DE102004029733A1

DE102004029733A1 - Rastermikroskop und Verfahren zur Rastermikroskopie

Info

Publication number: DE102004029733A1
Application number: DE102004029733A
Authority: DE
Inventors: Heinrich Dr. Ulrich; Werner Dr. Knebel
Original assignee: Leica Microsystems Heidelberg GmbH; Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2003-07-26
Filing date: 2004-06-21
Publication date: 2005-02-17
Anticipated expiration: 2024-06-22
Also published as: DE102004029733B4

Abstract

Ein Rastermikroskop mit einem Detektor zur Detektion des von einer Probe ausgehenden Detektionslichtes und mit einem im Lichtweg des Detektionslichtes angeordneten Bandpassfilter, der eine Kombination aus einem Kurzpass- und mindestens einem Langpassfilter beinhaltet, ist dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor ein Non-Descan-Detektor ist.

Description

Die Erfindung betrifft ein Rastermikroskop mit einem Non-Descan-Detektor zur Detektion des von einer Probe ausgehenden Detektionslichtes.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Rastermikroskopie an einer Probe.
In der Rastermikroskopie wird eine Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet, um das von der Probe emittierte Detektionslicht, als Reflexions- oder Fluoreszenzlicht, zu beobachten. Der Fokus eines Beleuchtungslichtstrahles wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung, im allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Probenebene bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so daß ein Spiegel in x-, der andere in y-Richtung ablenkt. Die Verkippung der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen bewerkstelligt. Die Leistung des vom Objekt kommenden Detektionslichtes wird in Abhängigkeit von der Position des Abtaststrahles gemessen. Üblicherweise werden die Stellelemente mit Sensoren zur Ermittlung der aktuellen Spiegelstellung ausgerüstet. Speziell in der konfokalen Rastermikroskopie wird ein Objekt mit dem Fokus eines Lichtstrahles in drei Dimensionen abgetastet.
Ein konfokales Rastermikroskop umfasst im allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende – die sog. Anregungsblende – fokussiert wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung, eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird über einen Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz- oder Reflexionslicht gelangt über die Strahlablenkeinrichtung zurück zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Diese Detektionsanordnung wird Descan-Anordnung genannt. Detektionslicht, das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so daß man eine Punktinformation erhält, die durch sequentielles Abtasten des Objekts mit dem Fokus des Beleuchtungslichtstrahles zu einem dreidimensionalen Bild führt. Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatennahme erzielt. Kommerzielle Rastermikroskope bestehen meist aus einem Scanmodul, dass an das Stativ eines klassischen Lichtmikroskops angeflanscht wird, wobei das Scanmodul alle genannten zur Abrasterung einer Probe zusätzlich nötigen Elemente beinhaltet.

Aus der Offenlegungsschrift DE 198 35 070 A1 ist eine Anordnung zur einstellbaren wellenlängenabhängigen Detektion in einem Laserscanmikroskop bekannt. Die Anordnung besteht aus einer im Detektionsstrahlengang des Laserscanmikroskop angeordneten Kombination aus einem Kurzpass- und einem Langpassfilter, die gemeinsam einen einstellbaren Bandpassfilter bilden.

In der konfokalen Rastermikroskopie kann im Falle der Zweiphotonenanregung (oder Mehrphotonenanregung) auf eine Detektionsblende verzichtet werden, da die Anregungswahrscheinlichkeit vom Quadrat der Photonendichte und damit vom Quadrat der Beleuchtungslichtintensität abhängt, die naturgemäß im Fokus viel höher ist als in den Nachbarregionen. Das zu detektierende Fluoreszenzlicht stammt daher mit großer Wahrscheinlichkeit zum aller größten Teil aus der Fokusregion, was eine weitere Differenzierung von Fluoreszenzphotonen aus dem Fokusbereich von Fluoreszenzphotonen aus den Nachbarbereichen mit einer Blendenanordnung überflüssig macht.

