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Die Erfindung betrifft eine optische Vorrichtung zur Beleuchtung einer in einem Probenvolumen angeordneten Probe mit Beleuchtungslicht und zur Detektion von Streu- und/oder Fluoreszenzlicht von der Probe, wobei die Vorrichtung eine optische Beleuchtungsanordnung zur Transmission des Beleuchtungslichts entlang eines Beleuchtungspfades ins Probenvolumen und eine optische Detektionsanordnung zum Aufsammeln und Weiterleiten des Streu- und/oder Fluoreszenzlichts entlang eines Detektionspfades vom Probenvolumen umfasst.
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Ferner betrifft die Erfindung ein optisches Modul und ein Mikroskop, insbesondere ein Konfokalmikroskop, umfassend eine mechanische Aufnahmevorrichtung für optische Module.
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Optische Vorrichtungen aus dem Stand der Technik, wie sie beispielsweise für Lichtblattmikroskope verwendet werden, sind aufgrund des bevorzugten geometrischen Aufbaus eines Lichtblattmikroskops, d.h. der Orientierung der Beleuchtungsanordnung und Detektionsanordnung senkrecht zueinander, nicht dafür geeignet, große Proben zu scannen. Bei den Lösungen aus dem Stand der Technik wird eine Probe beispielsweise von der Seite, besonders bevorzugt mit einem Lichtblatt, beleuchtet und insbesondere senkrecht dazu das von der Probe ausgesandte Streu- und/oder Fluoreszenzlicht detektiert. Die Beleuchtungsanordnung kann eine mögliche mechanische Verfahrung der Probe limitieren.
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Ziel der vorliegenden Erfindung ist es somit, eine kompakte optische Vorrichtung, ein kompaktes optisches Modul und ein Mikroskop zu schaffen, welche es erlauben, große Proben zu scannen.
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Die eingangs genannte optische Vorrichtung löst diese Aufgabe dadurch, dass sie wenigstens ein Vorsatzelement aufweist, in welchem der Beleuchtungspfad und/oder der Detektionspfad zumindest abschnittsweise verlaufen. Das erfindungsgemäße optische Modul löst diese Aufgabe dadurch, dass es eine erfindungsgemäße optische Vorrichtung aufweist und das eingangs genannte Mikroskop löst die obige Aufgabe dadurch, dass in diesem ein erfindungsgemäßes optisches Modul in der Aufnahmevorrichtung aufgenommen ist. Das Vorsatzelement erlaubt es, die Orientierung bzw. den Abstand der Beleuchtungs- und/oder Detektionsoptik von dem Probenvolumen zu modifizieren, was einen flexibleren und kompakteren Aufbau der optischen Vorrichtung erlaubt. Insoweit kann das Vorsatzelement eine strahlumlenkende Eigenschaft aufweisen. Ferner erlauben die erfindungsgemäßen Lösungen Untersuchungen von Probenschnitten, da der Raumwinkel, der von der optischen Beleuchtungsanordnung und der optischen Detektionsanordnung eingenommen wird, mit Vorsatzelement < 180° beträgt.
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Die optische Vorrichtung, das optische Modul und das Mikroskop können durch die im Folgenden beschriebenen, jeweils für sich vorteilhaften Ausgestaltungen weiter verbessert werden. Technische Merkmale der Ausgestaltungen können dabei beliebig miteinander kombiniert oder weggelassen werden, sofern es nicht auf den mit dem weggelassenen Merkmal erzielten technischen Effekt ankommt.
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Die optische Beleuchtungsanordnung bzw. optische Detektionsanordnung kann mehrere Einzelne Linsen bzw. ein Linsensystem umfassen. Eine solche Ausgestaltung erlaubt einen einfachen Zugang und Austausch der optischen Komponenten und bietet eine hohe Flexibilität. Insbesondere können die Beleuchtungsanordnung und/oder die Detektionsanordnung jeweils als Objektiv ausgestaltet sein. Der Beleuchtungspfad kann durch die optischen Elemente der Beleuchtungsanordnung definiert sein und insbesondere im Probenvolumen bzw. in der Probe enden. Ebenso kann der Detektionspfad durch die optischen Elemente der Detektionsanordnung definiert sein und auch der Detektionspfad kann im Probenvolumen enden.
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Insbesondere werden mit den Begriffen Beleuchtungspfad bzw. Detektionspfad jene Transmissionspfade bezeichnet, die auf eine Probenseite der Beleuchtungsanordnung bzw. auf der Probenseite der Detektionsanordnung angeordnet sind. Die optischen Pfade, welche auf der, der Probe abgewandten Seite der Beleuchtungsanordnung bzw. Detektionsanordnung verlaufen, werden von diesen Begriffen nicht umfasst.
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Ferner kann Beleuchtungslicht, welches durch eine Probe bzw. durch ein Probenvolumen ohne Probe hindurchtritt auch jenseits des Probenvolumens entlang eines optischen Pfades verlaufen. Auch dieser wird hierin nicht als Teil des Beleuchtungspfades verstanden.
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Das Vorsatzelement befindet sich folglich bevorzugt auf der Probenseite der Beleuchtungsanordnung und der Detektionsanordnung, wobei das Vorsatzelement ein dreidimensionaler, für das verwendete Licht transparente Körper sein kann, in welchem das Licht (Beleuchtungslicht und/oder Streu- und/oder Fluoreszenzlicht) transmittiert wird.
