EP2165182A2 - Vorrichtung und verfahren zur durchführung statischer und dynamischer streulichtmessungen in kleinen volumina - Google Patents

Vorrichtung und verfahren zur durchführung statischer und dynamischer streulichtmessungen in kleinen volumina

Info

Publication number
EP2165182A2
EP2165182A2 EP08784613A EP08784613A EP2165182A2 EP 2165182 A2 EP2165182 A2 EP 2165182A2 EP 08784613 A EP08784613 A EP 08784613A EP 08784613 A EP08784613 A EP 08784613A EP 2165182 A2 EP2165182 A2 EP 2165182A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
sample
electromagnetic radiation
radiation
scattered
detection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP08784613A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Christoph Janzen
Reinhard Noll
Walter Uhl
Kurt Hoffmann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hoffmann Kurt Dr
Original Assignee
Hoffmann Kurt Dr
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoffmann Kurt Dr filed Critical Hoffmann Kurt Dr
Publication of EP2165182A2 publication Critical patent/EP2165182A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/47—Scattering, i.e. diffuse reflection
    • G01N21/4738—Diffuse reflection, e.g. also for testing fluids, fibrous materials
    • G01N21/474—Details of optical heads therefor, e.g. using optical fibres
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/02—Objectives
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/06—Means for illuminating specimens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/47—Scattering, i.e. diffuse reflection
    • G01N21/4738—Diffuse reflection, e.g. also for testing fluids, fibrous materials
    • G01N21/474—Details of optical heads therefor, e.g. using optical fibres
    • G01N2021/4752—Geometry
    • G01N2021/4759—Annular illumination

