DE102017116892B4

DE102017116892B4 - Lichtquellenmodul zur Erzeugung einer Lichtblattebene, Mikroskop und Verfahren zur sequentiellen Untersuchung mehrerer Proben mittels eines Lichtblattebenenmikroskops

Info

Publication number: DE102017116892B4
Application number: DE102017116892.3A
Authority: DE
Inventors: Werner Knebel; Frank Sieckmann
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2016-07-26
Filing date: 2017-07-26
Publication date: 2022-01-05
Anticipated expiration: 2037-07-27
Also published as: DE102017116892A1

Abstract

Lichtquellenmodul zur Erzeugung einer Lichtblattebene mit einem Lichtquellenmodulgehäuse, einem innerhalb des Lichtquellenmodulgehäuses angeordneten Lichtblattebenengenerator zur Beeinflussung eines Lichtstrahls derart, dass außerhalb des Lichtquellenmodulgehäuses eine Lichtblattebene erzeugt wird, und einer Austrittsfläche des Lichtquellenmodulgehäuses, aus der der Lichtstrahl austritt, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest eine Lichtquelle innerhalb des Lichtquellenmoduls angeordnet ist.

Description

Die Erfindung betrifft ein Lichtquellenmodul zur Erzeugung einer Lichtblattebene, ein Mikroskop sowie ein Verfahren zur sequentiellen Untersuchung mehrerer Proben mittels eines Lichtblattebenenmikroskops.
Die Lichtblattebenenmikroskopie (auch SPIM, Lichtscheibenmikroskopie, Lichtblattmikroskopie) ist eine in den letzten Jahren stark weiterentwickelte Unterart der Fluoreszenzmikroskopie. Oftmals wird Sie mit den Abkürzungen LSFM von englisch „Lightsheet Fluorescence Microscopy“ oder SPIM von englisch „Selective Plane Illumination Microscopy“ bezeichnet. Als Synonyme zum Wort „Lichtblattebene“ können auch die Wörter „Lichtblatt“, „Lichtscheibe“ oder englisch „Lightsheet“ verwendet werden.
Bei der Lichtblattebenenmikroskopie wird die zu untersuchende Probe nicht wie bei den meisten anderen Mikroskopiemethoden von oben oder unten, sondern von der Seite beleuchtet. Dabei wird ein fokussierter Lichtstrahl verwendet, so dass jeweils nur ein relativ kleiner Volumenanteil der Probe beleuchtet wird. Die resultierende Fluoreszenz wird meist im rechten Winkel zur Einfallsrichtung des Beleuchtungslichts detektiert. Es ergeben sich gegenüber herkömmlichen Methoden der Fluoreszenzmikroskopie Vorteile bei der Auflösung und insbesondere durch die geringere Beanspruchung der Probe hinsichtlich Photobleaching, Erwärmung und chemischer Reaktionen, die durch den Eintrag von Energie in Form des Beleuchtungslichts vermittelt werden.
Derzeit verwendete Lichtblattebenenmikroskope basieren oftmals auf herkömmlichen Mikroskopen. Insbesondere werden meistens konventionelle Objektive zur Beleuchtung der Probe verwendet. Die Lichtblattebenen oder Lichtblätter werden dabei oftmals mittels der bereits vorhandenen Scanspiegel erzeugt. Es sind Aufbauten bekannt, bei denen die Beleuchtung von der Seite stattfindet und die Fluoreszenzsignale in einer vertikalen Richtung detektiert werden.
Alternative Lösungen verwenden unterschiedliche Objektive zur Beleuchtung und zur Detektion, die zur Vereinfachung der Probenhandhabung jeweils in einem 45°-Winkel zur Horizontalen angeordnet sind und miteinander einen Winkel von 90° bilden. Ebenfalls ist es bekannt, ein herkömmliches Detektionsobjektiv mit einer Kappe aufzurüsten, die mit zwei in einem Winkel von jeweils 45° zur optischen Achse des Objektivs angeordneten Spiegeln versehen ist, die horizontal neben der Probe angeordnet werden, so dass ein von unten eingestrahlter Lichtstrahl in Form einer Lichtscheibe in die Horizontale umgelenkt wird. Auf diese Weise lassen sich bestehende Mikroskope relativ einfach aufrüsten.
Derzeitige Lösungen zeichnen sich jedoch durch einen relativ hohen Preis und eine teilweise enorm aufwendige Justage aus. Ein automatisiertes Scannen mehrerer Proben ist in vielen Fällen unmöglich oder sehr schwierig. Die aktuellen Lösungen zeichnen sich darüberhinaus mehrheitlich durch einen besonders komplexen Aufbau aus. Proben können nur aufwändig in die gewünschte Form und Position gebracht werden. Oft verdeckt der Aufbau den Probenbereich, so dass das Experimentieren erschwert wird. Die Handhabung der zu untersuchenden Proben ist daher oft umständlich und erfordert einen erfahrenen Benutzer.
Zudem ist oft nur eine Probe scanbar. Ein größerer Durchsatz bzw. das Scannen vieler Proben wird durch die derzeitigen Lösungen erschwert, da aufgrund des schwierigen Probenhandlings der Wechsel von einer Probe zu einer anderen relativ lange dauert. Ein effektives „high throughput screening“ ist daher bisher nicht möglich.
Auch können die möglichen Lichtblattebenenmikroskopieverfahren meistens nicht oder nur sehr aufwendig durch manipulierende Verfahren wie Liquidhandling, Manipulationslaser oder Injektionsverfahren erweitert werden. Dies ist ebenso wie die Möglichkeit, ein und dieselbe Probe neben der Lichtblattebenenmikroskopie auch mit anderen Mikroskopiemethoden untersuchen zu können, jedoch wünschenswert.
Ein weiterer Nachteil derzeitiger Lösungen ist der hohe Spezialisierungsgrad, so dass ein Mikroskopiesystem nur für eine sehr bestimmte Art von Problemstellungen bzw. Untersuchungsmethoden verwendet werden kann.
WO 2015 / 184 124 A1 offenbart Verfahren und Vorrichtungen zur schnellen Untersuchung von großen Gewebeproben mittels Lichtblattmikroskopie.
Aus DE 10 2014 104 977 A1 sind Anordnungen zur Lichtblattmikroskopie bekannt, bei denen das Detektionsobjektiv und/oder das Beleuchtungsobjektiv ein im Strahlengang angeordnetes oder in diesen einbringbares adaptives optisches Korrekturelement umfasst.
Aus US 2014 / 0 126 046 A1 ist ein Modul bekannt, mit dem ein konventionelles Mikroskop in ein Lichtblattmikroskop umgewandelt werden kann.
Die vorliegende Erfindung löst die angesprochenen Probleme durch ein Lichtquellenmodul zur Erzeugung einer Lichtblattebene mit einem Lichtquellenmodulgehäuse, einem innerhalb des Lichtquellenmodulgehäuses angeordneten Lichtblattebenengenerator zur Beeinflussung eines Lichtstrahls derart, dass außerhalb des Lichtquellenmodulgehäuses eine Lichtblattebene erzeugt wird, und einer Austrittsfläche des Lichtquellenmodulgehäuses, aus der der Lichtstrahl austritt, wobei zumindest eine Lichtquelle innerhalb des Lichtquellenmoduls angeordnet ist. Weiterhin wird ein Mikroskop mit einem solchen Lichtquellenmodul vorgeschlagen sowie ein Verfahren zur sequentiellen Untersuchung mehrerer Proben mittels eines Lichtblattebenenmikroskops mit einem Untersuchungsbereich, wobei das verwendete Mikroskop ein Mikroskop mit einem solchen Lichtquellenmodul ist, mit den Schritten:

a. Einbringen einer Probe in den Untersuchungsbereich
b. Untersuchen der Probe mittels Lichtblattebenenmikroskopie
c. Bewegen der Probe entlang einer Bewegungsrichtung aus dem Untersuchungsbereich heraus und Bewegen einer weiteren Probe entlang der Bewegungsrichtung in den Untersuchungsbereich hinein,
d. Untersuchen der weiteren Probe mittels Lichtblattebenenmikroskopie, und
e. Wiederholung der Schritte c. bis d. so lange, bis alle zu untersuchenden Proben untersucht worden sind.

Die erfinderische Idee basiert dabei auf einem neuen Ansatz zur Beleuchtung der Probe sowie auf einer konsequenten Modularisierung des Aufbaus. Unter einem Modul wird im Rahmen der vorliegenden Anmeldung insbesondere eine Einheit verstanden, die von einer übergeordneten Vorrichtung, beispielsweise einem Mikroskop, auf einfache Art und Weise getrennt werden kann. Insbesondere besitzt das Modul ein eigenes Gehäuse sowie Schnittstellen, die zur Befestigung des Moduls an einer übergeordneten Vorrichtung sowie als Anschlüsse für Energie sowie für Steuersignale dienen.
Unter einem Lichtblattebenengenerator wird insbesondere eine Vorrichtung verstanden, mit Hilfe derer aus einem von einer primären Lichtquelle gelieferten Lichtstrahl eine Lichtblattebene erzeugt werden kann. Das Kernelement des Lichtblattebenengenerators kann dabei eine Zylinderlinse sein, wenn eine statische Lichtblattebene generiert wird. Alternativ kann mit Hilfe von Ablenkspiegeln auch eine sogenannte scannende Lichtblattebene generiert werden.
