JP6625696B2 - マルチビュー・ライトシート顕微鏡検査法 - Google Patents

マルチビュー・ライトシート顕微鏡検査法 Download PDF

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Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１３年１０月９日に出願された米国仮出願第６１／８８８，８６９号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
開示されている主題は、生物試料（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｐｅｃｉｍｅｎ）のライブイメージング（ｌｉｖｅ ｉｍａｇｉｎｇ）に関する。
複雑な生物試料の発達及び機能を理解することは、顕微鏡規模で高速の空間時間的力学を記録し定量化する我々の能力に危険なほど頼っている。空間分解能と時間分解能と光損傷との基本的な兼ね合いにより、生物学的ライブイメージングにおける実践的手法は、大きい試料の観察を小さい機能サブユニットに縮小し、これらを一度に１つずつ検討することであった。
いくつかの一般的な態様では、生きている生物試料をイメージングする方法は、１つ以上の第１のライトシート（ｌｉｇｈｔ ｓｈｅｅｔ）を生成することと、生成された１つ以上の第１のライトシートが第１の画像平面（ｉｍａｇｅ ｐｌａｎｅ）において生物試料の少なくとも一部分と光学的に相互作用するように第１の照射軸（ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ ａｘｉｓ）と平行なそれぞれの経路に沿って１つ以上の第１のライトシートを誘導することと、複数の第１のビューのそれぞれにおいて、生物試料から第１の検出軸（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｘｉｓ）に沿って放出された蛍光の画像を記録することを含む。この方法は、１つ以上の第２のライトシートを生成することと、生成された１つ以上の第２のライトシートが第２の画像平面において生物試料の少なくとも一部分と光学的に相互作用するように第２の照射軸と平行なそれぞれの経路に沿って１つ以上の第２のライトシートを誘導することであって、第２の照射軸が第１の照射軸と平行ではないことと、複数の第２のビューのそれぞれにおいて、生物試料から第２の検出軸に沿って放出された蛍光の画像を記録することを含む。
実現例は以下の特徴のうちの１つ以上を含むことができる。例えば、１つ以上の第１のライトシートは、２つの第１の光源ユニット（ｌｉｇｈｔ ｓｏｕｒｃｅ ｕｎｉｔ）を活動化して２つの第１のライトシートを生成することによって生成することができ、生成された１つ以上の第１のライトシートは、互いに平行であるが互いに反対方向を指しているそれぞれの経路に沿って、生成された２つの第１のライトシートを誘導することにより、生物試料を通って第１の照射軸と平行なそれぞれの経路に沿って誘導することができる。生成された２つの第１のライトシートは第１の画像平面に沿って生物試料内で空間的かつ時間的にオーバラップすることができる。生成された第１のライトシートの時間的オーバラップは、顕微鏡の空間分解能限界に対応する分解能時間より小さいタイムシフト内である。タイムシフト中に生物試料の追跡された構造物における空間的変位（ｓｐａｔｉａｌ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）は顕微鏡の空間分解能限界より小さくすることができる。
１つ以上の第２のライトシートは、２つの第２の光源ユニットを活動化して２つの第２のライトシートを生成することによって生成することができ、生成された１つ以上の第２のライトシートは、互いに平行であるが互いに反対方向を指しているそれぞれの経路に沿って、生成された２つの第２のライトシートを誘導することにより、生物試料を通って第２の照射軸と平行なそれぞれの経路に沿って誘導することができる。生成された２つの第２のライトシートは第２の画像平面に沿って生物試料内で空間的かつ時間的にオーバラップすることができる。生成された第２のライトシートの時間的オーバラップは、顕微鏡の空間分解能限界に対応する分解能時間より小さいタイムシフト内にすることができる。タイムシフト中に生物試料の追跡された構造物における空間的変位は顕微鏡の空間分解能限界より小さくすることができる。
第１のビューのそれぞれは第１の照射軸に垂直にすることができ、第２のビューのそれぞれは第２の照射軸に垂直にすることができる。
１つ以上の第１のライトシートを生成することは１つ以上のそれぞれの第１の光源ユニットを活動化することを含むことができ、１つ以上の第２のライトシートを生成することは１つ以上のそれぞれの第２の光源ユニットを活動化することを含むことができる。この方法は、１つ以上の第２の光源ユニットを活動化しながら１つ以上の第１の光源ユニットを非活動化することと、１つ以上の第１の光源ユニットを活動化しながら１つ以上の第２の光源ユニットを非活動化することを含むことができる。１つ以上の第１のライトシート及び１つ以上の第２のライトシートは同じ波長にすることができる。
また、この方法は、１つ以上の第２の光源ユニットを活動化しながら１つ以上の第１の光源ユニットを活動化することも含むことができる。１つ以上の第１のライトシートは第１の波長にすることができ、１つ以上の第２のライトシートは第１の波長とは別個の第２の波長にすることができる。生物試料内の第１のタイプの構造物は第１の波長の光に応答して蛍光を発する第１の蛍光体（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）を含むことができ、生物試料内の第２のタイプの構造物は第２の波長の光に応答して蛍光を発する第２の蛍光体を含むことができる。
１つ以上の第１のライトシート及び１つ以上の第２のライトシートは同じ波長にすることができる。第１の検出軸に沿って放出された蛍光の画像は、第１の対物レンズ（ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）で蛍光を捕捉し、捕捉された蛍光を対物レンズから第１の対物レンズの焦平面（ｆｏｃａｌ ｐｌａｎｅ）に配置されたアパーチャを通って誘導して焦点が合っていない蛍光の少なくとも一部分を遮断することによって記録することができる。第２の検出軸に沿って放出された蛍光の画像は、第２の対物レンズで蛍光を捕捉し、捕捉された蛍光を第２の対物レンズから第２の対物レンズの焦平面に配置されたアパーチャを通って誘導して焦点が合っていない蛍光の少なくとも一部分を遮断することによって記録することができる。
第１の検出軸に沿って放出された蛍光の画像は、第１の対物レンズで蛍光を捕捉し、捕捉された蛍光を対物レンズから蛍光の画像を記録する第１のカメラに誘導することによって記録することができ、第２の検出軸に沿って放出された蛍光の画像は、第２の対物レンズで蛍光を捕捉し、捕捉された蛍光を第２の対物レンズから蛍光の画像を記録する第２のカメラに誘導することによって記録することができる。
生成された第１のライトシートのそれぞれは互いに異なる偏光状態（ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｓｔａｔｅ）を有することができ、生成された第２のライトシートのそれぞれは互いに異なる偏光状態を有することができる。
この方法は、１つ以上の第１のライトシートの生成中に、生物試料の少なくとも一部分に及ぶ１組の第１の画像平面に沿って１つ以上の第１のライトシートが生物試料と光学的に相互作用するように、増分ステップ（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ ｓｔｅｐ）により、生物試料、１つ以上の第１のライトシート、及び蛍光が記録される第１のビューのうちの１つ以上を、第１の照射軸と垂直な第１の線形軸（ｌｉｎｅａｒ ａｘｉｓ）に沿って互いに対して並進させる（ｔｒａｎｓｌａｔｅ）ことと、それぞれの第１の画像平面について、生物試料によって生成された蛍光を第１のビューにおいて記録することを含むことができる。生物試料、１つ以上の第１のライトシート、及び第１の記録ビューのうちの１つ以上は、生物試料の位置を維持し、１つ以上の第１のライトシート及び第１の記録ビューを第１の線形軸に沿って並進させることにより、増分ステップにより第１の線形軸に沿って互いに対して並進させることができる。この方法は、１つ以上の第２のライトシートの生成中に、生物試料の少なくとも一部分に及ぶ１組の第２の画像平面に沿って１つ以上の第２のライトシートが生物試料と光学的に相互作用するように、増分ステップにより、生物試料、１つ以上の第２のライトシート、及び蛍光が記録される第２のビューのうちの１つ以上を、第２の照射軸と垂直な第２の線形軸に沿って互いに対して並進させることと、それぞれの第２の画像平面について、生物試料によって生成された蛍光を第２のビューにおいて記録することを含むことができる。この方法は、第１及び第２のビューにおいて記録された蛍光の画像を位置合わせすることにより生物試料の画像を作成することと、マルチビュー・デコンボリューション・アルゴリズム（ｍｕｌｔｉｖｉｅｗ ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を使用して、位置合わせされた画像を結合することを含むことができる。
この方法は、記録に基づいて生物試料内の構造物を追跡することを含むことができ、構造物を追跡することは、第１及び第２のビューにおいて記録された蛍光の画像を作成することと、位置合わせされた画像を結合することを含む。
第１のビューにおいて記録することは、照射軸に垂直な検出軸に沿って記録することを含むことができる。
そのそれぞれの検出軸に沿って取られたライトシートのそれぞれの最小厚さは、イメージングすべき試料内の構造物の断面サイズより小さくすることができる。
第２の照射軸は第１の照射軸と垂直にすることができる。
蛍光は、１つ以上の第１のライトシートが生物試料と光学的に相互作用した後又は相互作用している間に第１の検出軸に沿って放出することができ、蛍光は、１つ以上の第２のライトシートが生物試料と光学的に相互作用した後又は相互作用している間に第２の検出軸に沿って放出することができる。
第１の照射軸及び第２の照射軸は生物試料内で空間的にオーバラップすることができる。
ライトシートは、レーザ・ライトシートを生成することによって生成することができる。
ライトシートは、第１の交軸（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ ａｘｉｓ）に垂直な第２の交軸より第１の交軸に沿ってより長い空間プロファイルを有する光のシートを形成することによって生成することができ、これらの交軸はライトシートの伝搬の方向に垂直である。１つ以上の第１のライトシートの第２の交軸は第１の検出軸と平行にすることができ、１つ以上の第２のライトシートの第２の交軸は第２の検出軸と平行にすることができる。
それぞれの第１のライトシートは、第１の照射軸に対して横向きの方向に沿って第１の光源（ｌｉｇｈｔ ｓｏｕｒｃｅ）から放出された第１の光ビーム（ｌｉｇｈｔ ｂｅａｍ）をスキャンして第１のライトシートを生成することによって生成することができ、それぞれの第２のライトシートは、第２の照射軸に対して横向きの方向に沿って第２の光源から放出された第２の光ビームをスキャンして第２のライトシートを生成することによって生成することができ、第１のライトシートの第１の光ビームは生物試料内で第２のライトシートの第２の光ビームと交差しないようになっている。