Definitions

  • the present invention relates to a device, a measuring system and a method for carrying out scattered light measurements, in particular static and dynamic scattered light measurements.
  • Preferred fields of application are those in which it is necessary to carry out a large number of measurements in automated processes, for example in the investigation of crystallization processes in the context of the growth of protein crystals.
  • Scattered light measurements in particular laser scattered light measurements, are already used in a number of fields of application, for example for the characterization of colloids.
  • Scattered light measurements are already used in a number of fields of application, for example for the characterization of colloids.
  • the size distribution and stability of colloidal particles play an important role.
  • Molecules are of great importance. Structure elucidation based on X-ray diffraction experiments relies on high-quality single crystals with diffractive properties, which are usually grown from solutions. Essentially, the crucial step in the growth of protein crystals is to be suitable for crystallization
  • osmotic virial coefficient is a thermodynamic quantity that describes the real interaction behavior of dissolved particles as a deviation from the behavior of an ideal solution.
  • Osmotic virial coefficients can be determined by means of static scattered light measurements. For the measurement method, the detection of the absolute scattered light intensity in different solutions with different particle concentrations is necessary. Light reflected by interfaces can very easily disturb the measurement. It is already known that the osmotic virial coefficient is of particular importance for the crystallization of proteins. The probability of a successful crystallization is particularly high in a value range of the osmotic virial coefficient called "crystallization window" and particularly low outside this crystallization window.
  • round cuvettes are used which are positioned to further avoid reflectance in stray light in an index-matching bath (a vessel filled with a refractive index-matched liquid). Due to the small difference in the refractive index between the bath liquid and the cuvette wall, only a comparatively small proportion of reflected radiation is formed when the laser beam enters the cuvette.
  • the volumes of typical cuvettes for scattered light measurements are on the order of at least 5 -10 microliters, often even much higher. Although the production of cuvettes with even smaller volumes would be technically possible in principle, scattered-light cuvettes with nanoliter volumes have not hitherto been used and are currently not offered.
  • the handling of the solutions necessary for the manual execution of individual measurements requires a minimum volume, which is typically in the microliter scale. A large reduction of the cuvette volumes does not seem to be necessary for single measurements, moreover, the excitation and detection optics of the commercial scattered light devices are not optimized for extremely small cuvette volumes.
  • Static measurements are based on the recording of absolute scattered light intensities, here the influence of reflections on the scattering signals prevents the measurement.
  • the Wyatt Technology Corporation device is unable to suppress disturbing reflections as much as would be necessary to perform static scattered light measurements.
  • the invention has for its object to provide an apparatus and a method for carrying out scattered light measurements, in particular absolute scattered light measurements to provide a particularly effective suppression of unwanted radiation components is achieved, which also has a systematic and particularly largely automated and thus fast examination of a variety of Samples is possible, and in particular also samples with a very small volume can be examined or used.
  • the present device for carrying out scattered light measurements has at least one focusing element, with which electromagnetic radiation can be focused on a sample, a detector, and a Detection optics, with the scattered by the sample electromagnetic radiation can be passed to the detector.
  • the device additionally having a means for forming a ring beam, that the ring beam can be focused on a focal point within the sample by the at least one focusing element, and by the detection optics detected by the sample scattered electromagnetic radiation which propagates within the space surrounded by the ring beam.
  • a confocal optical system is realized, with the static or dynamic scattered light measurements are made possible in a backscatter geometry. That is, the detection of the scattered radiation is thus approximately in the same direction from which the excitation laser (or the light source used for the excitation) is irradiated (backscattering direction).
  • This facilitates in particular a particularly compact construction of the device and makes the device particularly flexible with respect to the sample carrier used.
  • this offers the possibility of carrying out scattered light measurements in measuring geometries with only one optical access. For example, it is possible to examine samples or sample drops in microtiter plates with glass plates. It can thus be achieved to perform a variety of measurements with a single sample carrier (e.g., microtiter plate).
  • microtiter plates simplifies the use of pipetting robots for automatic filling of individual sample positions. As a result, a comprehensive automation of sample preparation and scattered light measurement can be achieved.
  • This offers considerable economic advantages over the devices known from the prior art, in particular because the use of the sample carrier as a disposable article is economical due to the large number of measurements that can be carried out with a sample carrier and thus a complicated cleaning, as is the case in the prior art For cuvettes is known, can be omitted.
  • scattered radiation in particular exclusively scattered radiation
  • the exciting radiation may according to the invention be blasted into the sample at a very shallow angle. Direct reflections at the interfaces of air sample carrier and sample carrier sample liquid are thus reflected back at a very shallow angle.
  • the scattered radiation propagating within the space surrounded by the ring beam leaves the detection volume at a more acute angle. The difference in angle between stimulating light and scattered radiation thus leads to a strong suppression of reflections.
  • the ring beam is generated from a collimated beam with Gaussförmigen beam profile, as the beam source is preferably a laser, in particular a continuously operated semiconductor, solid state or gas laser used.
  • the shaping of the ring beam can be achieved by a beam expansion in conjunction with a ring diaphragm.
  • a particularly preferred embodiment provides for shaping the ring beam, a beam shaping optics, which comprises two positioned on the optical axis and with their tips facing each other Axicone (glass cone). These are illuminated on the input side by the laser beam in the middle.
  • Such an arrangement has particularly high transmission values, so that the losses due to the formation of a ring beam are comparatively small.
  • the focusing element is preferably reflective and annular. This allows an advantageous arrangement of the detection optics. It has advantages if the focusing element is designed in such a way that an approximately radially symmetrical (and as small as possible) focus can be generated in the sample, since in this way a particularly high intensity per volume element can be achieved. Since only signals from the overlapping region of excitation and detection focus are recorded by the confocal detection, both foci should have the same order of magnitude. Of course, a fully filled aperture microscope objective may produce a smaller focus than a ring beam, so the excitation focus will typically be greater than the detection focus.
  • a focusing element for example, a (annular) parabolic mirror can be used. With such, it is possible in principle to produce an approximately radially symmetrical focus. However, it is important to note the boundary layers to be crossed by the radiation between the focusing element and the sample so that an optimum focusing element is slightly modified in shape compared to a parabolic mirror and thereby corrects the effect of refraction on the glass bottom or on entering the sample.
  • the focusing element should be designed so that a focus diameter smaller than 30 microns, preferably less than 20 microns, can be generated (the focus diameter should be defined so that at its limits, the laser intensity to the 1 / e-part of the maximum intensity in Focus center has dropped). Due to the small size of the focus diameter, it is possible to examine even extremely small samples of less than 1 ⁇ l and, moreover, this results in a particularly high scattered radiation per volume element and thus overall a high signal strength. The high degree of focusing allows measurements with a very small distance to interfaces.
  • the detection optics is arranged within the space surrounded by the ring beam, in particular the detection optics is arranged centrally within this space, or in the center of the optical axis predetermined by ring beam or focusing element.
  • the focus of the detection optics falls doing so together with the focus of the excitation optics.
  • the detection optics is able to capture the largest possible proportion of the generated scattered radiation and to supply the detector without large losses.
  • a microscope objective with a numerical aperture of at least 0.6, preferably at least 0.7 can be used.
  • the molecules are much smaller (typically a few nm) than the wavelength of the laser light used (several 100 nm). Therefore, the scattering intensity is, in a first approximation, independent of the considered angle and a collection of the scattered radiation over many angles is possible and, in principle, provides no other results than experiments in which scattered light is collected only at an angle.
  • a detection optics with large numerical aperture thus has advantages, since a greater signal strength can be achieved.
  • the detection optics is designed such that it collects the scattered light emanating from the sample and in turn forms it into a collimated beam.
  • This collimated beam is then focused with a further optical element, for example a lens, onto a small entrance aperture of the detection system, for example onto the core of an optical fiber, preferably a single-mode fiber.
  • the system is designed such that only such radiation forms a collimated beam and is focused in the plane of the small entrance aperture of the detection system, eg the fiber front surface, which originates from a limited area within a predetermined detection plane.
  • the detection plane corresponds to the focal plane of the detection optics in the reverse direction of the beam path.
  • the limited area has an extension of less than 10 ⁇ m, preferably approximately 5 ⁇ m, in particular in the direction perpendicular to the detection axis. It lies completely within the focus of the stimulating radiation. Scattering radiation from planes other than the predetermined detection plane is focused by the focusing optics in front of or behind the plane of the fiber front surface and can therefore enter the fiber only to a very small extent.
  • excitation optics parabolic mirrors
  • Detection optics microscope objective
  • the detection optics can be formed, for example, by a multi-lens microscope objective with an adapted numerical aperture or comprise such.
  • the collection angle of the lens must be adapted to the angle under which is illuminated.
  • a further aspect of the invention resides in a measuring system for carrying out scattered light measurements with a device which has at least one focusing element, with which electromagnetic radiation can be focused on a sample, a detector, and detection optics, with the electromagnetic radiation scattered by the sample can be passed to the detector.
  • the measuring system comprises a flat sample carrier, which is designed such that a sample consisting of a single drop can form an interface with it.
  • the at least one focusing element and the detection optics are arranged such that the beam path of the electromagnetic radiation impinging on the sample and the scattered radiation detected by the detection optical system thwart the interface.
  • the measuring system thus comprises, in addition to a device with which electromagnetic radiation can be emitted and scattered radiation detected, a flat sample carrier.
  • a flat sample carrier This can be a flat plate in the simplest case. He must be in the areas designated for samples at least in be substantially transparent to the electromagnetic radiation used. Preferably, it is made of glass.
  • Excitation and detection takes place through the flat sample carrier and the interface that forms the sample with the flat sample carrier.
  • the beam thus crosses only planar interfaces and is therefore relatively easy to control with respect to unwanted reflections.
  • the detection optics defines an optical axis (z). This is (at least substantially) perpendicular to the sample carrier (xy plane) and forms the central axis for the ring beam and the focusing element.
  • the detection optics is capable of detecting the scattered radiation emitted by the sample starting from the detection volume in the direction of the z-axis and at an angle to the z-axis (half the opening angle) of up to 48 °, preferably up to 44 ° , A half opening angle of 44 ° leads to a numerical aperture of 0.7.
  • the exciting radiation guided by the focusing element in the direction of the focus forms an angle between 51 ° and 59 ° with the z-axis. The exciting radiation thus crosses the sample carrier and the interfaces at a shallower angle than the scattered radiation from the detection volume detected by the detection optics.
  • the focusing element focuses the exciting ring beam below an upper numerical limit aperture of at least 0.84 (corresponding to 57.1 °), preferably 0.86 (corresponding to 59.3 °), or lower numerical limit aperture of at most 0.82 (corresponding to 55.1 °), preferably 0.78 (corresponding to 51.2 °), to the test. This ensures a sufficient angular distance to the detection optics.
  • the sample carrier is preferably a microtiter plate, i. a standard component with a multitude of isolated measuring fields in rows and columns.
  • the measuring system With the measuring system according to the invention, it is possible to apply a large number of samples each as a single drop on a single flat sample carrier and thus perform a variety of measurements in a short time and automatically.
  • the measuring system has particular advantages if it additionally has an automated, image-data-based positioning unit with which the diffraction-limited laser focus can be positioned approximately in the center of the small, preferably less than 1 ⁇ l, volume of the protein solutions to be examined. This allows a rapid change from sample to sample under reproducible measurement conditions and thus the use of the laser scattered light method in the form of a high-throughput method for the systematic crystallization of protein.
  • a positioning for example, a system of multiple precision sliding tables with spindle drive and microprocessor-controlled stepper motors in question.
  • piezo-powered tables are also suitable.
  • the positioning accuracy should be significantly smaller than the dimension of the sample droplets, a positioning accuracy of a few micrometers has proven successful.
  • a further aspect of the invention consists in a method for carrying out scattered light measurements, in which electromagnetic radiation is focused on a sample and radiation scattered by the sample is detected, wherein the sample is present as a drop, which has an interface with a flat sample carrier, and wherein the Exposure to the electromagnetic radiation and the detection of scattered radiation through the flat sample carrier and the interface is carried out.
  • the use of the above-described device or the measuring system offers.
  • the sample is present as a single drop placed in connection with the sample carrier.
  • the shape of the kiln is determined in a known manner by the cohesive forces within the droplet and the adhesion forces against the surface of the sample carrier.
  • the sample ie, the small aqueous liquid droplet in which the proteins to be examined are dissolved
  • the sample miscible liquid preferably an oil or paraffin layer directly on the glass bottom of the sheet element.
  • the droplet displaces the paraffin or the oil from the glass bottom and sits in a hemispherical shape directly on the floor.
  • the oil or paraffin layer protects the small quantities of liquid from drying out.
  • the sample carrier can also be made easily even for a large number of drops. For example, it may also have only a few larger separate cells, since not every single drop has to be placed in its own compartment of the sample carrier.
  • the oil or paraffin surrounding the drop effectively replaces the walls of a separate sample compartment and prevents the individual drops from mixing.
  • the pobe especially in the case of protein solutions in the context of crystallization experiments, often applied in the form of small droplets; These can either sit on the floor of a sample holder (so-called “sitting drop”) or hang under the sample holder or glass plate (so-called “hanging drop”).
  • the invention also offers the possibility of carrying out scattered light measurements for such an unconventional geometry of the sample. Because of the effective suppression of unwanted disturbances, the curved and near-focus interfaces of the droplets can also be tolerated.
  • the electromagnetic radiation focused on the sample has a plurality of radiation components of different wavelengths, in particular two different light sources or laser sources can be selected for this purpose ,
  • different spectral components of the scattered radiation are detected separately.
  • the electromagnetic radiation preferably contain at least two different radiation components whose wavelengths differ by at least 50 nm, preferably even by at least 120 nm.
  • R reflectivity
  • / R reflected intensity (incidence perpendicular to the surface)
  • / E incident intensity
  • n and n 'refractive indices of the adjacent materials incident intensity
  • the device according to the invention is to be extended with an optical means which makes it possible to superimpose the beams of the two beam sources, for instance with a dichroic mirror, which reflects the wavelength of one beam and allows that of the other beam to pass ,
  • optical means which makes it possible to superimpose the beams of the two beam sources, for instance with a dichroic mirror, which reflects the wavelength of one beam and allows that of the other beam to pass .
  • This superposition of the two radiation components can be carried out particularly easily upstream of the beam-shaping optical system in the beam path. Furthermore, at least one further optical means is necessary in order to separate the radiation components in the detection beam path from one another or to guide them to different detectors. For this purpose, for example, a dichroic mirror can also be used.
  • the power of the two laser beam sources is adjusted so that when measuring a standard sample without scattering particles, for example, a blank solution that consists only of solvent, buffer, etc. but contains no proteins, the signal strength registered at both detectors is identical. If the standard sample or dummy solution is replaced by a "true sample", i. e.g. Replacing a solution with proteins as scattering particles, the signal strength for the detection channel with a shorter wavelength increases more than for the detection channel with a longer wavelength. The difference represents a scattering intensity proportional measurement signal, which is only very slightly distorted by reflection effects.
  • An embodiment of the invention with more than two lasers of different wavelengths is also possible.
  • only input and output optics and detectors for the other laser must be added.
  • the individual wavelengths are superimposed and separated again.
  • an intensity measurement with a sample without scattering particles eg without proteins
  • the proportionality constant is a measure of the scattering cross section of the examined sample and is only slightly distorted by reflectance components.
  • a spectrometer is preferably used as the detector.
  • a relative intensity profile which increases in proportion to v 4 , can be expected after referencing a measurement on a sample without scattering particles.
  • the scattering spectrum of a sample with scattering particles is divided by the scattering spectrum of a sample without scattering particles (eg without proteins).
  • a mathematical fit analysis eg according to the principle of least squares
  • the course of the relative scattering intensity can then be approximated by an analytical expression. This results in a proportionality factor k, which is a measure of the scattering cross section of the solution.
  • / re ⁇ (v) the relative wavelength-dependent scattering intensity
  • / 0 (v) and / p r (v) the intensities of the reference sample (without scattering particles) and the sample to be examined
  • v is the frequency
  • k is a proportionality factor, which corresponds to the scattering cross section of the sample.
  • protein-protein interactions in solution can be determined without markings by means of laser scattered light measurements.
  • a very narrow range of weakly attractive interactions sets limits within which protein crystals can form. These interactions are influenced by the properties of the solution.
  • Laser scattered light measurements are used to measure the interactions of proteins under different solution conditions. In this case, those solution compositions are determined that a protein crystallization favor.
  • new solution conditions can be calculated from the selected solution approaches, from which a further approximation to the sought-after crystallization window can be expected.
  • a set of other different protein solutions is automatically set up in the computed compositions and analyzed for protein-protein interactions by laser scattered light measurements. The iteration of the procedure described is intended to bring the crystallization parameters closer to the crystallization window with each pass until a protein single crystal is formed.
  • Fig. 1 an embodiment of the invention with a light source
  • 3 shows an embodiment of the invention with three light sources
  • Fig. 1 a the individual components of excitation and detection optics are shown schematically
  • Fig. 1b shows an enlarged section of Fig. 1 a and shows a sketch of sitting on the bottom of the microtiter plate 10 sample drop 11 and the beam paths of acting radiation 3 and detected radiation 15.
  • a collimated laser beam 1 is converted by a beam shaping optics 2 into a collimated ring beam 3. This can be done by a sequence of two identical axicon (glass cones), which are each arranged with their tips to each other, can be achieved.
  • the laser beam 1 is generated by a temperature-stabilized diode laser, which is coupled into a single-mode fiber. After coupling the beam out of the fiber, the intensity distribution has a pure Gaussian profile (TEM-OO mode), the beam diameter being 6 mm, for example.
  • TEM-OO mode pure Gaussian profile
  • the beam shaping by the axicon 2 results in an annular beam 3 with an inner diameter of 20 mm and an outer diameter of 26 mm.
  • the collimated ring beam 3 impinges on the parabolic mirror 4 and is focussed into the area covered by a not liquid with the sample 1 1 miscible liquid layer 14 sample 11 on the focal point 12. He passes through the glass bottom of a
  • Microtiter plate 10 and traverses the from the bottom of the sample 11 and the
  • Microtiter plate 10 formed interface 13.
  • the exciting ring beam 3 is irradiated at an angle range between 51 ° and 59 ° (half the opening angle), this corresponds to numerical Grenzaperturen of 0.78 to 0.86.
  • the generated stray radiation 15 is placed from the center in the parabolic mirror 4
  • Microscope objective 5 at an angle between 0 ° and 44 ° (half
  • Opening angle which corresponds to a numerical aperture of 0.7, collected and shaped again into a collimated beam 6. This is focused by a further optics 7 on a single mode fiber 8.
  • the fiber 8 directs the
  • Photomultiplier or an avalanche photodiode can act.
  • FIG. 2 shows a device according to the invention with two beam sources 18, 18 '.
  • the two laser beam sources 18 and 18 ' (eg a diode laser at 658 nm and a frequency-doubled Nd: YAG laser at 532 nm) each emit a collimated laser beam 1, 1'.
  • a dichroic mirror 16 Via a dichroic mirror 16, which reflects one wavelength and allows the other wavelength to pass, the two beams 1, 1 'are superimposed.
  • both beams are respectively transformed into a collimated ring beam 3.
  • the two superimposed ring beams 3 are focused by the parabolic mirror 4 without the occurrence of a chromatic error in the sample volume 11, scattered radiation 15 is collected by the chromatically corrected microscope objective 5 and as a collimated beam 6 via a Auskoppelapt 17 to another Directed dichroic mirror 20.
  • the separation of the wavelengths takes place, which are directed via two separate optics 7, 7 'onto two single-mode fibers 8, 8' and forwarded to two detectors 9, 9 '.
  • photomultipliers or avalanche photodiodes are used as detectors 9, 9 '.
  • FIG. 3 shows a device according to the invention with three (or more) beam sources 18, 18 ', 18 ".
  • the number of dichroic mirrors 16, 16 ⁇ 16" for superimposing the beams of the different lasers and the number of dichroic mirrors 20, 20 ', 20 "for separating the radiation components of the scattered radiation 15, the number of optics 7, TJ", the number of fibers 8, 8', 8 “and the number of detectors 9, 9 '. , 9 ".
  • FIG. 4 shows a possible arrangement with an excitation with continuous spectral distribution.
  • This has a polychromatic light source 18 and a detector 9 as a spectrometer.
  • the radiation of the light source 18 is ideally guided via a fiber (21) and a coupling-out optical system (19) into the beam-shaping optical system 2.
  • the light source 18 can be a classical light source (halogen lamp, discharge lamp) or a laser source (eg self-phase modulation of a femtosecond laser in an optical fiber).