Das Lichtquellenmodul kann mit sehr kleinen Abmessungen hergestellt werden, so dass es in unmittelbarer Nähe der Probe angeordnet werden kann. Die Lichtblattebene wird dadurch in enger räumlicher Nähe zur Probe erzeugt. Weiterhin erlauben es die geringen Abmessungen des Lichtquellenmoduls, der Probe weitere Beleuchtungs-, Detektions- oder Manipulationseinheiten aus anderen Richtungen anzunähern. Typischerweise kann ein Detektionsobjektiv oberhalb oder unterhalb der Probe angeordnet sein, während das Lichtquellenmodul beispielsweise rechts oder links von der Probe angeordnet ist. Stellt man sich die Probe idealisiert als würfelförmig vor, so bleiben dann noch vier Seiten der Probe frei, um weitere Instrumente gleichzeitig oder zumindest ohne Änderungen am allgemeinen Setup vorzunehmen.
Eine vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung sieht vor, dass das Lichtquellenmodulgehäuse ausgestaltet ist, um im Bereich der Austrittsfläche derart in ein Immersionsmedium eingetaucht zu werden, dass die Austrittsfläche vollständig von dem Immersionsmedium bedeckt wird. Es wird so eine effektive Einkopplung der Lichtblattebene in das Immersionsmedium erreicht. Das Immersionsmedium kann eine Flüssigkeit oder ein Gas sein.
Eine entsprechende Ausgestaltung des Lichtquellenmodulgehäuses zeichnet sich insbesondere durch ein geeignetes Material wie z.B. Glas oder einen glasähnlichen Kunststoff, beispielsweise einem transparenten Kunststoff, aus. Das Lichtquellenmodulgehäuse kann also im Bereich der Austrittsfläche aus Glas oder einem glasähnlichen Kunststoff bestehen. Weiterhin ist es vorteilhaft, wenn die Austrittsfläche im unteren Bereich des Gehäuses angeordnet ist, so dass nur ein kleiner Teil des Gehäuses in das Immersionsmedium eingetaucht werden muss. Dies minimiert unter anderem Effekte, die durch Verdrängung des Immersionsmediums durch das Lichtquellenmodul entstehen.
Aus dem gleichen Grund ist es vorteilhaft, wenn ein unterer Bereich des Lichtquellenmodulgehäuses zumindest im Wesentlichen aus Glas oder einem transparenten Kunststoff besteht. Hierunter wird insbesondere verstanden, dass zumindest die gemessen am Gesamtvolumen des Bauteils unteren 15% des Volumens, vorzugsweise die unteren 30% des Volumens, zumindest zu 50%, vorzugsweise zumindest zu 80% aus einem Glas oder einem transparenten Kunststoff bestehen.
Zum einen ermöglicht dies das angesprochene Eintauchen in ein Immersionsmedium, zum anderen kann die Austrittsfläche integral in das Gehäuse integriert sein, ohne ein separates Bauteil wie z.B. ein Fenster oder eine Linse vorsehen zu müssen. Die Austrittsfläche kann durch bekannte formgebende Verfahren dabei so ausgestaltet sein, dass sie eine optische Funktion, beispielsweise eine Linsenfunktion, übernimmt.
Die Erfindung sieht vor, dass zumindest eine Lichtquelle innerhalb des Lichtquellenmoduls angeordnet ist. Es ergibt sich somit ein besonders kompakter Aufbau. Es lässt sich so ein Modul mit weiterhin kompakten räumlichen Abmessungen konstruieren, das alle zur Erzeugung einer Lichtblattebene nötigen Komponenten beinhaltet. Es sind dann lediglich eine externe Energieversorgung sowie eine externe Steuerung notwendig.
Alternativ kann eine Einkoppelvorrichtung für eine externe Lichtquelle oder für mehrere externe Lichtquellen vorhanden sein. Dies ist vorteilhaft, wenn ein schnelles Umschalten zwischen verschiedenen Lichtquellen möglich sein soll, sehr spezielle Anforderungen an die Lichtquelle gestellt werden oder eine bereits vorhandene Lichtquelle genutzt werden soll, um Kosten zu sparen.
Eine vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung sieht vor, dass das Lichtquellenmodul ein optisches Umlenkelement aufweist, das eine Eingangsseite und eine Ausgangsseite aufweist, wobei durch die Eingangsseite eintretendes Licht innerhalb des Umlenkelements zur Ausgangsseite geleitet wird und die Austrittsfläche des Lichtquellenmoduls durch die Ausgangsseite des Umlenkelements gebildet wird. Das Umlenkelement kann dabei insbesondere einen Höhenversatz des Lichtstrahls innerhalb des Lichtquellenmoduls bewirken. Auf diese Art und Weise kann der Lichtstrahl in den unteren Bereich des Lichtquellenmoduls gelenkt werden, in dem sich typischerweise die Austrittsfläche befindet. Die Vorrichtung zur Modulation des Lichtstrahls, so dass eine Lichtblattebene erzeugt wird und ggf. die Lichtquelle können hingegen im oberen Teil des Gehäuses verbleiben. Das Umlenkelement kann eine planparallele Platte oder einen planparallelen Abschnitt aufweisen. Das Umlenkelement ist bevorzugt aus Glas hergestellt und kann ein Prisma sein. Unter einem Prisma wird dabei insbesondere ein transparenter, massiver Festkörper verstanden, der zwei einander gegenüber liegende parallele Oberflächen aufweist. In einem Spezialfall kann die klassische Definition eines Prismas gelten, wonach sich der Querschnitt über die Mantelfläche des Festkörpers konstant bleibt.
Eine Weiterbildung der Erfindung zeichnet sich dadurch aus, dass an der Austrittsfläche ein optisches Element angebracht ist, insbesondere mittels einer Klebverbindung, einer Klemmverbindung, einer Quetschverbindung, einer Schraubverbindung oder einer magnetischen Verbindung. In einer speziellen Ausführungsform ist die Austrittsfläche bereits so geformt, dass sie als optisches Element wirkt.
Vorteilhafterweise weist das Lichtquellenmodul ein Volumen von unter 50 cm³, vorzugsweise von unter 30 cm³, auf. Hierdurch lässt sich ein äußerst kompakter Aufbau erreichen, so dass sowohl das Probenhandling stark vereinfacht wird als auch die Möglichkeit geschaffen wird, verschiedene weitere Untersuchungs- oder Manipulationsvorrichtungen gleichzeitig zu installieren und zu betreiben.
Das erfindungsgemäße Lichtquellenmodul kann eine Koppelvorrichtung, mittels der das Lichtquellenmodul mit einem Mikroskop, insbesondere mit einem Detektionsobjektiv reversibel und mit einer Genauigkeit von unter 5 µm, bevorzugt von unter 2 µm positionsfest gekoppelt werden kann, aufweisen. Es wird dann möglich, das Lichtquellenmodul schnell und einfach auszutauschen. Durch eine relativ zum Detektionsobjektiv fixe Kopplung wird erreicht, dass eine einmal vorgenommene Justage von Anregungslicht zu Detektionsobjektiv konstant beibehalten wird.
Als Richtlinie zur Bestimmung der notwendigen Genauigkeit der Kopplungsverbindung kann dabei das Folgende herangezogen werden: Bei niedriger Beleuchtungsapertur < 0,1 NA sollte die Genauigkeit besser als 2 µm sein in Bezug auf die Fokuslage des Detektionsobjektivs sein. Bei höherer numerischer Apertur sollte die Genauigkeit besser als 1 µm in Bezug auf die Fokuslage des Detektionsobjektivs sein. Im Falle der Genauigkeit entlang der Beleuchtungsachse sind als Genauigkeitsmaß 5 % des Beobachtungsbereiches ausreichend. Als Beispiel: Hat man ein Beobachtungsfeld von 300x 300 µm so ist es ausreichend, wenn das Zentrum des Lichtblattebenenfokus nicht mehr als 15 µm von der Detektionsachse in x und y abweicht. Die benötigte Genauigkeit ist also nicht notwendigerweise für jede Raumrichtung die gleiche.
Das Lichtquellenmodul kann weiterhin eine Kühlvorrichtung und/oder eine Heizvorrichtung aufweisen. Dabei kann mindestens eine Gehäuseseite als aktive oder passive Kühlfläche ausgeprägt sein. Es wird so möglich, durch eine ggf. im Gehäuse vorhandene Lichtquelle frei werdende Energie und somit Wärme, welche die abbildende Optik ungünstig beeinflussen könnte, abzuführen, oder das Modul bei einer Umgebungstemperatur, die unter der optimalen Betriebstemperatur liegt, zu betreiben.
