JP2017517761A - 大きなインタクトな組織試料を撮像するための方法及び装置 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2014年5月30日に出願された米国仮特許出願第62/005,703号の出願日の優先権を主張し、この出願の開示は、全体として本明細書に参考として組み込まれる。
大きなインタクトな組織試料の撮像の主な課題は、実用的に可能な期間で、撮像プロセスを行うことである。共焦点顕微鏡は、撮像速度が遅いという欠点があり、試料が完全に撮像される前に、光退色に起因する試料のシグナルを発する能力をさらに損傷する可能性がある。試料の光退色効果を最小限に抑えながら、大きな組織試料を撮像するために必要とされる時間を低減させるために用いることができる、高速、高分解能の撮像法及び装置に対するニーズが、当該技術分野にある。本発明は、これらのニーズ及び他のニーズを提起する。
本発明の態様は、大きなインタクトな組織試料を撮像するために構成された、それらのシステム及び装置を含む。一部の実施形態では、対象システムは、光源を備える照明光路、カメラを備える検出光路、試料チャンバを備える光学的に均一な試料操作構成要素、制御部、処理部、及び処理部により実行される場合に、制御部に試料チャンバ内の試料に対する複数のアライメントパラメータを取得するために較正手順を実行させ、試料の三次元画像を生成するためにアライメントパラメータ利用する撮像手順を実行させる命令を含むコンピュータ可読媒体を備える顕微鏡装置を含む。ここで、これらの構成要素のそれぞれは、より詳細にさらに記載される。
本発明の態様は、大きなインタクトな組織試料を撮像するために用い得る方法を含む。一部の実施形態では、対象方法は、光学的に均一な試料操作構成要素の試料チャンバ内に試料を設置すること、各位置に対するアライメントパラメータを取得するために、試料内の複数の位置で光シート及び顕微鏡装置の検出焦点面をアライメントする較正手順を実施すること、試料内の複数の位置のそれぞれから画像を収集する撮像手順を実施すること、及び、各位置の画像を用いて、試料の三次元画像を構築することを含む。ここで、方法の態様は、以下でより詳細にさらに記載される。
対象方法及びシステムを用いて、通常の当業者が任意の生物学的組織を撮像することが可能となる。方法及びシステムは、任意の植物または動物、例えば、脊椎動物もしくは無脊椎動物、例えば昆虫、ワーム、アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュ、哺乳動物、例えばウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ネズミ、齧歯動物、非ヒト霊長類またはヒトからの標本を撮像するために用いてもよい。標本は、任意の組織型、例えば、造血、神経(中枢または末梢)、グリア、間葉系、皮膚、粘膜、間質、筋肉(骨格筋、心筋、または平滑筋)、脾臓、細網内皮、上皮、内皮、肝臓、腎臓、膵臓、胃腸、肺、線維芽細胞、及び他の細胞型であってもよい。場合によっては、標本は、生体、例えば、ワーム、昆虫、ゼブラフィッシュ、または発生中の胚である。他の場合、標本は、完全な器官、例えば齧歯動物の全脳である。他の場合、標本は、器官の部分、すなわち生検、例えば移植組織の生検である。標本は、新たに分離または保存、例えば急速凍結してもよい。標本は、「通常の」病状を有してもよく、または異常な徴候もしくは疾患に付随する病状を示してもよい。このような標本の例としては、腫瘍または腫瘍関連組織、疾患の組織、及び同類のものから得られるものが挙げられる。そのようなものであるから、対象方法及びシステムは、組織標本の病理学的分析において使用を見出す。
前記のように、光シート顕微鏡では、試料は薄い光のシートで、側面から照明され、発された光シグナル(例えば、蛍光シグナル)は、焦点を合わせた、直交配置された対物レンズで検出される。光学セクショニングは、選択面への照明を制限することにより達成され、高速CCDまたはsCMOSカメラを用いると、同時に全体画像を取り込むことが可能になり、撮像速度が増大する。さらに、光シート顕微鏡は、目的の面に照明を制限することにより、光退色(図5)を最小限に抑える。光シート顕微鏡のこれらの特性は、例えばCLARITYプロセスにより作製された大きな透明化試料の撮像に非常に適している。CLARITY最適化光シート顕微鏡(COLM)(図1A〜D)により、透明化試料の全深部、例えばマウス脳(>5mm)が、CLARITY最適化対物レンズ(図2、3、4B)を用いて高分解能で撮像可能になり、大きな透明化容積を高速収集することにより、光退色の大幅な低減がもたらされる(図2、3)。2つの検出アームにより、より深部での向上した撮像品質が可能になる。というのは、試料の一部が、その近くの検出アームから撮像されるからである(図10パネルb、c、及びd)。
試薬及び試料
ヒドロゲルモノマー(HM)溶液
40mLの40%のアクリルアミド(Bio−Rad、カタログ番号161−0140、4%の最終濃度)、10mLの2%のビスアクリルアミド(Bio−Rad、カタログ番号161−0142、0.05%の最終濃度)、40mLの10×PBS、100mLの16%のPFA(Electron Microscopy Sciences、カタログ番号15710−S、4%の最終濃度)、210mLの蒸留水、及び1gのVA−044熱反応開始剤(Wako、カタログ番号VA−044、0.25%w/vの最終濃度)を混合することにより、400mLのHM溶液を調製した。全ての試薬は、氷上に保った。40mLのHM溶液を、50mLのファルコンチューブに等分し、必要になるまで−20℃で保存した。HM溶液中のアクリルアミド及びビスアクリルアミドの濃度は、クリアリングプロセスの速度を上げために、比例して低減できる。4.0%/0.05%までの範囲のアクリルアミド/ビスアクリルアミドの0.5%/0.0125%の濃度をうまく用いたが、下限のアクリルアミド/ビスアクリルアミドの濃度は、クリアリング速度が数倍に増大した場合に、開始するために用いてもよい。