生物試料から第１の検出軸に沿って放出された蛍光の画像は、複数の第１のビューのそれぞれにおいて、第１の検出軸に沿って生物試料内で蛍光体から放出された蛍光の画像を記録することによって記録することができ、複数の第２のビューのそれぞれにおいて、生物試料から第２の検出軸に沿って放出された蛍光の画像を記録することは、複数の第１のビューのそれぞれにおいて、第２の検出軸に沿って生物試料内で蛍光体から放出された蛍光の画像を記録することを含む。
生物試料によって生成された蛍光の画像は、生物試料によって生成された一光子蛍光を記録することによって記録することができる。１つ以上の第１のライトシートは、１つ以上の持続波の第１のライトシートを生成することによって生成することができ、１つ以上の第２のライトシートを生成することは、１つ以上の持続波の第２のライトシートを生成することを含む。
生物試料によって生成された蛍光の画像は、生物試料によって生成された二光子蛍光を記録することによって記録することができる。１つ以上の第１のライトシートは、１つ以上のパルス波の第１のライトシートを生成することによって生成することができる。
その他の一般的な態様では、顕微鏡システム（ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｓｙｓｔｅｍ）は、生きている生物試料をイメージングするように構成される。この顕微鏡システムは、生物試料を受け入れるように構成された試料領域（ｓｐｅｃｉｍｅｎ ｒｅｇｉｏｎ）と、２つ以上の光学アーム（ｏｐｔｉｃａｌ ａｒｍ）とを含む。それぞれの光学アームは試料領域を横切る光路（ｏｐｔｉｃａｌ ｐａｔｈ）を有し、それぞれの光学アームは光源ユニットと検出ユニット（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｕｎｉｔ）とを含み、それぞれの光学アームは別個のアーム軸（ａｒｍ ａｘｉｓ）に沿って配置され、少なくとも２つのアーム軸は互いに平行ではない。それぞれの光源ユニットは、それぞれの照射軸に沿って試料領域に向かってライトシートを生成し誘導するように配置された１つの光源及び１組の照射光学装置（ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｖｉｃｅ）と、１つ以上の照射光学装置に結合された１組のアクチュエータとを含む。それぞれの検出ユニットは、照射軸のうちの１つ以上に垂直なそれぞれの検出軸に沿って試料領域内に受け入れた生物試料から放出された蛍光の画像を収集し記録するように配置された１つのカメラ及び１組の検出光学装置（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｖｉｃｅ）と、カメラ及び検出光学装置のうちの１つ以上に結合された１組のアクチュエータとを含む。それぞれの光学アームは、試料領域と光源ユニットと検出ユニットとの間の経路上にあって、光源ユニットと検出ユニットとの間の光学データを分離するように構成された光学データ分離装置（ｏｐｔｉｃａｌ ｄａｔａ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｐｐａｒａｔｕｓ）を含む。
実現例は以下の特徴のうちの１つ以上を含むことができる。例えば、顕微鏡システムは、試料領域、光源ユニット、及び検出ユニットのうちの１つ以上に結合され、試料領域内に受け入れた生物試料を回転させずに、試料領域、光源ユニット内のライトシート、及び検出ユニットのうちの１つ以上を線形軸に沿って互いに対して並進させるように構成された並進システム（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）を含むことができる。
この顕微鏡システムは、試料領域内に位置するようにその上に生物試料が装着される試料ホルダ（ｓｐｅｃｉｍｅｎ ｈｏｌｄｅｒ）を含むことができる。
少なくとも１つのコンポーネントは、それぞれの光学アームの光源ユニットと検出ユニットとの間で共用することができる。この少なくとも１つの共用コンポーネント（ｓｈａｒｅｄ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）は顕微鏡対物レンズ（ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）を含むことができる。少なくとも１つの共用コンポーネントは光学データ分離装置と試料領域との間に配置することができる。それぞれの光学アーム内の顕微鏡対物レンズは、他の光学アーム内の他の顕微鏡対物レンズと同じ焦平面を有することができる。この顕微鏡システムは、それぞれの光学アーム内の顕微鏡対物レンズとカメラとの間に配置されたアパーチャを含むことができる。
それぞれの検出ユニット内の顕微鏡対物レンズの視野（ｆｉｅｌｄ ｏｆ ｖｉｅｗ）は、顕微鏡対物レンズの回折限界（ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ）と少なくとも同じ大きさにすることができる。
それぞれの検出ユニット内の顕微鏡対物レンズは、検出ユニットによって追跡された生物試料の構造物を解明するのに十分な開口数（ｎｕｍｅｒｉｃａｌ ａｐｅｒｔｕｒｅ）を有することができる。
少なくとも１つの共用コンポーネントはチューブレンズを含むことができる。
互いに平行ではない少なくとも２つのアーム軸は互いに垂直にすることができる。
２つ以上の光学アームは４つの光学アームを含むことができ、それぞれの光学アーム軸は他の光学アーム軸のうちの少なくとも２つに垂直である。
光学データ分離装置は、光源ユニット及び検出ユニットの少なくとも１つの共用コンポーネントと残りのコンポーネントとの間に多色性光学素子（ｐｏｌｙｃｈｒｏｉｃ ｏｐｔｉｃａｌ ｅｌｅｍｅｎｔ）を含むことができる。それぞれの光学アーム内で、光源からのライトシートは多色性光学素子から反射することができ、生物試料からの蛍光は二色性光学素子（ｄｉｃｈｒｏｉｃ ｏｐｔｉｃａｌ ｅｌｅｍｅｎｔ）を通って透過することができる。
その他の一般的な態様では、生きている生物試料をイメージングする方法は、第１のライトシートを生成することと、生成された第１のライトシートが第１の画像平面において生物試料の少なくとも一部分と光学的に相互作用するように第１の照射軸と平行な経路に沿って第１のライトシートを誘導することと、複数の第１のビューのそれぞれにおいて、第１のライトシートと生物試料との光学的相互作用中に生物試料から第１の検出軸に沿って放出された蛍光の画像を記録することと、第２のライトシートを生成することと、生成された第２のライトシートが第２の画像平面において生物試料の少なくとも一部分と光学的に相互作用するように第２の照射軸と平行な経路に沿って第２のライトシートを誘導することであって、第２の照射軸が第１の照射軸と平行ではないことと、複数の第２のビューのそれぞれにおいて、第２のライトシートと生物試料との光学的相互作用中に生物試料から第２の検出軸に沿って放出された蛍光の画像を記録することを含む。
その他の一般的な態様では、生きている生物試料をイメージングする方法は、複数のライトシートを生成することと、ライトシートが画像平面に沿って生物試料内で空間的かつ時間的にオーバラップし、画像平面内で生物試料と光学的に相互作用するように生物試料を通って照射軸に沿って複数のライトシートを誘導することと、複数の第１のビューのそれぞれにおいて、ライトシートと生物試料との光学的相互作用により生物試料から第１の検出軸に沿って放出された蛍光の画像を記録することと、ライトシートの配向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）を回転させることと、複数の第２のビューのそれぞれにおいて、回転させたライトシートと生物試料との光学的相互作用により生物試料から第２の検出軸に沿って放出された蛍光の画像を記録することを含む。時間的オーバラップは、顕微鏡の空間分解能限界に対応する分解能時間より小さいタイムシフト内である。
その他の一般的な態様では、生きている生物試料をイメージングするための顕微鏡システムは、その上に生物試料が装着される試料ホルダと、複数の照射サブシステムと、複数の第１の検出サブシステムと、複数の第２の検出サブシステムと、試料ホルダ、複数の照射サブシステム、及び複数の第１の検出サブシステムのうちの１つ以上に結合され、生物試料を回転させずに、生物試料、複数のライトシート、及び複数の第１の検出サブシステムのうちの１つ以上を第１の線形軸に沿って互いに対して並進させるように構成された第１の並進システムと、試料ホルダ、複数の照射サブシステム、及び複数の第２の検出サブシステムのうちの１つ以上に結合され、生物試料を回転させずに、生物試料、複数のライトシート、及び複数の第２の検出サブシステムのうちの１つ以上を第２の線形軸に沿って互いに対して並進させるように構成された第２の並進システムとを含む。それぞれの照射サブシステムは、照射軸に沿って生物試料に向かってライトシートを生成し誘導するように配置された１つの光源及び１組の照射光学装置と、１つ以上の照射光学装置に結合された１組のアクチュエータとを含む。それぞれの第１の検出サブシステムは、照射軸に垂直な第１の検出軸に沿って生物試料から放出された蛍光の画像を収集し記録するように配置された１つのカメラ及び１組の検出光学装置と、カメラ及び検出光学装置のうちの１つ以上に結合された１組のアクチュエータとを含む。それぞれの第２の検出サブシステムは、照射軸に垂直な第２の検出軸に沿って生物試料から放出された蛍光の画像を収集し記録するように配置された１つのカメラ及び１組の検出光学装置と、カメラ及び検出光学装置のうちの１つ以上に結合された１組のアクチュエータとを含む。
実現例は以下の特徴のうちの１つ以上を含むことができる。例えば、顕微鏡システムは、複数の照射サブシステム、複数の第１の検出サブシステム、複数の第２の検出サブシステム、並びに第１及び第２の並進システムに接続され、第１の並進システムに信号を送信して、第１の組の画像平面に対する垂線と平行な第１の線形軸に沿って試料ホルダと複数の照射サブシステムと複数の第１の検出サブシステムとの相対位置を変更し、第１の組内のそれぞれの画像平面について、複数の照射サブシステムに信号を送信して、複数の照射サブシステムのそれぞれからのライトシートを画像平面に沿って生物試料内で空間的かつ時間的にオーバラップさせ、それにより生物試料と光学的に相互作用させ、それぞれの画像平面について、生物試料から放出された蛍光を取得する複数の第１の検出サブシステムから信号を受信するように構成された制御システムを含むことができる。時間的オーバラップは、顕微鏡システムの空間分解能に対応する分解能時間より小さいタイムシフト内である。
この顕微鏡システムは、複雑な生物試料全体を捕捉するレベルでの生物学的構造及び機能のインビボ研究に有用なツールを提供する。これは、光軸（ｌｉｇｈｔ ａｘｉｓ）に沿って誘導されたレーザ光の薄いシートで生物試料又はサンプルを照射することと、光軸に直交するようにこの薄いボリュームから放出された蛍光を記録することに基づくライトシート顕微鏡検査技法を含む。レーザ光は生物試料のサイズと比較して薄いものである。例えば、この薄いボリュームは光軸の方向に約１００ｎｍ〜約１０μｍの幅にすることができるであろう。
生物試料の焦点が合っている部分のみがレーザ光に曝され、これは光学的セクショニングを提供し、実質的に光損傷を低減する。その上、焦点が合っているセクションから放出された蛍光信号は視野全体について時間的に同時に検出され、これは例外的に高いイメージング速度（ｉｍａｇｉｎｇ ｓｐｅｅｄ）を提供する。一般的に使用される光学的セクショニング技法である共焦点顕微鏡検査法と比較して、イメージング速度、信号対雑音比、及び光退色速度は数桁分まで改善される。この顕微鏡システムは、空間及び時間分解能並びにライブイメージング実験の概念設計及び複雑さにおいて更なる改善を可能にすることができる。
この顕微鏡システムは、生きている組織内に数十乃至数百ミクロン以上浸透することができ、従って、複雑な生物試料又は有機体のイメージングである組織レベル（ｓｙｓｔｅｍｓ−ｌｅｖｅｌ）のイメージングを可能にする。この顕微鏡システム及び関連プロセスは、複雑な試料内の動的な生物学的プロセスを高い空間時間分解能で捕捉できるように、１００フレーム／秒程度の高いイメージング速度を達成する。