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
  • Analysing Materials By The Use Of Radiation (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Durchführung von Streulichtmessungen, aufweisend mindestens ein Fokussierungselement, mit dem elektromagnetische Strahlung auf eine Probe fokussiert werden kann, einen Detektor, sowie eine Detektionsoptik, mit der von der Probe gestreute elektromagnetische Strahlung zu dem Detektor geleitet werden kann, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mittel zur Bildung eines Ringstrahls vorhanden ist, dass durch das mindestens eine Fokussierungselement eine Fokussierung des Ringstrahls auf einen Fokuspunkt innerhalb der Probe bewirkbar ist und dass durch die Detektionsoptik von der Probe gestreute elektromagnetische Strahlung erfassbar ist, welche sich innerhalb des vom Ringstrahl umgebenen Raumes ausbreitet.

Description

Vorrichtung und Verfahren zur Durchführung statischer und dynamischer Streulichtmessungen in kleinen Volumina
Anmelderin: Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V.
Technisches Anwendungsgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung, ein Messsystem sowie ein Verfahren zur Durchführung von Streulichtmessungen, insbesondere statischer und dynamischer Streulichtmessungen. Bevorzugte Anwendungsgebiete sind solche, bei denen die Durchführung einer großen Zahl von Messungen in automatisierten Abläufen erforderlich ist, etwa bei der Untersuchung von Kristallisationsvorgängen im Rahmen der Züchtung von Proteinkristallen.
Stand der Technik
Streulichtmessungen, insbesondere Laser-Streulichtmessungen, werden bereits in etlichen Anwendungsgebieten eingesetzt, beispielsweise für die Charakterisierung von Kolloiden. In der Nahrungsmittelindustrie, für kosmetische Produkte oder aber auch für Polymere oder Klebstoffe spielen die Größenverteilung und Stabilität kolloidaler Partikel eine wichtige Rolle.
Ein weiteres Anwendungsgebiet ist die Aufklärung der Strukturen komplexer Proteine und anderer Biomoleküle, welche für die zielgerichtete Entwicklung neuer
Medikamente sowie die Untersuchung der biochemischen Funktion dieser
Moleküle von großer Wichtigkeit ist. Die auf Röntgenbeugungsexperimenten basierende Strukturaufklärung ist auf qualitativ hochwertige Einkristalle mit beugenden Eigenschaften angewiesen, die in der Regel aus Lösungen gezüchtet werden. Der entscheidende Schritt für die Züchtung von Proteineinkristallen besteht im Wesentlichen darin, für die Kristallisation geeignete
Lösungsbedingungen zu finden. Durch die Variation von Lösungsparametem wie pH-Wert, Proteinkonzentration, die Zusammensetzung und Konzentration von Salzen und Fällungsreagenzien, Temperatur etc. werden die Wechselwirkungen zwischen den gelösten Proteinmolekülen variiert und es können attraktive oder repulsive Wechselwirkungen eingestellt werden. Die Untersuchung der Kristallisation von Proteinen wird bisher in der Regel empirisch durchgeführt und stellt einen Engpass in der Strukturaufklärung der Proteine dar.
Laser-Streulichtmessungen erlauben eine direkte Messung der in einer Kristallisationslösung vorherrschenden Wechselwirkung zwischen gelösten Proteinen und können daher für das gezielte Auffinden von für die Kristallisation optimalen Lösungsparametern eingesetzt werden. Der so genannte osmotische Virialkoeffizient ist eine thermodynamische Größe, die das reale Wechselwirkungsverhalten gelöster Teilchen als Abweichung vom Verhalten einer idealen Lösung beschreibt. Osmotische Virialkoeffizienten können mit Hilfe von statischen Streulichtmessungen ermittelt werden. Für das Messverfahren ist die Detektion der absoluten Streulichtintensität in verschiedenen Lösungen mit unterschiedlichen Teilchenkonzentrationen notwendig. Von Grenzflächen reflektiertes Licht kann die Messung dabei sehr leicht stören. Es ist bereits bekannt, dass der osmotische Virialkoeffizient für die Kristallisation von Proteinen von besonderer Bedeutung ist. Die Wahrscheinlichkeit für eine erfolgreiche Kristallisation ist in einem „Kristallisationsfenster" genannten Wertebereich des osmotischen Virialkoeffizienten besonders hoch und außerhalb dieses Kristallisationsfensters besonders niedrig.
Mit Hilfe von dynamischen Streulichtverfahren können Informationen über das Diffusionsverhalten gelöster Teilchen und damit die Teilchengröße erhalten werden. Diese Größen ändern sich durch einen Aggregationsvorgang empfindlich. Der der Kristallisation vorausgehende Vorgang der Keimbildung kann so erkannt werden.
Besonders für statische Streulichtmessungen ist es von zentraler Bedeutung, eine optimale Unterdrückung von unerwünschten Strahlungsanteilen zu erreichen.
Diese werden vor allem durch Reflexionen an Grenzflächen verursacht. Je näher die Grenzflächen an dem Messvolumen liegen, desto schwieriger wird die effektive Unterdrückung.
Es ist bereits bekannt, Laserstreulichtverfahren zur Charakterisierung von Makromolekülen einzusetzen. Es stehen verschiedene Geräte zur Ermittlung von osmotischen Virialkoeffizienten oder von Molekulargewichten mittels statischer Lichtstreuung und auch zur Ermittlung hydrodynamischer Radienverteilungen mittels dynamischer Lichtstreuung zur Verfügung. Die heute verwendeten Geräte zur Durchführung von Streulichtmessungen arbeiten in der Regel mit Glasküvetten, in die Probenlösungen eingefüllt werden müssen. Meist wird dabei ein Laserstrahl in die Küvette hineinfokussiert, das von den untersuchten Teilchen gestreute Licht wird unter einem definierten Winkel relativ zur Einstrahlrichtung (z.B. 90°) detektiert. Es gibt auch Systeme, die es ermöglichen, den Detektionswinkel zu ändern oder simultan mit mehreren Detektoren unter verschiedenen Winkeln Streulicht zu sammeln, wie etwa in der EP 0867711 A2 beschrieben. Typischerweise werden für solche Systeme runde Küvetten eingesetzt, die zur weiteren Vermeidung von Reflexionsanteilen im Streulicht in einem Index-matching Bad (ein mit einer an den Brechungsindex angepassten Flüssigkeit gefülltes Gefäß) positioniert sind. Durch den geringen Unterschied im Brechungsindex zwischen der Badflüssigkeit und der Küvettenwand entsteht beim Übergang des Laserstrahls in die Küvette nur ein vergleichsweise geringer Anteil an reflektierter Strahlung.
Allerdings lassen sich mit den bekannten auf Küvetten basierenden Geräten keine automatisierten Hochdurchsatz-Streulichtmessungen durchführen, da eine in der Regel manuelle Befüllung der Küvetten notwendig ist. Die eingesetzten Küvetten bestehen im Falle von Präzisionsmessungen aus poliertem Glas und sind teuer. Zur ökonomischen Nutzung müssen sie vielfach wiederverwendet und daher aufwendig gereinigt werden. Die hohen Anforderungen des Messverfahrens - problematisch ist etwa, dass Oberflächenverunreinigungen auf dem Glas sowie Partikel in der Lösung die Streulichtintensität verfälschen - machen auch diesen Schritt aufwendig und schlecht automatisierbar. Das Problem der Reinigung kann nicht durch den Einsatz von Einwegküvetten, etwa aus Plastik, gelöst werden, da dies aufgrund der schlechteren optischen Eigenschaften gerade für die statischen Streulichtmessungen, bei denen absolute Lichtintensitäten mit hoher Präzision bestimmt werden müssen, durch das vom Plastik erzeugte Streulicht zu Verfälschungen führt. Insgesamt ist die Handhabung der Küvetten (Positionierung im Index-matching Bad, Reinigung, Wiederbefüllung) daher aufwendig und zeitraubend.
Die Volumina typischer Küvetten für Streulichtmessungen liegen in der Größenordnung von mindestens 5 -10 Mikrolitern, oft sogar noch wesentlich höher. Zwar wäre die Herstellung von Küvetten mit noch kleineren Volumina technisch grundsätzlich möglich, Streulichtküvetten mit Nanolitervolumina wurden bisher jedoch nicht verwendet und werden derzeit nicht angeboten. Die für die manuelle Durchführung von Einzelmessungen notwendige Handhabung der Lösungen (manuelles Pipettieren, Ansetzen der Lösungen, Einfüllen der Lösung in die Küvette etc.) erfordert ein Mindestvolumen, das typischerweise im Mikrolitermaßstab liegt. Eine starke Verkleinerung der Küvettenvolumina scheint für Einzelmessungen auch nicht erforderlich zu sein, hinzu kommt, dass die Anregungs- und Detektionsoptiken der kommerziellen Streulichtgeräte nicht auf extrem kleine Küvettenvolumina optimiert sind.
Im Falle von Reihenuntersuchungen mit hunderten oder tausenden von Messungen für die automatisierte Kristallisation von Proteinen ist jedoch eine weitere Minimierung des Probenvolumens und damit des Proteinverbrauches notwendig, da die Proteine oft aufwändig gewonnen werden müssen und nur in kleinen Mengen verfügbar sind. Auch der große Probenverbrauch verhindert bei den bekannten Streulichtmesssystemen somit systematische Untersuchungen zur Optimierung der Kristallisationsbedingungen auf der Basis statischer Streulichtmessungen.
Proteinlösungen werden im Rahmen von Kristallisationsexperimenten oft in Form kleiner Tröpfchen, die entweder unter einem Glasplättchen hängen (sog. „hanging drop") oder auf dem Boden eines Probenträger sitzen („sitting drop") appliziert. Die durch die Tropfenform verursachten gekrümmten Grenzflächen verursachen bei Durchstrahlung mit einem Laserstrahl schwer kontrollierbare Reflexionen, weshalb statische Streulichtmessungen an Tropfen bislang nicht durchgeführt worden sind bzw. unmöglich erschienen. Von der Wyatt Technology Corporation wird ein Streulichtmessgerät für den Einsatz in Mikrotiterplatten angeboten, mit dem jedoch nur dynamische Messungen und keine statischen Messungen möglich sind. Für die Aufnahme von dynamischen Streulichtmessungen werden Signalfluktuationen, die auf Teilchenbewegungen zurückzuführen sind, ausgewertet. Ein zeitlich konstanter Signaluntergrund, der auf Reflexe zurückzuführen ist, stört die dynamische Streulichtmessung nicht oder nur wenig. Statische Messungen hingegen basieren auf der Aufnahme von absoluten Streulichtintensitäten, hier verhindert die Beeinflussung der Streusignale durch Reflexionen die Messung. Das Gerät der Wyatt Technology Corporation ist jedoch nicht in der Lage, störende Reflexionen so stark zu unterdrücken, wie es für die Durchführung statischer Streulichtmessungen notwendig wäre.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung sowie ein Verfahren zur Durchführung von Streulichtmessungen, insbesondere auch absoluten Streulichtmessungen, bereitzustellen, womit eine besonders effektive Unterdrückung unerwünschter Strahlungsanteile erzielt wird, womit außerdem eine systematische und besonders weitgehend automatisierte und damit auch schnelle Untersuchung einer Vielzahl von Proben möglich ist, und wobei insbesondere auch Proben mit sehr kleinem Volumen untersucht bzw. verwendet werden können.