Wenn in dem Lichtquellenmodul eine Lichtquelle integriert ist, kann diese eine oder mehrere Laserdioden oder LEDs aufweisen. Eine solche Ausgestaltung ermöglicht die äußerst kompakten Außenmaße des erfindungsgemäßen Lichtquellenmoduls. Wenn mehrere Laserdioden oder LEDs verwendet werden, so können diese zweckmäßigerweise Licht verschiedener Wellenlängen liefern. Innerhalb des Lichtquellenmodulgehäuses kann ein mittels eines Motors drehbarer Filter oder Strahlteiler angeordnet sein, der ausgestaltet ist, um mehrere Lichtstrahlen bzw. Laserstrahlen auf einer gemeinsamen optischen Achse zu vereinigen. Zum Vereinigen mehrerer Lichtstrahlen können auch Strahlteiler verwendet werden.
Weiterhin können Abschwächer, beispielsweise akustooptische Abschächer, verwendet werden. Es wird so möglich, die Lichtquelle nicht nur ein- und auszuschalten, sondern auch schnell in ihrer Intensität zu regeln. Dadurch gelingt eine Anpassung der Intensität des Anregungslichtes an die Probeneigenschaften, derart, dass die Probe nicht zu stark leuchtet und dadurch die Kamera überbelichtet.
Eine besonders vorteilhafte Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Lichtquellenmoduls sieht vor, dass die Austrittsfläche an einem aus dem Lichtquellenmodulgehäuse vorstehenden Vorsprung angeordnet ist. Auf diese Art und Weise kann der Anteil des Lichtquellenmoduls, der in ein Immersionsmedium eingetaucht wird, und somit auch das verdrängte Volumen des Immersionsmediums, weiter reduziert werden. Es ist dabei möglich, dass der Vorsprung Teil eines Umlenkelements ist, das eine planparallele Platte aufweist und einen Höhenversatz des Lichtstrahls bewirkt.
Vorteilhafterweise befindet sich der Vorsprung unterhalb einer Unterseite des Lichtquellenmodulgehäuses und weist eine Austrittsfläche von weniger als 50 mm², bevorzugt weniger als 30 mm², besonders bevorzugt weniger als 10 mm² auf. Auch diese Merkmale ermöglichen eine weitere Miniaturisierung des Lichtquellenmoduls sowie eine möglichst geringe Beeinflussung des weiteren Aufbaus und der Probe durch ein geringes verdrängtes Volumen. Unter einer Unterseite wird dabei insbesondere eine Oberfläche des Lichtquellenmodulgehäuses verstanden, die einen großen Teil des Lichtquellenmodulgehäuses nach unten hin begrenzt. Die Unterseite kann eine ebene Oberfläche aufweisen, kann aber auch strukturiert sein. Insbesondere hat die Unterseite des Vorsprungs im Vergleich zur Unterseite des Lichtquellenmodulgehäuses eine kleine Oberfläche, beispielsweise weniger als 20% oder weniger als 10% der Oberfläche der Unterseite des Lichtquellenmodulgehäuses.
In einer speziellen Ausführungsform bildet das Profil einer Seite des Lichtquellenmodulgehäuses, auf welcher die Austrittsfläche angeordnet ist, zumindest abschnittsweise einen Winkel zwischen 40° und 70° mit dem austretenden Lichtstrahl. Auf diese Art und Weise lässt sich ein Umlenkelement, dass einen vertikalen Versatz des Lichtstrahls bewirkt, auf einfache Weise integrieren.
Innerhalb des Gehäuses können optische Elemente entlang einer optischen Achse manuell oder motorisch verschieblich angeordnet sein. Es wird dadurch eine einfache Justage des Lichtquellenmoduls, insbesondere der Fokuslage und somit der Position der austretenden Lichtblattebene, möglich. Das Justieren kann motorisch mittels eines Steuersignals und eines innerhalb des Lichtquellenmodulgehäuses angeordneten Motors, vorzugsweise eines Elektromotors, oder mittels von außerhalb des Gehäuses bedienbarer Justierschrauben ermöglicht werden.
Auf besonders einfache und effektive Art und Weise ist dies möglich, wenn das verschiebliche optische Element die entlang dem Strahlengang letzte Linse vor der Austrittsfläche ist.
In einer Weiterbildung der Erfindung weist das Lichtquellenmodul Mittel zur Beeinflussung der Divergenz der Lichtstrahlen innerhalb des Lichtquellenmodulgehäuses auf.
Es ist möglich, dass innerhalb des Lichtquellenmodulgehäuses ein optischer Sensor zur Detektierung von Streulicht angeordnet ist.
Ein besonders flexibles Lichtquellenmodul wird erhalten, wenn es zumindest ein Lichtblattebenengeneratorsubmodul, und/oder ein Steuerungssubmodul aufweist. Darüberhinaus kann ein Lichtquellensubmodul vorhanden sein. Beliebige andere Kombinationen dieser Module sind ebenfalls möglich. Ein Submodul weist dabei insbesondere insofern die gleichen Eigenschaften auf wie ein weiter oben bereits beschriebenes Modul, als dass es eine in sich abgeschlossene Einheit darstellt, die mit anderen Modulen bzw. Submodulen kombiniert und zusammengefügt werden kann. Die Submodule können jeweils ein eigenes Gehäuse sowie entsprechende Schnittstellen aufweisen. So kann das Lichtquellensubmodul eine Schnittstelle zur Übergabe des Lichtstrahls aufweisen. Durch die Konstruktion des Lichtquellenmoduls mit Submodulen wird die Möglichkeit geschaffen, insbesondere herstellerseitig verschiedene Submodule zu kombinieren, um auf unterschiedliche Anforderungen des Kunden flexibel zu reagieren. Weiterhin ermöglicht der modulare Aufbau ein schnelles und einfaches Austauschen von Komponenten in Form von Modulen oder Submodulen.
Es wird weiterhin vorgeschlagen, ein Mikroskop, insbesondere ein Fluoreszenzmikroskop, mit einem erfindungsgemäßen Lichtquellenmodul auszurüsten. Ein solches Mikroskop kann vorteilhafterweise weiterhin eine Vorrichtung aufweisen, die es erlaubt, mehrere, vorzugsweise in einer Reihe oder in mehreren Reihen angeordnete Probenbehälter nacheinander in einen Untersuchungsbereich des Mikroskops zu bringen. Durch das erfindungsgemäße Lichtquellenmodul steht genügend Platz zur Verfügung, um eine solche Vorrichtung einzusetzen. Es kann sich dabei beispielsweise um einen Förderer, ein Rondell oder einen Roboterarm handeln.
Das Lichtquellenmodul kann dabei derart angeordnet sein, dass es sowohl an einer festen Position fixiert oder in den Richtungen X, Y, Z frei bewegt werden kann. Zur Fixierung des Lichtquellenmoduls können geeignete Befestigungsmittel verwendet werden. Um das Lichtquellenmodul beweglich mit dem Mikroskop zu verbinden, können Schienen, Motortische oder sonstige übliche Justiermittel verwendet werden.
Vorzugsweise weist das Mikroskop eine Probenkammer auf, die aus einem Kunststoff besteht, dessen Brechungsindex zwischen 1,25 und 1,4, vorzugsweise zwischen 1,3 und 1,35, liegt. Eine solche Probenkammer unterscheidet sich hinsichtlich ihres Brechungsindex kaum von den üblicherweise verwendeten Immersions- oder Kulturmedien.
Gemäß einer Weiterbildung der Erfindung weist das Mikroskop eine Detektionsachse auf, und der Abstand des Lichtquellenmoduls oder der Lichtquellenmodule von der Detektionsachse ist veränderlich, um einen einfachen Probenwechsel zu ermöglichen. Mit anderen Worten lässt sich das Lichtquellenmodul aus dem Messvolumen bzw. aus dem Beobachtungsbereich entfernen und diesem wieder annähern. Diese Möglichkeit ermöglicht einen einfachen Probenwechsel, da mehr Platz zur Handhabung der verschiedenen Proben zur Verfügung steht. Der Probenwechsel kann manuell oder automatisch durch einen Roboter oder ein sonstiges automatisiertes System erfolgen. Weiterhin kann eine Beobachtungskamera vorgesehen sein, welche die für Justagezwecke oder zum Probenwechsel erforderliche Daten entweder direkt auf Sicht oder über eine Bildanalyse liefert.
Mit Vorteil ist vorgesehen, dass ein Lichtquellenmodul mit einem Detektionsobjektiv des Mikroskops mechanisch gekoppelt oder reversibel koppelbar ist, so dass diese gemeinsam bewegt werden können.
Vorzugsweise weist das Mikroskop eine Koppelvorrichtung auf, die eine reversible Kopplung des Lichtquellenmoduls an das Mikroskop mit einer reproduzierbaren Genauigkeit von unterhalb 5 µm, vorzugsweise von unterhalb 2 µm in allen drei Raumdimensionen erlaubt. Es wird dann möglich, das Lichtquellenmodul schnell und einfach auszutauschen.
Das Mikroskop kann einen oder mehrere Motoren zum horizontalen und/oder vertikalen Bewegen einer Probe und/oder des Lichtquellenmoduls und/oder eines Detektionsobjektivs aufweisen.
Weiterhin kann ein Motortisch vorgesehen sein, der die Probe in den Richtungen X, Y bewegen zu können. Um sowohl die Probe (X1, Y1), das Lichtquellenmodul (X2, Y2, Z2) als auch das Detektionsobjektiv (Z3) unabhängig voneinander bewegen zu können ist daher der Einsatz von mehreren, vorzugsweise getrennt agierenden Motoren möglich.