この顕微鏡システムは、生きている試料内の高速プロセスを捕捉するのに十分高速なものである。例えば、生きている多細胞有機体では、順次マルチビューイメージングシステムにおいて行われる順次マルチビュー取得間で高速発生プロセスが行われる可能性があり、これは取得したデータの正確な画像融合（ｉｍａｇｅ ｆｕｓｉｏｎ）を妨げるものである。従って、この顕微鏡システムは、細胞追跡及び細胞形態の再構築などの定量分析を根本的に抑制する可能性のある空間時間的アーチファクト（ａｒｔｉｆａｃｔ）を回避する。
複雑な発達中の生物試料又は有機体内のすべての細胞の動的挙動及び構造変化のグローバル測定の場合、関心のある最高速プロセスの時間尺度と一致する速度でしかも相補的ビュー間の最小限のタイムシフトでデータ取得が行われる。
一光子又は多光子ライトシートベースの蛍光励起による同時マルチビューイメージングのための技術フレームワークは、光退色及び光毒性効果を最小限にするか又は低減しながら例外的に高いイメージング速度及び物理的適用範囲をもたらすように設計される。この顕微鏡システムは、大きい生物試料を全体として長期間にわたり優れた空間時間分解能で定量的インビボイメージングすることにおいて優れている。
二光子励起による実現例と同様に、この概念は、とりわけ、ベッセル平面照射、スキャンライトシートベースの構造化照射、又は機能的イメージング手法と組み合わせることもできる。従って、照射サブシステムで使用される「ライトシート」は、これらのその他の照射手法を包含するものである。従って、ライトシートはスキャンライトシート又は静的ライトシートになる可能性がある。ライトシートを生成するためのレーザスキャンの使用（即ち、一度に試料内の１本の線のみを照射すること）は二光子励起及びベッセル・ビーム照射の使用を可能にし、スキャンプロセスの時間的特徴は構造化ライトシート（光のストライプ）などの複雑な照射パターンの構築も可能にする。
本明細書に提示されているイメージング技法は、高スループット高含有量のスクリーニング、高速機能的イメージング、及び発達中の有機体全体における細胞力学の総合的な定量分析に対して門戸を開放するものである。この方法と自動画像セグメント化及び細胞追跡のための高度な計算ツールとを組み合わせることにより、非常に複雑な生物試料の場合でも、高品質細胞系統ツリーの再構築、遺伝子発現力学の総合的マッピング、自動細胞表現型、並びに細胞形態変化及び細胞力の生物物理学的分析が手の届く範囲内になる。
シングルビューイメージングと比較して、同時マルチビューイメージングは、適用範囲をほぼ４倍に改善し、初期胚全体における細胞力学を明らかにする。その上、順次マルチビューイメージングと比較して、同時マルチビューイメージングは、高速核運動中の時間空間融合アーチファクトを除去するか又は大幅に低減し、時間分解能を改善し、自動細胞追跡などのその後の計算画像解析のための定量データを提供する。また、同時マルチビューイメージングは、順次マルチビュー画像登録に必要なオーバラップ領域の冗長な反復取得を回避することにより、試料に対するエネルギ荷重も低減する。
空間及び時間アーチファクトの除去の他に、同時マルチビューイメージングは優れた時間分解能も提供する。この点については、以下に述べるようにショウジョウバエ胚における細胞力学を定量化する基本的パラメータによって例示することができる。例えば、何千個もの核の高速運動は合胞性胞胚葉における分裂周期中に発生し、即ち、第１２分裂周期では、分裂中の核の平均運動速度は８．１２±２．５９μｍ／分（平均±標準偏差、ｎ＝２，７９８、フーバー・ロバスト推定量（Ｈｕｂｅｒ ｒｏｂｕｓｔ ｅｓｔｉｍａｔｏｒ））であり、平均最近接距離は７．５７±１．３４μｍ（平均±標準偏差、ｎ＝１．４４×１０５、フーバー・ロバスト推定量）である。重要なことに、最近接のものは、通常、同じ母核からの娘核ではない。このため、胞胚葉全体における核力学の分析のための定量データを入手するために、平均してその後の時点間の最近接距離の半分以下の核運動を保証する全体速度での同時マルチビューイメージングが必要である。従って、胚全体の同時マルチビューイメージングは、せいぜい約３０秒の時間サンプリングで実行しなければならない。
生物試料の同時マルチビューイメージングを提供するためにライトシート顕微鏡検査法を使用する模範的な顕微鏡システムのブロック図である。 図１Ａの顕微鏡システムを使用してイメージングされた試料の模範的な概略表現を示すブロック図である。 図１Ａの顕微鏡システムの模範的な実現例のブロック図である。 図１Ａの顕微鏡システムの模範的な顕微鏡の斜視図である。 試料及び対物レンズを示す、図３の模範的な顕微鏡の一部の拡大斜視図である。 図３の顕微鏡の模範的な照射システムの拡大斜視図である。 試料を準備するための模範的なステップと、図３の顕微鏡システム内で試料を保持するチャンバを示す斜視図である。 図１Ａの顕微鏡システムの模範的な電子機器コントローラ（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ）及び模範的な計算コントローラ（ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ）の詳細を示すブロック図である。 図１Ａの顕微鏡システムによって実行される模範的な手順のフローチャートである。 試料とライトシートとの相対位置が図１Ａの顕微鏡システム内の検出軸に沿って変更される模範的なイメージング方式を示すブロック図である。 試料とライトシートとの相対位置が図１Ａの顕微鏡システム内の検出軸に沿って変更される模範的なイメージング方式を示すブロック図である。 試料とライトシートとの相対位置が図１Ａの顕微鏡システム内の検出軸に沿って変更される模範的なイメージング方式を示すブロック図である。 試料とライトシートとの相対位置が図１Ａの顕微鏡システム内の検出軸に沿って変更される模範的なイメージング方式を示すブロック図である。 図１Ａの顕微鏡システムによって実行されるように試料の画像を作成するための模範的な手順のフローチャートである。 図９の手順中に実行される模範的なステップを示す、図１Ａの顕微鏡システム内の顕微鏡のブロック図である。 図９の手順中に実行される模範的なステップを示す、図１Ａの顕微鏡システム内の顕微鏡のブロック図である。 図９の手順中に実行される模範的なステップを示す、図１Ａの顕微鏡システム内の顕微鏡のブロック図である。 図１Ａの顕微鏡システムを使用して画像が捕捉される時に模範的な複数の時点における試料の発達を示す、試料の概略表現の図である。 図７の手順内の後処理ステップ中に取られた試料の画像である。 図７の手順内の後処理ステップ中に取られた試料の画像である。 生物試料としてのショウジョウバエ胚上で一光子励起方式を使用して検出軸に沿った複数ステップで図１Ａの顕微鏡システムによって取られた蛍光の画像である。 ある時点において一光子励起方式を使用して取られたショウジョウバエ胚の画像の最大値投影である。 発達の第１３分裂周期中に一連の微速度撮影で取られた図１３Ｂのショウジョウバエ胚の一領域の画像である。 図１３Ａ〜図１３Ｃのショウジョウバエ胚上で図１Ａの顕微鏡システムを使用して一光子励起中に得られた蛍光の画像の最大値投影である。 二光子励起方式を使用して図１Ａの顕微鏡システムによって検出軸に沿った模範的なイメージング平面において取られたショウジョウバエ胚の画像を示している。 図１４Ａの二光子励起方式を使用して図１Ａの顕微鏡システムによって取られたショウジョウバエ胚発育の微速度撮影記録の最大値投影を示している。 図１４Ａの二光子励起方式を使用して図１Ａの顕微鏡システムによって取られたショウジョウバエ胚発育の微速度撮影記録の最大値投影を示している。 図１Ａの顕微鏡システムを使用して第１２分裂波（ｍｉｔｏｔｉｃ ｗａｖｅ）前及び第１３分裂波後に取られたショウジョウバエ胚全体の細胞追跡結果が重ねられた生画像データを示している。 第１３分裂波がショウジョウバエ胚を通って進行する時に図１Ａの顕微鏡システムによって取られた図１５Ａの細胞追跡されたショウジョウバエ胚の画像を示している。 図１Ａの顕微鏡システムによって取られ、左側に細胞追跡情報及び右側に形態学的核セグメント化を伴う、図１５Ａの再構築されたショウジョウバエ胚の拡大図を示している。 図１５Ａ〜図１５Ｃのショウジョウバエ胚内の核分裂後の時間の関数としての平均核速度のグラフを示している。 図１５Ａ〜図１５Ｃのショウジョウバエ胚内の最近接隣接核間の距離の分布のグラフを示している。 ヒストン標識ショウジョウバエ胚上で一光子励起方式で図１Ａの顕微鏡システムを使用して得られ、受精後１２０〜３５３分間に３つの神経芽細胞と１つの表皮芽細胞から手作業で再構築された系統が重ねられた画像を示している。 図１６Ａで強調表示された追跡の拡大図を示している。 一光子励起方式を使用して図１Ａの顕微鏡システムで記録されたショウジョウバエ胚神経系発達の最大値投影（背部側及び腹部側）を示している。 一光子励起方式を使用して図１Ａの顕微鏡システムで記録されたショウジョウバエ胚神経系発達の最大値投影（背部側及び腹部側）を示している。 一光子励起方式を使用して図１Ａの顕微鏡システムで記録されたショウジョウバエ胚神経系発達の最大値投影（背部側及び腹部側）を示している。 図１６Ｅで強調表示されたエリアの拡大図を示している。 一光子励起方式を使用して図１Ａの顕微鏡システムで記録されたショウジョウバエ遺伝子導入胚（フォールスカラー・ルックアップテーブル）内の軸索形態形成の最大値投影の経過を示している。 それぞれの光学アームが照射タスクと検出タスクの両方を実行して生物試料の同時マルチビューイメージングを提供する模範的な顕微鏡システムのブロック図である。 それぞれの光学アームが照射タスクと検出タスクの両方を実行する模範的な顕微鏡システムの詳細を示すブロック図である。 図１８の顕微鏡システムの光学顕微鏡の斜視図である。 図１８の模範的な顕微鏡システムの電子機器コントローラ及び計算システムの詳細を示すブロック図である。 図１８〜図２０の顕微鏡システム内で生成された１つ以上の第１のライトシートを使用してイメージングされた生物試料の模範的な概略表現を示すブロック図である。 図１８〜図２０の顕微鏡システム内で生成された１つ以上の第２のライトシートを使用してイメージングされた生物試料の模範的な概略表現を示すブロック図である。 図１８〜図２０の顕微鏡システムによって実行される手順のフローチャートである。 試料と１つ以上の第１のライトシートとの相対位置が図１８〜図２０の顕微鏡システム内のｚ軸に沿って変更される模範的なイメージング方式を示すブロック図である。 試料と１つ以上の第１のライトシートとの相対位置が図１８〜図２０の顕微鏡システム内のｚ軸に沿って変更される模範的なイメージング方式を示すブロック図である。 試料と１つ以上の第１のライトシートとの相対位置が図１８〜図２０の顕微鏡システム内のｚ軸に沿って変更される模範的なイメージング方式を示すブロック図である。 図２３Ａ〜図２３Ｃに示されているイメージング方式を生成する図２２の手順中の動作モードを示す、図１８〜図２０の顕微鏡システム内の光学顕微鏡のブロック図である。 試料と１つ以上の第２のライトシートとの相対位置が図１８〜図２０の顕微鏡システム内のｙ軸に沿って変更される模範的なイメージング方式を示すブロック図である。 試料と１つ以上の第２のライトシートとの相対位置が図１８〜図２０の顕微鏡システム内のｙ軸に沿って変更される模範的なイメージング方式を示すブロック図である。 試料と１つ以上の第２のライトシートとの相対位置が図１８〜図２０の顕微鏡システム内のｙ軸に沿って変更される模範的なイメージング方式を示すブロック図である。 図２５Ａ〜図２５Ｃに示されているイメージング方式を生成する図２２の手順中の動作モードを示す、図１８〜図２０の顕微鏡システム内の光学顕微鏡のブロック図である。 