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Bevorzugt wird Licht im ultravioletten, sichtbaren und nahinfraroten Spektralbereich verwendet. So kann das Licht der Beleuchtung beispielsweise eine ultraviolette Anregungswellenlänge eines fluoreszierenden Stoffes aufweisen und das Fluoreszenzlicht Wellenlängen im langweiligen sichtbaren Spektralbereich oder im nahinfraroten Spektralbereich umfassen. Folglich ist die Beleuchtungsanordnung für den ultravioletten und die Detektionsanordnung für den nahinfraroten Spektralbereich optimiert. Das Umlenkelement kann sich bevorzugt lediglich im Beleuchtungspfad befinden und für den ultravioletten Spektralbereich optimiert sein.
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Das Vorsatzelement kann derart ausgestaltet sein, dass sowohl der Beleuchtungspfad, als auch der Detektionspfad in diesem verlaufen, oder aber lediglich der Beleuchtungspfad oder der Detektionspfad.
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In einer möglichen Ausgestaltung kann das Vorsatzelement einen eingangsseitigen optischen Querschnitt und einen ausgangsseitigen optischen Querschnitt aufweisen, wobei der eingangsseitige optischen Querschnitt größer als der ausgangsseitige optische Querschnitt sein kann. Ein solcher Querschnitt ist als für die Transmission von Licht nutzbare Fläche zu verstehen.
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Das Vorsatzelement kann beispielsweise kegelstumpf- oder pyramidenstumpfförmig sein.
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Die optische Vorrichtung kann weiter verbessert werden, indem das Vorsatzelement an der optischen Beleuchtungsanordnung und/oder an der optischen Detektionsanordnung befestigt ist. Das Vorsatzelement kann folglich mit jeweils einer der optischen Anordnungen oder mit beiden Anordnungen mitbewegt werden.
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Eine solche Ausgestaltung hat beispielsweise den Vorteil erhöhter Stabilität bei Beleuchtung/Betrachtung der Probe in einem flüssigen Medium, ohne die optischen Anordnungen selbst eintauchen zu müssen. Ein Kontakt der zumeist kostspieligen optischen Anordnungen mit unbekannten oder unerwünschten Flüssigkeiten wird somit vermieden.
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In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung kann zumindest die Detektoranordnung eine Immersionsoptik sein. Ebenso kann die Beleuchtungsanordnung eine Immersionsoptik sein.
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Die Beleuchtungsanordnung kann bevorzugt einen größeren Arbeitsabstand aufweisen als die Detektionsanordnung, so dass die Beleuchtungsanordnung in größerer Entfernung zum Probenvolumen positioniert werden kann als die Detektionsanordnung. Zudem können Beleuchtungsanordnungen genutzt werden, die eine geringere numerische Apertur (NA) als die Detektionsanordnung haben. Die geringere NA kann eine bezüglich einer optischen Achse schlankere, d.h. kleinere Bauform ermöglichen und somit mechanisch limitierte Winkel beim Positionieren der Beleuchtungsanordnung und der Detektionsanordnung weiter verringern.
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Wird als Detektionsanordnung eine Immersionsoptik verwendet, so taucht diese mit ihrem probenseitigen Ende insbesondere mit einer Frontfläche eines optischen Elements in ein Immersionsmedium ein. In einer vorteilhaften Ausgestaltung befindet sich das Vorsatzelement im Beleuchtungspfad und ist in das Immersionsmedium eingetaucht, wobei das Vorsatzelement aus dem Immersionsmedium herausragt.
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An dieser Stelle sei darauf hingewiesen, dass unter einem Immersionsmedium jenes Medium zu verstehen ist, welches sich zwischen dem Vorsatzelement und der Probe befindet und in welches die Probe eingebettet ist. Die Position des in dieser Offenbarung gezeigten Immersionsmediums ist explizit nicht auf den Bereich zwischen der optischen Anordnung in einem Deckglas beschränkt, sondern umfasst auch das die Probe umgebende Medium.
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Der Beleuchtungspfad tritt bevorzugt außerhalb des Immersionsmedium in das Vorsatzelement ein und bevorzugt im Immersionsmedium aus dem Vorsatzelement aus. Somit treten im Beleuchtungspfad keinerlei Störungen auf, die von einer bewegten Oberfläche des Immersionsmediums herrühren.
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Beim Scannen der Probe kann die Beleuchtungsanordnung somit die Probe störungsfrei beleuchten und eine Beruhigung der Oberflächenbewegung des Immersionsmediums muss nicht abgewartet werden.
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Auch über Luft übertragene Vibrationen, welche die Oberfläche des Immersionsmediums stören können, beeinflussen folglich die Beleuchtung oder Detektion nicht.
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Das Vorsatzelement kann becherförmig ausgestaltet sein, wobei es sich zur Beleuchtungsanordnung hin öffnet. Im Vergleich zu einem aus Vollmaterial hergestellten Vorsatzelement ist ein becherförmiges Vorsatzelement leichter und kann dadurch zu einer schnelleren möglichen Scanbewegung beitragen. Insbesondere liegt der Vorteil darin, dass die optische Wegstrecke (Produkt aus Brechungsindex und Strecke im Material des Vorsatzelements) nicht deutlich verändert wird, wodurch keine Anpassung der optischen Anordnung notwendig ist.
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In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung kann das Vorsatzelement zum Probenvolumen hin ein transparentes Element aufweisen. Dieses transparente Element kann ein Fenster sein und kann insbesondere für das Beleuchtungslicht und/oder für das Streu- und/oder Fluoreszenzlicht transparent sein. Insbesondere ist es vorteilhaft, wenn das transparente Element senkrecht zu dem jeweiligen Strahlengang der Beleuchtung oder der Detektion orientiert ist. Die senkrecht Orientierung zu einem Strahlengang hat den Vorteil einer Reduktion von Aberrationen, die durch schräges Auftreffen des Strahls auf eine Beleuchtungsindex-Grenzfläche entstehen.
