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Die Erfindung betrifft ein Mikroskop gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1, sowie ein entsprechendes Verfahren.
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Aus dem Stand der Technik sind ein Mikroskop und ein Mikroskopierverfahren bekannt, mittels denen innerhalb einer Probe befindliche Bereiche abgebildet werden können (Levene, M. J. et al., 2004: In vivo multiphoton microscopy of deep brain tissue; Journal of Neurophysiology 91: 1908 - 1912; Chia, T. H. & Levene, M. J., 2009: Microprisms for in vivo multilayer cortical imaging; Journal of Neurophysiology 102: 1310 - 1314). Eine schematische und auf die wesentlichen Elemente reduzierte Darstellung eines solchen Mikroskops aus dem Stand der Technik ist in der 1 angegeben.
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Ein kleines Umlenkprisma 8, beispielsweise ein 45°-Umlenkprisma, wird so in die Probe 11 gedrückt (1), dass eine erste Seitenfläche 8.1 des Umlenkprismas 8 zu einem Objektiv 6 des Mikroskops 1 hin weist und eine Beleuchtungsstrahlung 3 an der Hypotenuse 8.3 des Umlenkprismas 8 um 90° abgelenkt wird. Die Beleuchtungsstrahlung 3 wird durch eine zweite Seitenfläche 8.2 des Umlenkprismas 8 in einen Fokuspunkt 9 gerichtet, der außerhalb des Umlenkprismas 8 liegt. Ist das Umlenkprisma 8 in die Probe 11 gedrückt, liegt der Fokuspunkt 9 daher innerhalb der Probe 11.
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Wird das Objektiv 6 mittels eines Piezoantriebs 7 in Z-Richtung verfahren, wird der Fokuspunkt 9 in X-Richtung verschoben. Wird der Beleuchtungsstrahl bzw. das ganze Mikroskop inkl. Objektiv, aber ohne Prisma, in X-Richtung verfahren, wird der Fokuspunkt 9 in Z-Richtung verschoben.
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Auf diese Weise ist es in vivo möglich, tiefer gelegene Bereiche der Probe 11, beispielsweise eines lebenden Gewebes zu untersuchen, als dies mit konventionellen Mikroskopen, insbesondere mit konventionellen nicht-linearoptischen Anordnungen (Zweiphotonenmikroskopie bzw. NLO-Anordnung) möglich ist. Die Tiefe der abbildbaren Bereiche, d.h. die Ausdehnung der Fokusebene 10, in der Probe 11 hängt in einer solchen Anordnung nur vom Bildfeld des verwendeten Objektivs 6 ab und ist nicht wie in konventionellen Top-View-Anordnungen durch Streuung, Absorption und nichtlineare Dispersion limitiert.
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Nachteilig an dieser Methode ist, dass aufgrund der Größe des Umlenkprimas 8 nur (Nicht-Immersions-)Objektive mit relativ großem Arbeitsabstand und kleiner Numerischer Apertur (NA) verwendbar sind Zudem ist die Kontrolle der Lage und Orientierung des Umlenkprismas 8 schwierig.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein gegenüber dem Stand der Technik verbessertes Mikroskop vorzuschlagen. Außerdem liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein gegenüber dem Stand der Technik verbessertes Mikroskopierverfahren vorzuschlagen.
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Die Aufgabe wird hinsichtlich des Mikroskops durch die Merkmale des Anspruchs 1 gelöst. Hinsichtlich des Mikroskopierverfahrens wird die Aufgabe durch die Merkmale des Anspruchs 10 gelöst.
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Vorteilhafte Ausgestaltungen finden sich in den abhängigen Ansprüchen.
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Das Mikroskop umfasst in einem Beleuchtungsstrahlengang eine Lichtquelle zur Bereitstellung einer Beleuchtungsstrahlung, einen Scanner zur gesteuerten Auslenkung der Beleuchtungsstrahlung, ein Objektiv zum Fokussieren der Beleuchtungsstrahlung in ein Umlenkprisma, ein optisches Element zum Auskoppeln einer Detektionsstrahlung und eine Detektionseinheit zur Erfassung der Detektionsstrahlung.