図２２の手順中の多色動作モードを示す、図１８〜図２０の顕微鏡システム内の光学顕微鏡のブロック図である。 １つ以上の第１のライトシートと１つ以上の第２のライトシートの両方が図１８〜図２０の顕微鏡システム内で同時にスキャンされる模範的なイメージング方式を示すブロック図である。 図１８〜図２０の顕微鏡システムの１つの模範的な光学アームのブロック図である。 図１８〜図２０の顕微鏡システム内の記録されたデータが空間分離を使用して分離される模範的なイメージング方式を示すブロック図である。 図３０のイメージング方式を使用する図１８〜図２０の顕微鏡システムの光学アームのうちの１つの模範的な検出ユニットを示すブロック図である。 図３０のイメージング方式を使用する図１８〜図２０の顕微鏡システムの光学アームのうちの１つの模範的な検出ユニットを示すブロック図である。 図３０のイメージング方式を使用する図１８〜図２０の顕微鏡システムの光学アームのうちの１つの模範的な検出ユニットを示すブロック図である。 図３０のイメージング方式を使用して図１８〜図２０の顕微鏡システムのそれぞれの光学アームのライトシートがどのように位置合わせされるかを示すブロック図である。 図１８〜図２０の顕微鏡システムによって実行される模範的な手順のフローチャートである。 図１８〜図２０の顕微鏡システムに基づき、その他の光学アームと平行ではない１つ以上の追加の光学アームを含む模範的な顕微鏡システムのブロック図である。 生物試料の同時マルチビューイメージングを提供するためにライトシート顕微鏡検査法を使用し、試料の５つ以上の光学ビューを含む模範的な顕微鏡システムのブロック図である。 第１の対の検出サブシステムによる照射及び検出を示す、図１７Ａの顕微鏡システムの顕微鏡の斜視図である。 照射サブシステム内のライトシートの回転後の第２の対の検出サブシステムによる照射及び検出を示す、図１７Ａの顕微鏡システムの顕微鏡の斜視図である。 ５つ以上の光学ビューを使用して生物試料をイメージングするために図１７Ａの顕微鏡システムによって実行される模範的な手順のフローチャートである。
特許又は出願ファイルにはカラーで製作された少なくとも１つの図面が含まれる。カラー図面を含むこの特許又は特許出願公報のコピーは、請求並びに必要な手数料の支払に応じて特許庁から提供されるであろう。
図１Ａを参照すると、この説明は、発達中の胚などの複雑な生物試料（又は試料）１０１を全体としてライブイメージングするための顕微鏡システム１００及び対応するプロセスに関する。例えば、複雑な生物試料１０１は受精卵として始めることができ、この場合、顕微鏡システム１００は、数時間又は数日という規模で所定の期間にわたって形を成すにつれて受精卵から形成される胚内のそれぞれの細胞を追跡する能力を含む、機能中の動物への受精卵全体の転換を捕捉することができる。顕微鏡システム１００は、約２０時間にわたって捕捉された多くの画像の寄せ集めを提供して、単純な細胞クラスタとして出現し始める胚内の生物学的構造物が数万個の稠密にパックされた細胞を有する細長いボディに変形するのを観察者が見られるようにすることができる。
顕微鏡システム１００は同時マルチビューイメージングを提供するライトシート顕微鏡検査法を使用し、これはより低速の順次マルチビューイメージングによって引き起こされる可能性のある空間時間的アーチファクトを除去するか又は低減する。更に、照射されている試料１０１の一部を検出器が記録している間にスキャンされたレーザ光のシートで一度に試料１０１の１つの薄いセクション（例えば、ｚ軸に沿って取られた幅が約１マイクロメートル（μｍ）程度のもの）のみを照射するので、試料１０１に対する損傷が低減される。同時マルチビューイメージングを実行するために試料１０１の機械回転は全く必要ない。
一般に、光学顕微鏡１１０は、それぞれのライトシート軸に沿って別個の方向から試料１０１を照射する複数のライトシート（例えば、ライトシート１０２、１０４）と、複数の検出ビューに沿って結果として生じる蛍光を収集する複数の検出サブシステム（例えば、検出サブシステム１１６、１１８）で構成される。以下の例では、反対方向又はライトシート軸から試料１０１を照射するそれぞれの照射サブシステム１１２、１１４内に２つのライトシート１０２、１０４が生成され、それぞれの検出サブシステム１１６、１１８は２つの検出ビューに沿って結果として生じる蛍光を収集する。この特定の例では、ライトシート軸は照射軸（ｙ軸）と平行であり、検出ビューはｙ軸に垂直な検出軸（ｚ軸）と平行である。
従って、この例では、顕微鏡システム１００は４つの相補的光学ビューの取得によってほぼ完全な適用範囲を提供し、第１のビューはライトシート１０２と試料１０１との相互作用により放出された蛍光を検出する検出システム１１６から得られ、第２のビューはライトシート１０４と試料１０１との相互作用により放出された蛍光を検出する検出システム１１６から得られ、第３のビューはライトシート１０２と試料１０１との相互作用により放出された蛍光を検出する検出システム１１８から得られ、第４のビューはライトシート１０４と試料１０１との相互作用により放出された蛍光を検出する検出システム１１８から得られる。
ライトシート１０２、１０４と試料１０１との相互作用をより明確に示すために誇張されている図１Ｂ参照すると、ライトシート１０２、１０４は、ｙ−ｘ平面に沿って延びる画像ボリューム（ｉｍａｇｅ ｖｏｌｕｍｅ）ＩＶに沿って試料１０１内で互いに空間的にオーバラップし、時間的にオーバラップし、画像ボリュームＩＶ内で試料１０１と光学的に相互作用する。時間的オーバラップは、顕微鏡１１０の空間分解能限界に対応する分解能時間より小さいタイムシフト又は時間差の範囲内である。特に、これは、ライトシート１０２、１０４が、同時に或いは時間差中の生物試料１０１内の追跡された細胞Ｃの任意の変位が顕微鏡１１０の分解能限界より著しく小さく（例えば、１桁未満）なるほど非常に小さい時間差分だけ時間的に互い違いに配置されて、生物試料１０１の画像ボリュームＩＶ内で空間的にオーバラップすることを意味し、この場合、分解能限界は顕微鏡１１０の空間分解能限界に対応する時間である。
以下により詳細に述べるように、それぞれのライトシート１０２、１０４は、ｙ軸及びｚ軸に垂直な照射軸（ｘ軸）に沿ってレーザ光の薄い（例えば、１μｍの厚さ）ビームを急速に移動させて、一般的にシート１０２、１０４を形成するための平面に沿って又は平面に平行に延びる光ビームを形成するレーザスキャナによって生成される。この例では、ライトシート１０２、１０４の形のレーザビームは、試料１０１の両側でｙ軸に沿って試料１０１を照射する。薄いボリュームを急速スキャンし、照射軸に直角に（この例では、ｚ軸に沿って）蛍光検出すると、光学的にセクショニングされた画像が提供される。ライトシート１０２、１０４は試料１０１内の蛍光体をより高いエネルギ準位に励起し、その結果、蛍光光子Ｐのその後の放出が行われ、蛍光光子Ｐは（ｚ軸に沿って）検出サブシステム１１６、１１８内の検出器によって検出される。以下に詳細に述べるように、いくつかの実現例では、この励起は一光子励起であり、或いはそれは多光子（例えば、二光子）励起である。
試料内で励起される蛍光体は、例えば、ＧＦＰなどの遺伝的に符号化された蛍光タンパク質又はＡｌｅｘａ−４８８などの染料など、細胞に添付される標識にすることができる。しかし、蛍光体は、第２高調波発生又は第３高調波発生を使用するいくつかの実現例では、ライトシート１０２、１０４で露光した時に特定の波長の光を放出する、細胞内の実際の又は未変性のタンパク質になる可能性がある。
図１Ｂに概略的に示されているように、ライトシート１０２、１０４は試料１０１を通過し、蛍光体を励起する。しかし、ライトシート１０２、１０４は、試料１０１を通るそのそれぞれの経路に沿って光散乱及び光吸収を受けやすい。その上、非常に大きい（画像ボリュームＩＶ又は視野（ＦＯＶ）と比較して大きい）か又はかなり不透明な試料はライトシート１０２、１０４からのエネルギを吸収する可能性がある。
その上、ライトシート１０２、１０４が二光子励起方式で実現される場合、オーバラップしているライトシート１０２、１０４の中央領域１０３のみが二光子プロセスを効率的にトリガするために十分高い出力密度を有することができ、二光子ライトシート１０２、１０４に曝されたことに応答して、試料１０１の半分（近接側）のみが蛍光光子Ｐを放出することが可能である。
ライトシートの「空間的オーバラップ」という用語は、ライトシート１０２、１０４が試料１０１内で幾何学的に重ねられることを意味する可能性がある。また、「空間的オーバラップ」という用語は、両方のライトシートを検出サブシステム１１６、１１８のＦＯＶ（図１Ｂに示す通り）内及び試料１０１内に幾何学的に到達させることも包含することができる。例えば、二光子励起を効率的にトリガするために、ライトシート１０２、１０４の両方を使用することによって視野全体が可視状態になるように、それぞれのライトシート１０２、１０４は（それぞれのライトシートが視野のそれぞれの半分で中心に置かれるように）検出サブシステム１１６、１１８の視野の一部（例えば、半分）のみを覆うことができるであろう。
このため、ライトシート１０２、１０４が視野の半分のみを覆う必要がある場合、それぞれの二光子ライトシート１０２、１０４はより薄く（ｚ軸に沿って測定したもの）することができる。しかし、ライトシート１０２、１０４がより薄い（しかもレーザ出力が変化しない）場合、同じ数の光子が試料１０１のより小さい断面を通って移動し、即ち、レーザ出力密度がより高くなり、その結果、より効率的な二光子励起が行われる（これはレーザ出力密度の平方に比例する）。同時に、ライトシートがより薄いので、それぞれのライトシート１０２、１０４が視野全体を覆うシナリオに比較した場合、分解能が増加する。
もう１つの例として、ライトシート１０２、１０４が一光子励起方式で実現される場合、ライトシート１０２、１０４は中央領域１０３の外側であるが画像ボリューム内である試料１０１のエリアでも蛍光体を励起することができ、この部分は結果として生じる画像内でよりぼやけて現れることになる。この後者のケースでは、２つのライトシート１０２、１０４のそれぞれで２つの画像を順次記録することができ、計算システム１９０はより高い品質を得るように画像を調節するための計算を使用することができる。例えば、低コントラストの領域が除去される（しかも、このステップ後、相補的画像部分が残存する）ように２つの画像をトリミングすることができ、高品質で視野全体を覆う最終画像を得るために、２つのライトシートで記録された画像をまとめて綴じることができる。
ライトシート１０２、１０４は、その最小厚さ又は幅（ｚ軸に沿って取られたもの）が画像ボリュームＩＶ及びＦＯＶ内になるように構成される。２つのライトシート１０２、１０４が試料１０１に向かって誘導されると、それぞれのライトシート１０２、１０４の最小厚さは画像ボリュームＩＶとオーバラップするはずである。上述の通り、これは、図１Ｂに概略的に示されているように、ライトシート１０２の最小厚さがライトシート１０４の最小厚さからオフセットされるようにセットアップすることができる。このセットアップは、改善されたか又は優れた空間分解能（一光子及び二光子励起方式の両方の場合）並びに改善されたか又は優れた信号速度（二光子励起方式の場合）を提供する。
例えば、約２００μｍの厚さ（ｚ軸に沿って取られたもの）であるショウジョウバエ胚である試料１０１の場合、ライトシート１０２は試料１０１内に横切った後に試料１０１の左端から約５０μｍ（ページの左側から測定したもの）のその最小厚さに到達するように構成することができ、ライトシート１０４は試料１０１内に横切った後に試料１０１の右端から約５０μｍ（ページの右側から測定したもの）のその最小厚さに到達するように構成することができる。