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Das becherförmige Vorsatzelement kann bevorzugt in den Beleuchtungspfad eingebracht werden und mit einem Becherboden bzw. Bodenfläche in das Immersionsmedium eingetaucht sein. Zumindest ein Teil des Vorsatzelements oder das gesamte Vorsatzelement kann einen optischen Brechungsindex aufweisen, der an den optischen Brechungsindex der Probe oder des die Probe umgebenden Mediums angepasst ist.
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Das Vorsatzelement der optischen Vorrichtung kann mindestens zwei Grenzflächen aufweisen, die im Wesentlichen senkrecht zum Beleuchtungspfad und/oder zum Detektionspfad orientiert sind. Dies ist insbesondere vorteilhaft, wenn das zu transmittierende Licht mehrere Wellenlängen umfasst bzw. breitbandig ist.
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Durch einen senkrechten Durchtritt des Lichts durch die Grenzflächen wird eine wellenlängenabhängige Winkelaufspaltung (Winkeldispersion) durch die Materialdispersion vermieden. Bei Verwendung monochromatischen Lichts zur Beleuchtung kann der Einfall des Lichts in das Material des Vorsatzelements auch abweichend vom senkrechten Einfall erfolgen. Zu beobachten ist hierbei jedoch, dass der Durchtritt eines fokussierten Lichtstrahls durch eine schräge Grenzfläche zu Aberrationen (Koma etc.) führt, wenn sich auf den beiden Seiten der Grenzfläche der Brechungsindex des Materials unterscheidet. Ein wichtiges Kriterium an dieser Stelle ist also, ob der Brechungsindex des Vorsatzelements an das Proben/Immersions-Medium angepasst ist.
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Eine solche Anpassung kann mit einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der erfindungsgemäßen optischen Vorrichtung erreicht werden, in welcher das becherförmige Vorsatzelement mit einem weiteren optischen Medium gefüllt sein kann. So kann das Vorsatzelement beispielsweise mit einem weiteren optischen Medium gefüllt sein, dessen Brechungsindex jenem des Materials des Vorsatzelements entspricht. Ferner kann das weitere optische Medium das Medium des Vorsatzelements sein, wobei mit andern Worten ein massives, vollständig aus einem Material hergestelltes Vorsatzelement erhalten wird.
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Das becherförmige Vorsatzelement kann auch als Kammer ausgeführt sein. Die objektseitige Eintrittsfläche in die Kammer ist bevorzugt transparent und kann insbesondere senkrecht zur optischen Achse der optischen Anordnung stehen. Das Volumen der Kammer kann nun zum Beispiel mit dem Immersionsmedium gefüllt werden. Ebenso kommt natürlich ein beliebiges anderes Medium in Frage, zum Beispiel ein Gemisch, bei dem der Brechungsindex über die Konzentration einer Komponente maßgeblich verändert werden kann. Der Vorteil liegt dann darin, dass der Übertritt des Lichts von der optischen Anordnung in das Probenmedium an der Eintrittsfläche in das Vorsatzelement stattfindet, an welcher die Grenzfläche bereits senkrecht auf der optischen Achse steht. Somit sind Aberrationen minimiert. Der Austritt kann nun im Grunde unter einem beliebigen Winkel stattfinden, sofern kein Sprung im Brechungsindex vorliegt. Die vordere Grenzfläche muss also nicht mehr zwingend senkrecht zur optischen Achse orientiert sein, wenn zum Beispiel dadurch der Platz für die Probe vergrößert wird. Im Hinblick auf mögliche optische Fehler kann es jedoch vorteilhaft sein, das probenseitige Fenster der Kammer senkrecht zur optischen Achse der optischen Anordnung zu orientieren.
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Wird das Vorsatzelement, das vollständig aus einem Material besteht vor der optischen Anordnung befestigt, so ist es vorteilhaft, wenn die Eintritts- und Austrittsfläche senkrecht auf der optischen Achse der optischen Anordnung stehen. Umfasst ein aus einem einzigen Material hergestelltes Vorsatzelement ein Material mit im Vergleich zu Luft größerem Brechungsindex (Brechungsindex >1 bzw. weiter bevorzugt Brechungsindex >1,33), so wird bei einem solchen Vorsatzelement durch die Brechung an der Eintrittsfläche eine Verlängerung des Arbeitsabstandes der optischen Anordnung erhalten. Dies kann vorteilhafterweise dahingehend genutzt werden, dass die optische Anordnung noch weiter in Bezug zur Probe zurückgesetzt werden kann, um eine Kollision mit einer weiteren optischen Anordnung zu vermeiden. Ebenso ist es möglich, dass der Winkel zwischen der optischen Beleuchtungsanordnung und der optischen Detektionsanordnung kleiner gewählt werden kann, da diese räumlich voneinander getrennt werden können.
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Die zwei Grenzflächen des Becherbodens, eine weist zur Beleuchtungsanordnung, die andere zum Probenvolumen, können folglich auch senkrecht zum Beleuchtungspfad orientiert sein, so dass beim Durchtritt des Beleuchtungslichts durch den Becherboden keine wellenlängenabhängige Winkeldispersion auftritt.
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Das Vorsatzelement der optischen Vorrichtung kann in einer weiteren Ausgestaltung ein das Beleuchtungslicht und/oder Streu- und/oder Fluoreszenzlicht umlenkendes Umlenkelement sein. Dies hat den Vorteil, dass optische Achsen der Beleuchtungsanordnung und der Detektionsanordnung nicht senkrecht zueinander orientiert sein müssen, sondern ein Winkel kleiner 90° wählbar ist, wobei eine Umlenkung des Lichtes durch das Umlenkelement in der Nähe einer Anordnung (Beleuchtung oder Detektion) erfolgen kann. Die zweite Anordnung (Detektion oder Beleuchtung) kann vom Probenvolumen weg zurückgesetzt, d.h. weiter vom Probenvolumen entfernt angeordnet sein.
