CN115931811A

CN115931811A - 一种高通量神经环路解析方法和系统

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Publication number: CN115931811A
Application number: CN202310221654.6A
Authority: CN
Inventors: 斯科; 徐晓滨; 龚薇; 段树民; 吕杰; 朱之京
Original assignee: Liangzhu Laboratory
Current assignee: Liangzhu Laboratory
Priority date: 2023-03-09
Filing date: 2023-03-09
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2043-03-09
Also published as: CN115931811B

Abstract

本发明公开了一种高通量神经环路解析方法和系统。神经环路解析方法包括样品制备、超快光清除、高速高分辨脑组织成像、高通量三维图像拼接和自动神经细胞重构。样品制备包括固定、切片、染色等步骤；超快光清除方法只需使用超快光清除试剂孵育脑片3min左右即可；Schwartz调制的晶格光片显微成像具有成像速度快，分辨率高等优势；高通量图像拼接方法能够将荧光显微成像系统得到的光强信号拼接成全脑的三维成像结果；自动神经细胞重构方法能够从全脑的三维成像结果中，自动重构神经元、星形胶质细胞、血管等组织的结构。高通量神经环路解析系统能够在数小时内实现全脑的三维成像和神经环路解析，具有极高的应用和研究价值。

Description

一种高通量神经环路解析方法和系统

技术领域

本发明属于荧光显微成像与重构技术领域，具体涉及一种高通量神经环路解析方法和系统。

背景技术

脑功能的研究对情感、记忆、意识等的脑结构基础和产生机理，神经系统疾病的诊断和治疗，人类生活质量的提高以及脑机系统的开发等都至关重要。神经环路是脑功能的基本单位，负责信息采集、处理、传输等工作，可以说生物体几乎所有的活动都是受神经环路的控制。神经环路解析的基础是脑组织的高分辨率快速三维成像，然而脑组织具有高散射性和高浑浊度，这极大地限制了光学成像系统的成像深度。

光清除技术通过脱色、脱钙和折射率匹配减少散射和折射，提高激发光和发射光的组织穿透能力，从而显著提高光学显微镜的成像深度。然而，现有的光清除技术存在光清除速度与荧光保留能力不兼备的缺陷。光清除技术与光学显微成像技术的结合，使脑片甚至全脑的三维荧光成像成为可能。

光学显微成像技术中，光片荧光显微镜（LSFM）的激发和发射光路相互垂直，采用线扫描或面扫描替代点扫描，显著提高了成像速度，降低了光漂白和光毒性。然而即使是经过光清除的生物组织也并不是完全透明的，LSFM在进行生物组织内部毫米甚至厘米级的深度成像时也存在着组织吸收和散射导致的光针变形、旁瓣干扰大、数据处理困难等问题。

在实现了脑组织的高分辨率快速三维成像之后，还需要对成像结果进行三维图像拼接和神经细胞重构等图像处理操作，以实现神经环路的高通量解析。

发明内容

为了解决背景技术中的问题，本发明提出一种脑片超快光清除方法，并与Schwartz调制的晶格光片显微成像技术相结合，实现脑组织的超快高分辨三维成像，进而提出一种高通量图像拼接与神经细胞重构方法，实现高通量神经环路解析；此外，还提出一种光清除评估方法，实现光清除效果的精准量化评估。

本发明采用的技术方案如下：

一、一种高通量神经环路解析方法，具体步骤如下：

1）对已脱离人体或动物体的脑组织进行固定、切片后获得脑片；

2）对无荧光的脑片进行染色，已表达免疫荧光蛋白的转基因动物（如Thy1-eGFP-M标记的小鼠）无需染色；

3）对所有脑片进行超快光清除，然后进行光清除效果的量化评估，并对评估结果进行判断：若光清除效果T达到85%，执行下一步骤3）；若光清除效果T未达到85%，重复当前超快光清除的操作；