Eine Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens sieht vor, dass vor Schritt c. ein Abstand eines oder mehrerer Lichtquellenmodule von dem Untersuchungsbereich vergrößert und nach Schritt c. der ursprüngliche Abstand wiederhergestellt wird. Weiterhin kann nach den Schritten a. und c. ein Zwischenschritt ausgeführt werden, bei dem die Probe und/oder das Lichtquellenmodul in den drei Raumrichtungen X, Y und Z justiert werden.
Das Bewegen der Probe entlang einer Bewegungsrichtung aus dem Untersuchungsbereich heraus und Bewegen einer weiteren Probe entlang der Bewegungsrichtung in den Untersuchungsbereich hinein kann gleichzeitig oder nacheinander erfolgen.
Vorteilhafterweise wird zur Durchführung des Verfahrens ein erfindungsgemäßes Mikroskop verwendet.
Das erfindungsgemäße Lichtquellenmodul kann werksseitig bereits an einen bestimmten Einsatzzweck angepasst werden. Dabei können einerseits passende Komponenten oder Submodule gewählt und andererseits bereits eine Vorjustage vorgenommen werden. Ist beispielsweise das Detektionsobjektiv ein Trockenobjektiv und ist die Probe in einem Medium eingeschlossen und von einer Glaskapillare mit einer bestimmten Wandstärke umgeben, so muss die Abstimmung der Optik in dem Lichtquellenmodul sowohl den Brechungsindex des Mediums, in dem die Probe sich befindet, berücksichtigen, da sich der Beleuchtungsfokus gegenüber Luft nach vorne verschiebt, wenn der Brechungsindex größer als 1,0 ist. Weiterhin muss auch die Wandstärke der Glaskapillare und der Brechungsindex des verwendeten Glases berücksichtigt werden, da sich der Beleuchtungsfokus gegenüber Luft nach vorne verschiebt, wenn der Brechungsindex größer als 1,0 ist. Typischerweise hat Glas einen Brechungsindex zwischen 1,4 und 1,52.
Ist das Detektionsobjektiv ein Immersionsobjektiv und das Immersionsmedium identisch mit dem Einbettungsmedium, und ist die Probe in einem Medium eingeschlossen und von einer Glaskapillare mit einer bestimmten Wandstärke umgeben, so muss die Abstimmung der Optik in dem Beleuchtungsmodul zusätzlich zu dem bereits genannten auch den Abstand der Austrittsfläche des Beleuchtungsmoduls zur Glaskapillare berücksichtigen. Auf diese Weise kann der Beleuchtungsfokus in die Achse des Detektionsobjektivs verschoben werden.
Das Lichtquellenmodul kann werkseitig auf spezielle Einsatzgebiete optisch, lichttechnisch, mechanisch und elektronisch passend vorbereitet werden, so dass ein kostengünstiger Einsatz in Massengeräten, beispielsweise für die Pharmaindustrie, ermöglicht wird. Dabei können die Art der Probe und des Probenbehälters, das Detektionsobjektiv, das Probenmedium sowie das Einkoppelmedium berücksichtigt werden. Das in dem Lichtblattebenengenerator auftretende Streulicht kann zudem zur Kontrolle mittels eines Sensors abgefragt werden. So lässt sich die aktuelle Intensität des Laserstrahls abschätzen und an eine Steuersoftware zurückkoppeln.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben und in der Beschreibung beschrieben.
Figurenliste
Ausführungsbeispiele der Erfindung werden anhand der Zeichnungen und der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert. Es zeigen:

1 einen schematischen Überblick über mögliche Anordnungen des erfindungsgemäßen Lichtquellenmoduls,
2 ein erstes Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Lichtquellenmoduls,
3 eine Anordnung mit einem erfindungsgemäßen Lichtquellenmodul, einer Probenkammer und einem Detektionsobjektiv,
4 eine Anordnung mit zwei erfindungsgemäßen Lichtquellenmodulen, einer Probenkammer und einem Detektionsobjektiv,
5 eine Anordnung mit zwei erfindungsgemäßen Lichtquellenmodulen, einer Probenkammer und zwei Detektionsobjektiven,
6 eine Anordnung gemäß 5 mit einem Motortisch,
7 eine detaillierte Darstellung eines zweiten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Lichtquellenmoduls,
8 ein erstes Ausführungsbeispiel eines Umlenkelements,
9 ein zweites Ausführungsbeispiel eines Umlenkelements,
10 ein drittes Ausführungsbeispiel eines Umlenkelements,
11 ein Ausführungsbeispiel eines Lichtscheibengeneratorsubmoduls,
12 ein Ausführungsbeispiel eines Lichtquellensubmoduls,
13 ein weiteres Ausführungsbeispiel eines Lichtquellensubmoduls,
14 ein Ausführungsbeispiel eines Steuerungssubmoduls, und
15 einen schematischen Aufbau mit einem Lichtquellenmodul und zwei Detektionsobjektiven.

1 zeigt einen schematischen Überblick über mögliche Anordnungen des erfindungsgemäßen Lichtquellenmoduls. Zentrales Element ist der Probenbehälter 10. Auf zwei einander gegenüberliegenden Seiten des Probenbehälters 10 sind erfindungsgemäße Lichtquellenmodule 12 angeordnet. Aus der schematischen Darstellung wird hier bereits der Miniaturisierungsgedanke ersichtlich: Die vollständigen Lichtquellenmodule 12 beanspruchen lediglich ein Volumen in der Größenordnung des Volumens des Probenbehälters 10. Unterhalb des Probenbehälters 10 ist ein Beobachtungsobjektiv 14 angeordnet. Hier können prinzipiell alle bekannten Arten von Beobachtungsobjektiven verwendet werden. Oberhalb des Probenbehälters sind schematisch Vorrichtungen zur Probenmanipulation eingezeichnet. Dies können beispielsweise ein Liquidhandler 16, ein Manipulations-Laser 18 und ein Injektionssystem 20 sein. Weiterhin sind Probenbehälter 10.1, 10.2 und 10.3 eingezeichnet - Diese können sequentiell abgearbeitet werden. Da alle verwendeten Komponenten kompakt und außerhalb der Vebindungsachse der Probenbehälter 10 angeordnet sind, kann ein sequentielles Untersuchen der Probenbehälter 10 ohne Schwierigkeiten erfolgen. Mit anderen Worten liegen die Probenbehälter in einer Raumdimension frei und können daher einfach in den Wirkungsbereich der Lichtquellenmodule 12 und wieder heraus bewegt werden.
2 zeigt ein erstes Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Lichtquellenmoduls 12. Es weist eine Lichtquelle 22, einen Lichtblattebenengenerator 24 und ein Umlenkelement 26 auf, an dem die Austrittsfläche 28 angeordnet ist. Das Umlenkelement 26 ist im dargestellten Beispiel als Umlenkprisma ausgestaltet, das eine Umlenkfläche 30 aufweist. Dies bildet im gezeigten Beispiel sowohl mit der Vertikalen als auch mit der Horizontalen einen Winkel von 45°, so dass ein vertikal von der Lichtquelle 22 gelieferter Lichtstrahl 28 in horizontaler Richtung aus der Austrittsfläche 56 und somit aus dem Lichtquellenmodul 12 austritt. Der Lichtstrahl 28 ist derart geformt, dass er innerhalb des Probenbehälters 10 eine Lichtblattebene 32 bildet. Die Lichtquelle 22 ist im gezeigten Ausführungsbeispiel oberhalb des Lichtblattebenengenerators 24 und dieser wiederum oberhalb des Umlenkelements 26 angeordnet. Alternativ ist es auch möglich, die genannten Komponenten nebeneinander anzuordnen. Die Lichtquelle 22 emittiert einen Lichtstrahl 28 nach unten in Richtung zum Lichtblattebenengenerator 24 hin. Dieser moduliert den Lichtstrahl 28 derart, dass die Voraussetzungen gegeben sind, um außerhalb des Lichtquellenmoduls 12 innerhalb der zu untersuchenden Probe eine Lichtblattebene 32 zu erzeugen. Der modulierte Lichtstrahl 28 wird dann mittels des Umlenkelements 26 zur Probe geleitet und im vorliegenden Beispiel aus einer vertikalen Richtung in eine horizontale Richtung umgelenkt.
3 zeigt eine Anordnung mit einem erfindungsgemäßen Lichtquellenmodul 12, einer Probenkammer 10 und einem Detektionsobjektiv 14. Es ist zu erkennen, dass sich das Lichtquellenmodul 12 und das Detektionsobjektiv 14 gegenseitig nicht beeinflussen sowie, dass genügend Platz für die Handhabung der Probenkammer 10 sowie der eigentlichen Probe verbleibt. Das Lichtquellenmodul 12 ist dabei so designt, dass es teilweise in das Immersionsmedium, beispielsweise in Wasser, eingetaucht werden kann.