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Da sich eine optische Anordnung bevorzugt rotationssymmetrisch um den entsprechenden Transmissionspfad erstreckt, zum Beispiel in Form von Halterungen und Gehäuseteilen der optischen Elemente, kann der zwischen Beleuchtungsanordnung und Detektionsanordnung kleinstmögliche Winkel durch eben diese Gehäuseteile begrenzt sein.
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Ein Zurücksetzen einer Anordnung im Bezug zur anderen Anordnung kann diese geometrische Limitierung abschwächen, so dass beide Anordnungen unter einem kleineren Winkel zueinander orientiert sein können. Lediglich der entsprechende Transmissionspfad der zurückgesetzten Anordnung passiert die nicht zurückgesetzte Anordnung und kann im Umlenkelement derart umgelenkt werden, dass der Beleuchtungspfad bevorzugt senkrecht zum Detektionspfad orientiert ist.
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In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung kann im Umlenkelement ein Transmissionspfad für das Beleuchtungslicht und/oder das Streu- und/oder Fluoreszenzlicht in einem spitzen Glanzwinkel zu einer Seitenfläche des Umlenkelements orientiert sein. Für die Seitenfläche und das transmittierte Licht können die Bedingungen für Totalreflexion erfüllt sein.
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Somit kann auf einfache Weise lediglich durch die Wahl der Geometrie des Umlenkelements eine Umlenkung erfolgen.
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Der Glanzwinkel ist als Winkel zwischen dem einfallenden Licht (entlang des entsprechenden Transmissionspfades) und der Oberfläche der Seitenfläche definiert. Der Glanzwinkel ist der Komplementärwinkel zum Einfallswinkel zu 90°.
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Die Bedingungen für das Auftreten von Totalreflexion sind aus dem Stand der Technik bekannt und umfassen beispielsweise den Übergang von einem optisch dichten zu einem optisch weniger dichten Medium.
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Insbesondere bei der Verwendung eines Immersionsmediums kann es möglich sein, dass der Brechzahlunterschied zwischen dem Material des Umlenkelements und dem Immersionsmedium zu gering ist, um Totalreflexion unter dem gewünschten Glanzwinkel zu ermöglichen. In einem solchen Fall weist die Seitenfläche bevorzugt eine für das einfallende Licht reflektive Schicht auf. Eine solche Beschichtung kann ein aufgedampftes Metall oder eine dielektrische Beschichtung sein. Insbesondere eine dielektrische Beschichtung kann für einen vorbestimmten Glanzwinkel und die verwendete Wellenlänge des Lichts optimiert sein.
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Auch das als Umlenkelement ausgestaltete Vorsatzelement weist bevorzugt die zwei im Wesentlichen senkrecht zum Beleuchtungspfad und/oder zum Detektionspfad orientierten Grenzflächen auf. Somit wird sichergestellt, dass das Umlenkelement keine Winkeldispersion einführt und die Umlenkung lediglich auf einer Reflexion beruht.
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Insbesondere kann ein solches Umlenkelement auch aus dem Immersionsmedium herausragen, wobei der Eintritt des Beleuchtungslichts in das Umlenkelement außerhalb des Immersionsmediums erfolgt und der Austritt aus dem Umlenkelement innerhalb des Immersionsmediums. Um an den Grenzflächen Fresnel-Reflexionen zu vermeiden, können Antireflexionsbeschichtungen auf diesen vorgesehen sein.
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Da sich eine Probe komplett im Immersionsmedium befinden kann, kann diese durch die ebenfalls, zumindest abschnittsweise, im Immersionsmedium eingetauchte Detektionsanordnung beobachtet werden.
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Die Probe kann dabei mittels des Translationstisches bewegt, d.h. gescannt werden, wobei dieses Scannen zwar Störungen in der Oberfläche des Immersionsmediums induzieren kann, diese aber weder in der Beleuchtung, noch in der Detektion zu Störungen führt.
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Durch die senkrecht zum entsprechenden Transmissionspfad orientierten Grenzflächen werden ferner keine Verzeichnungen in das Beleuchtungslicht bzw. das Streu- und/oder Fluoreszenzlicht eingeführt.
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Das Scannen kann insbesondere über eine Strecke von mehreren Zentimetern erfolgen, was es zum Beispiel erlaubt große Gehimschnitte zu mikroskopieren. Auch sind Aufnahmen dreidimensionaler Zellhaufen (Organoide) in lokal abgegrenzten Volumina (sogenannten Wells), die sich in die Raumrichtungen über mehrere 100 µm erstrecken, möglich.
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Da im Gegensatz zur Konfokalmikroskopie der Bereich eines Lichtblattes, das heißt beispielsweise eine Fläche von 500 µm mal 500 µm in einem Schritt detektiert werden kann und nicht lediglich ein beugungsbegrenzter Punkt, wird in einem Scanschritt eine Fläche und nicht lediglich ein Punkt gescannt, was es erlaubt das großflächige Objekt schnell zu mikroskopieren. Ein schiefgestelltes Lichtblatt kann bei der Untersuchung einer ungeklärten Probe eine Eindringtiefe bis zu etwa 300 µm ermöglichen. Im Fall einer geklärten, d.h. chemisch behandelten (aufgehellten) Probe kann die Eindringtiefe mehrere Millimeter betragen.