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Ein erfindungsgemäßes Mikroskop ist dadurch gekennzeichnet, dass das Objektiv und das Umlenkprisma miteinander kraft-, form-, und/oder stoffschlüssig miteinander verbunden sind, wobei der Arbeitsabstand des Objektivs derart gewählt ist, dass der Fokuspunkt außerhalb des Umlenkprismas liegt. Weiterhin ist in dem Beleuchtungsstrahlengang ein mindestens entlang des Beleuchtungsstrahlengangs bewegliches optisches Element, beispielsweise eine Kollimationslinse, angeordnet.
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Das Objektiv und das Umlenkprisma sind infolge der kraft-, form-, und/oder stoffschlüssig Verbindung relativ zueinander wenigstens in Z-Richtung fixiert. Die Z-Richtung ist die Richtung der optischen Achse des Objektivs.
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Die Verbindung von Objektiv und Umlenkprisma ist beispielsweise durch Verbindungselemente wie, jeweils eine oder mehrere, Streben, Stege, Profile, Hülsen gebildet. Die Verbindung ist in weiteren Ausführungen durch Kleben, optional kombiniert mit Verbindungselementen, realisiert.
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Es wurde erkannt, dass sich die aus dem Stand der Technik bekannten Nachteile durch die Verwendung eines fest mit dem Objektiv verbundenen Umlenkprismas in Kombination mit einem im Beleuchtungsstrahlengang befindlichen, veränderbaren optischen Element, beispielsweise mit einem Kollimator, zur Einstellung des Fokuspunkts der Beleuchtungsstrahlung und zu dessen Führung in der Fokusebene lösen lassen.
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Durch die Verwendung des beweglichen optischen Elements im Beleuchtungsstrahlengang als fokussierendes Element ist eine Einstellung der Fokusebene ermöglicht.
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Beispielsweise kann bei Zweiphotonen- oder NLO-Messungen mittels eines Laserscanningmikroskops (LSM) auf die Lochblende (Pinhole) verzichtet und ein sogenannter NDD-Detektor (non-descanned-detector, NDD) als Detektionseinheit verwendet werden.
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Bei Nutzung eines NDD-Detektors stört eine Fokussierung über die Änderung des Beleuchtungsstrahlenganges nicht bei der Detektion. Ist beispielsweise ein fluoreszenzmikroskopisch zugängliches Volumen, fortan auch als Probenort bezeichnet, in einer konventionellen Top-View-Anordnung 1500X1500X250 µm (X-/Y-/Z-Richtung) groß, so ist unter den gleichen Bedingungen mit einem erfindungsgemäßen Mikroskop ein Volumen von 250X1500X1500 µm abbildbar.
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Damit der Fokuspunkt außerhalb des Umkehrprismas zu liegen kommt, muss der Arbeitsabstand des Objektivs genügend groß sein. Um eine hohe Auflösung und Sammeleffizienz zu erzielen, soll das Objektiv eine möglichst große NA aufweisen. Üblicherweise bedingt eine große NA aber einen kleinen Arbeitsabstand.
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Diese Diskrepanz wird vorteilhaft mit einer Ausführung des Mikroskops gelöst, bei dem das Umlenkprisma direkt als Teil des Objektivs ausgeführt ist. Das Umlenkprisma und das Objektiv sind in einer solchen Ausführung Bestandteile eines gemeinsamen optischen Elements.
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Während der Konstruktion des Objektivs, insbesondere während der Optikrechnung, wird die Umlenkung durch das Umlenkprisma berücksichtigt, wobei die letzte Linse des Objektivs hinter dem Umlenkprisma und vor der Probe angeordnet oder ausgebildet ist. Eine Objektivlinse des Objektivs ist in Beleuchtungsrichtung nach einer dem Objektiv abgewandten Seitenfläche des Umlenkprismas vorhanden. Die Objektivlinse ist der Seitenfläche vorgesetzt ausgebildet. Eine Seitenfläche ist dem Objektiv abgewandt, wenn diese mit der optischen Achse des Objektivs einen Winkel von 45° einschließt.