Die Probenkammer 10 besteht dabei z.B. aus einem Kunststoff mit einem Brechungsindex der dem von Wasser nahekommt oder entspricht. Die Seitenwände der Probenkammer 10 sind flache Ebenen welche senkrecht zur Lichtblattebene 32 stehen. Das gezeigte Setup ermöglicht eine Verfahrenskombination verschiedener mikroskopischer Methoden. So kann z.B. das Lichtquellenmodul 12 ausgeschaltet werden, so dass ein normales inverses Mikroskop vorliegt und somit alle für inverse Mikroskope verfügbaren Techniken zum Einsatz kommen können (FLIM, FCS, FRAP, FRED, STED etc.). Sobald das Lichtquellenmodul 12 eingeschaltet wird ändert sich das Mikroskopierverfahren auf Kamerabetrieb und es kann ein klassisches Lichtblattebenenexperiment durchgeführt werden.
4 zeigt eine Anordnung mit zwei erfindungsgemäßen Lichtquellenmodulen 12, 34, einer Probenkammer 10 und einem Detektionsobjektiv 14. Gegenüber dem in 3 gezeigten Aufbau ist lediglich ein weiteres Lichtquellenmodul 34 ergänzt worden. Es wird deutlich, dass durch das erfindungsgemäße Lichtquellenmodul 12 eine einfache Probenhandhabung möglich wird. Bisher ist es nur unter großem Aufwand möglich, ein Objekt mittels zweier Lichtblattebenen gleichzeitig zu untersuchen. Beim hier vorgeschlagenen Setup hingegen bleibt um die Probe herum immer noch genügend Freiraum, um diese zu manipulieren und zu bewegen.
5 zeigt eine Anordnung mit zwei erfindungsgemäßen Lichtquellenmodulen 12, 34, einer Probenkammer 10 und zwei Detektionsobjektiven 14, 36. Dieser Aufbau ermöglicht das Anbringen eines zweiten Objektivs 36 oberhalb der Probenkammer 10 bzw. der Probe. Dabei wird ausgenutzt, dass sich die Lichtquellenmodule 12, 34 derart designen lassen, dass der für ein oben liegendes Objektiv 36 benötigte Raum geschaffen werden kann. Die konkrete Ausgestaltung der beiden Lichtquellenmodule 12, 34 wird weiter unten noch genauer beschrieben. Mit dem gezeigten Aufbau kann das Objekt, welches durch die Lichtblattebene in einer Ebene beleuchtet wird, auch simultan von zwei Seiten aus beobachtet werden. Zudem lassen sich nun wieder verschiedener Mikroskopierverfahren miteinander kombinieren. Da sich die Probe und die gesamte Anordnung bei der Umschaltung der Mikroskopierverfahren nicht bewegen müssen, können die Bilder, welche durch die verschiedenen Mikroskopierverfahren entstanden, später leicht überlagert oder in anderer sinnvoller Weise miteinander korreliert werden. So könnte z.B. zunächst ein Übersichtsbild aufgenommen werden. Mittels Bildanalyse können aus dem Übersichtsbild interessante Objekte ermittelt werden. Diese Objekte werden anschließend durch einen Manipulationslaser durch das obere Objektiv 36 hindurch manipuliert. Anschließend schaltet das System beide Objektive auf Lichtblattebenenbetrieb (Kamera) um und aktiviert die beiden Lichtquellenmodule 12, 34 um den weiteren Prozess der manipulierten Stelle zu beobachten. Dabei muss der freie Arbeitsabstand der Objektive 14, 36 groß genug sein, um noch eine Probe zwischen die beiden Objektive 14, 36 platzieren zu können. Zum Erzeugen einer Lichtblattebene wird eine numerische Apertur von 0,2 bis 0,3 benötigt, aus dieser folgt dann der freie Arbeitsabstand.
6 zeigt eine Anordnung gemäß 5, die um einen Motortisch 38 ergänzt ist. Durch eine Bewegung des Motortisches 38 in Y-Richtung kann mit geringem Aufwand zwischen mehreren Probenkammern 10.1, 10.2, 10.3 gewechselt werden. Die Bewegung ist durch den eingezeichneten Doppelpfeil angedeutet. Das gezeigte Setup ermöglicht auch einen scannenden Betrieb, d.h. das beschriebene Setup kann an verschiedenen X- und Y-Positionen, welche mittels des motorisierten Tisches 38 angefahren werden, wiederholt ausgeführt werden. Die Lichtquellenmodule 12, 34 sind dabei an einem hier nicht dargestellten Rahmen befestigt, derart, dass die Lichtquellenmodule 12, 34 gemeinsam oder getrennt in der Z-Richtung (hoch und runter) sowie in der X- und Y-Richtung (rechts, links, vor, zurück) verfahren werden können.
7 zeigt eine detaillierte Darstellung eines zweiten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Lichtquellenmoduls 12. Das Lichtquellenmodul weist ein Lichtquellensubmodul 40, ein Lichtblattebenengeneratorsubmodul 42 und ein Elektroniksubmodul 44 auf. Weiterhin weist das Lichtquellenmodul 12 ein Umlenkelement 26 auf, das derart ausgestaltet ist, dass die Austrittsfläche 56 an einem Vorsprung 46 angeordnet ist, der unterhalb der Unterseite 48 des Lichtquellenmoduls 12 angeordnet ist. Die Submodule 40, 42 und 44 weisen jeweils ein eigenes Gehäuse auf. Im gezeigten Fall bilden die außen liegenden Teile der Submodule 40, 42 und 44 das Gehäuse des gesamten Lichtquellenmoduls 12. Lösungen, bei denen die Submodule 40, 42 und 44 von einem zusätzlichen Gehäuse umschlossen werden, sind jedoch ebenfalls denkbar.
Im gezeigten Ausführungsbeispiel ist das Lichtquellensubmodul 40 neben dem Lichtblattebenengeneratorsubmodul 42 angeordnet. Das Elektroniksubmodul 44 ist oberhalb der beiden anderen Submodule 40, 42 angeordnet und überdeckt die beiden Oberseiten des Lichtquellensubmoduls 40 und des Lichtblattebenensubmoduls 42. Das Gehäuse des Elektroniksubmoduls 44 ist wie auch das Gehäuse des Lichtquellensubmoduls 40 kastenförmig bzw. quaderförmig. Das Gehäuse des Lichtblattebenengeneratorsubmoduls 42 weist ebenfalls eine quaderförmige Grundform auf, hat an der probenzugewandten Seite im oberen Bereich aber eine schräge Ebene. Die Unterseite des Lichtblattebenengeneratorsubmoduls 42 hat eine größere Oberfläche als seine Oberseite. Auf diese Weise kann erreicht werden, dass das Lichtquellenmodul 12 das Beobachtungsobjektiv nur in sehr geringem Maße beeinflusst bzw. sich diesem annähert. Typischerweise haben solche Beobachtungsobjektive im unteren Bereich einen konisch zulaufenden Abschnitt, so dass weiter oben weniger Platz für das Lichtquellenmodul 12 zur Verfügung steht als im unteren Bereich des Objektivs. Da die Austrittsfläche 56 aber möglichst nah an die Probe gebracht werden soll, können das Gehäuse des Lichtquellenmoduls bzw. die Gehäuse der Submodule sowie das Umlenkelement 26 entsprechend ausgestaltet werden. Sowohl das Gehäuse des Lichtquellenmoduls 12, das Gehäuse des Lichtblattebenengeneratorsubmoduls und/oder das Umlenkelement können dabei derart ausgestaltet sein, dass sie sich entlang einer Diagonalen von oben nach unten gesehen der Probe annähern. Es bleibt dann im oberen Bereich des entsprechenden Bauelements mehr Platz für das Beobachtungsobjektiv.
Zwischen den einzelnen Submodulen 40, 42, 44 besteht sowohl struktureller als auch funktioneller Kontakt. Mechanisch können die Submodule 40, 42, 44 beispielsweise über Schraub- oder Klebverbindungen miteinander verbunden werden. Funktionell weisen das Lichtquellensubmodul 40 und das Lichtblattebenengeneratorsubmodul 42 jeweils ein Interface zur Übergabe des Lichtstrahls auf. Weiterhin sind Kontakte, beispielsweise Steckverbindungen, vorgesehen, so dass das Elektroniksubmodul 44 sowohl mit dem Lichtquellensubmodul 40 als auch mit dem Lichtblattebenengeneratorsubmodul 42 in Kontakt steht. Wenn, anders als im gezeigten Ausführungsbeispiel, das Lichtquellensubmodul 40 zwischen dem Lichtblattebenengeneratorsubmodul 42 und dem Elektroniksubmodul 44 angeordnet ist, kann der Kontakt zwischen Elektroniksubmodul 44 und Lichtquellensubmodul 40 auch durch das Lichtblattebenengeneratorsubmodul 42 durchgeschleift werden.