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Die Beleuchtung der Probe kann dabei mittels eines sogenannten statischen Lichtblattes erfolgen, welches bevorzugt durch eine Zylinderlinse erzeugt wird. In transparenten bzw. semitransparenten Proben beleuchtet ein Lichtblatt einen Querschnitt, bei intransparenten Objekten wird lediglich der vom Beleuchtungslicht erreichte Teil des Umfangs des Objekts beleuchtet.
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Ebenso ist es möglich, ein sogenanntes virtuelles Lichtblatt zu erzeugen, in dem fokussiertes Beleuchtungslicht mittels einer Scanvorrichtung, beispielsweise einem Scanspiegel entlang einer Richtung senkrecht zur Ausbreitungsrichtung (bevorzugt) periodisch bewegt wird. Die Frequenz des Scannens ist dabei bevorzugt größer als eine Bildaufnahmefrequenz.
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Das Scannen einer Probe und Detektieren des von dieser ausgesandten Streu- und/oder Fluoreszenzlichts resultiert in einem Stapel geneigter Schnitte durch die Probe, welche eine 3D-Rekonstruktion ermöglichen.
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Das Vorsatzelement kann bevorzugt an der Beleuchtungsanordnung und/oder an der Detektionsanordnung befestigt sein, so dass nach einmaliger Justage keine nachträgliche Justage des Umlenkelements notwendig ist.
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Das erfindungsgemäße optische Modul umfasst eine erfindungsgemäße optische Vorrichtung, wobei für das Beleuchtungslicht und das Streu- und/oder Fluoreszenzlicht eine gemeinsam genutzte Zugangs- bzw. Austrittsöffnung im optischen Modul vorgesehen sein kann. Eine derartige gemeinsam genutzte Öffnung kann es ermöglichen, das erfindungsgemäße Modul in einer Aufnahmevorrichtung eines Mikroskops aufzunehmen.
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Insbesondere Konfokalmikroskope können einen kollinear verlaufenden Transmissionspfad für das Beleuchtungslicht und das Streu- und/oder Fluoreszenzlicht aufweisen, so dass beim Anschluss des optischen Moduls vom Mikroskop ausgesandtes Beleuchtungslicht im Modul durch die optische Beleuchtungsanordnung über den Beleuchtungspfad zum Probenvolumen transmittiert wird.
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Ebenso wird vom Probenvolumen, speziell von einer in diesem angeordneten Probe, ausgesandtes Streu- und/oder Fluoreszenzlicht entlang des Detektionspfades durch die optische Detektionsanordnung durch die gemeinsame Öffnung in das Mikroskop eingespeist, wo es detektiert werden kann.
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Das optische Modul kann folglich als Nachrüstsatz verstanden werden, mittels welchem Lichtblattmikroskopie mit einem Konfokalmikroskop möglich ist. Durch einen einfachen und schnellen Ausbau des optischen Moduls ist das Konfokalmikroskop wieder für die Konfokalmikroskopie verwendbar.
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Sowohl die Beleuchtungsanordnung, als auch die Detektionsanordnung kann über einen Adapterblock mechanisch am Modul fixiert und insbesondere wechselbar sein. Ebenso ist es denkbar, dass die einzelnen optischen Elemente der Beleuchtungsanordnung bzw. der Detektionsanordnung jeweils separat im optischen Modul angeordnet und befestigt sind und somit variabel ausgetauscht werden können.
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Das optische Modul kann ferner einen Aktuator aufweisen, welcher es ermöglicht die Entfernung des Moduls zur Probe zu variieren und somit die Lage des auszubildenden Lichtblattes, d.h. die Probenebene einzustellen. Ferner kann das Modul alternativ auf bereits in einem Mikroskop vorgesehene Aktuatoren zurückgreifen.
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Zur Kombination der Transmissionspfade der Beleuchtung und Detektion kann in einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen optischen Moduls mindestens ein wellenlängenselektives optisches Element vorgesehen sein, welches Transmissions- und/oder Reflexionseigenschaften für das Beleuchtungslicht aufweist, die sich von den Transmissions- und/oder Reflexionseigenschaften des Fluoreszenzlichts unterscheiden.
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Das wellenlängenselektive optische Element kann ein dichroitischer Spiegel oder ein partieller Reflektor sein. Denkbar ist auch das erfindungsgemäße Modul als Konfokales Beleuchtungs- und/oder Detektionsmodul auszulegen, indem ein Teilerelement (dichroitischer Teiler 101, 102, 35) entfernt wird.
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Im erfindungsgemäßen Mikroskop kann nunmehr mittels der mechanischen Aufnahmevorrichtung ein erfindungsgemäßes optisches Modul aufgenommen werden. Dies erfolgt bevorzugt mittels einer genormten mechanischen Aufnahmevorrichtung, die zum einen ausgestaltet ist, das optische Modul mechanisch fest und sicher im Mikroskop aufzunehmen und zum anderen über eine Aufnahmemechanik das optische Modul bezüglich der Transmissionspfade des Mikroskops präzise auszurichten.
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Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung anhand beispielhafter Ausgestaltungen näher erläutert. Die Ausgestaltungen sind jeweils für sich vorteilhaft, wobei die technischen Merkmale der gezeigten Ausgestaltungen beliebig miteinander kombiniert und/oder weggelassen werden können. Gleiche technische Merkmale und technische Merkmale gleicher Funktion oder technischer Wirkung werden mit denselben Bezugszeichen versehen.
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Es zeigen:
- 1 eine erste Ausgestaltung der erfindungsgemäßen optischen Anordnung;
- 2 eine zweite Ausgestaltung der erfindungsgemäßen optischen Anordnung;
- 3 ein erfindungsgemäßes optisches Modul; und
- 4 die erfindungsgemäße optische Vorrichtung in zwei verschiedenen Konfigurationen.