Darstellung der Erfindung
Die Lösung dieses technischen Problems erfolgt durch eine Vorrichtung, ein Messsystem, sowie ein Verfahren gemäß den unabhängigen Ansprüchen. Vorteilhafte Ausgestaltungen und Weiterbildungen werden durch die abhängigen Ansprüche angegeben oder lassen sich aus der nachfolgenden Beschreibung und den Ausführungsbeispielen entnehmen.
Die vorliegende Vorrichtung zur Durchführung von Streulichtmessungen weist mindestens ein Fokussierungselement auf, mit dem elektromagnetische Strahlung auf eine Probe fokussiert werden kann, einen Detektor, sowie eine Detektionsoptik, mit der von der Probe gestreute elektromagnetische Strahlung zu dem Detektor geleitet werden kann. Erfindungsgemäß wurde erkannt, dass sich das technische Problem dadurch lösen lässt, dass bei der Vorrichtung zusätzlich ein Mittel zur Bildung eines Ringstrahls vorhanden ist, dass durch das mindestens eine Fokussierungselement eine Fokussierung des Ringstrahls auf einen Fokuspunkt innerhalb der Probe bewirkbar ist und dass durch die Detektionsoptik von der Probe gestreute elektromagnetische Strahlung erfassbar ist, welche sich innerhalb des vom Ringstrahl umgebenen Raumes ausbreitet.
Durch diese Merkmale wird ein konfokal-optisches System realisiert, mit dem statische oder dynamische Streulichtmessungen in einer Rückstreugeometrie ermöglicht werden. Das heißt, die Detektion der Streustrahlung erfolgt also näherungsweise in der gleichen Richtung, aus der der Anregungslaser (bzw. die zur Anregung verwendete Lichtquelle) eingestrahlt wird (Rückstreurichtung). Dies erleichtert insbesondere eine besonders kompakte Konstruktion der Vorrichtung und macht die Vorrichtung besonders flexibel in Bezug auf den verwendeten Probenträger. Insbesondere bietet dies die Möglichkeit, Streulichtmessungen in Messgeometrien mit nur einem optischen Zugang durchzuführen. Beispielsweise ist es möglich, Proben bzw. Probentropfen in Mikrotiterplatten mit Glasböden zu untersuchen. Damit kann erreicht werden, eine Vielzahl von Messungen mit einem einzigen Probenträger (z.B. Mikrotiterplatte) durchzuführen. Die Verwendung von Mikrotiterplatten vereinfacht den Einsatz von Pipettierrobotem zur automatischen Befüllung einzelner Probenpositionen. Dadurch lässt sich eine umfassende Automatisierung von Probenpräparation und Streulichtmessung erreichen. Dies bietet erhebliche ökonomische Vorteile gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten Vorrichtungen, insbesondere auch, weil die Verwendung des Probenträgers als Einwegartikel aufgrund der großen Anzahl der mit einem Probenträger durchführbaren Messungen wirtschaftlich ist und somit eine komplizierte Reinigung, wie sie aus dem Stand der Technik für Küvetten bekannt ist, entfallen kann.
Dadurch, dass mit der Vorrichtung die Bildung eines Ringstrahls und eine Fokussierung dieses Ringstrahls möglich ist, lässt sich zudem zum einen eine vergleichsweise starke Fokussierung, und damit eine Minimierung des Messvolumens erreichen. Auf diese Weise ist es möglich, Messungen auch an Proben mit besonders kleinen Volumina (unter 1 μl, bzw. in der Größenordnung von (wenigen) 100 nl) durchzuführen. Zusätzlich ist durch die vergleichsweise kleine Größe des Fokusvolumens des anregenden Strahls bei gegebener Gesamtleistung die Intensität der Bestrahlung besonders hoch. Somit ist pro Volumenelement eine besonders hohe Streustrahlung erzeugbar.
Zum anderen ist, indem Streustrahlung, insbesondere ausschließlich Streustrahlung, erfassbar ist, welche sich innerhalb des vom Ringstrahl umgebenen Raumes ausbreitet, gleichzeitig gewährleistet, dass eine vergleichsweise starke Unterdrückung von unerwünschter, von Grenzflächen der Probe bzw. des Probenträgers reflektierter Strahlung erfolgen kann. Die anregende Strahlung kann erfindungsgemäß unter einem sehr flachen Winkel in die Probe gestrahlt werden. Direkte Reflexionen an den Grenzflächen Luft- Probenträger und Probenträger-Probenflüssigkeit werden so auch unter einem sehr flachen Winkel zurückreflektiert. Die sich innerhalb des vom Ringstrahl umgebenen Raumes ausbreitende Streustrahlung verlässt das Detektionsvolumen dagegen unter einem spitzeren Winkel. Der Winkelunterschied zwischen anregendem Licht und Streustrahlung führt somit zu einer starken Unterdrückung der Reflexionen.
Der Ringstrahl wird aus einem kollimierten Strahl mit gaussförmigen Strahlprofil erzeugt, als Strahlquelle wird vorzugsweise ein Laser, insbesondere ein kontinuierlich betriebener Halbleiter-, Festkörper- oder Gaslaser verwendet. Die Formung des Ringstrahls lässt sich durch eine Strahlaufweitung in Verbindung mit einer Ringblende erreichen. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform sieht jedoch zur Formung des Ringstrahls eine Strahlformungsoptik vor, welche zwei auf der optischen Achse positionierte und mit ihren Spitzen zueinander weisende Axicone (Glaskegel) umfasst. Diese werden eingangsseitig vom Laserstrahl mittig beleuchtet. Eine derartige Anordnung weist besonders hohe Transmissionswerte auf, so dass die Verluste durch die Formung eines Ringstrahls vergleichsweise gering sind.
Das Fokussierelement ist vorzugsweise reflektierend und ringförmig ausgebildet. Dies ermöglicht eine vorteilhafte Anordnung der Detektionsoptik. Vorzüge hat es, wenn das Fokussierelement derart ausgebildet ist, dass in der Probe ein annähernd radialsymmetrisch ausgebildeter (und möglichst kleiner) Fokus erzeugbar ist, da auf diese Weise eine besonders hohe Intensität pro Volumenelement erzielbar ist. Da durch die konfokale Detektion nur Signale aus der Überlappungsregion aus Anregungs- und Detektionsfokus aufgenommen werden, sollten beide Foki die gleiche Größenordnung aufweisen. Naturgemäß kann ein Mikroskopobjektiv mit voll gefüllter Apertur einen kleineren Fokus erzeugen als ein Ringstrahl, daher wird der Anregungsfokus in der Regel größer als der Detektionsfokus sein. Aus diesem Grunde gewinnt man an Signalintensität, indem man einen möglichst kleinen Anregungsfokus erzeugt und eine möglichst hohe flächenbezogene Anregungsintensität bereitstellt, da nur der innere Teil des Fokus (aus dem Überlappungsbereich) zum Signal beiträgt. Als Fokussierelement kann beispielsweise ein (ringförmiger) Parabolspiegel verwendet werden. Mit einem solchen ist es prinzipiell möglich, einen annähernd radialsymmetrisch ausgebildeten Fokus zu erzeugen. Zu beachten sind jedoch die von der Strahlung zwischen Fokussierelement und Probe zu durchlaufenden Grenzschichten, so dass ein optimales Fokussierelement gegenüber einem Parabolspiegel leicht in seiner Form modifiziert ist und dadurch den Effekt der Brechung am Glasboden bzw. beim Eintreten in die Probe korrigiert.
Das Fokussierelement sollte so ausgelegt sein, dass ein Fokusdurchmesser kleiner als 30 μm, vorzugsweise kleiner als 20 μm, erzeugt werden kann (wobei der Fokusdurchmesser so definiert sein soll, dass an seinen Grenzen die Laserintensität auf den 1/e-Teil der maximalen Intensität im Fokusmittelpunkt gesunken ist). Durch die geringe Größe des Fokusdurchmessers ist es möglich, auch extrem kleine Proben von unter 1 μl zu untersuchen und darüber hinaus steht dadurch eine besonders hohe Streustrahlung pro Volumenelement und damit insgesamt eine hohe Signalstärke zur Verfügung. Der starke Fokussierungsgrad erlaubt Messungen mit sehr geringem Abstand zu Grenzflächen.
Vorzugsweise ist die Detektionsoptik innerhalb des vom Ringstrahl umgebenen Raumes angeordnet, insbesondere ist die Detektionsoptik zentrisch innerhalb dieses Raumes, bzw. im Zentrum der durch Ringstrahl bzw. Fokussierelement vorgegebenen optischen Achse angeordnet. Der Fokus der Detektionsoptik fällt dabei mit dem Fokus der Anregungsoptik zusammen. Durch eine derartige Anordnung ist die Detektionsoptik in der Lage, einen möglichst großen Anteil der erzeugten Streustrahlung einzufangen und ohne große Verluste dem Detektor zuzuführen. Für die Sammlung der Streustrahlung kann ein Mikroskopobjektiv mit einer numerischen Apertur von mindestens 0.6, vorzugsweise mindestens 0.7 eingesetzt werden.
Für die Mehrzahl der für die Kristallisation interessanten Proteine gilt, dass die Moleküle wesentlich kleiner sind (typischerweise wenige nm) als die Wellenlänge des eingesetzten Laserlichtes (mehrere 100 nm). Daher ist die Streuintensität in erster Näherung unabhängig vom betrachteten Winkel und eine Sammlung der Streustrahlung über viele Winkel ist möglich und liefert prinzipiell daher keine anderen Ergebnisse als Experimente, in denen Streulicht nur unter einem Winkel gesammelt wird. Eine Detektionsoptik mit großer numerischer Apertur hat somit Vorteile, da eine größere Signalstärke erreichbar ist.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform ist die Detektionsoptik derart ausgebildet, dass sie das von der Probe ausgehende Streulicht sammelt und wiederum zu einem kollimierten Strahl formt. Dieser kollimierte Strahl wird dann mit einem weiteren optischen Element, beispielsweise einer Linse, auf eine kleine Eintrittsapertur des Detektionssystems, beispielsweise auf den Kern einer Lichtleiterfaser, vorzugsweise einer Single mode Faser, fokussiert. Das System ist dabei so ausgelegt, dass nur solche Strahlung einen kollimierten Strahl bildet und in der Ebene der kleinen Eintrittsapertur des Detektionssystems, also z.B. der Faserfrontfläche fokussiert wird, welche aus einem begrenzten Bereich innerhalb einer vorgegebenen Detektionsebene stammt. Die Detektionsebene entspricht der Fokusebene der Detektionsoptik bei umgekehrter Richtung des Strahlenganges. Der begrenzte Bereich hat eine Ausdehnung von weniger als 10 μm, vorzugsweise ca. 5 μm, insbesondere in der zur Detektionsachse senkrechten Richtung. Er liegt vollständig innerhalb des Fokus der anregenden Strahlung. Streustrahlung aus anderen Ebenen als der vorgegebenen Detektionsebene wird durch die Fokussieroptik vor oder hinter die Ebene der Faserfrontfläche fokussiert und kann daher nur zu einem sehr kleinen Anteil in die Faser eintreten. Damit das Verfahren funktioniert müssen die Foki von Anregungsoptik (Parabolspiegel) und Detektionsoptik (Mikroskopobjektiv) möglichst gut in allen drei Raumrichtungen übereinander liegen.