4）利用高速LSFM系统对光清除后的脑片进行超快高分辨成像；

5）将所有脑片的成像结果进行高通量的三维图像拼接和自动神经细胞重构，从而完成高通量神经环路解析。

所述步骤2）中：

染色采用免疫荧光染色、免疫组织化学染色、化学染料染色和病毒感染表达荧光蛋白的方法。免疫荧光染色法具体是：组织样本加入一抗孵育使抗体完全结合靶位点，再使用PBST洗脱多余的一抗，然后加入携带有荧光基团的二抗进行孵育，使二抗与一抗结合，最后用PBST洗脱多余的二抗。

对于自表达荧光蛋白的生物组织，不需要生物组织染色步骤，而是直接进行成像。

所述步骤3）中的超快光清除试剂是尿素溶于二甲基亚砜（DMSO）溶剂中形成的混合试剂。尿素溶于DMSO的质量体积比是25％-35％。

所述的尿素为市售产品，是主要的光清除成分，用于非破坏性的溶解细胞膜，具备快速和强大的脱水作用。还能使蛋白质溶解、变性，增进水合作用，进而提高光清除效果。

所述的DMSO为市售产品，是一种亲水性有机溶剂，不仅可以起到折射率匹配的作用，还能够在膜上诱导出瞬时水孔道，增加生物膜通透性。

超快光清除方法只需将超快光清除试剂滴加到脑片上，孵育3min左右即可，有着操作简单、处理时间快、光清除效果好和荧光保留能力好等优点。

所述步骤3）中，光清除效果的量化评估方法的具体步骤如下：

3.1）将脑片置于透明培养皿中，培养皿置于黑色的拍摄背景上，采用白光照明，利用相机拍摄得到光清除前的脑片图像和光清除后的脑片图像；借助黑色边框和白色填充对拍摄到的图片进行亮度归一化；

拍摄背景中心为黑色实心方框，中心黑框周边均是边框为黑色填充为白色的方格，培养皿放置于中心黑框上；

3.2）对图像的中心黑框进行自动识别，找到中心黑框所在区域进行裁剪，得到裁剪后的图像b；

3.3）对裁剪后的图像进行图像增强处理，提高图像对比度，然后进行二值化；

3.4）对二值化后的图像去孤点，得到图像e，图像e中的白色区域为第一次预识别的脑片区域；去孤点时可以将黑色区域的阈值设置的较大，用于去除噪点，白色区域的阈值设置的较小，避免脑室被误认为是有脑组织的区域；但因为脑片所在区域的光强均值与脑片外的光强均值没有明显的差异，所以第一次预识别的脑片区域坐标往往是不准确的；

3.5）采用预识别的脑片和背景范围的坐标的强度均值对第3.2步的图像b进行处理，增大脑片范围内和范围外的强度差异；

将图像b中与图像e中白色区域对应的区域的坐标的数值增大至两倍以上；

将图像b中与图像e中黑色区域对应的区域的坐标的数值减小至二分之一以下；

3.6）进行降噪和二值化处理；

3.7）再去孤点即可得到脑片所在的区域，白色区域为脑区，黑色区域为非脑区，白色像素点总和即为脑片面积。

将识别出的脑区所有像素点的亮度均值定义为 I，非脑区（背景）所有像素点的亮度均值定义为 I _b，光清除效果T的定义为：

其中， I _o 、I _ob分别为光清除前的脑区与非脑区所有像素点的亮度均值。

利用该光清除量化评估方法，可以对脑片的光清除效果进行精准、高效的量化评价，并将脑片面积的计算精确到像素级。

所述步骤4）中，超快高分辨三维成像的方法为：

4.1）将样品置于透明容器中，其中填充光清除试剂，置于成像系统的物镜焦点处；

4.2）打开激光、高速空间光调制器（SLM）或数字微镜阵列（DMD）、共振振镜电源；

4.3）光经过光束校正后入射到DMD/SLM中生成晶格层光，并对晶格层光进行Schwartz调制，调制函数为：

其中：

其中， t表示光斑半径的平方， θ表示调制片的角度， x表示沿调制片径向方向的坐标，表示调制片内侧收敛系数，表示调制片外侧收敛系数，表示收敛函数，表示收敛系数，收敛系数代表了或者，exp表示常数e；