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Die 1 zeigt eine optische Vorrichtung 1, welche eine optischen Beleuchtungsanordnung 3, eine optische Detektionsanordnung 5 und ein Vorsatzelement 7 umfasst. Die optische Beleuchtungsanordnung 3 umfasst ein schematisch gezeigtes Linsensystem 9 mit einer bildseitigen Hauptebene 10, die optische Detektionsanordnung 5 dagegen eine einzelne Linse 11. Sowohl die optische Beleuchtungsanordnung 3, als auch die optische Detektionsanordnung 5 sind mit einem Gehäuse 13 gezeigt, wobei in anderen Ausgestaltungen lediglich Linsensysteme 9 beziehungsweise einzelne Linsen 11 in der optischen Vorrichtung 1 angeordnet sein können.
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Die optische Beleuchtungsanordnung 3 transmittiert Beleuchtungslicht 15, welches von einer Geräteseite 19 zu einer Probenseite 17 geleitet wird und dort entlang eines Beleuchtungspfades 21 durch ein Probenvolumen 23 hindurch transmittiert wird. Im Probenvolumen 23 ist eine Probe 25 zumindest partiell aufgenommen.
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Von der Probe 25 ausgehend wird Streu- und/oder Fluoreszenzlicht 27 entlang eines Detektionspfades 29 zur optischen Detektionsanordnung 5 durch das Probenvolumen 23 hindurch transmittiert und von der optischen Detektionsanordnung 5 aufgesammelt und zur Geräteseite 19 weitergeleitet.
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Das Vorsatzelement 7 ist becherförmig ausgestaltet und weist zwei senkrecht zum Beleuchtungspfad 21 orientierte Grenzflächen 31 auf. In der Probe 25 sind der Beleuchtungspfad 21 und der Detektionspfad 29 im Wesentlichen unter einem Winkel von 90° zueinander orientiert. Die beiden Grenzflächen 31 weisen einen ausgangsseitigen optischen Querschnitt 8b auf, welcher die Größe des hindurchtretenden Lichts limitiert. In der gezeigten Ausgestaltung ist der ausgangsseitige optische Querschnitt 8b kleiner als ein eingangsseitiger optischer Querschnitt 8a, der der optischen Beleuchtungsanordnung zugewandt ist. Ist das Vorsatzelement 7 einer optischen Detektionsanordnung 5 zugeordnet, so werden diese Querschnitte 8a, 8b analog definiert.
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Auf der Geräteseite 19 sind mehrere Umlenkspiegel 33 sowie dichroitische Spiegel 35 gezeigt. Die dichroitischen Spiegel 35 sind spezielle Ausgestaltungen wellenlängenselektiver optischer Elemente 101, die für das Beleuchtungslicht 15 und das Streu- und/oder Fluoreszenzlicht 27 unterschiedliche Transmissions- und/oder Reflexionseigenschaften 102 aufweisen.
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Des Weiteren zeigt 1 schematisch den Ausschnitt eines Mikroskops 37, welches in der gezeigten Ausgestaltung ein Konfokalmikroskop 39 ist. Dieses umfasst beispielsweise eine Optik 41, die das Beleuchtungslicht 15 kollimiert und über die beiden dichroitischen Spiegel 35 zu einer Zylinderlinse 43 leitet.
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In der Zylinderlinse 43 wird das Beleuchtungslicht 15 lediglich in einer Richtung fokussiert, so dass sich in der Probe 25 ein Lichtblatt 45 ausbildet. Das Lichtblatt ist in 4 in Vergrößerungen 47 deutlich gezeigt.
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Senkrecht zum Lichtblatt 45 wird somit das Streu- und/oder Fluoreszenzlicht 27 abgestrahlt und entlang des Detektionspfades 29 zur optischen Detektionsanordnung 5 geleitet. Diese transmittiert das Streu- und/oder Fluoreszenzlicht 27 über zwei Umlenkspiegel 33 sowie durch die beiden dichroitischen Spiegel 35 hindurch zu einem Detektorsystem 49 des Mikroskops 37.
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Das sich ausbildende Lichtblatt 45 erstreckt sich entlang einer Propagationsrichtung 51, die im gezeigten Ausführungsbeispiel parallel zum Beleuchtungspfad 21 orientiert ist und entlang einer Breitenrichtung 53, die sich in die Zeichenebene hinein erstreckt. Das Lichtblatt 45 weist ferner eine Dicke 55 auf, die entlang einer Dickenrichtung 57 gemessen wird wobei die Dickenrichtung 57 und der Detektionspfad 29 parallel zueinander sind.
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Sowohl der Beleuchtungspfad 21 als auch der Detektionspfad 29 können als Transmissionspfade 59 bezeichnet werden. Zur Unterscheidung der Pfade zwischen der Probenseite 17 und der Geräteseite 19 werden die Pfade auf der Geräteseite als Eingangspfad 61 bzw. als Ausgangspfad 63 bezeichnet.
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In einem Flanschbereich 65 verlaufen sowohl der Eingangspfad 61 als auch der Ausgangspfad 63 kolinear.
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Die Funktionsweise des Vorsatzelements 7 ist in 2 dargestellt. Die optische Vorrichtung 1 der 2 umfasst ein jeweils als Objektiv 67 ausgestaltete optische Beleuchtungsanordnung 3 bzw. optische Detektionsanordnung 5. Die optische Detektionsanordnung 5 ist insbesondere als Immersionsoptik 68 und in der in 2 gezeigten Ausgestaltung als Immersionsobjektiv 69 ausgestaltet, welches mit einer Front 71 komplett in ein Immersionsmedium 73 eingetaucht ist. Die optische Beleuchtungsanordnung 3 hingegen befindet sich lediglich partiell unter einer Oberfläche 75 des Immersionsmediums 73.