Durch dieses Messprinzip erhält man eine weitgehende Unterdrückung unerwünschter Reflexionsanteile. Auf diese Weise werden sowohl gerichtete Reflexionen als auch diffus gestreute Strahlung, die beispielsweise an Kratzern und Fehlstellen im Glasboden des Probenträgers entsteht, wirksam unterdrückt.
Die Detektionsoptik kann etwa durch ein mehrlinsiges Mikroskopobjektiv mit angepasster numerischer Apertur gebildet sein bzw. ein solches umfassen. Hierbei muss der Sammelwinkel des Objektivs an den Winkel, unter dem beleuchtet wird, angepasst sein. Indem die Apertur des Mikroskopobjektivs möglichst groß, jedoch etwas kleiner als die innere Grenzapertur der Beleuchtung gewählt wird, stellt man sicher, dass einerseits ein möglichst hoher Signalanteil des Streulichtes erfasst wird, und dabei andererseits keine direkten Reflexionen von der Glasfläche in den Detektionsstrahlengang eintreten können.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht in einem Messsystem zur Durchführung von Streulichtmessungen mit einer Vorrichtung, welche mindestens ein Fokussierungselement, mit dem elektromagnetische Strahlung auf eine Probe fokussiert werden kann, einen Detektor, sowie eine Detektionsoptik aufweist, mit der von der Probe gestreute elektromagnetische Strahlung zu dem Detektor geleitet werden kann. Darüber hinaus umfasst das Messsystem einen flächigen Probenträger, der so ausgebildet ist, dass eine aus einem einzelnen Tropfen bestehenden Probe mit ihm eine Grenzfläche ausbilden kann. Außerdem sind das mindestens eine Fokussierungselement und die Detektionsoptik so angeordnet, dass der Strahlengang der die Probe beaufschlagenden elektromagnetischen Strahlung und der von der Detektionsoptik erfassten Streustrahlung die Grenzfläche durchkreuzt.
Das Messsystem umfasst somit neben einer Vorrichtung, mit der elektromagnetische Strahlung abgegeben und Streustrahlung erfasst werden kann, einen flächigen Probenträger. Dieser kann im einfachsten Fall eine ebene Platte sein. Er muss in den für Proben vorgesehenen Bereichen zumindest im wesentlichen transparent für die verwendete elektromagnetische Strahlung sein. Vorzugsweise besteht er aus Glas.
Anregung und Detektion erfolgt durch den flächigen Probenträger und die Grenzfläche, die die Probe mit dem flächigen Probenträger ausbildet. Der Strahlengang kreuzt somit nur ebene Grenzflächen und ist daher relativ leicht in Bezug auf unerwünschte Reflexionen kontrollierbar.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform definiert die Detektionsoptik eine optische Achse (z). Diese ist (zumindest im wesentlichen) senkrecht zu dem Probenträger (xy-Ebene) und bildet die Mittelachse für den Ringstrahl bzw. das Fokussierungselement. Die Detektionsoptik ist in der Lage, die ausgehend von dem Detektionsvolumen in Richtung der z-Achse sowie unter einem Winkel zur z- Achse (halber Öffnungswinkel) von bis zu 48°, vorzugsweise von bis zu 44°, von der Probe abgestrahlte Streustrahlung zu erfassen. Ein halber Öffnungswinkel von 44° führt zu einer numerischen Apertur von 0.7. Die vom Fokussierungselement in Richtung des Fokus geführte anregende Strahlung bildet mit der z-Achse einen Winkel zwischen 51 ° und 59°. Die anregende Strahlung kreuzt den Probenträger und die Grenzflächen somit unter einem flacheren Winkel als die von der Detektionsoptik erfasste, aus dem Detektionsvolumen stammende Streustrahlung.
Das Fokussierelement fokussiert den anregenden Ringstrahl unter einer oberen numerischen Grenzapertur von mindestens 0.84 (entspricht 57.1 °), vorzugweise 0.86 (entspricht 59.3°), bzw. unteren numerischen Grenzapertur von höchstens 0.82 (entspricht 55.1 °), vorzugweise 0.78 (entspricht 51.2°), auf die Probe. Dadurch wird ein ausreichender Winkelabstand zur Detektionsoptik sichergestellt.
Bei dem Probenträger handelt es sich vorzugsweise um eine Mikrotiterplatte, d.h. ein Standardbauteil mit einer Vielzahl voneinander isolierter Messfelder in Reihen und Spalten.
Mit dem erfindungsgemäßen Messsystem ist es möglich, eine große Zahl von Proben jeweils als einzelnen Tropfen auf einen einzigen flächigen Probenträger zu applizieren und damit eine Vielzahl von Messungen in kurzer Zeit und automatisiert durchzuführen. Besondere Vorteile hat das Messsystem, wenn es zusätzlich eine automatisierte, bilddatengestützte Positioniereinheit aufweist, mit der der beugungsbegrenzte Laserfokus näherungsweise im Zentrum des geringen, vorzugsweise unter 1 μl großen Volumens der zu untersuchenden Proteinlösungen positionierbar ist. Dies erlaubt einen schnellen Wechsel von Probe zu Probe unter reproduzierbaren Messbedingungen und damit die Verwendung des Laserstreulichtverfahren in Form eines Hochdurchsatzverfahren zur systematisierten Proteinkristallisation.
Als Positioniereinheit kommt beispielsweise ein System mehrerer Präzisionsverschiebetische mit Spindelantrieb und mikroprozessorgesteuerten Schrittmotoren in Frage. Alternativ eignen sich auch piezogetriebene Tische. Die Positioniergenauigkeit sollte deutlich kleiner als die Dimension der Probentröpfchen sein, bewährt hat sich eine Positioniergenauigkeit von wenigen Mikrometern.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht in einem Verfahren zur Durchführung von Streulichtmessungen, bei dem elektromagnetische Strahlung auf eine Probe fokussiert und von der Probe gestreute Strahlung detektiert wird, wobei die Probe als Tropfen vorliegt, welcher eine Grenzfläche zu einem flächigen Probenträger aufweist, und wobei die Beaufschlagung mit der elektromagnetischen Strahlung sowie die Detektion der Streustrahlung durch den flächigen Probenträger und die Grenzfläche hindurch erfolgt. Für das Verfahren bietet sich die Verwendung der vorab beschriebenen Vorrichtung bzw. des Messsystems an.
Die Probe liegt als einzelner, in Verbindung mit dem Probenträger gebrachter Tropfen vor. Das bedeutet, die Probe bildet eine in sich geschlossene Phasengrenzfläche, wobei ein Teil ihrer Oberfläche eine Grenzfläche mit dem Probenträger, der übrige Teil eine flüssig/gasförmige Phasengrenzfläche mit der gasförmigen Umgebung (Luft) ausbildet, wobei ein stabiler Zustand vorliegt. Die Form des Trofens wird dabei in bekannter Weise durch die Kohäsionskräfte innerhalb des Tropfens und die Adhäsionskräfte gegenüber der Oberfläche des Probenträgers bestimmt.
Vorzugsweise wird die Probe, d.h. das kleine wässrige Flüssigkeitströpfchen, in dem die zu untersuchenden Proteine gelöst sind, unter einer Schicht einer nicht mit der Probe mischbaren Flüssigkeit, vorzugsweise einer Öl- oder Paraffinschicht direkt auf den Glasbodens des flächigen Elements pipettiert. Der Tropfen verdrängt dabei das Paraffin bzw. das Öl vom Glasboden und sitzt halbkugelförmig direkt auf dem Boden auf. Dies ist auch für kleinste Probenvolumina, etwa Volumen unter einem μl bzw. sogar für 100 nl realisierbar und automatisiert mit nadelbasierten Pipettierrobotem durchführbar. Durch die Öl- oder Paraffinschicht sind die kleinen Flüssigkeitsmengen vor dem Eintrocknen geschützt. Weiterer Vorteil ist, dass der Probenträger darüber hinaus selbst für eine große Zahl von Tropfen einfach gefertigt sein kann. Er kann beispielsweise auch lediglich wenige größere separate Zellen aufweisen, da nicht jeder Einzeltropfen in ein eigenes Kompartiment des Probenträgers gegeben werden muss. Das den Tropfen umgebende Öl oder Paraffin ersetzt gewissermaßen die Wände eines eigenen Probenkompartimentes und verhindert eine Vermischung der einzelnen Tropfen.
Die Pobe wird, insbesondere im Fall von Proteinlösungen im Rahmen von Kristallisationsexperimenten, häufig in Form kleiner Tröpfchen appliziert; diese können entweder auf dem Boden eines Probenträgers sitzen (sog. "sitting drop") oder aber unter dem Probenträger bzw. Glasplättchen hängen (sog. "hanging drop"). Die Erfindung bietet auch für eine derartige unkonventionelle Geometrie der Probe die Möglichkeit, Streulichtmessungen durchzuführen. Aufgrund der wirksamen Unterdrückung von unerwünschten Störungen können dabei auch die gekrümmten und nahe des Fokus befindlichen Grenzflächen der Tröpfchen toleriert werden.
Um eine weitere Reduktion unerwünschter Strahlung (Reflexionen an Grenzflächen u.a.) im detektierten Signal zu erreichen, weist gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung die auf die Probe fokussierte elektromagnetische Strahlung mehrere Strahlungsanteile unterschiedlicher Wellenlänge auf, insbesondere können dafür zwei verschiedenen Licht- bzw. Laserquellen gewählt werden. Außerdem werden unterschiedliche spektrale Anteile der Streustrahlung getrennt voneinander detektiert. Dies ermöglicht die Messung einer Differenzintensität. Damit diese Maßnahme eine hinreichende Steigerung der Genauigkeit bewirkt, sollte die elektromagnetische Strahlung vorzugsweise zumindest zwei unterschiedliche Strahlungsanteile enthalten, deren Wellenlängen sich zumindest um 50 nm, vorzugsweise sogar um mindestens 120 nm unterscheiden.
Die Reflexion von Strahlung an einer Grenzfläche lässt sich mit Hilfe der Fresnelschen Gleichungen beschreiben. So berechnet sich der Reflexionsgrad einer Grenzfläche zwischen zwei Materialien mit den Brechungsindizes n und n' wie folgt:
R _ = -I±« An - n) I B (»' + »)
mit: R = Reflektivität, /R = reflektierte Intensität (Einfall senkrecht zur Oberfläche), /E = eingestrahlte Intensität, n und n' Brechungsindizes der angrenzenden Materialien.
Für den Übergang eines Laserstrahles von Luft (n = 1) in ein typisches Glas (n' = 1 ,5) ergibt sich so ein Reflexionsgrad von ca. 4%. Die Wellenlänge hat im Falle kleiner Verschiebungen nur einen sehr geringen Einfluss auf den Reflexionsgrad. Gleichzeitig geht die Wellenlänge jedoch mit der vierten Potenz in die Streuintensität kleiner Partikel ein, so dass sich kleine Wellenlängenunterschiede bereits deutlich in unterschiedlichen Streuintensitäten bemerkbar machen. Wird nun nicht die absolute Streuintensität bei einer Wellenlänge sondern die Differenz der Streuintensitäten bei zwei verschiedenen Wellenlängen als Grundlage für ein Streulichtexperiment verwendet, so erhält man eine Messgröße, die relativ unempfindlich gegenüber Verfälschungen des Messsignals durch Reflexionsanteile ist. Wenn bei aufeinander folgenden Messungen an derselben Probe verschieden große Anteile an reflektiertem Licht in die Detektionsoptik eintreten, werden die Messergebnisse in einem Experiment mit nur einer Wellenlänge stark verfälscht. In einem Experiment mit zwei Wellenlängen würden die Intensitäten beider Wellenlängen in gleicher weise verändert, die Differenz der beiden Intensitäten würde jedoch nur schwach gestört. Daher bietet dieser Ansatz die Möglichkeit, selbst bei Anwesenheit von unerwünschten Reflexionen Streulichtmessungen mit hoher Genauigkeit durchzuführen. Für die Ausführungsform mit zwei Strahlquellen, ist die erfindungsgemäße Vorrichtung mit einem optischen Mittel zu erweitern, welches es ermöglicht, die Strahlen der beiden Strahlquellen zu überlagern, etwa mit einem dichroitischen Spiegel, der die Wellenlänge des einen Strahls reflektiert und die des anderen Strahls passieren lässt. Andere gleichwirkende optische Mittel sind denkbar. Diese Überlagerung der beiden Strahlungsanteile kann besonders einfach der Strahlformungsoptik im Strahlengang vorgelagert erfolgen. Des weiteren ist zumindest ein weiteres optisches Mittel nötig, um die Strahlungsanteile im Detektionsstrahlengang voneinander zu trennen bzw. auf unterschiedliche Detektoren zu leiten, auch hierfür kann beispielsweise ein dichroitischer Spiegel eingesetzt werden.