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In einer weiteren möglichen Ausführung des Mikroskops ist eine Objektivlinse des Objektivs an und/oder in einer dem Objektiv abgewandten Seitenfläche des Umlenkprismas ausgebildet.
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Beispielsweise ist eine als Austrittsfläche des Umlenkprismas dienende Seitenfläche direkt als Objektivlinse ausgebildet.
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Um das Eindringen des Umlenkprismas in die Probe zu erleichtern und/oder um eine Beschädigung der abzubildenden Bereiche der Probe durch mechanische Belastungen, insbesondere durch Zug- und/oder Druckbelastungen, zu reduzieren oder gar zu vermeiden, ist in einer weiteren Ausführung eine dem Objektiv abgewandte Kante, an der mindestens zwei Seitenflächen des Umlenkprismas aneinanderstoßen, als eine Schneide ausgebildet.
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Die Schneide ist in einer weiteren möglichen Ausführung durch eine Verlängerung mindestens einer der Seitenflächen über die Kante hinaus gebildet. Der über die Kante hinausragende Abschnitt der Seitenflächen kann in weiteren Ausführungen sich beispielsweise verjüngend und/oder gebogen ausgebildet sein.
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Das Umlenkprisma kann ein 45°-Prisma, ein Amici roof-Prisma oder ein Schmidt-Prisma sein. Außerdem sind weitere Prismenformen möglich. So können Umlenkprismen verwendet sein, mittels denen die Beleuchtungsstrahlung unter einem anderen Winkel als 90° abgelenkt und in den Fokuspunkt gerichtet wird.
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Außerdem können die Kanten solcher Umlenkprismen durch Seitenflächen gebildet sein, die unter einem Winkel kleiner als 45° zusammenstoßen, wodurch schärfere Schneiden erhalten werden.
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Um ein Einschneiden des Umlenkprismas in die Probe zu unterstützen, sind in weiteren Ausführungen des erfindungsgemäßen Mikroskops Mittel zur Erzeugung einer Relativbewegung zwischen dem Umlenkprisma und der Probe vorhanden. Der Probenort ist dabei zur Anordnung einer mittels des Mikroskops abzubildenden Probe ausgebildet.
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Die Mittel zur Erzeugung der Relativbewegung sind beispielsweise das mit einem Antrieb, beispielsweise mit einem Piezoantrieb, versehene Objektiv und/oder ein in mindestens einer Ebene beweglicher, den Probenort umfassender, Tisch.
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Die Mittel sind mit einer Frequenz von vorteilhaft mindestens 5 Hz, beispielsweise mit 10 Hz, in mindestens einer Raumrichtung, X-, Y- und/oder Z-Richtung, schwingend beweglich. Eine Frequenz von etwa 5 Hz oder mehr unterstützt die Schneidwirkung.
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Ein wichtiger Bestandteil des Mikroskops ist durch die Anordnung des Objektivs und des Umlenkprismas gegeben, bei der das Objektiv und das Umlenkprisma miteinander kraft-, form-, und/oder stoffschlüssig derart miteinander verbunden sind, dass diese in Z-Richtung relativ zueinander fixiert sind und wobei der Arbeitsabstand des Objektivs derart gewählt ist, dass der Fokuspunkt außerhalb des Umlenkprismas liegt.
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Dieses Anordnung, die auch als side-view-Objektiv bezeichnet werden kann, ist kompatibel mit Mikroskopen, wie diese aus dem Stand der Technik bekannt und lässt sich in diese integrieren. Neben der Möglichkeit der Nachrüstung vorhandener Mikroskope ist von Vorteil, dass keine zusätzliche externe Halterung für das Umlenkprisma erforderlich ist. Das Objektiv und das Umlenkprisma können vorteilhaft gemeinsam so verbunden sein, dass Verunreinigungen wie Gewebeflüssigkeit nicht zwischen Objektiv und Umlenkprisma gelangen können. Ferner ist bei der Anordnung eine hohe NA und ein großes Bildfeld bei kleinem Arbeitsabstand erreichbar.
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Es ist vorteilhaft möglich, bei einer erfindungsgemäßen Anordnung Immersionsobjektive zu verwenden.