8 zeigt ein erstes Ausführungsbeispiel eines Umlenkelements 26. Das Umlenkelement 26 ist im Wesentlichen prismenartig ausgeführt und besteht aus einem optisch transparenten Material, beispielsweise aus Glas oder Kunststoff. Das Umlenkelement 26 weist einen Eintrittsbereich 50, einen Versatzabschnitt 52 und einen Austrittsbereich 54 mit der Austrittsfläche 56 auf. Der Versatzabschnitt 52 ist dabei mit zwei planparallelen Seiten ausgestaltet, die einen vertikalen Versatz des Lichtstrahls durch mehrfache Totalreflexion an den Außenseiten des Versatzabschnittes 52 zu ermöglichen. Der Versatzabschnitt 52 wird also von einer planparallelen Platte gebildet. Im gezeigten Beispiel verjüngt sich der Versatzabschnitt in horizontaler Richtung quer zum Lichtstrahl, so dass der resultierende, außerhalb des Lichtquellenmodulgehäuses liegende Vorsprung 46 nur ein kleines Volumen einnimmt. An dem Vorsprung 46 ist auch die Austrittsfläche 56 angeordnet. Je nach Länge und Neigungswinkel dieser planparallelen Platte 58 kann ein gewünschter Abstand in X-Richtung und in Z-Richtung zwischen dem Eintrittsbereich 50 und dem Austrittsbereich 54 des Umlenkelements 26 hergestellt werden. Auf diese Weise entsteht ein größerer freier Raum oberhalb der Probe. Das prismatische Umlenkelement 26 sorgt für einen horizontalen sowie einen vertikalen Versatz des Lichtstrahls durch mehrfache interne Reflexion.
Der Eintrittsbereich 50 und der Austrittsbereich 54 weisen jeweils eine im Wesentlichen quaderförmige Grundstruktur auf. Im gezeigten Ausführungsbeispiel ist wiederum die der Probe bzw. der Austrittsfläche 56 zugewandte Seite des Eintrittsbereich 50 abgeschrägt ausgeführt, um der konischen Form eines Detektionsobjektivs zu folgen. Der Versatzabschnitt 52 erstreckt sich diagonal zwischen dem Eintrittsbereich 50 und dem Austrittsbereich 54.
Das Umlenkelement 26 kann auf unterschiedliche Weisen ausgestaltet werden. Hauptmerkmal ist es, das Licht an die Probe zu führen. Dabei ist das Umlenkelement 26 so ausgeformt, dass es zumindest teilweise in ein Immersionsmedium eingetaucht werden kann, während sich alle anderen Bauteile außerhalb des Immersionsmediums befinden. Das Umlenkelement 26 ist vorzugsweise aus Glas hergestellt und hat dadurch keinen schädlichen Einfluss auf die Probe. Es ist neben einer festen Struktur des Umlenkelements 26 auch denkbar, das Umlenkelement 26 als Glasfaser auszugestalten. Die Glasfaser kann dann durch geeignete Aufnahmen ortsfest positioniert werden, so dass das Umlenkelement nur ein einziges Mal kalibriert werden muss.
In dem Umlenkelement 26 kann eingangs- wie ausgangsseitig eine optische Einheit eingeklebt sein, welche die Lichtblattebene 32 in die gewünschte Form bringt. Diese optischen Einheiten können z.B. mittels eines optisch unbedenklichen Klebers wasserdicht (bzw. dicht gegen das verwendete Immersionsmedium) eingesetzt werden.
Das Umlenkelement 26 lenkt das Licht von dem Eintrittsbereich 50 zu dem Austrittsbereich 54 und ändert dabei die Höhe, so dass das Umlenkelement 26 in das Immersionsmedium getaucht werden kann. Optional kann ausgangsseitig eine zusätzliches Optikelement 62 zur Strahlformung eingesetzt sein. Ebenfalls kann beleuchtungsseitig, also eingangsseitig, ein zusätzliches Optikelement 64 zur Strahlformung eingesetzt sein.
Die Aufgabe des in 8 abgebildeten Umlenkelements ist es, einen Höhenversatz zwischen den Beleuchtungselementen, also der Lichtquelle bzw. dem Lichtquellensubmodul 40 und der Lichtblattebene 32 zu erreichen. Es wird dadurch möglich, einen großen Teil des Lichtquellenmoduls 12 und insbesondere das Lichtquellensubmodul 40 außerhalb des möglicherweise flüssigen Immersionsmediums zu halten und dennoch die Lichtblattebene an das Beobachtungsobjekt zu führen.
Das objektseitige Optikmodul 62, welches wasserdicht in das Umlenkelement 26, das im dargestellten Fall als prismenförmiger Glasblock ausgeführt ist, eingesetzt wurde, dient der abschließenden Strahlformung um die Lichtblattebene 32 optimal auszugestalten. Das Gegenstück ist ein optionales beleuchtungsseitiges Optikmodul 64, welches für eine gute Lichteinkopplung in das Beleuchtungsprisma, also in das Umlenkelement 26, sorgt.
Im dargestellten Ausführungsbeispiel sind die Fläche des Eintrittsbereichs 50, über die der Lichtstrahl eingekoppelt wird, und die Austrittsfläche 56 parallel zueinander ausgerichtet. In anderen Ausführungsformen sind aber auch andere Winkel zwischen den beiden genannten Flächen, insbesondere ein Winkel von 90°, möglich.
9 zeigt ein zweites Ausführungsbeispiel eines Umlenkelements 26. Im dargestellten Ausführungsbeispiel wurde auf die planparallele Platte verzichtet. Ausgangsseitig ist ein optisches Element 66 an der Austrittsfläche 56 angeordnet, das die Funktion einer Zylinderlinse hat und somit an der Erzeugung der Lichtblattebene 32 beteiligt ist. Die Zylinderlinse 66 kann als separates optisches Element ausgestaltet oder durch ein formgebendes Verfahren monolithisch direkt aus dem Umlenkelement 26 hergestellt sein. Im in 9 dargestellten Ausführungsbeispiel findet innerhalb des Umlenkelements 26 nur eine einzige Reflexion statt, die den Lichtstrahl um 90° umlenkt. Die Fläche des Eintrittsbereichs, über die der Lichtstrahl in das Umlenkelement 26 eingekoppelt wird, ist in einem Winkel von 90° zu der Austrittsfläche 56 orientiert. Hierbei wird, da im gezeigten Fall die Austrittsfläche 56 gekrümmt ist, eine Ausgleichsebene durch die Austrittsfläche 56 als Maß für die Orientierung der Austrittsfläche 56 herangezogen.
10 zeigt ein drittes Ausführungsbeispiel eines Umlenkelements 26, welches zur 9 vergleichbar ausgebildet ist. Jedoch weist das Umlenkelement eine sphärische Linse bzw. eine entsprechende Mikrooptik 67 auf, mit welcher ein im Wesentlichen rotationssymmetrischer Lichtstrahl geformt wird.
Im Folgenden werden mehrere Submodule detailliert beschrieben. Es sei an dieser Stelle angemerkt, dass der innere Aufbau der Submodule nicht davon abhängig ist, dass im gezeigten Ausführungsbeispiel das Lichtquellenmodul aus Submodulen aufgebaut ist. Selbstverständlich können alle technischen Lösungen auch in einem einzelnen größeren Gehäuse des Lichtquellenmoduls verwirklicht werden, ohne auf die Lösung anhand von Submodulen angewiesen zu sein. Streng genommen handelt es sich bei den Darstellungen um Schnitte durch die Submodule, da die jeweilige vordere Seitenwand nicht dargestellt ist, um einen Blick in das Innere der Submodule zu erlauben.
11 zeigt ein Ausführungsbeispiel eines Lichtblattebenengeneratorsubmoduls 42. In diesem Submodul wird die gewünschte Lichtscheibe generiert. Die Ausführungen können dabei unterschiedlich sein, je nachdem wie die Lichtscheibe erzeugt wird. So können hier z.B. Zylinderlinsen und entsprechende optische Transformatoren eingebaut sein, um in Zusammenarbeit mit den Optikkomponenten des Umlenkelements 26 eine Lichtblattebene mittels Zylinderlinsen zu generieren. Das Umlenkelement 26 und insbesondere der Versatzabschnitt 52 durchdringt dabei die Unterseite bzw. den Boden des Gehäuses des Lichtblattebenengeneratorsubmoduls 42 und somit auch die Unterseite bzw. den Boden des Gehäuses des Lichtquellenmoduls 12. Alternativ kann das Umlenkelement 26 auch die jeweilige Seitenwand des Lichtblattebenengeneratorsubmoduls 26 bzw. des Lichtquellenmoduls 12 durchdringen.
Ebenfalls ist es möglich, einen Galvanometrischen Spiegel 68 und entsprechende optische Transformatoren zu verwenden, um einen Laserstrahl 70 so abzulenken, dass die gewünschte Lichtscheibe bzw. Lichtblattebene entsteht, beispielsweise in Form eines scannenden Lichtblatts. Das Beleuchtungsprisma 26 lenkt das Licht vom Lichtquellenmodul zur Probe. Zur optimalen Abbildung in das Beleuchtungsprisma 26 weist dieses eine Eingangsoptik 64 auf. Am Boden des Lichtblattebenengeneratorsubmoduls 42 ist ein zweites Umlenkelement 72 angeordnet. Dieses ist im vorliegenden Fall als Prisma ausgestaltet, kann aber auch ein zweiter Galvanometrischer Spiegel sein. Der Galvanometrische Spiegel 68 erzeugt durch Strahlablenkung die gewünschte Lichtblattebene. Alternativ zu dem galvanometrischen Spiegel 68 kann auch ein rotierendes Spiegelsystem, beispielsweise ein Oktagon, zum Einsatz kommen. Die im gezeigten Ausführungsbeispiel dargestellte planparallele Glasplatte 74 ist eine elektronisch justierbare Platte zum Erzeugen eines planparallelen Strahlversatzes. Hiermit kann die Lage der Lichtblattebene in Z-Richtung nachjustiert werden. Es ist deutlich zu erkennen, dass der Laserstrahl 70 in Strahlrichtung hinter der planparallelen Gasplatte 74 einen leichten Versatz nach unten erfahren hat, die Ausbreitungsrichtung aber konstant geblieben ist.