ライトシート１０２、１０４の最小厚さと、画像ボリュームＩＶを横切るライトシート１０２、１０４の厚さの均一性との兼ね合いが図られる。従って、最小厚さが低減される場合、ライトシート１０２、１０４は画像ボリュームＩＶの両端でより厚くなる。ライトシート１０２、１０４の厚さはそれぞれの照射サブシステム１１２、１１４の開口数に比例し、ライトシート１０２、１０４の使用可能な長さ、即ち、厚さが十分均一になる長さは開口数の平方に反比例する。ライトシート１０２、１０４の厚さは、その最大強度の半分で取られたｚ軸に沿ったライトシート１０２、１０４の全幅（ＦＷＨＭ）などの任意の適切な尺度（ｍｅｔｒｉｃ）を使用して推定することができる。
例えば、４μｍという最小厚さ（ＦＷＨＭなどの適切な尺度を使用する）を有するライトシート１０２、１０４は、２５０μｍというＦＯＶを有する画像ボリュームＩＶについて良い組み合わせである（これは、それが２５０μｍの長さ（ｙ軸に沿って取られたもの）であることを意味する）。良い組み合わせとは、それが視野の全域で良好な平均分解能を提供することを意味する。より薄いライトシートは、中心（ｙ軸に沿って取られたもの）において分解能を改善すると思われるが、試料１０１の両端では劇的に容認できないほど分解能を低下させる可能性があり、おそらく視野の全域で平均分解能が悪化する可能性がある。より薄いライトシートは、画像ボリュームＩＶの全域でライトシートをより均一にすると思われるが、画像ボリュームＩＶ全体で分解能を低下させると思われる。もう１つの例として、７μｍという最小厚さ（ＦＷＨＭなどの適切な尺度を使用する）を有するライトシート１０２、１０４は、７００μｍというＦＯＶを有する画像ボリュームＩＶについて良い組み合わせである（従って、それは７００μｍの長さ（ｙ軸に沿って取られたもの）である）。
一般に、ライトシート１０２、１０４の厚さ（ｚ軸に沿って取られたもの）は、画像コントラストを維持し、焦点が合っていない背景光を低減するために、試料１０１のサイズ（及び厚さ）より小さくなければならない。特に、ライトシート１０２、１０４の厚さは、試料１０１全体が照射される従来の照射手法より画像コントラストを改善するために、試料１０１のサイズより実質的に小さくなければならない。この体制（ライトシートの厚さが試料の厚さより実質的に小さい）においてのみ、ライトシート顕微鏡検査法は従来の照射手法を上回る実質的な利点を提供する。
例えば、ライトシート１０２、１０４の厚さは、ｚ軸に沿って取られた試料１０１の幅の１０分の１より小さくすることができる。いくつかの実現例では、視野の一部分（半分など）のみを覆うためにそれぞれのライトシートが使用され、即ち、それぞれのライトシートの最小厚さのポイントが、上述の通り、視野を半分ずつ２つに分けた場合の一方の側の中心に位置する場合、ライトシート１０２、１０４の厚さは試料１０１の幅又はサイズの約１００分の１である。
ライトシート１０２、１０４の最小厚さを設定するため又は現実的な画像ボリュームＩＶを規定するためのもう１つの重要な考慮事項は、顕微鏡システム１００によって解明する必要がある試料１０１内の構造物のサイズである。多くの場合、顕微鏡システム１００は、システム１００を使用できる初期発達段階において、ショウジョウバエでは約４〜５μｍのサイズ（核の端から端までの直線に沿って取られたもの）であり、ゼブラフィッシュでは約７〜８μｍのサイズである、細胞核をイメージングするようにセットアップされる。適度に良好な空間サンプリング及び分解能を達成するために、ライトシート１０２、１０４は、これらの核の断面サイズ又は長さの半分よりあまり厚くない最小厚さを有するものでなければならない。従って、ショウジョウバエの場合、ライトシート１０２、１０４の最小厚さは２〜３μｍより小さくなければならず、ゼブラフィッシュの場合、ライトシート１０２、１０４の最小厚さは３〜４μｍより小さくなければならない。その上、試料１０１の画像は（試料１０１、光ビーム１０２、１０４、或いは試料１０１と光ビーム１０２、１０４の両方をｚ軸に沿って並進させることによって）ｚ軸に沿って取られた複数ステップで記録しなければならず、そのステップのサイズはおよそこの最小厚さのサイズでなければならない。
顕微鏡システム１００は、完全な技術フレームワークを含む総合的な解決策である。従って、顕微鏡システム１００は、電子機器コントローラ１８０と計算システム１９０とを含む電子機器フレームワークも含む。電子機器コントローラ１８０は、長期間にわたってミリ秒の精度で顕微鏡１１０内のすべての光学機械コンポーネントの同期制御を提供する。計算システム１９０は、生きている試料１０１上で複雑な光学位置合わせを急速に実行し、数百メガバイト／秒の持続的データ転送速度で検出サブシステム１１６、１１８内の複数の検出器（又はカメラ）による同時高速画像収集のためのロバスト・パイプライン並びにすべての実験から発生する複数テトラバイトの生マルチビュー画像データを登録し再構築するために効率的な自動画像処理のための高スループット計算戦略を提供する。
本明細書に提供されている例は、照射用の２つのライトシートと、蛍光を収集するための２つの検出器とを使用する４ビュー・システムについて説明しているが、追加の検出器及び／又は照射システムを追加することにより、より多くのビューが可能である。この例では、照射サブシステム１１２、１１４は、図１Ｂの概略図により明確に示されているように、試料１０１を２つの側からライトシートで照射できるように、互いに向き合っている。それぞれの検出サブシステム１１６、１１８は、試料１０１から放出された蛍光を収集し記録するように配置された１組の検出光学装置に加えて、それぞれの検出器又はカメラ１０６、１０８を含む。また、それぞれの検出サブシステム１１６、１１８は、一方の端部で検出器１０６、１０８及び検出光学装置のうちの１つ以上に結合され、もう一方の端部で電子機器コントローラ１８０とのインターフェースを取る、１組のアクチュエータも含む。
照射及び検出のそれぞれの組み合わせは異なるビュー又は眺めを提供する。（この例では）４つのビューを同時に捕捉することにより、（過去の順次イメージング技法のように）試料１０１を新しい位置に繰り返し回転させることによって引き起こされる遅延は低減されるか又は除去される。従って、顕微鏡システム１００は、試料１０１を回転させる必要なしに複数の相補的ビューを同時取得するために設計されている。
照射サブシステム
図２〜図５Ａも参照すると、照射サブシステム１１２、１１４のそれぞれは、それぞれの光ビームを出力するそれぞれの光源１２２、１２４と、試料１０１に誘導されるライトシート１０２、１０４を生成するように光ビームの方向、サイズ、形状寸法などの特性を変更する光学コンポーネントのそれぞれのセット１３２、１３４とを含む。照射サブシステム１１２、１１４内で生成されるライトシート１０２、１０４は、以下に述べるように、それぞれの光源１２２、１２４の出力をスキャンすることによって生成することができる。
光源１２２、１２４はレーザなどの１つ以上の光源を含むことができる。いくつかの実現例では、ライトシート１０２、１０４は単一の（１つの）光源から生成することができ、この単一光源からの出力は、それぞれの光源１２２、１２４として機能するように２つのビームに分割することができる。その他の実現例では、ライトシートは、それぞれの光源１２２、１２４として機能するように２つの個別の光源から生成することができる。
二光子励起配置の場合、単一のパルスＴｉ：サファイアレーザは２つのビームに分割される単独光源にすることができる。この場合、光の波長は６９０〜１０８０ｎｍの任意の値に調節することができる。
一光子励起配置のいくつかの実現例では、光源は６つのレーザダイオード及びダイオード励起固体（ＤＰＳＳ）レーザで構成することができ、そのレーザビームはダイクロイックミラーを使用して同じ光軸上ですべて結合され、従って、ユニット全体を単一の光源であるように見える何かに効果的に変化させる。この場合、多色イメージング或いは蛍光マーカ選択の柔軟性の増加を提供するので、２つ以上の光源を使用することにとって有利である。レーザダイオード及びＤＰＳＳレーザはそれぞれ別個の波長を提供し、これにより顕微鏡システム１００は単一の実験内で異なるタイプの蛍光タンパク質及び複数のカラーチャネルで作用することができる。いくつかの実現例では、任意の所与の時間にその配置の１つの波長のみを活動化することができる。波長の活動化は電子機器コントローラ１８０及び計算システム１９０によって制御することができ、例えば、電子機器コントローラ１８０は、マイクロ秒の速度の範囲内でそれぞれの波長による寄与を活動化又は非活動化するレーザ又は音響光学チューナブルフィルタに信号を送ることができる。次に、レーザビームはビームスプリッタなどの静的光学素子を使用して２つのビームに分割されるので、両方の照射サブシステム１１２、１１４は同時に光を受け取り、それぞれのサブシステム１１２、１１４内の高速レーザシャッタにより、それぞれのサブシステム１１２、１１４内で生成されたライトシート１０２、１０４の選択的活動化が可能になる。
その他の実現例では、それぞれの照射サブシステムのために専用のレーザシステム（又は光源）を提供することができ、それぞれの専用のレーザシステムは電子機器コントローラ１８０及び計算システム１９０によって個々に制御可能なものにすることができる。
例えば、光源１２２及び光源１２４はそれぞれ、柔軟性を提供するために複数の波長で動作する１つ以上の固体レーザ（ダイオード励起固体レーザなど）を含むことができる。一例では、それぞれの光源１２２、１２４は、ドイツ連邦共和国ロートガウ市ドゥーデンホーフェン市区のＯｍｉｃｒｏｎ−Ｌａｓｅｒａｇｅ Ｌａｓｅｒｐｒｏｄｕｋｔｅ ＧｍｂＨによって生産されたＳＯＬＥ（登録商標）レーザライトエンジンを含む。このような光源の詳細はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｍｉｃｒｏｎ−ｌａｓｅｒ．ｄｅ／の同社のウェブサイトで見つけることができる。このようなライトエンジンでは、別個の波長で動作する内部の個別レーザからの複数の出力を結合して、単一の出力を形成することができる。ＳＯＬＥ（登録商標）レーザライトエンジンからの出力は、適用例次第で１つ以上の光ファイバにより誘導することができる。光源１２２、１２４は、アクティブなレーザライン及びそのそれぞれのレーザ出力の制御を可能にするために電子機器コントローラ１８０内のコンポーネントに接続される。更に、単一出力を形成するために結合された後、例えば、４０５ｎｍ、４４５ｎｍ、４８８ｎｍ、５１５ｎｍ、５６１ｎｍ、５９４ｎｍ、６４２ｎｍ、及び６８５ｎｍのレーザ波長を提供する近紫外から近赤外までの蛍光励起のためにこの出力を２つの照射アームに分割することが可能である。
その他の実現例では、異なるカラーチャネルを同時に記録できるように、任意の所与の時間に（同時に）異なるカラーを有する複数の光源及び／又は複数のライトシートを使用し、二色性ビームスプリッタ及び複数のカメラをそれぞれの検出サブシステム１１６、１１８に装備することが可能である。
光源１２２、１２４のそれぞれからの出力は光シャッタ１２３、１２５を使用して制御することができ、これにより試料１０１に到達するライトシート１０２、１０４のタイミングを制御し、その結果、どのライトシート１０２、１０４（例えば、ライトシート１０２のみ、ライトシート１０４のみ、又はライトシート１０２とライトシート１０４の両方）が任意の一瞬に試料１０１を照射するかを制御する。いくつかの実現例では、光シャッタ１２３、１２５はＵｎｉｂｌｉｔｚレーザシャッタ（Ｕｎｉｂｌｉｔｚ ＬＳ６ＺＭ２−１００レーザシャッタ又はＵｎｉｂｌｉｔｚ ＶＳ１４Ｓ２ＺＭ１−１００レーザシャッタなど）である。これらの光シャッタはアパーチャを通って誘導される光を遮断することができ、光の遮断は、適用例次第で同期化、非同期化、又は制御することができる。従って、試料１０１での照射は、いずれかの側から同期的に又は非同期的に実行することができる。それぞれのドライバ又はアクチュエータ１２６、１２８は電子機器コントローラ１８０からの制御下でレーザシャッタ１２３、１２５を操作する。アクチュエータ１２６、１２８は、例えば、Ｕｎｉｂｌｉｔｚ ＶＭＭ−Ｄ３の３チャネル・ドライバにすることができる。