20%SDS(Sigmaカタログ番号L337またはAmrescoカタログ番号0837、H2O中)及び1Mホウ酸緩衝液(pHは8.5に調整された)のストックを調製した。最終のクリアリング緩衝液を、20%のSDS及び1Mのホウ酸緩衝液を蒸留水で5倍に希釈することにより新たに調製した。
用いられた他の試薬は、次のとおりであった。FocusClear(CelExplorer Labs)、Custom Refractive Index liquids(RI1.454、カタログ番号1806Y、Cargille Labs)、Clearing solution(Boric Acid(Sigma、カタログ番号B7901)、Sodium Hydroxide pellets(EMD、カタログ番号SX0590−3)。
撮像試料を、成体Thy1−eYFPまたはWTマウスから調製した。全ての動物実験を、スタンフォード大学の施設内審査委員会の承認を受けて実行した。
組織試料は、試料において分子の及び構造的な細部を標識化するために、蛍光体の内因性のトランスジェニック発現を有してもよいが、さらに、免疫組織化学は、目的の構造及び分子を標識化するために用いることができる。
CLARITY最適化光シート顕微鏡
光シート顕微鏡は、検出対物レンズ、チューブレンズ、及び、カメラを含む1つ以上の標準的広視野検出光学的アーム、ならびに、開口数の小さい対物レンズ、チューブレンズ、及び、ガウシアンまたはベッセルビームで、静的光シートを発生させるシリンドリカルレンズまたは動的光シートを発生させるためのガルバノメータスキャナ/f−θレンズから構成される1つ以上の直交配置された独立した照明アームから構成される。
COLMの構成要素は、1つ以上の検出経路に沿った光学的不均一性を最小限に抑える、CLARITY最適化試料搭載方策であった(図1B)。透明化完全なマウス脳(または、脊髄などの任意の大きさのインタクトな透明化組織)を、FocusClearで充たした、溶融石英ガラスで作製されたキュベット(分光光度測定のために用いられる標準的なキュベット)に搭載した。溶融石英の屈折率(約1.458)は、FocusClearのものとほぼ同一であった。ボトムアダプタ(図1B)を用いて、試料チャンバ(図1B)の内側のxyz−θステージに試料キュベットを搭載した。次に、比較的経済的な価格のカスタム屈折率マッチング液(RI1.454、カタログ番号1806Y、Cargille Labs)で、はるかに大きなチャンバを充たして、光学的に均一な試料操作系をもたらした。RI液は、試料チャンバを充たすのに十分な半リットルあたり、数百ドルがかかり(FocusClearよりも1桁以上安い)、何度も再利用できた。あるいは、87%のグリセロールでチャンバをさらに充たすことができた。
画像データが非常に大きいので、大量のRAM、マルチコアCPU、及び優れたグラフィックスカードを有する計算ワークステーションを用いることが重要であった。次の構成を有するワークステーションで、ここに示されたデータを扱った。Intel サーバボードS2600CO、2つのIntel Xeon E5−2687W 8C CPU、約130GBのDIMM RAM、約8TBのハードディスク(Seagate Savvio 10K)、NVidia K5000グラフィックスカード、及び高分解能モニタ(NEC MultiSync PA301W 30インチ 2560×1600)。
CLARITY最適化光シート顕微鏡
適切な大きさの石英キュベットに、試料(例えば、インタクトなマウス脳)を搭載したので、試料は、撮像しながら静止したままであった(図1B)。多くの異なるサイズの石英キュベットが、販売会社(例えば、Starna Cells)から入手でき、アクリルアミドゲル(または、同様の透明材料)の小片は、撮像側と反対側に、構造パディングを提供するために用いてもよいことに注意を要する。成体マウス脳の場合、パディングを有する10×5mmまたは10×10mmベースのキュベットが、年齢に応じて用いてもよい。
市販のソフトウエア(例えば、Bitplane製ImarisもしくはAmira)または無料の/オープンソースのプロジェクト(例えば、Vaa3D、www.vaa3d.org)で、三次元の再構築を実施した。タイルのステッチングを、TeraStitcherで実施した。神経形態の手動または半自動のトレースは、Imaris及びAmiraなどの市販のソフトウエアまたはNeuromanticなどのオープンソースツールの特定モジュールを用いて実施できる。
完全なマウス脳に、4%のアクリルアミドモノマー溶液を灌流させて、受動的に透明化し、全てのパルブアルブミン(PV)陽性ニューロンを標識するために免疫染色した。25×の対物レンズを有するCOLMを用いて、インタクトな脳を撮像した。試料内の異なる深部で標識された細胞を観察した(図4B)。
Claims (54)
- 顕微鏡装置であって、
光源を備える照明光路、
カメラを備える検出光路、
容積を有する試料チャンバを備える光学的に均一な試料操作構成要素、
制御部、
処理部、ならびに
前記処理部により実行される時、前記制御部に
前記試料チャンバ内に設置された試料に対する複数のアライメントパラメータを取得するための較正手順を実行させ、及び
前記試料の三次元画像を生成するために、前記アライメントパラメータを利用する撮像手順を実行させる命令を含むコンピュータ可読媒体を備える、前記顕微鏡装置。 - 前記光学的に均一な試料操作構成要素が、xyz−θ試料搭載ステージを備える、請求項1に記載の顕微鏡装置。
- 前記xyz−θ試料搭載ステージが、各次元で少なくとも45mmの移動範囲を有する、請求項1又は2に記載の顕微鏡装置。