Aus der wissenschaftlichen Veröffentlichung von G. Gauderon, P.B. Lukins, C.J.R. Sheppard, „Three-dimensional second-harmonic generation imaging with femtosecond laser pulses", Opt. Lett. 23, p. 1209–1211, 1998 ist ein Auflicht-Rastermikroskop bekannt, das auf dem nichtlinearen Phänomen der Erzeugung der zweiten Harmonischen (second-harmonic generation, SHG) basiert. SHG ist ein Prozess, bei dem eine Phasenanpassungsbedingung erfüllt sein muss. Die Wellenlänge des Detektionslichtes entspricht genau der halben Wellenlänge des Beleuchtungslichtstrahles mit dessen Fokus die Probe abgerastert wird. Zur Erhöhung der zum Detektor gelangenden Detektionslichtmenge ist die Probe bei diesem Rastermikroskop auf einem Spiegel angebracht, der das in Rückwärtsrichtung – entgegen der Fortpfanzugsrichtung des Beleuchtungslichtstrahles – emittierte Detektionslicht reflektiert, so dass dieses gemeinsam mit dem in Rückwärtsrichtung – entgegen der Fortpflanzungsrichtung des Beleuchtungslichtstrahles – emittierten Detektionslicht dem Detektor zuführbar ist.

Insbesondere vor dem Hintergrund einer ohnehin geringen Ausbeute an Fluoreszenzphotonen bei Zweiphotonenanregung oder bei Second-Harmonic-Generation ist eine Non-Descan-Anordnung, bei der das Detektionslicht nicht über die Strahlablenkeinrichtung (Descan-Anordnung) und den Strahlteiler zur Beleuchtungslichteinkopplung zum Detektor gelangt, sondern beispielsweise direkt nach dem Objektiv mit Hilfe eines dichroitischen Strahlteilers ausgelenkt und detektiert wird, interessant; denn im Allgemeinen geht auf diesem Detektionslichtweg weniger Licht verloren. Außerdem tragen bei der Zweiphotonenanregung mit Descan-Detektion gestreute Anteile des Detektionslichtes Wesentlich zum Signal bei, was bei Non-Descan-Detektion nur in wesentlich verringertem Maße eine Rolle spielt. Anordnungen dieser Art sind beispielsweise aus der Veröffentlichung von David. W. Piston et al. „Two photon-excitation fluorecence imaging of three dimensional calcium-ion activity", Applied Optics, Vol. 33, No. 4, Feb 1996, und aus Piston et al: „Time-Resolved Fluorecence Imaging and Background Rejection by Two-Photon Excitation in Laser Scanning Microscopy", SPIE Vol. 1640 bekannt.

Aus der U.S.-Patentschrift US 6,169,289 B1 ist ein Mikroskop mit Mehrphotonenanregung bekannt, bei dem das von der Probe ausgehende Detektionslicht in Non-Descan-Detektion kondensorseitig detektiert wird.

Rastermikroskope mit Non-Descan-Detektion haben den Nachteil, dass der zu detektierende Detektionslichtstrahl am Ort des Detektors, nicht wie bei Descan-Detektion ortsfest ist. Dies führt dazu, dass Multibanddetektoren, wie sie beispielsweise aus der Offenlegungsschrift DE 198 03 151 A1 bekannt ist, nicht verwendet werden können. Die elektrischen Strahlteiler zum Aufteilen des Detektionslichts in mehrere Detektionskanäle sind zum einen nicht variabel einstellbar und führen in der Regel zu spektral sehr breiten Detektionskanälen, die insbesondere eine Unterscheidung von SHG-Licht und Licht der Autofluoreszenz nicht zulässt.

Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Rastermikroskop anzugeben, das in Non-Descan-Detektion eine spektral hoch genaue Untersuchung einer Probe ermöglicht.

Die Aufgabe wird durch ein Rastermikroskop gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass im Lichtweg des Detektionslichtes ein Bandpassfilter vorgesehen ist, der eine Kombination aus mindestens einem Kurzpassfilter und mindestens einem Langpassfilter beinhaltet.

Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Untersuchung einer Probe, deren Detektionslicht auf der Erzeugung einer Harmonischen beruht, unter weitgehender Vermeidung von störenden und verfälschenden Anteilen im Detektionslicht zu ermöglichen.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, das durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist:

• Ermitteln einer Beleuchtungslichtfrequenz bei der in der Probe Detektionslicht erzeugbar ist, das die Frequenz einer Harmonischen der Beleuchtungslichtfrequenz aufweist,
• Beleuchten der Probe mit Beleuchtungslicht der ermittelten Beleuchtungslichtfrequenz,
• Ausblenden der Lichtanteile, die die Frequenz des Beleuchtungslichtes und/oder die die Frequenz von Autofluoreszenzlicht aufweisen, aus dem von der Probe ausgehendem Detektionslicht mit einem im Lichtweg des Detektionslichtes angeordneten Bandpassfilter, der eine Kombination aus einem Kurzpaß- und mindestens einem Langpassfilter beinhaltet und
• Detektieren des gefilterten Detektionslichtes mit einem Non-Descan-Detektor.

Die Erfindung hat insbesondere bei der Detektion von Detektionslicht, das auf der Second-Harmonic-Generation beruht, den Vorteil, dass der Bandpassfilter einerseits ganz genau auf die Second-Harmonic-Wellenlänge einstellbar ist und die Trennschärfe darüber hinaus ausreicht, um gleichzeitig das Auto-Fluoreszenzlicht aus dem Detektionslicht auszublenden.

In einer besonderen Ausführungsform des Rastermikroskops ist der Kurzpassfilter und/oder der Langpassfilter ein spektraler Verlaufsfilter, der vorzugsweise als dielektrischer Filter ausgebildet ist.

Der Kurzpass- und der Langpassfilter sind senkrecht zur Ausbreitungsrichtung des Detektionslichts verschiebbar, so dass durch Verschieben des Kurzpass- bzw. des Langpassfilters die untere bzw. obere Grenze des aus der Kombination entstehenden Bandpassfilters einstellbar ist.

In einer anderen Variante sind der Kurz- und der Langpassfilter scheibenförmig ausgebildet und sind zueinander drehbar angeordnet.

In einer besonderen Variante beinhaltet der Kurzpassfilter und/oder der Langpassfilter einen Gradienten-Interferenzfilter oder einen Verlaufsfilter. Vorzugsweise ist zumindest eine verschiebbare Blende vorgesehen, deren relative Position zum Gradienten-Interferenzfilter bzw. zum Verlaufsfilter den Sperrbereich des Kurzpass- und/oder des Langpassfilters definiert.

Das erfindungsgemäße Rastermikroskop bzw. das erfindungsgemäße Verfahren eignen sich insbesondere zur Untersuchung von Proben in der Mehrphotonenmikroskopie und bei der Second-Harmonic-Generation, da die geringe Detektionslichtleistung weitgehend verlustfrei genutzt werden kann. Vorzugsweise ist zur Erzeugung des Beleuchtungslichts eine Pulslichtquelle, vorzugsweise ein Pulslaser, der beispielsweise als Titan-Saphirlaser ausgebildet sein kann, vorgesehen.

In einer ganz besonders bevorzugten Ausgestaltungsform umfasst der Lichtweg des Detektionslichts mehrere Detektionskanäle, wobei in jedem der Detektionskanäle ein Bandpassfilter vorgesehen sein kann.

In einer besonderen Variante wird das Detektionslicht, das den Bandpassfilter nicht passiert, in andere Detektionskanäle reflektiert. In dieser Ausgestaltungsform bewirkt der Bandpassfilter die Aufteilung des Detektionslichts auf verschiedene Detektionskanäle. So ist es z.B. denkbar, dass neben dem Detektionslicht, das Licht aus einem Second-Harmonic-Prozess beinhaltet, auch Licht aus einem Zweiphotonenanregungsprozess simultan detektierbar ist.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsvariante ist das Rastermikroskop als konfokales Rastermikroskop ausgestaltet.