その他のタイプの光源も可能であり、光源の選択に対する制約としては、１つ又は複数の所望の波長（試料１０１内の蛍光体を励起するために選択又は変更することができる）、所望の出力、及び所望のビーム品質を含む。
光源１２２、１２４から出力される光ビームは、電子機器コントローラ１８０に接続されたそれぞれのアクチュエータシステム１３３、１３５によって駆動される光学コンポーネントのそれぞれのセット１３２、１３４を通って誘導される。一般に、光学コンポーネントのそれぞれのセット１３２、１３４は、例えば、ミラー、レンズ、及び対物レンズ、光学機械コンポーネント（対物レンズなど）、並びに電気光学コンポーネントを含むことができる。
明瞭にするために、光学コンポーネント・セット１３２及びそのアクチュエータシステム１３３について説明し、もう一方の光学コンポーネント・セット１３４及びそのアクチュエータシステム１３５は同様に設計されているので、これらの要素について個別の説明は行わない。
レーザ光は光シャッタ１２３を通って照射サブシステム１１２内の光源１２２から出て、光学スキャナ装置１４０に誘導され、その光学スキャナ１４０はｘ軸に沿って光ビームを偏向してライトシートを形成し、そのライトシートはｆθレンズ１４１、チューブレンズ１４２、及び照射対物レンズ１４３に向かって誘導される。光学スキャナ装置１４０は入射レーザ光を偏向して、試料１０１内のｘ軸に沿ってライトシート１０２の高さを規定する角度範囲を生成する。そして、光学スキャナ装置１４０はｆθレンズ１４１の焦平面に位置するように位置決めされ、その結果、巨視的ライトシートを生成するので、光学スキャナ装置１４０から出る光ビームの角度はｆθレンズ１４１によってｘ軸に沿った変位又は方向に変換される。この１対のチューブレンズ１４２及び照射対物レンズ１４３はｆθレンズ１４１から出力された巨視的ライトシートを試料１０１における微視的ライトシート１０２に集束させる。照射対物レンズ１４３は比較的長い作動距離の空気対物レンズにすることができる。照射対物レンズ１４３は、単一レンズを含むか或いは複数レンズとその他の光学素子の組み合わせを含む、顕微鏡対物レンズにすることができる。
この説明では、光学スキャナ装置１４０はｘ軸に沿って光ビームを偏向するが、適用例次第で他の軸に沿って光ビームを偏向できることは可能である。例えば、試料１０１を移動させずに容積イメージングを実行する場合、光ビームはｚ軸に沿って偏向させることもできる。その上、ｚ軸に沿って光ビームを偏向して、互いに対してライトシート１０２、１０４を位置合わせすることが可能である。
光学スキャナ装置１４０は１つ以上の可動ミラー１４０によって形成することができる。ミラー１４０は、圧電ドライバなどのアクチュエータの制御下で移動可能なチップ／チルトステージ上に装着することができるか或いはミラーを含むＰｈｙｓｉｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｅ（ＰＩ）によるＳ−３３４ミニチュアピエゾチップ／チルトミラーなどのアクチュエータシステム内に統合することができる。もう１つの実現例として、ミラー１４０は、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによる６２１５ＨＳＭ４０Ｂモデルなどのガルバノメータスキャナを使用して制御することができる。ＸＹスキャンヘッド内で２つのスキャナを組み合わせると、チップ／チルトミラーアセンブリと同じ角度自由度が提供されるが、より高速にすることができる。
圧電ドライバは、電子機器コントローラ１８０内にあるピエゾドライバモジュール及びピエゾサーボモジュールに接続することができる。例えば、ＰＩ Ｓ−３３４は、ミラー１４０の動きを制御するために圧電アクチュエータに電流を出力する増幅器を含むＰＩ Ｅ−５０３ピエゾアンプモジュールと、ＰＩ Ｅ−５０９ピエゾサーボモジュールに接続することができる。ミラー１４０を制御するためのモジュールはいずれも、電子機器コントローラ１８０内のサブコントロールモジュール内に収納することができる。
ｆθレンズ１４１はスキャンミラー１４０の傾斜運動をｘ軸に沿ったレーザビームの変位（図５Ａに矢印で示す）に変換する。チューブレンズ１４２及び照射対物レンズ１４３は、この例ではｚ軸に沿って検出サブシステム１１６、１１８と位置合わせされる試料１０１にレーザビームを集束させる。ｆθレンズ１４１は、例えば、４５０ｎｍ〜６５０ｎｍの波長を有する光について機能するＳｉｌｌ Ｏｐｔｉｃｓによる部品Ｓ４ＬＦＴ４３７５などの色補正したレンズにすることができる。チューブレンズ１４２及び照射対物レンズ１４３は、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｎｉｋｏｎ、又はＯｌｙｍｐｕｓなどの供給業者からの在庫から購入することができる。一例では、チューブレンズ１４２はＯｌｙｍｐｕｓ Ｕ−ＴＬＵ−１−２カメラチューブレンズであり、照射対物レンズ１４３は電子機器コントローラ１８０内の電子機器によって制御される圧電ポジショナ上に装着されたＯｌｙｍｐｕｓ ＸＬＦＬＵＯＲ ４ｘ／３４０／０．２８対物レンズである。例えば、照射対物レンズ１４３は、電子機器コントローラ１８０内で、Ｐｈｙｓｉｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｅによって生産されたＥ−６６５などのアンプ／サーボコントローラによって制御されるＰｈｙｓｉｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｅによって生産されたＰ−７２５ ＰＩＦＯＣなどのロングトラベルスキャナに装着することができる。
更に、図示されていないが、光源１２２、１２４から出力される光ビームは、コントローラ付きの小型照射フィルタホイール（ニューヨーク州ホーソーンのＬｕｄｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｌｔｄ．によって製作されたＤＣサーボコントローラなど）上に装着することができるそれぞれの光学フィルタを通って誘導することができる。
いくつかの実現例では、照射サブシステム１１２内のすべての要素を操作するために必要な電子コンポーネントは電子機器コントローラ１８０内のコンポーネントの第１のセットによって制御することができ、照射サブシステム１１４内のすべての要素を操作するために必要な電子コンポーネントは電子機器コントローラ１８０内のコンポーネントの第２のセットによって制御することができる。これらのセット１３２、１３４内の特定の光学コンポーネントの選択は、通過させ誘導しなければならない光の波長、光が機能する出力、及び開口数又は焦点のサイズなどのその他の要因によって決まる。
検出サブシステム
次に、模範的な検出サブシステム１１６、１１８についてより詳細に考察する。いくつかの実現例では、図３に示されているように、サブシステム１１６、１１８はどちらも同じコンポーネントで設計される。例えば、試料１０１から放出される蛍光ライト（又は光子Ｐ）は対向する検出対物レンズ１５０、１５２によって収集され、それぞれの対物レンズ１５０、１５２からの収集された光はフィルタ１５４、１５６を通過し、このフィルタは検出すべき蛍光ライトの波長を中心とする波長帯域の外側の波長の光を拒絶する。フィルタ１５４、１５６はその他のフィルタとともにフィルタホイール（図示せず）上に装着することができ、従って、拒絶された光の波長は、単にホイールを新しい位置に回転させることによりホイール上の異なるフィルタを選択することによって変更することができるであろう。フィルタ１５４、１５６は、例えば、イリノイ州レークフォレストのＩＤＥＸ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの一部であるＳｅｍｒｏｃｋ， ＩｎｃによるＢｒｉｇｈｔＬｉｎｅ蛍光フィルタなどのショートパス又はバンドパスフィルタにすることができる。
フィルタ１５４、１５６からの光は、カメラ１０６、１０８のセンサ上にその光を集束させるそれぞれのレンズ１５８、１６０を通って誘導される。レンズ１５８、１６０はチューブレンズにすることができる。
検出対物レンズ１５０、１５２は、それぞれが単一のレンズを含むか又は複数レンズとその他の光学素子との組み合わせを含む、顕微鏡対物レンズにすることができる。いくつかの実現例では、検出対物レンズ１５０、１５２は高開口数の水浸対物レンズにすることができる。例えば、対物レンズは、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｎｉｋｏｎ、又はＯｌｙｍｐｕｓなどの供給業者から購入することができる。検出対物レンズ１５０、１５２は、電子機器コントローラ１８０内でコネクタブロックに接続され、それによって制御される、スキャナ１６２、１６４に装着するか又は取り付けることができる。例えば、このスキャナは、ドイツ連邦共和国のＰｈｙｓｉｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｅ （ＰＩ） ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ． ＫＧによって生産されたＰＩＦＯＣ（登録商標）ＰＩ Ｐ−７２５ ＰＩＦＯＣロングトラベル対物レンズ用スキャナなどのピエゾ作動スキャナ（ナノポジショナ）にすることができる。
フィルタホイールはＬｕｄｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｌｔｄ．から購入することができる。例えば、フィルタホイールはＬｕｄｌによって生産された９６Ａ３５４ ６スロットフィルタホイールにすることができる。フィルタホイールは、電子機器コントローラ１８０内でコネクタブロックに接続された１つ以上のサーボコントローラによって操作される。
チューブレンズ１５８、１６０はＣａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｎｉｋｏｎ、又はＯｌｙｍｐｕｓなどの供給業者から購入することができ、カメラ１０６、１０８は科学用ＣＭＯＳ（相補型金属酸化膜半導体）イメージセンサ（ｓＣＭＯＳセンサ）にすることができる。ｓＣＭＯＳセンサは、Ａｎｄｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｐｌｃ．又はＰＣＯ−ＴＥＣＨ Ｉｎｃ．（旧Ｔｈｅ Ｃｏｏｋｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から購入することができる。或いは、ｓＣＭＯＳセンサは、ＨａｍａｍａｔｓｕによるＯｒｃａ Ｆｌａｓｈ ４．０ ｓＣＭＯＳセンサにすることができる。カメラ１０６、１０８は、電子機器コントローラ１８０の一部である、Ｃａｍｅｒａ Ｌｉｎｋ（登録商標）ケーブルなどの１対の標準的なデータ転送ケーブルによって計算システム１９０内の完全構成フレームグラバに接続される。
試料及び支持コンポーネント
次に、試料１０１並びにそれに関連する光学、機械、及び電気コンポーネントの説明を提供する。
図５Ａ及び図５Ｂも参照すると、試料１０１は、試料１０１を照射サブシステム１１２、１１４及び検出サブシステム１１６、１１８のいずれにとっても光学的にアクセス可能にすることができる試料ホルダ１６６に取り付けられる。試料１０１及びホルダ１６６は、試料チャンバ１６８によって規定される中空スペース内に配置することができる。例えば、ホルダ１６６は、中実ベース２０１に装着されたガラス毛管２００を含むことができる。試料ホルダ１６６のベース２０１は医療グレードのステンレス鋼で生産することができる。ホルダ１６６は特注の水封式柔軟試料ホルダにすることができる。