4.4）Schwartz调制的晶格层光依次经过两个振镜、扫描透镜、套筒透镜实现物光的二维扫描；

4.5）晶格层光最后经过第一个物镜生成光针，步骤4.4）中第二个振镜的作用为将光针变成光片，第一个振镜的作用为实现光片在成像深度方向的扫描；

4.6）光针通过脑组织样品后使免疫荧光蛋白发出荧光，荧光经过第二个成像物镜收集，由sCMOS进行成像。

相比于传统的LSFM，高速LSFM系统利用SLM或DMD对光源进行调制，实现Schwartz调制的晶格层光入射，并采用高速激光扫描振镜和高速sCMOS相机进一步提高成像速度。

所述步骤5）中的高通量图像拼接与神经细胞重构：

超快光清除技术极大地提高了光清除效率，然而其只能实现厚度约300um的脑片的快速光清除。因此为了实现全脑的三维成像和神经环路重构，还需要完成脑片的三维图像拼接和神经细胞重构。

要实现全脑的三维成像，就需要完成三维图像的拼接。然而离体脑片在光清除、成像、二维图像拼接后，脑片之间的相对位置会发生旋转、移动甚至形变。更严重的是脑片与脑片之间不仅没有图像的重叠，而且还会因为脑组织在切片过程中的损失而使脑片不再连续。

本发明针对图像相对位移问题，采用范围识别的方法实现脑片的拼接，范围识别的方法具体为：

利用背景荧光识别出脑片的位置，进而计算出脑片的质心；以质心为依据将多幅脑片图像进行二维平移，使平移后的各图像的质心重合。然后以首幅图像为基准，依次对每幅图像沿质心进行旋转，通过对比基准图像和旋转图像的荧光成像的相关系数，相关系数最大时对应的旋转角度为最终的旋转角度，实现脑片之间的对准。根据相邻两层脑片之间的二维成像结果预测相比原脑组织缺失的部分，并对缺失的组织进行补充。

在完成全脑的三维图像拼接后，本发明开发一种自动神经细胞重构方法，可以实现神经元、星形胶质细胞、血管等组织的自动识别与重构。自动神经细胞重构方法的步骤是：

5.1）对拼接后的三维图像进行归一化、去噪、去孤点等预处理；

5.2）在预处理后的三维图像中先找到极值点，选取其中一种极值点，然后以此极值点为中心，判断与极值点空间相邻的所有点是否满足阈值条件，满足阈值条件的点判断为属于当前重构组织的坐标点；具体的阈值条件为绝对值大于0.3，且大于0.7*中心极值点；

5.3）被判断为细胞的坐标点作为新的中心，该中心处的荧光强度作为阈值的新基数，判断新中心点的周围点是否满足阈值条件，满足阈值条件的点判断为属于当前重构组织的坐标点；重复当前步骤，直至没有点满足阈值条件；

5.4）最后判断此次重构组织是否为细胞组织，将细胞组织保存为新图片，并将此次重构组织从原三维图像中去除；

5.5）更新步骤5.2）的三维图像，再从更新后的三维图像中选取下一个极值点，重复步骤5.2）~5.4），输出步骤5.4）的新图片，直至所有点的荧光强度均为零。

本发明的有益效果是：

1）本发明的超快光清除方法只需使用超快光清除试剂孵育脑片3min左右即可，操作简单、处理时间快、光清除效果好，荧光保留能力好；

2）本发明的超快高分辨三维成像方法具有超快的组织成像速度和较高的成像分辨率；

3）本发明的高通量图像拼接方法能够将显微成像系统得到的脑片荧光成像结果拼接成全脑的三维成像结果；

4）本发明的自动神经细胞重构方法能够从全脑的三维成像结果中，自动重构神经元、星形胶质细胞、血管等组织；

5）本发明的光清除量化评估方法可以对脑片的光清除效果进行精准、高效的量化评价，并将脑片面积的计算精确到像素级。

附图说明

图1是高通量神经环路解析流程图；

图2是光清除试剂制备和处理流程图；

图3是高速高分辨显微成像装置图；

图4是三维成像与神经环路重构结果；（a）神经元的三维成像结果，（b）神经元的神经环路重构，（c）胶质细胞的三维成像结果，（d）胶质细胞的神经环路重构；

图5是光清除效果量化评估流程图；（a）脑片的拍照结果，（b）脑片自动识别结果，（c）图像增强结果，（d）二值化结果，（e）第一次去孤点，（f）图（b）的差异化处理，（g）降噪，（h）第二次二值化的结果，（i）第二次去孤点得到的脑片区域；

