消毒，给小鼠注射阵痛药物酮咯酸氨丁三醇注射液(20μl/10g,1mg/ml)，抗炎药物0.5％恩诺沙星注射液(20μl/10g)，将小鼠放置加热垫上面保温至苏醒，小鼠清醒之后放回笼中送回动物房，连续给予抗炎镇痛药物三天。
(9)实验台面清理：完成实验后需要先按照相关标准对台面进行清理，其中在消毒方面主要利用了75％的酒精，必须对整个台面以及其他设备、器械等进行全面的消杀，整个实验的详细流程如图2中所示。
在操作过程中必须保持规范性和安全性，其中操作人员必须穿好防护服进行操作，同时病毒注射以及灌流等操作必须在生物安全2级实验室中进行，避免造成不利的影响。
实施例2鼠脑组织样本的处理
注射示踪病毒的小鼠经过2周的病毒表达期后，需要对小鼠进行心脏灌流，取脑。用5％水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，将深度麻醉后的小鼠固定在灌流板上，剪开胸腔，充分暴露心脏，对心脏进行插管之后将右心耳剪开，先通过0.01M PBS缓冲液灌流直至肝脏变白，右心耳流出无血色的液体，继续采用4％多聚甲醛(PFA)溶液进行灌流，在小鼠躯体完全僵硬之后结束此过程。将剥离的鼠脑放置在4％PFA溶液内，并放置在冰箱中固定，保持温度条件为4℃，过夜。之后，采用0.01M PBS缓冲液漂洗样本4-5次，接着利用20％蔗糖溶液完成脱水的过程，直至鼠脑下沉至样本瓶底部，然后将鼠脑样本换至30％蔗糖溶液继续进行脱水，直至鼠脑完全沉到样本瓶底部完成脱水，进行下一步操作冰冻切片。
实施例3鼠脑组织切片的制备
1、组织切片和切片收集：首先将冰冻切片机调至-20℃，等待切片机温度降至-20℃之后，将脑组织从30％蔗糖溶液中取出，用无尘纸轻轻将脑组织表面的溶液吸干，用刀片将脑组织小脑部分削掉小部分使脑底部平整，先在承托脑组织的底座上涂抹部分O.C.T，凝固之后，将底座表面的O.C.T用刀片修平整，将脑组织放在底座上面，然后用O.C.T将脑组织包裹，放在冰冻切片机速冻位置，直至O.C.T和包裹的脑组织完全冷冻僵硬(一般需要20-30分钟)，冷冻时间较短的话，在切片的时候脑组织容易破碎，影响后续的图像处理。将冷冻好的脑组织和底座固定在切片机的底座卡槽中，调整底座的位置，使脑组织和刀片的位置垂直，然后获得全脑冠状面组织切片，确保切片处于30μm的厚度。在采集脑片过程中，需要通过48孔板来装每隔三片取一片的方式获取脑组织，并将其作为全脑输入的数据，即两张之间约相隔120μm。所有的脑片成像之前浸泡于0.01M PBS缓冲溶液中，4℃冰箱保存。
2、贴片和封片：切好的脑片尽快捞出贴片封片，将48孔板中的脑片小心用毛笔移至大的器皿中用0.01M PBS缓冲液漂洗3遍，每次5分钟，然后将脑片小心用毛笔移至载玻片上面，待载玻片上面的脑片半干时，用50％甘油(0.01M PBS缓冲液和甘油1:1配制)封片。在冰箱内保存封好的片子，温度设置在4℃。
实施例4全脑数据的采集与分析方法
将每个样本收集的脑组织切片(脑片)用连续荧光自动切片扫描系统(10×,NA0.4，分辨率0.67μm，Olympus VS120,Japan)对全部脑片按照前、后顺序进行自动扫描成像(图3)，得到针对每个样本的全脑图像。
1、样本成像
上游脑区的输入神经元成像：利用连续荧光自动切片扫描系统×10物镜下，双通道实现连续快速自动扫描。需要先结合荧光信号强度对增益曝和光时间进行调节。同时时刻关注图像质量变化，如果图像存在模糊现象需要进行对焦处理，而如果图像出现水渍，则需要取下片子用滤纸吸干表面的水渍，最终确保所成图像清晰可辨。
2、数据统计与分析方法
使用来自大脑的30μm切片，为了生成病毒标记的上游或下游神经元的全脑分布，使用自动切片扫描系统对每四个脑切片进行成像(图4的A)。使用Image J软件进行细胞计数。在进行细胞计数之前，利用ImageJ软件中的Clear outside插件对每个脑片进行背景清除，然后将每一个脑片置于相同的画布大小，保存图片。然后手动将脑切片图像沿鼻尾轴对齐(图4的B)。