Das in 11 dargestellte Lichtblattebenengeneratorsubmodul 42 erzeugt in diesem Fall eine Lichtblattebene durch einen kontinuierlichen Versatz eines Laserstrahls 70 in einer Richtung. Der von dem Lichtquellensubmodul 40 eingekoppelte Laserstrahl 70 wird durch die planparallele Glasplatte 74 parallel versetzt. Der Neigungswinkel der Platte 74 ist motorisiert einstellbar. Mittels einer Änderung des Neigungswinkels der Platte 74 kann die Lichtblattebene am Ausgang des Beleuchtungsprismas 26 parallel in der Höhe feinjustiert werden.
Der galvanometrische Spiegel 68 lenkt den einlaufenden Laserstrahl 70 nach unten unter einstellbaren Winkeln ab und erzeugt auf diese Weise einen Lichtstreifen. Der Lichtstreifen wird im Weiteren über das Umlenkprisma 72, alternativ über einen Spiegel oder einen weiteren galvanometrischen Spiegel auf das Optikmodul 64 abgebildet, welches das Eingangslicht geeignet auf den Eingang des Beleuchtungsprismas 26 lenkt. Alternativ ist auch denkbar, dass das Optikmodul 75 eine oder mehrere Zylinderlinsen zur Erzeugung der Lichtblattebene enthält. In diesem Fall kann der galvanometrische Spiegel 68 durch ein einfacheres Umlenkelement wie einen statischen Spiegel oder ein Prisma ersetzt werden.
Des Weiteren könnte das Lichtblattebenengeneratorsubmodul auch einen zur Erzeugung (und gegebenenfalls auch kohärenter oder inkohärenter Überlagerung) von Bessel-Strahlen, Mathieu-Strahlen, Airy-Strahlen oder anderer Strahlarten geeigneten optischen Aufbau enthalten. Ebenfalls wäre die Verwendung diffraktiver Elemente zur Erzeugung der Lichtblattebene denkbar. Eine weitere Methode einer Strahlablenkung könnte durch den Einsatz akustooptischer Elemente erfolgen. Dieses Ausführungsbeispiel hatte z.B. den Vorteil besonders schnell und trägheitsarm reagieren zu können.
12 zeigt ein Ausführungsbeispiel eines Lichtquellensubmoduls 40. Es dient dazu, die gewünschten Wellenlängen in optimaler Weise zu generieren und in das Lichtscheibengeneratorsubmodul 42 einzukoppeln. Das Lichtquellensubmodul 40 enthält Laser 78.1, 78.2 und 78.3 verschiedener Wellenlängen. Die Laser 78.1, 78.2 und 78.3 sind als Diodenlaser ausgeführt. Die Adaptermodule 80.1, 80.2 und 80.3 bilden die Laserstrahlen optisch geeignet auf die Filter/Strahlteiler 82.1, 82.2 und 82.3 ab, schalten sie und lenken sie ab. Sie können verschiedene Ausführungen und einen komplexeren Aufbau haben. So kann ein AOBS („Acousto-Optical Beam Splitter“) oder ein Shutter für ein schnelles Abschalten sorgen. Weiterhin können optische Elemente zum Abbilden der Laser enthalten sein. Die Filter/Strahlteiler 82.1, 82.2 und 82.3 sorgen dafür, dass das Licht aller Laserquellen 78.1, 78.2 und 78.3 auf eine optische Achse „aufgefädelt“ wird. Weiterhin umfasst das Lichtquellensubmodul 40 eine Einkoppeloptik 84 für das Lichtblattebenengeneratorsubmodul. Die Laser 78.1, 78.2 und 78.3 sind dabei an der Unterseite bzw. am Boden des Lichtquellensubmoduls 40 angeordnet. Sie können innerhalb des Lichtquellensubmoduls 40 ebenfalls auch an der Oberseite oder einer anderen Seitenfläche des Lichtquellensubmoduls 40 angeordnet sein.
Die Filter 82 können motorisiert drehbar ausgeführt sein. Dadurch kann ein automatisches Alignment durchgeführt werden. Die Einkoppeloptik 84 enthält dann neben optischen Komponenten ein Pinhole mit Photozellen auf den Lamellen. Wenn das Licht perfekt auf der optischen Achse ausgerichtet ist so durchquert der Laserstrahl vollständig das Pinhole und die Photodetektoren liefern kein Signal. Andernfalls trifft Licht auf die Photozellen. Über ein Elektronikmodul, beispielsweise das Steuerungssubmodul, kann dann eine Auswertung und gegebenenfalls eine Korrektur erfolgen.
13 zeigt ein Ausführungsbeispiel eines Lichtquellensubmoduls 40 mit einer Einkoppelvorrichtung 86 zur Einkopplung eines oder mehrerer externer Laser, beispielsweise in Form einer Lichtleitfaser 87. Im gezeigten Beispiel weist das Lichtquellensubmodul 40 ein Einkoppelmodul 76 auf, welches den eingekoppelten Laserstrahl auf das Lichtblattebenengeneratorsubmodul abbildet.
14 zeigt ein Ausführungsbeispiel eines Steuerungssubmoduls 44. Das Steuerungssubmodul übernimmt die Steuerung des Lichtscheibengeneratorsubmoduls 42 und des Lichtquellensubmoduls 40. Zudem ist das Steuerungssubmodul mit verschiedenen externen Schnittstellen ausgestattet, wie z.B. den Kabelsteckern 88 und der Antenne 90. Über diese Schnittstellen kann das Steuerungssubmodul 44 sowohl drahtlos als auch kabelgestützt mit externen Systemen wie PCs oder Netzwerken kommunizieren.
Des Weiteren kann in das Steuerungssubmodul 44 eine m2m (machine to machine) Schnittstelle integriert sein, um direkt an die Hardware anderer Systeme angeschlossen zu werden. Damit ist eine schnelle und synchrone Echtzeitkommunikation mit anderen Maschinenteilen möglich, vorzugsweise mit einer Kamera oder einem anderen Lichtquellenmodul.
Das Steuerungssubmodul 44 kann zudem einen programmierbaren Teil (z.B. FPGA, „Field Programmable Gate Array“) enthalten, in dem ein Anwender eine Ablauflogik, beispielsweise in Form eines Programms, hinterlegen kann um zeitkritische Prozesse PC-unabhängig zu steuern. Mehrere Lichtquellenmodule 40 können auf diese Weise hintereinandergeschaltet werden. Kameras können die Lichtquellenmodule 40 triggern, alternativ kann das Lichtquellenmodul 40 eine oder mehrere Kameras aufweisen.
Das Steuerungssubmodul 44 weist eine Elektronikeinheit 92, beispielsweise in Form einer Platine, auf. Die Elektronikeinheit kann Auswerte- und Analyseeinheiten, elektronische Baugruppen, ein FPGA sowie verschiedene weitere Komponenten enthalten. Die Antenne 90 dient zur Funkverbindung, beispielsweise über Bluetooth, WLAN oder ein anderes geeignetes existierendes oder zukünftig existierendes Protokoll. Die Steckverbindung 88.1 dient zur Energieversorgung und die Steckverbindung 88.2 zum Anschluss eines Steuerbus, beispielsweise zur Kommunikation über ein Bussystem mit Steuerrechnern etc., einem CAN Bus, einem m2m Steuerprotokoll oder ähnlichem. Die Steckverbindung 88.3 ist ein Eingang eines direkten Steuerbusses von einem Nachbarelement, z.B. einem weiteren Lichtquellenmodul, einer Kamera usw. Steckverbindung 88.3 kann auch als Eingang für ein Triggersignal genutzt werden. Die Steckverbindung 88.4 dient als Ausgang eines direkten Steuerbusses zu einem Nachbarelement, z.B. einem weiteren Lichtquellenmodul, einer Kamera oder dergleichen. Steckverbindung 88.4 kann auch als Ausgang für ein Triggersignal genutzt werden. Das Elektronikmodul 44 kann mit seiner Umwelt kommunizieren. Als leicht nutzbares Universalinterface ist eine Antenne 90 vorgesehen, über die auf dem Funkwege Daten und Steuerinformationen ausgetauscht werden können. Dieses Funkinterfaces verwendet Standard-Protokolle wie Bluetooth LE (>= 4.0), WLAN oder andere bekannte Protokolle.
Über die Schnittstelle 88.1 erfolgt die Energieversorgung. Diese Energieversorgungsschnittstelle 88.1 kann neben der Elektronik auch die ggf. vorhandenen Laserkomponenten versorgen. Ein externes Netzteil ist günstig, um die Erwärmung des Lichtquellenmoduls sowie Störstrahlung zu minimieren.