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Damit Vibrationen 77, die sich auf der Oberfläche 75 ausbilden können, nicht den Beleuchtungspfad 21 stören und die Beleuchtung mittels des Beleuchtungslichtes 15 fluktuiert, ist das Vorsatzelement 7 vorgesehen. Dessen erstes Ende 79 befindet sich oberhalb der Oberfläche 75 des Immersionsmediums 73, wohingegen dessen zweites Ende 81 unterhalb der Oberfläche 75 des Immersionsmediums 73 befindet.
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Das becherförmige Vorsatzelement 7 ist nicht mit dem Immersionsmedium 73 gefüllt und erlaubt durch die Grenzflächen 31 hindurch eine störungsfreie Beleuchtung der Probe 25.
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In anderen (nicht gezeigten) Ausgestaltungen kann das Vorsatzelement 7 mit einem weiteren optischen Medium gefüllt oder massiv ausgestaltet sein, um eine Anpassung an den Brechungsindex der Probe und/oder des Immersionsmediums zu gewährleisten.
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Die Vibrationen 77 können insbesondere auf der Oberfläche 75 des Immersionsmediums 73 auftreten, wenn ein Probenhalter 83, auf dem sich die Probe 25 befindet, entlang einer von zwei möglichen Scanrichtungen 85 bewegt wird.
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Im Gegensatz zum Mikroskop 37 der 1 weist das Mikroskop 37 der 2 einen Scanspiegel 87 auf, der um eine Achse 87 beweglich gehaltert ist und ein sogenannte virtuelles Lichtblatt 91 durch eine Scanbewegung 93 in der Probe 25 ausbildet.
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In 3 ist eine weitere Ausgestaltung der erfindungsgemäßen optischen Vorrichtung 1 gezeigt, welche in einem optischen Modul 95 aufgenommen ist.
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Ein solches optisches Modul 95 kann mittels einer geeigneten Aufnahmevorrichtung 97 im Mikroskop 37 aufgenommen sein und optional einen Konfokalscanner umfassen. In der Aufnahmevorrichtung 97, als auch im Modul 95 selbst ist eine gemeinsam genutzte Zugangs- bzw. Austrittsöffnung 99 ausgestaltet, durch welche sowohl der Eingangspfad 61 als auch der Ausgangspfad 63 kolinear verläuft.
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Dies wird durch zuvor beschriebene dichroitische Spiegel 35 realisiert, welche eine spezielle Ausgestaltung der wellenlängenselektiven optischen Elemente 101 darstellen.
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In der in 3 gezeigten Ausgestaltung der optischen Vorrichtung 1 ist das Vorsatzelement 7 als Umlenkelement 103 ausgestaltet.
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Das Umlenkelement 103 umfasst die Grenzflächen 31 sowie Seitenflächen 31a.
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Eine Grenzfläche 31 (diejenige, die sich oberhalb der Oberfläche 75 des Immersionsmediums 73 befindet) ist senkrecht zum Beleuchtungspfad 21 orientiert, wohingegen die sich im Immersionsmedium 73 befindliche Grenzfläche 31 in einem Winkel ungleich 90° zum Beleuchtungspfad 21 orientiert ist.
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Das durch das Umlenkelement 103 transmittierte Beleuchtungslicht 15, das heißt transmittiertes Licht 105 wird an einer Seitenfläche 31a reflektiert und bildet das Lichtblatt 45 aus, welches senkrecht zum Detektionspfad 29 orientiert ist.
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Die Beleuchtungsanordnung 3 und die Detektionsanordnung 5 sind allerdings im Vergleich zu den zuvor gezeigten Ausgestaltungen in einem Justagewinkel 107 zueinander angeordnet, welche deutlich kleiner als 90° ist.
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In der 4 ist die erfindungsgemäße optische Vorrichtung 1 in unterschiedlichen Konfigurationen 109 gezeigt.
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Die Konfigurationen 109 beziehen sich insbesondere auf unterschiedlich verlaufende Transmissionspfade 59, die zu sich unterscheidenden Beleuchtungspfaden 21 führen.
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In 4 sind ein paraxialer Transmissionspfad 59a und ein peripherer Transmissionspfad 59b gezeigt, welche in einem paraxialen Beleuchtungspfad 21a und in einem peripheren Beleuchtungspfad 21b resultieren.
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Eine Konfiguration paraxialer Beleuchtung mit Umlenkelement 109a und mit Vorsatzelement ohne umlenkende Funktion 109b, sowie eine Konfiguration peripherer Beleuchtung 109b sind in den zwei Vergrößerungen 47 dargestellt.
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In der Konfiguration paraxialer Beleuchtung 109a ist der paraxiale Beleuchtungspfad 21a kollinear mit einer optischen Achse 111 der optischen Beleuchtungsanordnung 3 und tritt über die Grenzfläche 31 in das als Umlenkelement 103 ausgestaltete Vorsatzelement 7 ein.
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Das Umlenkelement 103 ist in der gezeigten Konfiguration 109a mittels geeigneter Befestigungselemente 121 an der optischen Detektionsanordnung 5 befestigt, kann in anderen Ausgestaltungen allerdings auch an der optischen Beleuchtungsanordnung 3 befestigt sein.
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Das transmittierte Licht 105 trifft auf eine Seitenfläche 31a und schließt mit dieser einen Glanzwinkel 113 ein. An der Seitenfläche 31a kann Totalreflexion 115 auftreten oder eine reflektive Schicht 117 vorgesehen sein, welche das transmittierte Licht 105 reflektiert.