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Die Anordnung von Objektiv und Umlenkprisma (side-view Objektiv) ist primär für Zweiphotonenmikroskopie einsetzbar.
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Die Aufgabe wird ferner durch ein Mikroskopierverfahren gelöst, das zur Erfassung von Bildern von unter einer Materialoberfläche liegenden Bereichen einer Probe dient. Zur Ausführung des Mikroskopierverfahrens wird ein erfindungsgemäßes Mikroskop in einer der oben genannten Ausführungen verwendet. In dem Mikroskopierverfahren wird eine abzubildende Probe an dem Probenort platziert, das Umlenkprisma eine vorbestimmte Strecke in das Material eingedrückt oder eingestochen, die Beleuchtungsstrahlung in den Fokuspunkt gerichtet und mittels des Scanners der Fokuspunkt über abzubildende Bereiche der Probe geführt und von der Probe erhaltene Detektionsstrahlung entlang des Detektionsstrahlengangs geführt und erfasst.
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Die Vorteile des erfindungsgemäßen Mikroskops beziehungsweise des erfindungsgemäßen Mikroskopierverfahrens liegen darin, dass der mechanische und damit auch der optische Aufbau des Mikroskops, insbesondere der Einheit von Objektiv und Umlenkprisma, stabiler sind als dies bei einer getrennter Anordnung von Umlenkprisma und Objektiv der Fall ist. Außerdem ist die Bedienung des Mikroskops sowie die Verfahrensdurchführung erleichtert, da Objektiv und Umlenkprisma immer gemeinsam verfahren werden, beispielsweise wenn eine zweite Probenstelle untersucht werden soll.
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Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen und Abbildungen näher erläutert. Es zeigen:
- 1 eine schematische Darstellung eines Mikroskops gemäß dem Stand der Technik,
- 2 eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Mikroskops mit einem ersten Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Anordnung eines Objektivs und eines Umlenkprismas und
- 3 eine schematische Darstellung eines zweiten Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Mikroskops und eines zweiten Ausführungsbeispiels einer Anordnung eines Objektivs und eines Umlenkprismas.
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Die in den nachfolgend beschriebenen Abbildungen verwendeten Bezugszeichen bezeichnen jeweils gleich technische Elemente.
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In der 1 ist ein Mikroskop 1 gemäß dem Stand der Technik dargestellt. Ein Objektiv 6 und ein Umlenkprisma 8 sind in Z-Richtung Z, also in Richtung der optischen Achse des Objektivs 6, nicht miteinander verbunden, so dass das Objektiv 6 unabhängig von dem Umlenkprisma 8 mittels eines Objektivantriebs 7 in Z-Richtung Z verstellbar ist.
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Ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Mikroskops 1 ist in der 2 dargestellt. Mittels einer Lichtquelle 2 ist eine Beleuchtungsstrahlung 3 bereitgestellt beziehungsweise bereitstellbar. Die Beleuchtungsstrahlung 3 ist mittels einer Linse 4 in Beleuchtungsrichtung entlang eines Beleuchtungsstrahlengangs auf ein entlang des Beleuchtungsstrahlengangs bewegliche optisches Element 13 in Form einer Linse gerichtet. Durch die beiden Linsen 4 und 13 (optisches Element 13) ist ein einstellbarer Kollimator gebildet.
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Um eine Bewegung des optischen Elements 13 entlang des Beleuchtungsstrahlengangs gesteuert zu ermöglichen, steht das optische Element 13 mit einem Antrieb 13.1 in Verbindung, der durch eine Steuereinheit 14 ansteuerbar ist.
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In dem Beleuchtungsstrahlengang ist nach dem optischen Element 13 ein Scanner 5 angeordnet, durch den die Beleuchtungsstrahlung 3 gesteuert in einer X-Richtung und/oder einer Y-Richtung auslenkbar ist. Der Scanner 5 ist ebenfalls durch die Steuereinheit 14 ansteuerbar.