为了在每个区域进行细胞计数，利用ImageJ软件中的Cell counter multi-point插件对每个脑片上病毒标记的神经元数目进行手动计数(图4的C)，得到每个大脑区域中每个标记单元格的像素位置，导出为.csv的原始数据。使用交互式WholeBrain框架(交互式WholeBrain框架(http://wholebrainsoftware.org/)是由Fürth开发的基于R语言的开源软件，Fürth D,Vaissière T,Tzortzi O,et al.An interactive framework for whole-brain maps at cellular resolution.Nat Neurosci.2018.21(1):139-149.)，将对应的鼻尾位置的每个对齐的图像注册到艾伦标准脑全脑图谱中(图5的A，图6)。该框架允许对图像进行手动调整，以根据大脑中的细胞结构标志物来匹配图像。手动校正后神经元区域分割的改善如图5的B和图6的D、E所示。将脑图片注册到Allen标准脑图谱中之后可以看到，标准脑图谱的轮廓(左侧图中的亮灰色线)和实际脑片上的外围轮廓以及脑区的轮廓并没有完全吻合，不能够得到准确的脑区的神经元数量信息。经过WholeBrain框架矫正之后，自动配准的脑轮廓线(右侧图中的暗灰色线)和脑片的外围轮廓以及各个脑区完全吻合，之后生成各个脑区的神经元数量的数据，进行后续的数据分析。具体的配准过程见图6。将具有后缀.csv的原始数据转换为R数据，然后将其与相应层面的图像一起注册到交互式WholeBrain框架中，以便于在交互式WholeBrain框架中进行进一步分析。
将具有细胞计数信息的图像加载到交互式WholeBrain框架后，会自动加载相应的Allen Brain Atlas进行注册(图6)。将脑图片和该图片中被标记的神经元的坐标信息注册到WholeBrain框架的标准脑图集中出现了两个界面，其中，左侧界面如图6的A左侧标准脑的轮廓框架(亮灰色线条)，以及亮灰色线条后面的相应的脑图像，右侧界面自动配准的结果，发现由于注射，灌注或切片可能会导致小鼠大脑某些变形，切片的原始图像没有与标准Allen脑图谱协调(图6的A)，放大的区域可以清楚看到暗灰色线(右侧)的中线1和32之间的线没有在脑图像的中间，有些许的偏差。
WholeBrain框架提供了一个窗口，可以通过此程序编辑脑图集以适应变形的切片。首先，需要根据左侧标准脑轮廓线来调整右侧自动配准的轮廓线，如图6的B右侧所示，调整脑外围轮廓，可以调整数字1-32的位置调整暗灰色线与实际脑图像的轮廓，亮灰色点即为调整各个轮廓点的新的位置，局部放大图可见白色箭头指示的亮灰色点的位置)。经过程调整之后可以看到新的轮廓线(暗灰色)已经与脑图像的外围轮廓相吻合(图6的C)，图6的C的右侧放大图可以看到1和17之间的中线已经移动到了脑图片的中间位置。然后，再调整脑图像里面脑区的轮廓界限，根据一些特征性的脑区来进行调整，如侧脑室，海马，前连合，外囊等轮廓结构清晰的脑区，将这些脑区作为地标性的脑区，来调整其轮廓。如图6的D所示，以调整左侧脑室和前连合的轮廓为例，根据左侧界面左侧侧脑室和前连合的轮廓来调整右侧界面侧脑室和前连合的轮廓，在左侧界亮灰色线围成的左侧侧脑室的轮廓的某一处标记一个点，然后在右侧界面中图片上实际左侧侧脑室的相同的位置标记一个点，图6的D左侧和中间图中用相同符号箭头指示点表示。经过调整之后可以看到，右侧界面中，暗灰色线围成的侧脑室的轮廓(放大图片中数字33-43所围成的侧脑室的轮廓)以及左侧前连合的轮廓线(放大图像中数字44-46所围成的前连合的轮廓)已经和图像中实际的侧脑室以及前连合的位置吻合(图6的E)。