ホルダ１６６は、電子機器コントローラ１８０に接続され、並進ステージ及び回転ステージを提供する位置決めシステムに物理的に取り付けられる。並進ステージは、３つの直交方向に沿って、例えば、ｘ軸、ｙ軸、及びｚ軸に沿って、ホルダ１６６及びその結果、試料１０１を並進させるようにセットアップすることができる。回転ステージは、ｘ軸の周りでホルダ１６６及びその結果、試料を回転させるようにセットアップすることができる。位置決めシステムは試料チャンバ１６８の内部又は外部にすることができる。
ホルダ１６６及びチャンバ１６８のうちの１つ以上は、試料１０１を特定の温度に維持するために一体型ペルティエ冷却器、加熱器、又は熱電ポンプなどの熱電冷却装置に接続することができる。
照射サブシステム１１２、１１４及び検出サブシステム１１６、１１８内の対物レンズは、試料１０１が位置決めされて位置する、チャンバ１６８の中心領域に向けられる。この実現例では、照射サブシステム１１２、１１４の軸（ｙ軸である）は検出サブシステム１１６、１１８の軸（ｚ軸である）に垂直に配向される。
いくつかの実現例では、ホルダ１６６（及びその結果、試料１０１）用の位置決めシステムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓによって生産されたＮＩ ＰＸＩ−７３５４モーションコントローラなどの高性能ステッパ及びサーボモーションコントロールにすることができる。このコントロールは、Ｐｈｙｓｉｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｅ （ＰＩ） ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ． ＫＧによって生産されたＣ−８０９．４０ ４チャネルサーボアンプ／モーション入出力インターフェースなどの電子機器コントローラ１８０内のインターフェースに接続することができる。
チャンバ１６８は試料１０１及びホルダ１６６を収容するのに十分な大きさの体積を有する内部中空スペースを有し、例えば、４つの対物レンズによる同時ライトシート照射及び蛍光検出を可能にするためにすべての側面から完全光学アクセス可能なチャンバである。完全光学アクセス及び改善された試料位置決め制御（３次元の並進及び１次元の回転）は、顕微鏡サブシステムを２つの水平層に分割することによって実現することができる。例えば、すべての光学系は上部層に位置することができ、試料位置決めシステムは下部光学テーブル上の試料チャンバ１６８の下に位置することができるであろう。試料位置決めシステムは、（例えば、ｘ軸に沿って）直立位置に構成することができ、従って、ホルダ１６６のガラス毛管２００内の試料包埋のために例外的に柔らかい（０．４％）アガロースゲルの使用が可能になる。イメージング中の機械的安定度は、主として毛管が装着されているホルダ１６６の中実ベースによって提供される。
チャンバ１６８は、照射及び検出のために十分なビュー、この例では４つのビューを提供するように特注設計し構築することができる。これは灌流システムを含むことができる。試料チャンバ１６８は、試料ホルダ１６６を収納し、試料ホルダ１６６を試料位置決めシステム及び特注灌流システムに接続するためのマルチステージアダプタモジュールも収納することができる。位置決めシステムを使用すると、ホルダ１６６は、水封を破らずに３次元に並進し、その主軸（ｘ軸）の周りで回転することができる。チャンバ１６８は、水浸検出対物レンズを収容するために２つの対向する側に開いており、レーザ・ライトシート照射のために残りの２つの側にカバーガラス付きの２つのウィンドウを含む。チャンバ１６８の上部は、機械又は光学アクセスのために開いており、冷光源による背景照射を可能にする。チャンバ１６８は、デュアルチャネルの１２ローラポンプ（例えば、マサチューセッツ州ホリストンのＨａｒｖａｒｄ ＡｐｐａｒａｔｕｓによるＲＥＧＬＯ）によって操作される灌流システムに接続された入口及び出口弁を有する。このポンプは、Ｔｙｇｏｎ（ＴＭ）チューブなど、化学薬品に対するあるレベルの耐性を有する透明で柔軟なチューブによってチャンバ１６８に接続することができ、このチューブは試料１０１の温度制御及び酸素化のためにベンチトップインキュベータ（ＴｅｓｔＥｑｕｉｔｙのモデル１０７ベンチトップ環境チャンバ）を通って誘導される。
いくつかの実現例では、試料位置決めシステムは、チャンバ１６８内の試料ホルダ１６６に磁気的に接続することができる。
上述の通り、チャンバ１６８は、試料１０１のための生理的条件を維持するために、所望の速度でチャンバ１６８の空洞内の緩衝蒸気の交換の可能にするポンプである特注の灌流システムも含むことができる。このような灌流システムは、例えば、マウスの胚など、培養するのが困難である可能性がある試料１０１による長期のイメージング実験のために、或いは周囲の媒体における温度、ｐＨ、酸素濃度、糖類、及びアミノ酸など、安定した環境条件を必要とするイメージングのために、有益である可能性がある。灌流システムは、チャンバ並びに試料１０１の周りの環境の温度調節を可能にするためにチャンバ１６８に熱的に接続された温度制御システムと組み合わせて使用することができる。
電子機器コントローラ
図６を参照すると、顕微鏡１１０のすべての光学及び機械コンポーネント（照射サブシステム１１２、１１４、検出サブシステム１１６、１１８、又は試料ホルダ１６６及び試料チャンバ１６８内のものなど）は、電子機器コントローラ１８０内に設けられた高性能リアルタイム電子機器コントローラ６５０によって操作され同期化される。リアルタイムコントローラ６５０は、計算システム１９０と通信して、３５０メガバイト／秒の速度で同時画像収集ワークフローを調整する。また、電子機器コントローラ１８０は、カメラ１０６、１０８に直接接続するために特殊なカメラリンク６６０も含むことができる。
光学顕微鏡１１０内の光学、機械、及び電気コンポーネントのすべてはコントローラ６５０内のコンポーネントに接続され、顕微鏡の「アーム」のそれぞれでリアルタイム制御を行い、それぞれのアームは照射サブシステム１１２、１１４又は検出サブシステム１１６、１１８のいずれかのものである。また、コントローラ６５０は、２つのライトシート１０２、１０４及びそれぞれの焦平面の急速相対位置決め及び配向のための自動位置合わせモジュールも含む。コントローラ６５０は、光学顕微鏡の様々な光学、機械、及び電気コンポーネントを変更して、蛍光信号を最適化するために２０動作自由度を提供する。
一般的な一態様では、リアルタイム電子機器コントローラ６５０は、テキサス州オースティンのＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ によるＰＸＩ−８１１０ ２．２ＧＨｚ Ｑｕａｄ Ｃｏｒｅ組み込みコントローラなどのリアルタイムコントローラである。このコントローラは、ＬａｂＶＩＥＷ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅオペレーティング・システムを実行することができ、ＢＮＣコネクタブロック（同じくＮａｔｉｏｎａｌ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓによるＢＮＣ−２１１０シールドコネクタブロックなど）にリンクされた３つの入出力インターフェースボード（同じくＮａｔｉｏｎａｌ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓによるＰＸＩ−６７３３高速アナログ出力８チャネルボードなど）並びにシリアルインターフェースボード（同じくＮａｔｉｏｎａｌ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓによるＰＸＩ−８４３２／２など）を装備している。リアルタイムコントローラ６５０は、ギガビット・イーサネットなどの高速データ伝送により計算システム１９０と通信する。
リアルタイムコントローラ６５０に加えて、電子機器コントローラ１８０は、個別のコントローラ上にモーションコントローラとアナログ及びデジタル入出力チャネルも含むことができる。モーションコントローラはＮａｔｉｏｎａｌ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓによるＰＸＩ−７３５４モーションコントローラにすることができ、これは、それぞれ８つのアナログ出力と８つのデジタル入出力チャネルとを有する、Ｎａｔｉｏｎａｌ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓによるＰＸＩ−６７３３コントローラなどの複数の入出力コントローラを含むことができる。
すべての時間制約型タスクは電子機器コントローラ１８０内で実行することができ、残りのタスク（カメラ１０６、１０８によって記録されたフレームを収集し可視化することなど）は計算システム１９０に割り当てられる。
計算システム
もう一度図６を参照すると、計算システム１９０は、データを記憶し、検索し、処理する能力を有するワークステーションなどのコンピュータを含むことができる。従って、このコンピュータは、モニター又はプリンタなどの１つ以上の出力装置６００と、キーボード、マウス、タッチディスプレイ、又はマイクロホンなどの１つ以上のユーザ入力インターフェース６０２と、特定のタスクを実行するための専門ワークステーションを含む１つ以上の処理装置６０４と、メモリ（例えば、ランダムアクセスメモリ又は読み取り専用メモリ或いは仮想メモリなど）６０６と、ハードディスクドライブ、ソリッドステートドライブ、又は光ディスクなどの１つ以上の記憶装置６０８などのハードウェアを含む。処理装置は、スタンドアロンプロセッサにすることができるか、或いは本来的にワークステーションなどのサブコンピュータにすることができる。
専門ワークステーションは、メモリに加えて、実装されている処理装置と、特定のタスクを実行するためのソフトウェアとを含む。専門ワークステーションとしては、画像収集ワークステーション６１０、画像処理ワークステーション６２０、及び任意選択の画像セグメント化追跡ワークステーション６３０を含む。
記憶装置６０８は、とりわけ、画像収集ワークステーション６１０から情報を受け取り、追加の処理能力のためにそれ自体のプロセッサを受け入れるように装備されている画像データ管理記憶ユニット６１８を含む。
ワークステーションはそれ自体のソフトウェアモジュールを含み、そのモジュールは電子機器コントローラ１８０内のハードウェアに何を実行すべきかを指示する１組の命令を含む。
計算システム１９０は、数日間の連続画像収集を伴う高速イメージング実験のために設計される。計算システム１９０は、試料あたり１０テラバイトまでの全データセットサイズで中断なしの高速イメージングセッションにおいて百万枚を超える高解像度画像を記録することができる。高速記録を可能にするために、画像収集ワークステーション６１０を画像データ管理ユニット６１８及びコントローラ６５０に接続するラインのそれぞれは、ガラスファイバ・ネットワークパイプラインとしてセットアップし、１０ギガビット／秒のデータ速度を提供し、従って、長期イメージングセッションのために一千万枚までの高解像度画像又は試料１０１あたり１００テラバイトの記録を可能にすることができる。画像データ管理ユニット６１８が１０：１という平均比率を有する３次元ウェーブレット圧縮技法を使用する場合、１ペタバイトの最大記録容量を実現することができる。
画像収集ワークステーション６１０及びマルチビュー画像処理ワークステーション６２０は、それぞれ内容ベースの画像登録及びマルチビュー画像融合のために開発され、これは約２００メガバイト／秒の速度で生画像データを処理するための光学実現例に関する従来の知識を効率的に取り入れている。画像収集ワークステーション６１０は、リアルタイム画像登録が可能であり、大規模データ管理のために画像処理ワークステーション６２０と統合される。計算システム１９０は複数のビューを同時に取得するので、イメージングボリュームＩＶ内の基準マーカの必要なしに、画像収集ワークステーション６１０内で高速かつ正確な画像登録（画像の位置合わせ）が達成される。