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Die ausgelenkte oder auslenkbare Beleuchtungsstrahlung 3 ist mittels des Scanners 5 auf das Objektiv 6 gerichtet und wird durch dieses in das Umlenkprisma 8 gerichtet, das als ein 45°-Umlenkprisma ausgeführt ist.
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Das Objektiv 6 und das Umlenkprisma 8 sind in einem ersten Ausführungsbeispiel einer Anordnungen von Objektiv 6 und Umlenkprisma 8 mittels Verbindungselementen 12 in X-, Y- und Z-Richtung X, Y, Z fixiert. Die Z-Richtung Z fällt mit der optischen Achse des Objektivs 6 zusammen.
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Die Beleuchtungsstrahlung 3 tritt über die erste Seitenfläche 8.1 in das Umlenkprisma 8 ein, wird an der Innenseite der als Hypotenuse 8.3 bezeichneten Seitenfläche in X-Richtung X reflektiert, tritt durch die zweite Seitenfläche 8.2 aus dem Umlenkprisma 8 aus und ist in den Fokuspunkt 9 einer ersten Fokusebene 10.1 fokussiert.
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Die zweite Seitenfläche 8.2 und die Hypotenuse 8.3 stoßen an einer dem Objektiv 6 abgewandten Kante unter einem Winkel von 45° zusammen und bilden eine Schneide 18, mittels der das Umlenkprisma 8 in die Probe 11 schneidet, während es in diese gedrückt wird.
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In der 2 ist das Mikroskop 1 in einem Betriebszustand dargestellt, bei dem das optische Element 13 in einer ersten Position P1 eingestellt ist, so dass der Fokuspunkt 9 in der ersten Fokusebene 10.1 liegt. Um den Fokuspunkt 9 in eine weitere Fokusebene 10n zu fokussieren, die hier durch eine vertikale Strichlinie angedeutet ist, ist das optische Element 13 mittels des Antriebs 13.1 in eine zweite Position P2 verstellbar.
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An dem Fokuspunkt 9 reflektierte Beleuchtungsstrahlung 3 und/oder infolge einer Anregung durch die Beleuchtungsstrahlung 3 emittierte Strahlung, beispielsweise Fluoreszenzstrahlung, gelangt als Detektionsstrahlung 15 durch die zweite Seitenfläche 8.2 in das Umlenkprisma 8, wird an der Hypotenuse 8.3 in Z-Richtung Z reflektiert und gelangt durch das Objektiv 6 zu einem Element zur Auskopplung der Detektionsstrahlung 15, das nachfolgend als Auskoppelelement 17 bezeichnet wird. Das Auskoppelelement 17 ist zur Auskopplung der Detektionsstrahlung 15 ausgebildet und im Ausführungsbeispiel durch einen dichroitischen Spiegel realisiert.
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Die Probe 11 wird mit einem fokussierten Strahl der Beleuchtungsstrahlung 3 einer Wellenlänge zwischen ca. 680 nm und 1300 nm angeregt. In der Probe 11 findet dann eine nichtlineare Frequenzverdopplung statt, die entweder direkt als Signal mittels der Detektionsstrahlung 15 detektiert wird (second harmonic generation, SHG), oder die dann einen Farbstoff zur Emission von Fluoreszenzlicht anregt.
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Das Auskoppelelement 17 ist derart ausgebildet und derart in dem Beleuchtungsstrahlengang angeordnet, dass dieses von der Beleuchtungsstrahlung 3 durchdrungen wird. Dagegen ist auf das Auskoppelelement 17 auftreffende Detektionsstrahlung 15 auf eine Detektionseinheit 16, die als ein NDD-Detektor ausgebildet ist, reflektierbar. Die Detektionsstrahlung 15 durchläuft von dem Fokuspunkt 9 bis zur Detektionseinheit 16 einen Detektionsstrahlengang.
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Mittels der Detektionseinheit 16 ist die erfasste Detektionsstrahlung 15 einem Erfassungszeitpunkt und/oder einem durch Koordinaten bestimmten Fokuspunkt 9 zugeordnet als Messwerte abspeicherbar. Die Koordinaten sind beispielsweise durch die zu einem Erfassungszeitpunkt eingestellten Auslenkungen der Beleuchtungsstrahlung 3 durch den Scanner 5 sowie durch eine zum Erfassungszeitpunkt vorliegende Position P1, P2 des nicht-linearen optischen Elements 13 ermittelbar. Optional kann eine Korrektur beispielsweise hinsichtlich der Laufzeiten von Beleuchtungsstrahlung 3 und/oder Detektionsstrahlung 15 vorgesehen sein.