15 zeigt einen schematischen Aufbau mit einem Lichtquellenmodul 12 und zwei Detektionsobjektiven 14, 36. Im unteren rechten Bereich der Figur ist der mit dem Pfeil gekennzeichnete Bereich der Figur vergrößert dargestellt. Das Lichtquellenmodul weist ein im Wesentlichen kasten- bzw. quaderförmiges Gehäuse und einen an der Unterseite angeordneten Vorsprung auf, an dem die Austrittsfläche angeordnet ist. Der von dem Lichtquellenmodul 12 bereitgestellte Laserstrahl 28 kann durch eine entsprechend gestaltete Optik und gesteuerte Ablenksysteme in eine schnelle, horizontale Schwingung 94 versetzt werden, so dass eine horizontale Lichtscheibe bzw. Lichtblattebene 32 mit den gewünschten Eigenschaften entsteht. Ein Objekt, welches in diese Lichtblattebene 32 geführt wird, wird dadurch von dem Lichtquellenmodul 12 beleuchtet und das emittierte Licht kann durch mindestens ein Objektiv 14 beobachtet werden. Es kann ein zweites Detektionsobjektiv 36 vorhanden sein. Dann können die beiden Objektive koaxial angeordnet sein, so dass sie denselben Bereich der Lichtscheibe 32 scharf abbilden können.
In der dargestellten Ausführungsform sind den beiden Objektiven 14 und 36 zwei Kameras 96, 98 oder Lichtfeldkameras zugeordnet, derart, dass die Kamera oder Lichtfeldkamera 96, welche Objektiv 14 zugeordnet ist, und die Kamera oder Lichtfeldkamera 98, welche Objektiv 36 zugeordnet ist, jeweils einen ersten räumlichen Bereich 100 und einen zweiten räumlichen Bereich 102 erfassen, derart, dass der räumlich auflösbare Bereich verdoppelt werden kann.
Der dargestellte Aufbau kann derart genutzt werden, dass entweder das Objektiv 14 oder das Objektiv 36 der Beobachtung während das jeweils andere Objektiv 36 oder 14 zur Manipulation eines Objektes innerhalb der Lichtscheibe 32 verwendet werden kann. Das jeweilige Manipulations-Objektiv 14 oder 36 kann dabei ein Objekt innerhalb der Lichtscheibe 32 ausbleichen, zerstören oder per Lichtfalle verschieben, während das Objekt gleichzeitig mit dem jeweiligen Beobachtungsobjektiv 36 oder 14 untersucht werden kann.
Ein weiteres mögliches Verfahren kombiniert mehrere verschiedene Verfahren der Mikroskopie. So kann Objektiv 14 oder 36 das Bild mittels einer CCD oder CMOS oder SCMOS Kamera beobachten während das jeweils andere Objektiv 36 oder 14 die Probe zugleich mittels einer konfokalen Anordnung abrastert. Dabei können die beiden Beobachtungsobjektive 14 und 36 in Ihrem Abstand zur Lichtscheibe 32 so angeordnet werden, dass insgesamt zwei verschiedene Fokusebenen, die in den jeweiligen ersten und weiten räumlichen Bereichen 100, 102 liegen, abgebildet werden.
Das Lichtquellenmodul kann dabei in einer besonderen Ausführungsform derart ausgestaltet sein, dass die Verlustleistung der Laserkomponenten thermisch gut über das Gehäuse abgeführt werden kann. Indem man ein eigenes Lichtquellenmodul verwendet können Teile des optischen Aufbaus im Lichtblattebenengenerator thermisch gut isoliert werden. Dies hat Einfluss auf die Stabilität der optischen Justage.

Claims

Lichtquellenmodul zur Erzeugung einer Lichtblattebene mit einem Lichtquellenmodulgehäuse, einem innerhalb des Lichtquellenmodulgehäuses angeordneten Lichtblattebenengenerator zur Beeinflussung eines Lichtstrahls derart, dass außerhalb des Lichtquellenmodulgehäuses eine Lichtblattebene erzeugt wird, und einer Austrittsfläche des Lichtquellenmodulgehäuses, aus der der Lichtstrahl austritt, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest eine Lichtquelle innerhalb des Lichtquellenmoduls angeordnet ist.
Lichtquellenmodul nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Lichtquellenmodulgehäuse ausgestaltet ist, um im Bereich der Austrittsfläche derart in ein Immersionsmedium eingetaucht zu werden, dass die Austrittsfläche vollständig von dem Immersionsmedium bedeckt wird.
Lichtquellenmodul nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein unterer Bereich des Lichtquellenmoduls zumindest im Wesentlichen aus Glas oder einem transparenten Kunststoff besteht.
Lichtquellenmodul nach einem der vorstehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch eine Einkoppelvorrichtung für eine externe Lichtquelle oder für mehrere externe Lichtquellen.
Lichtquellenmodul nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es ein optisches Umlenkelement aufweist, das eine Eingangsseite und eine Ausgangsseite aufweist, wobei durch die Eingangsseite eintretendes Licht innerhalb des Umlenkelements zur Ausgangsseite geleitet wird und die Austrittsfläche des Lichtquellenmoduls von der Ausgangsseite des Umlenkelements gebildet wird.
Lichtquellenmodul nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass an der Austrittsfläche ein optisches Element angebracht ist, insbesondere mittels einer Klebverbindung, einer Klemmverbindung, einer Quetschverbindung, einer Schraubverbindung oder einer magnetischen Verbindung.
Lichtquellenmodul nach einem der vorstehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch ein Volumen von unter 50 cm³, vorzugsweise von unter 30 cm³.
Lichtquellenmodul nach einem der vorstehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch eine Koppelvorrichtung, mittels der das Lichtquellenmodul mit einem Mikroskop, insbesondere mit einem Detektionsobjektiv des Mikroskops, reversibel und mit einer Genauigkeit von unter 5 µm, bevorzugt von unter 2 µm positionsfest gekoppelt werden kann.
Lichtquellenmodul nach einem der vorstehenden Ansprüche, gekennzeichnet durcheine Kühlvorrichtung und/oder eine Heizvorrichtung.
Lichtquellenmodul nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Austrittsfläche an einem aus dem Lichtquellenmodulgehäuse vorstehenden Vorsprung angeordnet ist.
Lichtquellenmodul nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Vorsprung sich unterhalb einer Unterseite des Lichtquellenmodulgehäuses befindet und eine Austrittsfläche von weniger als 50 mm², bevorzugt weniger als 30 mm², besonders bevorzugt weniger als 10 mm² aufweist.
Lichtquellenmodul nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Profil einer Seite des Lichtquellenmodulgehäuses, auf welcher die Austrittsfläche angeordnet ist, zumindest abschnittsweise einen Winkel zwischen 40° und 70° mit dem austretenden Lichtstrahl bildet.
Lichtquellenmodul nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass innerhalb des Gehäuses ein optisches Element oder mehrere optische Elemente entlang einer optischen Achse manuell oder motorisch verschieblich angeordnet sind.
Lichtquellenmodul nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Lichtquellenmodul ein Lichtblattebenengeneratorsubmodul und/oder ein Steuerungssubmodul aufweist.
Mikroskop mit zumindest einem Lichtquellenmodul zur Erzeugung einer Lichtblattebene nach einem der vorstehenden Ansprüche.
Mikroskop nach Anspruch 15, gekennzeichnet durch eine Vorrichtung, die es erlaubt, mehrere, vorzugsweise in einer Reihe oder in mehreren Reihen angeordnete Probenbehälter nacheinander in einen Untersuchungsbereich des Mikroskops zu bringen.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 15 oder 16, gekennzeichnet durch eine Detektionsachse, und dadurch, dass der Abstand des Lichtquellenmoduls oder der Lichtquellenmodule von der Detektionsachse veränderlich ist, um einen einfachen Probenwechsel zu ermöglichen.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein Lichtquellenmodul mit einem Detektionsobjektiv des Mikroskops mechanisch gekoppelt oder reversibel koppelbar ist, so dass diese gemeinsam bewegt werden können.
Mikroskop nach Anspruch 18, gekennzeichnet durch eine Koppelvorrichtung, die eine reversible Kopplung des Lichtquellenmoduls an das Mikroskop mit einer reproduzierbaren Genauigkeit von unterhalb 5 µm, vorzugsweise von unterhalb 2 µm in allen drei Raumdimensionen erlaubt.
Verfahren zur sequentiellen Untersuchung mehrerer Proben mittels eines Lichtblattebenenmikroskops mit einem Untersuchungsbereich, wobei das verwendete Mikroskop ein Mikroskop nach einem der Ansprüche 15 bis 19 ist, mit den Schritten: a. Einbringen einer Probe in den Untersuchungsbereich b. Untersuchen der Probe mittels Lichtblattebenenmikroskopie c. Bewegen der Probe entlang einer Bewegungsrichtung aus dem Untersuchungsbereich heraus und Bewegen einer weiteren Probe entlang der Bewegungsrichtung in den Untersuchungsbereich hinein, d. Untersuchen der weiteren Probe mittels Lichtblattebenenmikroskopie, und e. Wiederholung der Schritte c. bis d. so lange, bis alle zu untersuchenden Proben untersucht worden sind.
Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass vor Schritt c. ein Abstand eines oder mehrerer Lichtquellenmodule von dem Untersuchungsbereich vergrößert und nach Schritt c. der ursprüngliche Abstand wiederhergestellt wird.