Zu Beginn einer Messung wird die Leistung der beiden Laserstrahlquellen so einjustiert, dass bei Vermessung einer Standardprobe ohne Streupartikel, beispielsweise einer Blindlösung, die lediglich aus Lösungsmittel, Puffer etc. besteht aber keine Proteine enthält, die an beiden Detektoren registrierte Signalstärke identisch ist. Wird nun die Standardprobe bzw. Blindlösung durch eine "echte Probe", d.h. z.B. eine Lösung mit Proteinen als streuenden Partikeln ersetzt, so steigt die Signalstärke für den Detektionskanal mit kürzerer Wellenlänge stärker an als für den Detektionskanal mit längerer Wellenlänge. Die Differenz stellt ein der Streuintensität proportionales Messsignal dar, das nur sehr wenig von Reflexionseffekten verfälscht ist.
Möglich ist auch eine Ausführungsform der Erfindung mit mehr als zwei Lasern verschiedener Wellenlänge. Hierfür müssen lediglich Ein- und Auskopplungsoptiken sowie Detektoren für die weiteren Laser ergänzt werden. Über verschiedene dichroitische Spiegel werden die einzelnen Wellenlängen überlagert und wieder getrennt. Um unterschiedliche Laserintensitäten und spektrale Empfindlichkeiten der Detektoren auszugleichen, muss wiederum zunächst eine Intensitätsmessung mit einer Probe ohne Streupartikel (z.B. ohne Proteine) durchgeführt werden. Alle weiteren Messungen mit den zu untersuchenden Substanzen werden auf diese Referenzmessung bezogen, durch Division wird eine relative Streuintensität erhalten. Wird ein lineares Detektorverhalten vorausgesetzt, ergibt sich für die verschiedenen Detektoren eine Folge von relativen Streuintensitäten, die proportional zu v4 (mit v = Frequenz der anregenden Laserstrahlung) ansteigen. Die Proportionalitätskonstante ist ein Maß für den Streuquerschnitt der untersuchten Probe und ist nur wenig von Reflexionsanteilen verfälscht.
Denkbar ist auch eine Ausführungsform der Erfindung, bei der das anregende Licht eine kontinuierliche spektrale Verteilung aufweist. In diesem Fall wird als Detektor vorzugsweise ein Spektrometer eingesetzt. Vorausgesetzt, die Probe zeigt in dem betrachteten Wellenlängenbereich keine Absorption, kann - nach Referenzierung auf eine Messung an einer Probe ohne Streupartikel - ein relativer Intensitätsverlauf, der proportional zu v4 ansteigt, erwartet werden. Das Streuspektrum einer Probe mit streuenden Partikeln wird durch das Streuspektrum einer Probe ohne streuende Partikel (z.B. ohne Proteine) dividiert. Durch eine mathematische Fit-Analyse (z.B. nach dem Prinzip der kleinsten Fehlerquadrate) kann der Verlauf der relativen Streuintensität anschließend durch einen analytischen Ausdruck angenähert werden. Dabei ergibt sich ein Proportionalitätsfaktor k, der ein Maß für den Streuquerschnitt der Lösung ist.
Dabei sind /reι(v) die relative wellenlängenabhängige Streu intensität, /0(v) und /pr(v) die Intensitäten der Referenzprobe (ohne Streupartikel) und der zu untersuchenden Probe, v ist die Frequenz und k ist ein Proportionalitätsfaktor, der dem Streuquerschnitt der Probe entspricht.
Mit dem beschriebenen Verfahren können mittels Laserstreulichtmessungen Protein-Proteinwechselwirkungen in Lösung markierungsfrei bestimmt werden. Dabei gibt ein sehr eng umgrenzter Bereich schwach attraktiver Wechselwirkungen Grenzen vor, innerhalb derer sich Proteineinkristalle ausbilden können. Diese Wechselwirkungen werden durch die Eigenschaften der Lösung beeinflusst. Mithilfe der Laserstreulichtmessungen werden die Wechselwirkungen der Proteine unter verschiedenen Lösungsbedingungen gemessen. Dabei werden diejenigen Lösungszusammensetzungen ermittelt, die eine Proteinkristallisation begünstigen. Mithilfe mathematischer Optimierungsalgorithmen können aus den ausgewählten Lösungsansätzen neue Lösungsbedingungen berechnet werden, von denen eine weitere Annäherung an das gesuchte Kristallisationsfenster zu erwarten ist. Ein Satz weiterer unterschiedlicher Proteinlösungen wird in den berechneten Zusammensetzungen automatisiert angesetzt und durch Laserstreulichtmessungen auf die Protein-Protein- Wechselwirkungen untersucht. Die Iteration der beschriebenen Vorgehensweise soll die Kristallisationsparameter mit jedem Durchlauf näher an das Kristallisationsfenster heranbringen, bis sich ein Protein-Einkristall ausbildet.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen in Verbindung mit den Zeichnungen ohne Beschränkung des durch die Patentansprüche vorgegebenen Schutzbereichs nochmals näher erläutert. Hierbei zeigen:
Fig. 1 : eine Ausführungsform der Erfindung mit einer Lichtquelle
Fig. 2: eine Ausführungsform der Erfindung mit zwei Lichtquellen
Fig. 3: eine Ausführungsform der Erfindung mit drei Lichtquellen
Fig. 4: eine Ausführungsform der Erfindung mit einer polychromatischen Lichtquelle
Wege zur Ausführung der Erfindung
In Fig. 1 a sind die einzelnen Komponenten von Anregungs- und Detektionsoptik schematisch wiedergegeben, Fig. 1b stellt einen vergrößerten Ausschnitt von Fig. 1 a dar und zeigt eine Skizze des auf dem Boden der Mikrotiterplatte 10 aufsitzenden Probentropfens 11 sowie die Strahlengänge von beaufschlagender Strahlung 3 und detektierter Strahlung 15.
Ein kollimierter Laserstrahl 1 wird durch eine Strahlformungsoptik 2 in einen kollimierten Ringstrahl 3 umgewandelt. Dies kann durch eine Abfolge von zwei identischen Axiconen (Glaskegeln), die jeweils mit ihren Spitzen zueinander angeordnet sind, erreicht werden. Der Laserstrahl 1 wird von einem temperaturstabilisierten Diodenlaser erzeugt, der in eine Single mode Faser eingekoppelt wird. Nach Auskopplung des Strahles aus der Faser weist die Intensitäts-Verteilung ein reines Gauss-Profil auf (TEM-OO Mode), der Strahldurchmesser beträgt beispielsweise 6 mm. Nach der Strahlformung durch die Axicone 2 ergibt sich ein ringförmiger Strahl 3 mit einem Innendurchmesser von 20 mm und einem Außendurchmesser von 26 mm.
Der kollimierte Ringstrahl 3 trifft auf den Parabolspiegel 4 und wird in die von einer nicht mit der Probe 1 1 mischbaren Flüssigkeitsschicht 14 überdeckten Probe 11 auf den Fokuspunkt 12 hineinfokussiert. Dabei durchtritt er den Glasboden einer
Mikrotiterplatte 10 und durchquert die von der Unterseite der Probe 11 und der
Mikrotiterplatte 10 ausgebildete Grenzfläche 13. Der anregende Ringstrahl 3 wird unter einem Winkelbereich zwischen 51° und 59° (halber Öffnungswinkel) eingestrahlt, dies entspricht numerischen Grenzaperturen von 0,78 bis 0,86. Die erzeugte Streustrahlung 15 wird von dem mittig im Parabolspiegel 4 platzierten
Mikroskopobjektiv 5 unter einem Winkel zwischen 0° und 44° (halber
Öffnungswinkel), dies entspricht einer numerischen Apertur von 0,7, gesammelt und wieder zu einem kollimierten Strahl 6 geformt. Dieser wird durch eine weitere Optik 7 auf eine Single mode Faser 8 fokussiert. Die Faser 8 leitet das
Streulichtsignal an einen empfindlichen Photodetektor 9, bei dem es sich um einen
Photomultiplier oder eine Avalanche-Photodiode handeln kann.
Die Fig. 2 zeigt eine erfindungsgemäße Vorrichtung mit zwei Strahlquellen 18,18'. Die beiden Laserstrahlquellen 18 und 18', (z.B. ein Diodenlaser bei 658 nm und ein frequenz-verdoppelter Nd:YAG Laser bei 532 nm) emittieren jeweils einen kollimierten Laserstrahl 1 ,1 '. Über einen dichroitischen Spiegel 16, der die eine Wellenlänge reflektiert und die andere Wellenlänge passieren lässt, werden die beiden Strahlen 1 ,1 ' überlagert. In einer Strahlformungsoptik 2 werden beide Strahlen jeweils in einen kollimierten Ringstrahl 3 umgeformt. Die beiden überlagerten Ringstrahlen 3 werden durch den Parabolspiegel 4 ohne Auftreten eines chromatischen Fehlers in das Probenvolumen 11 fokussiert, Streustrahlung 15 wird durch das chromatisch korrigierte Mikroskopobjektiv 5 gesammelt und als kollimierter Strahl 6 über einen Auskoppelspiegel 17 auf einen weiteren dichroitischen Spiegel 20 gelenkt. Hier erfolgt die Trennung der Wellenlängen, die über zwei separate Optiken 7,7' auf zwei single-mode Fasern 8,8' gelenkt und an zwei Detektoren 9,9' weitergeleitet werden. Als Detektoren 9,9' werden wiederum Photomultiplier oder Avalanche Photodioden eingesetzt.
Die Fig. 3 zeigt eine erfindungsgemäße Vorrichtung mit drei (oder mehr) Strahlquellen 18,18', 18". Im Übrigen erhöht sich gegenüber Fig. 2 die Zahl der dichroitischen Spiegel 16,16\ 16" zur Überlagerung der Strahlen der verschiedenen Laser, sowie die Zahl der dichroitischen Spiegel 20,20',20" zur Trennung der Strahlungsanteile der Streustrahlung 15, die Zahl der Optiken 7,TJ", die Zahl der Fasern 8,8',8" und die Zahl der Detektoren 9,9',9".
Die Fig. 4 zeigt eine mögliche Anordnung mit einer Anregung mit kontinuierlicher spektraler Verteilung. Diese weist eine polychromatische Lichtquelle 18 und als Detektor 9 ein Spektrometer auf. Die Strahlung der Lichtquelle 18 wird idealerweise über eine Faser (21) und eine Auskoppeloptik (19) in die Strahlformungsoptik 2 geführt. Bei der Lichtquelle 18 kann es sich um eine klassische Lichtquelle (Halogenlampe, Entladungslampe) oder aber um eine Laserquelle handeln (z.B. Selbstphasenmodulation eines Femtosekundenlasers in einer optischen Faser).
Bezugszeichenliste
1 Laserstrahl
2 Strahlformungsoptik
3 Ringstrahl
4 Parabolspiegel
5 Mikroskopobjektiv
6 kollimierter Streulichtstrahl
7 Fokussieroptik für den Streulichtstrahl
8 Lichtleitfaser
9 Photodetektor
10 Mikrotiterplatte
11 Probe
12 Fokus
13 Grenzfläche
14 Flüssigkeitsschicht
15 Streustrahlung
16 Dichroitischer Spiegel
17 Auskoppelspiegel
18 Strahlquelle
19 Auskoppeloptik
20 Dichroitischer Spiegel
21 Lichtleiterfaser