- 前記試料チャンバが、溶液で充たされる、請求項1から3のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
- 前記光学的に均一な試料操作構成要素が、前記試料チャンバの前記容積よりも小さい容積を有する内側チャンバを備える、請求項1から4のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
- 前記内側チャンバが、キュベットである、請求項1から5のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
- 前記キュベットが、溶液で充たされる、請求項1から6のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
- 前記キュベットが、溶融石英を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
- 前記較正手順が、前記z方向における試料に対する開始地点及び終了地点を特定することを含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
- 前記較正手順が、Z−ステップ値を特定することを含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
- 前記較正手順が、複数のタイルに試料をデジタル的に分割することを含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
- 前記較正手順が、各位置に対するアライメントパラメータを取得するために、試料内の複数の位置で光シート及び検出焦点面をアライメントすることを含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
- 前記較正手順が、2つの隣接する位置からの線形補間により、前記試料内の複数の位置に対するアライメントパラメータを取得することを含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
- 前記光シート及び前記検出焦点面をアライメントすることが、画像品質測定値を最大化することを含む、請求項1から13のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
- 前記画像品質測定値が、光学焦点品質測定値である、請求項1から14のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
- 前記光学焦点品質測定値が、フーリエ空間における高周波及び低周波シグナルの比を含む、請求項1から15のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
- 前記較正手順が、自動化される、請求項1から16のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
- 前記撮像手順が、
アライメントパラメータを用いて前記試料の照射面と前記顕微鏡の検出焦点面をアライメントすること、
前記光源で前記照射面の直線部分を照明すること、及び
前記カメラで、前記照射面の前記照明された直線部分に沿って、複数の発された光シグナルを取り込むことを含む、請求項1から17のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。 - 前記照射面と、前記顕微鏡の前記検出焦点面をアライメントすることが、前記照射面の前記直線部分を照明することと同期される、請求項1から18のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
- 前記撮像手順が、
前記照射面の複数の異なる直線部分を照射するために、前記光源を向けること、及び
前記カメラで、前記試料の二次元画像を形成するために、前記照射面の前記異なる直線部分のそれぞれに沿って、複数の発された光シグナルを取り込むことをさらに含む、請求項1から19のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。 - 前記撮像手順が、
前記試料内の異なる照射面から複数の二次元画像を収集すること、及び
前記試料の三次元画像を形成するために、前記二次元画像を組み立てることをさらに含む、請求項1から20のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。 - 前記撮像手順が、自動化される、請求項1から21のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
- 前記カメラが、CCDカメラまたはsCMOSカメラである、請求項1から22のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
- 前記検出光路が、検出対物レンズを備える、請求項1から23のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
- 前記検出対物レンズが、試料の屈折率に合致する屈折率を有する、請求項1から24のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
- 前記照明光路が、動的光シートを発生させるように構成された開口数が小さい対物レンズを備える、請求項1から25のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
- 前記装置が、2つの照明光路を備える、請求項1から26のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
- 前記装置が、2つの検出光路を備える、請求項1から27のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