图6是人脑病理分析结果图；（a）光清除前的健康人脑血管，（b）光清除前的脑胶质瘤血管，（c）光清除后的健康人脑血管，（d）光清除后的脑胶质瘤血管；

其中，1、小鼠，2、鼠脑，3、人脑，4、脑片，5、染色后的人脑，6、光清除，7、成像，8、样本，9、成像结果，10、尿素，11、DMSO，12、光清除试剂，13、盖玻片，14、样本槽，15、光源，16、滤光片，17、反射镜，18、透镜，19、半波片，20、分束镜，21、SLM或DMD，22、锥形镜，23、振镜，24、扫描透镜，25、套筒透镜，26、物镜，27、sCMOS。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做详细说明。

实施例1

本实例应用于Thy1-eGFP-M转基因小鼠的神经环路解析，如图1所示。

A．首先对Thy1-eGFP-M转基因小鼠（成年雄性或雌性，C57BL/6J品系，饲养环境为25摄氏度，60%湿度，饮食无限制，12小时日夜循环）进行麻醉、灌流、取脑、固定、切片：1）使用浓度为1%的戊巴比妥钠溶液（50mg/kg）对小鼠进行腹腔注射，麻醉小鼠；2）以0℃的0.01M磷酸盐缓冲液（PBS）和多聚甲醛（PFA，4% wt/vol溶于PBS中）进行经心灌流；3）取脑后置于4℃的PFA（4% wt/vol溶于PBS中）溶液中以固定样本；4）用震荡切片机以1mm/s的速度连续切片。

B．然后对小鼠脑组织切片进行组织光清除，如图2所示：1）清洗样本；2）将样本在光清除试剂（DMSO+30% wt/vol尿素）中孵育1-5min；3）完成光清除后立即将样本置于高速LSFM的样本槽中，其中充满光清除试剂。

C．对脑片进行光清除处理之后，即可对样本进行显微成像，如图3所示：1）样本槽置于高速LSFM的物镜焦点处；2）打开激光、SLM或DMD、共振振镜电源；3）SLM或DMD中加载特定图案使物光成为Schwartz调制的晶格层光；4）Schwartz调制的晶格层光依次经过两个共振振镜、扫描透镜、套筒透镜实现物光的扫描；5）光经过第一个物镜生成扫描的光针，激发GFP荧光；6）荧光经过第二个成像物镜收集，由高速sCMOS进行成像。

D．最后进行高通量图像拼接与神经细胞重构，步骤如下：

1）图像拼接：利用背景荧光识别出脑片的位置，进而计算出脑片的质心，以质心为依据将多幅脑片图像进行二维平移，使平移后的各图像的质心重合；然后以首幅图像为基准，依次对每幅图像沿质心进行旋转，通过对比基准图像和旋转图像的坐标的相关系数，确定合适的旋转角度，实现脑片之间的对准；进而基于上层脑片最下方和下层脑片最上方的二维成像结果进行缺失部分的预测，将断裂的突触进行连接。2）神经细胞重构：预处理（归一化、去噪、去孤点等）后先找到一个极值点，然后以此极值点为中心，判断与极值点空间相邻的所有点是否满足阈值条件，满足阈值条件的点判断为神经细胞；被判断为细胞的点坐标作为新的中心，该中心处的荧光强度作为阈值的新基数，直至没有点满足阈值限制再判断此次重构的组织是否为完整细胞；将此次重构的结构从原图中去除后，再开始用下一个极值点重复以上循环，直到没有极值点满足条件为止。三维成像结果和神经细胞重构结果如图4所示，图4中的（a）为神经元的三维成像结果，图4中的（b）为其中一个神经元的神经细胞重构，图4中的（c）为胶质细胞的三维成像结果，图4中的（d）为多个胶质细胞的神经细胞重构。