In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben, wobei gleich wirkende Elemente mit denselben Bezugszeichen versehen sind. Dabei zeigen:
1 einen Teil eines erfindungsgemäßen Rastermikroskops,
2 eine Variante eines erfindungsgemäßen Rastermikroskops,
3 eine weitere Variante eines erfindungsgemäßen Rastermikroskops, und
4 einen Teil eines weiteren erfindungsgemäßen Rastermikroskops.
1 zeigt den erfindungswesentlichen Teil eines Rastermikroskops. Das von einer nicht gezeigten Lichtquelle kommende Beleuchtungslicht 1 wird von einem Objektiv 3 auf eine Probe 5 fokussiert, die auf einem Deckglas 7 positioniert ist. Das von der Probe ausgehende Detektionslicht 9 wird von einem Kondensor 11 zu einem Detektionslichtstrahl 13 kollimiert, der von dem Spiegel 15 über die Optiken 17 und 19 zu dem Detektor 21 gelenkt wird, der als Photomultiplier 23 ausgeführt ist. Im Lichtweg des Detektionslichtes 13 befindet sich ein Bandpassfilter 25, der einen Kurzpassfilter 27 und einen Langpassfilter 29 beinhaltet. Der Kurzpassfilter 27 und der Langpassfilter 29 sind als spektrale Verlaufsfilter ausgeführt, die senkrecht zur Ausbreitungsrichtung des Detektionslichtstrahls 13 zueinander verschiebbar sind, um die untere und die obere Grenze des Bandpassfilters einzustellen.
2 zeigt eine Variante, bei der das von der Probe ausgehende Detektionslicht zum Transport zum Non-Descan-Detektor 21 in eine Lichtleitfaser 31 eingekoppelt wurde. Zur Auskopplung des Detektionslichts 9 aus der Lichtleitfaser 31 sind die Auskoppeloptiken 33, 35, vorgesehen. Der ausgekoppelte kollimierte Detektionslichtstrahl 13 wird von einem dichroitischen Strahlteiler in zwei Detektionskanäle 39, 41 spektral aufgeteilt. Jeder der Detektionskanäle 39, 41 beinhaltet einen Photomultiplier 23, vor denen jeweils ein Bandpassfilter 25 positioniert ist. Mit Hilfe des dichroitischen Strahlteilers 37 wird eine spektrale Vorselektion vorgenommen, während die spektrale Feineinstellung mit den Bandpassfiltern 25 ermöglicht ist.
3 zeigt eine Variante, bei der der Detektionslichtstrahl 13 von dem Bandpassfilter 25 selbst in einen ersten Detektionskanal 39 und einen zweiten Detektionskanal 41 aufgeteilt wird. Der Teil des Detektionslichtstrahls 13, der den Langpassfilter 29 nicht passiert, wird zum ersten Detektor 43 reflektiert, während der den Bandpassfilter 25 passierende Anteil auf den zweiten Detektor 45 trifft.
4 zeigt den erfindungswesentlichen Teil eines weiteren erfindungsgemäßen Rastermikroskops das einen Gradienten-Interterenzfilter 47 beinhaltet. Der Gradienten-Interferenzfilter 47 bildet in Zusammenwirkung mit der ersten Blende 49 einen Kurzpassfilter 27 und in Zusammenwirkung mit der zweiten Blende 51 einen Langpassfilter. Die Sperrbereiche des Kurzpass und des Langpassfilters sind durch verschieben der ersten Blende 49 bzw. der zweiten Blende 51 relativ zum Gradienten-Interferenzfilter 47 ermöglicht, wie durch die Doppelpfeile angedeutet ist.
Die Erfindung wurde in Bezug auf eine besondere Ausführungsform beschrieben. Es ist jedoch selbstverständlich, dass Änderungen und Abwandlungen durchgeführt werden können, ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.