结果显示，用WholeBrain框架编辑图集后区域位置的改变，和大脑图谱适应前后神经元分布的差异(图7)，图7的A是开始注册到WholeBrain框架、未进行调整之前的脑轮廓线和神经元的分布情况，图7的B是调整之后脑轮廓线和脑图像吻合之后的神经元分布的脑区。通过对比可以看出WholeBrain框架编辑图集后的脑区的轮廓可以表示出准确的神经元所在的脑区，配准后会自动统计每个脑区标记的细胞的个数，从WholeBrain框架收集数据以进行进一步的统计分析，得到目标脑区与全脑范围的连接的拓扑图。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种构建全脑神经元网络连接图谱的方法，其特征在于，包括：
将荧光标记物注射至脑区，进行脑坐标定位，
对目标脑区进行示踪病毒的立体定位微量注射，
在病毒表达期后，取脑组织样本，
将所述脑组织样本制备为脑组织切片，
对所述脑组织切片进行连续扫描成像，获得全脑图像，
使用交互式WholeBrain框架对所述全脑图像进行数据统计和分析，获得所述目标脑区与全脑范围连接的图谱。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光标记物为荧光染料羰化青Dil。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，利用连续荧光自动切片扫描系统将所述脑组织样本的全部脑组织切片按照由前至后的顺序进行自动扫描成像，得到所述脑组织样本的全脑图像。
4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述数据统计和分析包括：对每个脑组织切片上示踪病毒标记的神经元数目进行计数，得到每个脑区中每个标记单元格的像素位置的原始数据。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述数据统计和分析还包括：将每一层面图像的神经元坐标原始数据转换为R数据，然后将其与对应的鼻尾位置对齐的相应层面图像注册到艾伦标准脑全脑图集中，在WholeBrain框架中进行进一步分析，根据WholeBrain框架编辑图集后的脑区的轮廓获得神经元所在的脑区，统计每个脑区中示踪病毒标记的神经元数目。
6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，所述示踪病毒为顺行示踪病毒rAAV和/或逆行示踪病毒retro-AAV；
优选地，所述示踪病毒的立体定位注射采用玻璃电极进行。
7.根据权利要求1～6任一项所述的方法，其特征在于，所述立体定位微量注射中，目标脑区三维坐标为将小鼠脑颅骨前囟点作为参照点，利用Franklin&Paxinos标准脑图谱确定。
8.根据权利要求1～7任一项所述的方法，其特征在于，取脑组织样本后，先将脑组织样本在3-5％的PFA溶液中于2-4℃固定10-14h，漂洗固定后的样本，利用18-22％的蔗糖溶液对漂洗后的样本进行脱水，再利用28-32％的蔗糖溶液继续进行脱水，将脱水后的脑组织进行脑组织切片的制备。
9.根据权利要求1～8任一项所述的方法，其特征在于，所述脑组织切片为冰冻切片。
10.权利要求1～9任一项所述的方法在全脑神经网络分析或神经元之间的连接关系分析中的应用。
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|---|---|---|---|
| CN202110758540.6A CN113571163A (zh) | 2021-07-05 | 2021-07-05 | 一种构建全脑神经元网络连接图谱的方法 |
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