- 前記2つの照明光路が、前記光学的に均一な試料操作構成要素の両側から前記試料を照明するように構成される、請求項1から28のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
- 前記検出光路のうちの1つ以上が、前記照明光路のうちの1つ以上と直交配置される、請求項1から29のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
- 顕微鏡装置を用いて試料を撮像する方法であって、前記方法が、
光学的に均一な試料操作構成要素内の試料チャンバ内に前記試料を設置すること、
各位置に対するアライメントパラメータを取得するために、前記試料内の複数の位置で、1つ以上の光シート及び顕微鏡装置の1つ以上の検出焦点面をアライメントする較正手順を実施すること、
前記試料内の前記複数の位置のそれぞれから画像を収集する撮像手順を実施することであって、前記撮像手順が、
各位置に前記アライメントパラメータを適用すること、及び
光シートで前記位置を同時に照明すること及び前記位置の画像を取り込むことを含む撮像手順を実施すること、ならびに
各位置からの前記画像を用いて、前記試料の三次元画像を構成することを含む。 - 前記撮像手順が、2つ以上の独立した光シートを用いて、前記試料の2つ以上の異なる面を同時に照明することを含む、請求項31に記載の方法。
- 前記撮像手順が、単一の光シートの高速スイッチングを用いて、前記試料の2つの異なる面を同時に照明することを含む、請求項31に記載の方法。
- 前記試料が、
複数のヒドロゲルサブユニットに前記試料を固定すること、
ヒドロゲル包埋試料を形成するために、前記ヒドロゲルサブユニットを重合すること、及び
前記ヒドロゲル包埋試料をクリアリングすることにより顕微鏡分析のために調製されている、請求項31に記載の方法。 - 前記試料が、生物学的組織を含む、請求項31から34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生物学的組織が、脳組織を含む、請求項31から35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料が、完全な器官を含む、請求項31から36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記器官が、脳、目、心臓、肝臓、膵臓、筋肉、骨、腎臓、または卵巣である、請求項31から37のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料が、完全な器官または発生中の胚を含む、請求項31から38のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料の屈折率に合致する屈折率を有する溶液で前記試料チャンバを充たすことをさらに含む、請求項31から39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記較正手順が、前記z方向における前記試料に対する開始地点及び終了地点を特定することを含む、請求項31から40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記較正手順が、z−ステップ値を特定することを含む、請求項31から41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記較正手順が、複数のタイルに前記試料をデジタル的に分割することを含む、請求項31から42のいずれか一項に記載の方法。
- 前記較正手順が、各位置に対するアライメントパラメータを取得するために、前記試料内の複数の位置で光シート及び検出焦点面をアライメントすることを含む、請求項31から43のいずれか一項に記載の方法。
- 前記較正手順が、2つの隣接する位置からの線形補間により、前記試料内の複数の位置に対するアライメントパラメータを取得することを含む、請求項31から44のいずれか一項に記載の方法。
- 前記光シート及び前記検出焦点面をアライメントすることが、画像品質測定値を最大化することを含む、請求項31から45のいずれか一項に記載の方法。
- 前記画像品質測定値が、光学焦点品質測定値である、請求項31から46のいずれか一項に記載の方法。
- 前記光学焦点品質測定値が、フーリエ空間における高周波及び低周波シグナルの比を含む、請求項31から47のいずれか一項に記載の方法。
- 前記較正手順が、自動化される、請求項31から48のいずれか一項に記載の方法。
- 前記撮像手順が、
アライメントパラメータを用いて、前記試料の照射面とカメラの検出焦点面をアライメントすること、
前記光源で前記照射面の直線部分を照明すること、及び
前記照射面の前記照明された直線部分に沿って、複数の発された光シグナルを取り込むことを含む、請求項31から49のいずれか一項に記載の方法。 - 前記照射面と前記カメラの前記検出焦点面をアライメントすることが、前記照射面の前記直線部分を照明することと同期する、請求項31から50のいずれか一項に記載の方法。
- 前記撮像手順が、
照射面の複数の異なる直線部分を照射するために、前記光源を向けること、及び
前記試料の二次元画像を形成するために、前記照射面の前記異なる直線部分のそれぞれに沿って、複数の発された光シグナルを取り込むことをさらに含む、請求項31から51のいずれか一項に記載の方法。 - 前記撮像手順が、
前記試料内の異なる照射面から複数の二次元画像を収集すること、及び
前記試料の三次元画像を形成するために、前記二次元画像を組み立てることをさらに含む、請求項31から52のいずれか一項に記載の方法。 - 前記撮像手順が、自動化される、請求項31から53のいずれか一項に記載の方法。
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