E．可以选择对光清除效果进行量化评估，如图5所示：1）首先将样品置于培养皿中，透明培养皿放置在中心黑框上；2）如图5中的（a）和图5中的（b）所示，采用白光照明，利用相机对光清除过程进行拍摄成像；3）借助边框为黑色填充为白色的格子对拍摄到的图片进行亮度归一化；4）如图5中的（c）和图5中的（d）所示，进行图像增强处理，提高图像对比度，然后进行二值化；5）如图5中的（e）所示，去孤点，得到第一次预识别的脑片区域；6）如图5中的（f）所示，采用预识别的脑片和背景范围的坐标的强度均值对第3步的结果进行处理，增大脑片范围内和范围外的强度差异；7）如图5中的（g）和图5中的（h）所示，进行降噪和二值化处理；8）如图5中的（i）所示，去孤点即可得到脑片所在的区域，白色区域为脑区，黑色区域为非脑区，白色像素点总和即为脑片面积；9）以脑片范围的亮度均值和脑片外的亮度均值的差值作为光清除效果的评价依据。

实施例2

本实例应用于人脑的神经环路解析。

具体方案与实施例1接近，只是采用的样本为已离体的人脑组织，将人脑组织固定、切片后，还需要进行免疫荧光标记：1）以PBS溶液清洗样本三次，然后置于PBST溶液中；2）使用摇床以80rpm、37℃进行破膜；3）一抗以1:500的体积比稀释在PBST溶液中；4）将样本放入后置于摇床上，以60rpm、37℃孵育；5）用PBST溶液清洗样本三次；6）二抗以1:500的体积比稀释在PBST溶液中；7）将样本放入后置于摇床上，以60rpm、37℃孵育；8）用PBST溶液清洗样本三次。然后再进行光清除和成像，成像结果如图6所示，图6中的（a）图为光清除前的健康人脑血管，图6中的（b）图为光清除前的脑胶质瘤血管，图6中的（c）图为光清除后的健康人脑血管，图6中的（d）图为光清除后的脑胶质瘤血管。可见，光清除前，无法区分健康与患病脑血管的差异；而在光清除后，可以明显看到脑胶质瘤血管相比于正常血管呈环状，且结构紊乱，直径增大。

Claims

1.一种高通量神经环路解析方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将离体的脑组织进行切片，并对获取的脑片进行染色；

2）对所有脑片进行超快光清除，然后进行光清除效果的量化评估，并对评估结果进行判断：若光清除效果T达到85%，执行下一步骤3）；若光清除效果T未达到85%，重复当前超快光清除的操作；