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In 4 ist die reflektive Schicht 117 schematisch unterhalb der Position der Totalreflexion 115 gezeigt. Bei realen Anwendungen wird im Allgemeinen entweder Totalreflexion 115 oder eine reflektive Schicht 117 genutzt, um das transmittierte Licht 105 und den paraxialen Beleuchtungspfad 21a umzulenken. Für diese Überlegungen sind sowohl der Glanzwinkel 113, als auch die Brechzahl 103a des Umlenkelements 103 und die Brechzahl 73a des Immersionsmediums 73 heranzuziehen, da bei ähnlich großen Brechzahlen 73a, 103a möglicherweise keine Totalreflexion 115 unter dem gewünschten Glanzwinkel 113 realisierbar ist.
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Durch die Umlenkung im Umlenkelement 103 verläuft der weitere paraxiale Beleuchtungspfad 21a im Wesentlichen senkrecht zur optischen Achse 111 der optischen Detektionsanordnung 5.
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Mit einer gepunkteten Linie ist ein unveränderter Beleuchtungspfad 21u eingezeichnet, welche die optische Achse 111 der optischen Detektionsanordnung 5 nicht im rechten Winkel schneidet.
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In der Konfiguration peripherer Beleuchtung 109b ist das Beleuchtungslicht 15 nicht kollinear in die optische Beleuchtungsanordnung 3 eingestrahlt, so dass der periphere Beleuchtungspfad 21a im Gegensatz zur Konfiguration paraxialer Beleuchtung 109a nicht mit der optischen Achse 111 der optischen Beleuchtungsanordnung 3 übereinfällt bzw. übereinstimmt.
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Das Beleuchtungslicht 15 wird entlang des peripheren Beleuchtungspfades 21b im becherförmigen Vorsatzelement 7 transmittiert und tritt senkrecht durch die beiden Grenzflächen 31 einer Bodenfläche 119 des Vorsatzelements 7 hindurch.
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Durch diese senkrechte Orientierung tritt beim Übergang vom Vorsatzelement 7 in das Immersionsmedium 73 keine Winkeldispersion auf.
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Durch die nichtkollineare Einstrahlung in die optische Beleuchtungsanordnung 3 ist der periphere Beleuchtungspfad 21b ohne jegliche Umlenkung bereits im Wesentlichen senkrecht zur optischen Achse 111 der optischen Detektionsanordnung 5 orientiert.
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In der Konfiguration 109c ist das Vorsatzelement 7 massiv, d.h. als Volumenkörper 123 ausgestaltet. Diese Ausgestaltung hat den Vorteil, dass ein Abstand (nicht gezeigt) zwischen der Front der optischen Anordnung und der Probe vergrößert werden kann.
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Bezugszeichenliste
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- 1
- optische Vorrichtung
- 3
- optische Beleuchtungsanordnung
- 5
- optische Detektionsanordnung
- 7
- Vorsatzelement
- 8a
- eingangsseitiger optischer Querschnitt
- 8b
- ausgangsseitiger optischer Querschnitt
- 9
- Linsenanordnung
- 10
- bildseitige Hauptebene
- 11
- Linse
- 13
- Gehäuse
- 15
- Beleuchtungslicht
- 17
- Probenseite
- 19
- Geräteseite
- 21
- Beleuchtungspfad
- 21a
- paraxialer Beleuchtungspfad
- 21b
- peripherer Beleuchtungspfad
- 21u
- unveränderter Beleuchtungspfad
- 23
- Probenvolumen
- 25
- Probe
- 27
- Streu- und/oder Fluoreszenzlicht
- 29
- Detektionspfad
- 31
- Grenzfläche
- 31a
- Seitenfläche
- 33
- Umlenkspiegel
- 35
- dichroitischer Spiegel
- 37
- Mikroskop
- 39
- Konfokalmikroskop
- 41
- Optik43 Zylinderlinse
- 45
- Lichtblatt
- 47
- Vergrößerung
- 49
- Detektorsystem
- 51
- Propagationsrichtung
- 53
- Breitenrichtung
- 55
- Dicke
- 57
- Dickenrichtung
- 59
- Transmissionspfad
- 59a
- paraxialer Transmissionspfad
- 59b
- peripherer Transmissionspfad
- 61
- Eingangspfad
- 63
- Ausgangspfad
- 65
- Flanschbereich
- 67
- Objektiv
- 68
- Immersionsoptik
- 69
- Immersionsobjektiv
- 71
- Front
- 73
- Immersionsmedium
- 73a
- Brechzahl Immersionsmedium
- 75
- Oberfläche
- 77
- Vibrationen
- 79
- erstes Ende
- 81
- zweites Ende
- 83
- Probenhalter
- 85
- Scanrichtung
- 87
- Scanspiegel
- 89
- Achse
- 91
- virtuelles Lichtblatt
- 93
- Scanbewegung
- 95
- optisches Modul
- 97
- Aufnahmevorrichtung
- 99
- Zugangs- bzw. Austrittsöffnung
- 101
- wellenlängenselektives optisches Element
- 102
- Transmissions- und/oder Reflexionseigenschaften
- 103
- Umlenkelement
- 103a
- Brechzahl Umlenkelement
- 105
- transmittiertes Licht
- 107
- Justagewinkel
- 109
- Konfiguration
- 109a
- Konfiguration paraxialer Beleuchtung
- 109b
- Konfiguration peripherer Beleuchtung
- 111
- optische Achse
- 113
- Glanzwinkel
- 115
- Totalreflexion
- 117
- reflektive Schicht
- 119
- Bodenfläche
- 121
- Befestigungselement
- 123
- Volumenkörper