Claims

Patentansprüche
1. Vorrichtung zur Durchführung von Streulichtmessungen, aufweisend mindestens ein Fokussierungselement (4), mit dem elektromagnetische Strahlung (3) auf eine Probe (11) fokussiert werden kann, einen Detektor (9), sowie eine Detektionsoptik (5,7,8), mit der von der Probe (11) gestreute elektromagnetische Strahlung (15) zu dem Detektor (9) geleitet werden kann, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mittel (2) zur Bildung eines Ringstrahls (3) vorhanden ist, dass durch das mindestens eine Fokussierungselement (4) eine Fokussierung des Ringstrahls (3) auf einen Fokuspunkt (12) innerhalb der Probe (11) bewirkbar ist und dass durch die Detektionsoptik (5,7,8) von der Probe (11 ) gestreute elektromagnetische Strahlung (15) erfassbar ist, welche sich innerhalb des vom Ringstrahl (3) umgebenen Raumes ausbreitet.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionsoptik (5,7,8) innerhalb des vom Ringstrahl (3) umgebenen Raumes angeordnet ist.
3. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionsoptik eine numerische Apertur von mindestens 0.6, vorzugsweise mindestens 0.7, aufweist.
4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionsoptik ein Mikroskopobjektiv (5) umfasst.
5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionsoptik (5,7,8) so ausgebildet ist, dass im wesentlichen nur aus einem vorgegebenen Detektionsvolumen in die Detektionsoptik (5) gestrahlte elektromagnetische Strahlung (15), zum Detektor (9) gelangen kann.
6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Detektionsvolumen innerhalb des Fokuspunktes (12) des Ringstrahls (3) liegt.
7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Fokussierungselement (4) reflektierend ist.
8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Fokussierungselement (4) ringförmig ist.
9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Fokussierungselement (4) ein Parabolspiegel ist.
10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Fokussierungselement (4) derart ausgestaltet ist, dass in der Probe (11) ein annähernd radialsymmetrisch ausgebildeter Fokus (12) erzeugbar ist.
11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass ein Fokusdurchmesser kleiner 30 μm, vorzugsweise kleiner 20 μm, erzeugbar ist.
12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass eine Strahlformungsoptik (2) zur Formung des Ringstrahls (3) vorhanden ist.
13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Strahlformungsoptik (2) zwei mit ihren Spitzen zueinander angeordnete Axicone umfasst.
14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (11) mit elektromagnetischer Strahlung (1 ,3) bestehend aus Strahlungsanteilen mindestens zweier unterschiedlicher Wellenlängen beaufschlagbar ist.
15. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Detektoren (9, 91) sowie mindestens ein Mittel (20) vorhanden sind, um voneinander verschiedene spektrale Strahlungsanteile der Streustrahlung (6) auf voneinander verschiedene Detektoren (9, 9',9") zu leiten.
16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (11) mit elektromagnetischer Strahlung (1 ,3) einer kontinuierlichen spektralen Verteilung beaufschlagbar ist.
17. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor (9) ein Spektrometer ist.
18. Messsystem zur Durchführung von Streulichtmessungen mit einer Vorrichtung, insbesondere nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welche mindestens ein Fokussierungselement (4), mit dem elektromagnetische Strahlung (1 ,3) auf eine Probe (11) fokussiert werden kann, einen Detektor (9), sowie eine Detektionsoptik (5,7,8), mit der von der Probe (11) gestreute elektromagnetische Strahlung (6) zu dem Detektor (9) geleitet werden kann, aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass das Messsystem einen flächigen Probenträger (10) umfasst, der so ausgebildet ist, dass eine aus einem einzelnen Tropfen bestehenden Probe (11) mit ihm eine Grenzfläche (13) ausbilden kann, und dass das mindestens eine Fokussierungselement (4) und die Detektionsoptik (5,7,8) so angeordnet sind, dass der Strahlengang der die Probe (11) beaufschlagenden elektromagnetischen Strahlung (3) und der von der Detektionsoptik (5,7,8) erfassten Streustrahlung (15) die Grenzfläche (13) durchkreuzt.
19. Messsystem nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der flächige Probenträger (10) geeignet ist zur Bereitstellung einer Vielzahl einzelner von einander separierter Probentropfen (11).
20. Messsystem nach einem der Ansprüche 18 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass der flächige Probenträger (10) eine Mikrotiterplatte mit einem für die die Probe (11) beaufschlagende elektromagnetische Strahlung (3) transparentem Boden ist.
21. Messsystem nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass eine Positioniereinheit vorhanden ist, mit der die Lage des flächigen Probenträgers (10) relativ zum Fokuspunkt (12) einstellbar ist.
22. Verfahren zur Durchführung von Streulichtmessungen, bei dem elektromagnetische Strahlung (1 ,3) auf eine Probe (11) fokussiert und von der Probe (11) gestreute Strahlung (15) detektiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (11) als Tropfen vorliegt, welcher eine Grenzfläche (13) zu einem flächigen Probenträger (10) aufweist und die Beaufschlagung mit der elektromagnetischen Strahlung (3) sowie die Detektion der Streustrahlung (15) durch den flächigen Probenträger (10) und die Grenzfläche (13) hindurch erfolgt.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass der Tropfen mit einer Flüssigkeit (14), vorzugsweise ein Paraffin oder ein Öl, überschichtet vorliegt, was der Verdunstung der Probe (11 ) entgegenwirkt.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Volumen der Probe (11) kleiner als 1 μl ist.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass die auf die Probe (11) fokussierte elektromagnetische Strahlung (3) mehrere Strahlungsaηteile unterschiedlicher Wellenlänge aufweist und dass unterschiedliche spektrale Anteile der Streustrahlung (15) getrennt voneinander detektiert werden.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (11) als Tropfen auf dem flächigen Probenträger (10) sitzt.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (11) als Tropfen unter dem flächigen Probenträger (10) hängt.
EP08784613A 2007-07-05 2008-07-04 Vorrichtung und verfahren zur durchführung statischer und dynamischer streulichtmessungen in kleinen volumina Withdrawn EP2165182A2 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102007031244A DE102007031244B3 (de) 2007-07-05 2007-07-05 Vorrichtung und Verfahren zur Durchführung statischer und dynamischer Streulichtmessungen in kleinen Volumina
PCT/EP2008/005468 WO2009003714A2 (de) 2007-07-05 2008-07-04 Vorrichtung und verfahren zur durchführung statischer und dynamischer streulichtmessungen in kleinen volumina