3）利用高速LSFM系统对光清除后的所有脑片进行高速高分辨三维成像；

4）将所有脑片的成像结果进行高通量的三维图像拼接和自动神经细胞重构的图像处理操作，从而完成高通量神经环路解析。

2.根据权利要求1所述的高通量神经环路解析方法，其特征在于，

所述步骤1）中：对已脱离人体或动物体的脑组织进行固定、切片后获得脑片；

所述步骤1）中：只对无荧光的脑片进行染色，已表达免疫荧光蛋白的转基因动物的脑片无需染色。

3.根据权利要求1所述的高通量神经环路解析方法，其特征在于，所述步骤2）中，超快光清除方法具体为：将超快光清除试剂滴加到脑片上，孵育3min；

其中，超快光清除试剂是尿素溶于二甲基亚砜溶剂中形成的混合试剂，尿素与二甲基亚砜溶剂的质量体积比是25％-35％。

4.根据权利要求1所述的高通量神经环路解析方法，其特征在于，所述步骤2）中，光清除效果的量化评估方法具体为：

2.1）将脑片置于透明培养皿中，培养皿置于黑色的拍摄背景上，采用白光照明，利用相机拍摄得到光清除前的脑片图像和光清除后的脑片图像；

2.2）利用拍摄背景方格的黑色边框和白色填充对拍摄的图像进行亮度归一化；

2.3）对图像的中心黑框进行自动识别，找到中心黑框所在区域进行裁剪，得到裁剪后的图像b；

2.4）对裁剪后的图像进行图像增强处理，以提高图像对比度，然后进行二值化；

2.5）对二值化后的图像去孤点，得到图像e，图像e中的白色区域为第一次预识别的脑片区域；

去孤点时，将黑色区域的阈值设置大于白色区域的阈值设置；

2.6）对步骤2.3）的图像b进行处理，以增大脑片范围内和范围外的强度差异，具体为：

2.7）对步骤2.6）处理后的图像进行降噪和二值化处理；

2.8）对步骤2.7）得到的图像再去孤点即可得到脑片所在的区域，其中白色区域为脑区，黑色区域为非脑区，白色像素点总和即为脑片面积；

将识别出的脑区所有像素点的亮度均值定义为I，非脑区所有像素点的亮度均值定义为I _b，光清除效果T的定义为：

其中，I _o 、I _ob分别为光清除前的脑区与非脑区所有像素点的亮度均值。

5.根据权利要求1所述的高通量神经环路解析方法，其特征在于，所述步骤3）中的高速高分辨三维成像具体为：

3.1）将脑片样品置于透明容器中，其中填充光清除试剂，置于成像系统的物镜焦点处；

3.2）打开激光、SLM或DMD、共振振镜电源；

3.3）光经过光束校正后入射到DMD/SLM中生成晶格层光，并对晶格层光进行Schwartz调制，Schwartz调制的晶格层光依次经过两个振镜、扫描透镜和套筒透镜实现物光的二维扫描；

3.4）晶格层光最后经过第一个物镜生成光针；

3.5）光针通过样品后使免疫荧光蛋白发出荧光，荧光经过第二个成像物镜收集，由sCMOS进行成像。

6.根据权利要求1所述的高通量神经环路解析方法，其特征在于，所述步骤4）中，采用范围识别的方法对所有脑片的成像结果进行三维图像拼接，以克服脑片之间发生相对位移的问题，范围识别的方法具体为：

步骤a）利用图像的背景荧光识别脑片的位置，进而计算脑片的质心；以质心为依据将多幅脑片图像进行二维平移，使平移后各图像的质心重合；

步骤b）然后以首幅图像为基准图像，依次对每幅图像沿质心进行旋转，实现各脑片之间的对准。

7.根据权利要求6所述的高通量神经环路解析方法，其特征在于，所述步骤b）中，每幅待旋转图像的旋转角度为：

将待旋转图像进行旋转，每旋转1度，对比基准图像和旋转图像的荧光成像的相关系数，相关系数最大时对应的旋转角度为当前待旋转图像最终的旋转角度。

8.根据权利要求1所述的高通量神经环路解析方法，其特征在于，所述步骤4）中，自动神经细胞重构的方法具体为：

4.1）对拼接后的三维图像进行预处理，包括归一化、去噪、去孤点；

4.2）在三维图像中先找到极值点，选取其中一个极值点，然后以此极值点为中心，判断与极值点空间相邻的所有点的荧光强度是否满足阈值条件，满足阈值条件的点判断为属于当前重构组织的坐标点；

4.3）被判断为重构组织的坐标点作为新的中心，判断新中心点的周围点的荧光强度是否满足阈值条件，满足阈值条件的点判断为属于当前重构组织的坐标点；重复当前步骤，直至没有点满足阈值条件；

4.4）最后判断当前重构组织是否为细胞组织，将属于细胞组织的重构组织保存为新图片；

4.5）将当前重构组织从原三维图像中去除，更新步骤4.2）的三维图像，再从更新后的三维图像中选取下一个极值点，重复步骤4.2）~4.4），每次循环后输出步骤4.4）保存的新图片；直至所有点的荧光强度均为零，停止循环，多次循环后保存的所有新图片为重构的神经环路解析。

9.一种高通量神经环路解析系统，其特征在于，包括：

采样模块，采用权利要求1中的步骤1）获取离体脑组织的切片，采用权利要求1中的步骤2）对所有脑片进行超快光清除；

成像模块，采用权利要求1中的步骤3）对超快光清除后的所有脑片进行高速高分辨三维成像；

图像处理模块，采用权利要求1中的步骤4）对所有脑片的成像结果进行高通量的三维图像拼接和自动神经细胞重构的图像处理操作，获取高通量神经环路解析结果。