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Die erfassten Messwerte sind der Steuereinheit 14 und/oder einer nicht dargestellten Auswerteeinheit, die in die Steuereinheit 14 integriert sein kann, übermittelt oder die erfassten Messwerte sind durch die Steuereinheit 14 und/oder die Auswerteeinheit abrufbar.
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Die Probe 11 ist auf einem Tisch 21 an einem Probenort 22 aufgelegt, der mittels eines nicht dargestellten Antriebs in jede der Richtungen X, Y und Z verfahrbar ist.
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In weiteren Ausführungen ist der Tisch 21 in mindestens einer der Richtungen X, Y und Z mit einer Frequenz von mindestens 5 Hz schwingend beweglich. Der Antrieb des Tisches 21 ist optional als Mittel zur Erzeugung einer Relativbewegung zwischen Umlenkprisma 8 und Probenort 22 ausgebildet.
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In der 3 ist als ein zweites Ausführungsbeispiel der Anordnung des Objektivs 6 und des Umlenkprismas 8 ein Objektiv 6 umfassend weitere Objektivlinsen 19 sowie eine Objektivlinse 20 dargestellt, die in der zweiten Seitenfläche 8.2 des Umlenkprismas 8 ausgebildet ist. In dieser Ausführung wirken das Objektiv 6 und das Umlenkprisma 8 zusammen und erfüllen die Objektivfunktion.
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In weiteren Ausführungen ist die Objektivlinse 20 anders gestaltet, beispielsweise konvex, plan-konvex, plan-konkav, bikonkav oder bikonvex ausgebildet.
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Das Objektiv 6 und das Umlenkprisma 8 sind stoffschlüssig miteinander verbunden, insbesondere miteinander verklebt.
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Die Schneide 18 ist durch eine Verlängerung der zweiten Seitenfläche 8.2 über die Kante hinaus gebildet. Zusätzlich ist die zweiten Seitenfläche 8.2 in ihrem über die Kante hinaus verlängertem Abschnitt ausgekehlt, so dass eine besonders scharfe Schneide 18 geschaffen ist.
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Die Anordnung ist in einem zweiten Ausführungsbeispiel des Mikroskops 1 angeordnet. Dabei steht das Objektiv 6 mit einem Objektivantrieb 7, der als ein Piezoantrieb ausgebildet ist, in Verbindung und ist durch diesen in mindestens einer der Richtungen X, Y und Z beweglich und/oder mit einer Frequenz von mindestens 5 Hz schwingend beweglich, um die Wirkung der Schneide 18 zu unterstützen.
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Die aufgeführten Ausführungsbeispiele und Alternativen sind im Rahmen fachmännischen Handelns frei miteinander kombinierbar.
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Bezugszeichenliste
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- 1
- Mikroskop
- 2
- Lichtquelle
- 3
- Beleuchtungsstrahlung
- 4
- Linse
- 5
- Scanner
- 6
- Objektiv
- 7
- Objektivantrieb
- 8
- Umlenkprisma
- 8.1
- erste Seitenfläche
- 8.2
- zweite Seitenfläche
- 8.3
- Hypotenuse
- 9
- Fokuspunkt
- 10
- Fokusebene
- 10.1
- erste Fokusebene
- 10n
- weitere Fokusebene
- 11
- Probe
- 12
- Verbindungselemente
- 13
- optisches Element
- 13.1
- Antrieb
- 14
- Steuerungseinheit
- 15
- Detektionsstrahlung
- 16
- Detektionseinheit
- 17
- Auskoppelelement
- 18
- Schneide
- 19
- weitere Objektivlinse
- 20
- Objektivlinse
- 21
- Tisch
- 22
- Probenort
- P1
- erste Position
- P2
- zweite Position