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP2165182A2 true EP2165182A2 (de) 2010-03-24

Family

ID=40076266

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP08784613A Withdrawn EP2165182A2 (de) 2007-07-05 2008-07-04 Vorrichtung und verfahren zur durchführung statischer und dynamischer streulichtmessungen in kleinen volumina

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20100315635A1 (de)
EP (1) EP2165182A2 (de)
JP (1) JP2010532468A (de)
DE (1) DE102007031244B3 (de)
WO (1) WO2009003714A2 (de)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5911354B2 (ja) * 2012-03-30 2016-04-27 オリンパス株式会社 倒立顕微鏡
US9419573B2 (en) 2014-06-27 2016-08-16 Nxp, B.V. Variable gain transimpedance amplifier
US9952039B2 (en) 2015-06-26 2018-04-24 Glasstech, Inc. System and method for measuring reflected optical distortion in contoured panels having specular surfaces
US9470641B1 (en) 2015-06-26 2016-10-18 Glasstech, Inc. System and method for measuring reflected optical distortion in contoured glass sheets
US9851200B2 (en) 2015-06-26 2017-12-26 Glasstech, Inc. Non-contact gaging system and method for contoured panels having specular surfaces
US9952037B2 (en) 2015-06-26 2018-04-24 Glasstech, Inc. System and method for developing three-dimensional surface information corresponding to a contoured sheet
US9933251B2 (en) 2015-06-26 2018-04-03 Glasstech, Inc. Non-contact gaging system and method for contoured glass sheets
US9841276B2 (en) 2015-06-26 2017-12-12 Glasstech, Inc. System and method for developing three-dimensional surface information corresponding to a contoured glass sheet
ES2865119T3 (es) 2015-10-01 2021-10-15 Nanotemper Tech Gmbh Sistema y método para la medición óptica de la estabilidad y la agregación de partículas
EP3309536A1 (de) * 2016-10-11 2018-04-18 Malvern Panalytical Limited Partikelcharakterisierungsinstrument
CN109891217B (zh) * 2016-11-01 2023-02-28 韩国食品研究院 高分辨率太赫兹波聚光模块、散射光检测模块和采用太赫兹贝塞尔光束的高分辨率检查装置
DE102023103406A1 (de) 2023-02-13 2024-08-14 Isud Solutions Gmbh Vorrichtung zur Untersuchung von Stoffproben mittels elektromagnetischer Strahlung

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE593226C (de) * 1932-06-23 1934-02-28 Zeiss Carl Fa Dunkelfeldkondensor fuer Mikroskope
JPS60217325A (ja) * 1984-04-13 1985-10-30 Nippon Kogaku Kk <Nikon> エピダ−ク用対物レンズ
DE3421577C2 (de) * 1984-06-09 1986-06-05 Harald Dr.-Ing. 6240 Königstein Krzyminski Gerät zur Reflexionsmessung an farbigen Objekten
GB8726305D0 (en) * 1987-11-10 1987-12-16 Secr Defence Portable particle analysers
JPH0815156A (ja) * 1993-06-03 1996-01-19 Hamamatsu Photonics Kk レーザスキャン光学系及びレーザスキャン光学装置
JPH1054793A (ja) * 1996-08-09 1998-02-24 Dainippon Screen Mfg Co Ltd 分光反射光量測定装置
DE19713200C1 (de) * 1997-03-28 1998-06-18 Alv Laser Vertriebsgesellschaf Meßgerät zur Bestimmung der statischen und/oder dynamischen Lichtstreuung
DE19949029C2 (de) * 1999-10-11 2002-11-21 Innovatis Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur Charakterisierung einer Kulturflüssigkeit
US6330059B1 (en) * 1999-10-27 2001-12-11 Hitachi, Ltd. Optical system for detecting surface defects, a disk tester and a disk testing method
CA2444484A1 (en) * 2002-04-10 2003-10-10 Dave Riling Automated protein cyrstallization imaging
JP4171775B2 (ja) * 2002-08-26 2008-10-29 賢二 安田 核酸分析装置
DE102004005878A1 (de) * 2004-02-05 2005-09-01 Rina-Netzwerk Rna Technologien Gmbh Verfahren zur Überwachung der Herstellung von Biomolekülkristallen
US7292263B2 (en) * 2005-03-16 2007-11-06 The Regents Of The University Of California Robotic CCD microscope for enhanced crystal recognition
KR101283071B1 (ko) * 2005-07-15 2013-07-05 바이오비질런트 시스템즈 인코포레이티드 병원체 및 입자 검출기 시스템 및 방법
BE1017090A6 (de) * 2006-04-03 2008-02-05 Hoffmann Kurt Mario Victor Virtuelle reaktionsgef sse.

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO2009003714A3 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2010532468A (ja) 2010-10-07
WO2009003714A2 (de) 2009-01-08
DE102007031244B3 (de) 2009-01-02
US20100315635A1 (en) 2010-12-16
WO2009003714A3 (de) 2009-03-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE102007031244B3 (de) Vorrichtung und Verfahren zur Durchführung statischer und dynamischer Streulichtmessungen in kleinen Volumina
EP3129818B1 (de) Anordnung zur lichtblattmikroskopie
DE102013112596B4 (de) Anordnung zur Lichtblattmikroskopie
DE69622588T2 (de) Fluorometer
EP0867711B1 (de) Messgerät zur Bestimmung der statischen und/oder dynamischen Lichtstreuung
DE202014011312U1 (de) Mikroskop, Fokussierungseinheit, Flüssigkeitshalteeinheit und optische Einheit
EP2977810A1 (de) Verfahren und vorrichtung zum mikroskopischen untersuchen einer probe
EP2912510A1 (de) Mikroskop mit mindestens einem beleuchtungsstrahl in form einer lichtscheibe
DE2446032A1 (de) Verfahren und vorrichtung zur feststellung submikrometrisch bemessener partikel
EP0946855B1 (de) Verfahren und vorrichtungen zur distanzmessung zwischen objektstrukturen
EP1511989B1 (de) Fluoreszenzmesssystem
EP3150988B1 (de) System und verfahren für die optische messung der stabilität und der aggregation von partikeln
DE102017107857A1 (de) Flüssigkeitszelle zur mikroskopischen Bildgebung und ramanspektroskopischen Materialanalyse von Partikelsuspensionen
DE102017204325A1 (de) Anordnung, Mikroskop und Verfahren zur TIRF-Mikroskopie
EP1004014A1 (de) Verfahren und vorrichtung zur fluoreszenzkorrelationsspektroskopie, insbesondere zur mehrfarben-fluoreszenzkorrelationsspektroskopie
DE102004008762B4 (de) Verfahren und Vorrichtung zur Detektion und zum Identifizieren von Biopartikeln
DE60214561T2 (de) Fluorimetrische Multi-Parameter-Analyse in einer parallelen Multi-Fokus-Anordnung
DE102011055426A1 (de) Mikroskopieverfahren zur Erkennung biologischer Zielobjekte
DE19729245C1 (de) Spiegelobjektiv und dessen Verwendung
DE102014108630B4 (de) Vorrichtung und Verfahren zur Durchführung optischer Messungen an fluiden Substanzen in Gefäßen mit einer Längsrichtung
DE102008048266A1 (de) Verfahren zur schnellen Bestimmung der separaten Anteile von Volumen- und Oberflächenabsorption von optischen Materialien, eine Vorrichtung hierzu sowie deren Verwendung
DE102013111780B4 (de) Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung einer Eigenschaft eines Objekts
DE10024135B4 (de) Mikroskop
WO2011144208A2 (de) Anordnung zum messen der optischen eigenschaften von partikeln einer dispersion
DE102012108620A1 (de) Verfahren zum Bestimmen der Weglänge einer Probe und Validierung der damit erhaltenen Messung

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20091217

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MT NL NO PL PT RO SE SI SK TR

AX Request for extension of the european patent

Extension state: AL BA MK RS

DAX Request for extension of the european patent (deleted)
STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20140201