1: Beleuchtungslicht
3: Objektiv
5: Probe
7: Deckglas
9: Detektionslicht
11: Kondensor
13: Detektionslichtstrahl
15: Spiegel
17: Optik
19: Optik
21: Detektor
23: Photomultiplier
25: Bandpassfilter
27: Kurzpassfilter
29: Langpassfilter
31: Lichtleitfaser
33: Auskoppeloptik
35: Auskoppeloptik
37: dichroitischer Strahlteiler
39: Detektionskanal
41: Detektionskanal
43: erster Detektor
45: zweiter Detektor

Claims

Rastermikroskop mit einem Non-Descan-Detektor zur Detektion des von einer Probe ausgehenden Detektionslichtes, dadurch gekennzeichnet, dass im Lichtweg des Detektionslichtes ein Bandpassfilter vorgesehen ist, der eine Kombination aus mindestens einem Kurzpassfilter und mindestens einem Langpassfilter beinhaltet.
Rastermikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Kurzpassfilter und/oder der Langpassfilter ein spektraler Verlaufsfilter ist.
Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Kurzpassfilter und/oder der Langpassfilter ein dielektrischer Filter ist.
Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Kurzpassfilter und/oder der Langpassfilter einen Gradienten-Interferenzfilter oder einen Verlaufsfilter beinhaltet.
Rastermikroskop nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest eine verschiebbare Blende vorgesehen ist, deren relative Position zum Gradienten-Interferenzfilter bzw. zum Verlaufsfilter den Sperrbereich des Kurzpass- und/oder des Langpassfilters definiert.
Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Kurzpassfilter und/oder der Langpassfilter relativ zueinander verdrehbar und/oder verschiebbar sind.
Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe über einen Mehrphotonenprozess anregbar ist.
Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Erzeugung des Detektionslichtes in der Probe einen SHG-Prozess (second-harmonic generation)umfasst.
Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass zur Erzeugung des Beleuchtungslichtes eine Pulslichtquelle, insbesondere ein Pulslaser, vorgesehen ist.
Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass Lichtweg des Detektionslichtes mehrere Detektionskanäle umfasst.
Rastermikroskop nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass in mehreren Detektionskanälen Bandpassfilter vorgesehen sind.
Rastermikroskop nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Bandpassfilter die Aufteilung der Detektionskanäle bewirkt.
Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Rastermikroskop ein konfokales Rastermikroskop ist.
Verfahren zur Rastermikroskopie an einer Probe gekennzeichnet durch folgende Schritte: • Ermitteln einer Beleuchtungslichtfrequenz bei der in der Probe Detektionslicht erzeugbar ist, das die Frequenz einer Harmonischen der Beleuchtungslichtfrequenz aufweist, • Beleuchten der Probe mit Beleuchtungslicht der ermittelten Beleuchtungslichtfrequenz, • Ausblenden der Lichtanteile, die die Frequenz des Beleuchtungslichtes und/oder die die Frequenz von Autofluoreszenzlicht aufweisen, aus dem von der Probe ausgehendem Detektionslicht mit einem im Lichtweg des Detektionslichtes angeordneten Bandpassfilter, der eine Kombination aus einem Kurzpaß- und mindestens einem Langpassfilter beinhaltet und • Detektieren des gefilterten Detektionslichtes mit einem Non-Descan-Detektor.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Kurzpassfilter und/oder der Langpassfilter ein spektraler Verlaufsfilter ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Kurzpassfilter und/oder der Langpassfilter ein dielektrischer Filter ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Kurzpassfilter und/oder der Langpassfilter einen Gradienten-Interferenzfilter oder einen Verlaufsfilter beinhaltet.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest eine verschiebbare Blende vorgesehen ist, deren relative Position zum Gradienten-Interterenzfilter bzw. zum Verlaufsfilter den Sperrbereich des Kurzpass- und/oder des Langpassfilters definiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Kurzpassfilter und/oder der Langpassfilter relativ zueinander verdrehbar und/oder verschiebbar sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe über einen Mehrphotonenprozess anregbar ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass eine durchstimmbare Lichtquelle zur Erzeugung des Beleuchtungslichtes vorgesehen ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass zur Erzeugung des Beleuchtungslichtes eine Pulslichtquelle, insbesondere ein Pulslaser, vorgesehen ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass Lichtweg des Detektionslichtes mehrere Detektionskanäle umfasst.
Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass in mehreren Detektionskanälen Bandpassfilter vorgesehen sind.
Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass der Bandpassfilter die Aufteilung der Detektionskanäle bewirkt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass zur Durchführung ein konfokales Rastermikroskop verwendet wird.