一実現例では、計算システム１９０は、３．３ＧＨｚで動作する処理装置６０４内の１２個の物理的コアプロセッサを有し、メモリ６０６内の６４ギガバイト（ＧＢ）のＲＡＭにアクセスする、Ｗｉｎｄｏｗｓベースのパーソナルコンピュータである。処理装置６０４はＬａｂＶＩＥＷ（登録商標）Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ Ｓｕｉｔｅを実行することができる。また、メモリ６０６は、２×５ＴＢという全容量を有する複数のハードディスクドライブからなる高速ＲＡＩＤシステム（それぞれ６００ＧＢの容量を有する２２個のハードディスクがそれぞれ２ディスクの冗長性で２つのＲＡＩＤ−６アレイに結合されている）と、２つのＮＩ ＰＣＩｅ−１４２９完全構成フレームグラバも含むことができる。２つの仮想ディスクドライブを有することにより、それぞれのカメラ１０６、１０８に１つのドライブを割り当てること又は単一のカメラ１０６、１０８のみを使用して両方のドライブに交互に画像を書き込むことが可能になる。しかし、典型的に、１回の実験に両方のカメラ１０６、１０８が使用される。
以下の説明では、デカルト座標系を形成するために検出サブシステム１１６、１１８の光軸としてｚ軸を参照し、照射サブシステム１１２、１１４の光軸としてｙ軸を参照し、残りの軸としてｘ軸を参照して、計算システム１９０におけるワークフローについて短い説明を提供する。
一般に、画像収集ワークステーション６１０は画像の登録を実行し、これはカメラ１０６、１０８からの画像を位置合わせするプロセスである。一般に、画像処理ワークステーション６２０は画像の融合を実行し、これは登録画像（ｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ ｉｍａｇｅ）を単一の表現又は画像に結合するプロセスである。特に、画像の情報内容を単一の画像に結合することによって画像が融合される。融合に関する詳細については以下に述べる。
画像データ管理ユニット６１８は、６００メガバイト／秒の持続的データストリーミング、１００テラバイトサイズのデータセットの中断なしの長期画像収集、及びウェーブレットベースの損失なしの画像圧縮（例えば、１０倍）のための高スループット画像記憶パイプラインを提供する。
いくつかの実現例では、画像収集ワークステーション６１０は、画像を処理するためにカメラ１０６、１０８のそれぞれについて１つずつ、１対の６コア中央処理装置（ＣＰＵ）を含む。ＣＰＵは、例えば、カリフォルニア州サンタクララのＩｎｔｅｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入されたＸｅｏｎ（登録商標）プロセッサＸ５６８０にすることができる。また、画像収集ワークステーション６１０は、画像リングバッファ及びオンライン処理のためのＲＡＭ（例えば、Ｋｉｎｇｓｔｏｎによる１４４ＧＢ ＤＤＲ−３ ＲＡＭ）などの専用のメモリ、高速画像収集のために２２個のＳＡＳ−２ハードディスク（例えば、ＳｅａｇａｔｅによるＣｈｅｅｔａｈ １５Ｋ．７）がＲＡＩＤ−６に結合された２４チャネルＲＡＩＤコントローラ（例えば、Ａｄａｐｔｅｃによる５２４４５モデル）、オンラインデータストリーミングのための１０ギガビットファイバネットワークアダプタ（例えば、Ｉｎｔｅｌ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＥＸＰＸ９５０１ＡＦＸＳＲなど）、ＧＰＵベースの処理のためのグラフィックスアダプタ（例えば、Ｎｖｉｄｉａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＧｅＦｏｒｃｅ ＧＴＸ４７０など）、２つのカメラリンク・フレームグラバ（例えば、Ｎｅｏｎ、ＢｉｔＦｌｏｗ、又はＮａｔｉｏｎａｌ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓのＰＣＩｅ−１４２９など）、及びサーバボード（例えば、ＳｕｐｅｒｍｉｃｒｏのＸ８ＤＡＨ＋−Ｆなど）も含むことができる。
画像収集ワークステーション６１０は、光ファイバにより生のマルチビューデータストリームを画像処理ワークステーション６２０及び画像データ管理ユニット６１８にリレーする。ワークステーション６１０で使用されるソフトウェアは、高スループットマルチビュー画像処理及びリアルタイム画像データ管理を提供するために、例えば、Ｍａｔｌａｂ及びＣ＋＋で作成することができる。
いくつかの実現例では、画像処理ワークステーション６２０は、１対の６コアＣＰＵ（例えば、カリフォルニア州サンタクララのＩｎｔｅｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入されたＸｅｏｎ（登録商標）プロセッサＸ５６８０など）、９６ＧＢ ＤＤＲ−３ ＲＡＭ（Ｋｉｎｇｓｔｏｎ）、オペレーティング・システムのために２つのＳＡＳ−２ハードディスク（ＴｏｓｈｉｂａのＡＬ１１ＳＥ １４７ＧＢ）がＲＡＩＤ−１に結合され、画像データバッファのために１０個のＳＡＳ−２ハードディスク（ＴｏｓｈｉｂａのＡＬ１１ＳＥ ６００ＧＢ）がＲＡＩＤ−６に結合された１６チャネルＲＡＩＤコントローラ（Ａｄａｐｔｅｃの５１６４５）、オンラインデータストリーミングのための１０ギガビットファイバネットワークアダプタ（Ｉｎｔｅｌ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＥＸＰＸ９５０１ＡＦＸＳＲ）、ＧＰＵベースの処理のための高性能グラフィックスアダプタ（Ｎｖｉｄｉａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＱｕａｄｒｏ ＦＸ５８００）、及びサーバボード（Ｉｎｔｅｌ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＳ５５２０ＳＣ）を含む。
上述の通り、画像データ管理ユニット６１８は、ギガビット光ファイバによって画像収集ワークステーション６１０及び画像処理ワークステーション６２０に接続され、トリプルチャネルＳＡＳインターフェース及び１０ギガビットファイバネットワークアダプタ（Ｉｎｔｅｌ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＥＸＰＸ９５０１ＡＦＸＳＲ）並びに２つの２４ディスクＲＡＩＤ格納装置（ＩｎｆｏｒｔｒｅｎｔのＥＳＤＳ Ａ２４Ｓ−Ｇ２１３０）を備えたラックマウント・サーバを含む。ＲＡＩＤ格納装置は４８個のＳＡＴＡ−２ハードディスク（ＨｉｔａｃｈｉのＵｌｔｒａｓｔａｒ Ａ７Ｋ２０００）を装備し、これらは長期イメージング実験及び収集後のウェーブレット圧縮データ記憶のための２つのＲＡＩＤ−６アレイを形成する。
手順
図７を参照すると、手順７００は、複雑な生物試料１０１をイメージングするために顕微鏡システム１００によって実行される。最初に、生物試料１０１が準備される（７０２）。生物試料１０１は、化学的かつ生物学的に試料を準備し、試料をホルダ１６６に物理的に移送又は装着し、チャンバ１６８の内部にホルダ１６６を配置することにより、準備される（７０２）。
顕微鏡１１０は、例えば、ライトシート１０２、１０４の特性（位置合わせなど）を調節することにより、準備される（７０４）。顕微鏡１１０が準備されると、ライトシート１０２、１０４が生成される（７０６）。ライトシート１０２、１０４は、試料１０１内で空間的及び時間的オーバラップが発生するように、生物試料１０１を通って誘導される（７０８）。照射の開始及び蛍光の記録は、受精卵から複雑系への発達において生物試料１０１のイメージングを可能にするために、受精卵が形成された瞬間に開始することができる。
生物試料１０１から放出された蛍光は、生物試料１０１全体が捕捉されるまでカメラ１０６、１０８によって記録される（７１０）。次に、生物試料１０１のイメージングを続行しなければならないかどうかが判断される（７１２）。例えば、イメージングは、通常、発達中の胚内で強い筋収縮が始まるまで続行することができ、その時点で、試料１０１がより物理的にアクティブになり、イメージングするのがより困難になる可能性があるので、イメージングを停止することができる。しかし、この発達ポイントを過ぎてもイメージングを続行できることは可能である。
イメージングを続行する場合（７１２）、ライトシートと生物試料１０１との相対位置合わせがリセットされ（７１４）、蛍光がもう一度記録される（７１０）。生物試料１０１の画像が作成され（７１６）、追加の後処理を実行することができる（７１８）。
次に、生物試料１０１の準備（７０２）に関する考察を図５Ｂに関連して提供する。一例として、必要に応じて、薬品、標識付きタンパク質（蛍光体など）、又は抗体などの何らかの物質を試料１０１に顕微注射５００することができ、絨毛膜除去（即ち、その後のイメージングを可能にするために絨毛膜（又は最も外側の膜）を一掃又は除去することができる）を行うこともできる。ホルダ１６６がガラス毛管２００を含む場合、アガロースゲルなどの液体５０５で毛管２００を事前充填することができ、次に試料１０１を毛管２００内に慎重に移送５１０することができる。
毛管２００内に移送した後、その軸の１つ（その前後軸など）が毛管２００の対称軸に平行の配向になるように、毛管２００内にあるアガロースゲル５０５内で試料１０１を中心に置き、適切な配向にすることができる。その上、このステップ中に試料１０１を安定した温度に維持することができる。ゲルが落ち着けるようにした後、試料１０１を含むゲル５０５のセクションを毛管２００から強制的に取り出して５１５、図５Ａ及び図５Ｂの図に示されているように、試料１０１への完全光学アクセスを可能にすることができる。次に、その対称軸が顕微鏡１１０のｘ軸と位置合わせするように、試料１０１がゲル５０５内に埋め込まれている毛管２００をベース２０１に装着５２０することができる。そして、毛管２００並びにゲル５０５内に埋め込まれた試料１０１を備えたベース２０１がチャンバ１６８内に装着５２５される。
顕微鏡は、顕微鏡１１０の以下の諸相のうちの１つ以上を調節することによって準備７０４することができる。例えば、装着された生物試料１０１を通過するｙ軸から離れるそれぞれのライトシート１０２、１０４の変位を調節することができる。装着された生物試料１０１を通過するｙ軸に対するそれぞれのライトシート１０２、１０４の傾斜を調節することができる。ライトシート１０２、１０４の相対強度を調節することができる。装着された生物試料１０１を通過するｚ軸に対する検出サブシステム１１６、１１８のそれぞれの傾斜及び変位のうちの１つ以上を調節することができる。検出サブシステム１１６、１１８のそれぞれの相対検出効率を調節することができる。
ライトシート１０２、１０４は、光学スキャナ装置１４０を使用する急速レーザスキャンによって生成される（７０６）。ライトシート１０２、１０４は、それぞれのライトシートが生物試料１０１内であって依然として時間的オーバラップの範囲内である別個の時点に到達するように閉じられる持続波ライトシートから生成することができる。ライトシート１０２、１０４はパルス波ライトシートから生成することができ、同時発生的に活動化することができる。
一光子励起を使用する一実現例の場合、ライトシート１０２、１０４の活動化は、任意の瞬間にイメージングされるそれぞれのｚ平面について２つの照射サブシステム１１２、１１４内で交互に行うことができる。例えば、一光子励起による連続照射を使用する場合、ライトシート１０２、１０４を互い違いに配置するために、照射サブシステム１１２、１１４の両方において高速レーザシャッタを使用することができる。
二光子励起を使用する一実現例の場合、照射プロセスにおける光散乱は最小限であり、蛍光励起は画像ボリュームＩＶに空間的に限られるので、中央領域１０３の外側における生物試料１０１内の画像品質の劣化はほとんど発生せず、従って、照射サブシステム１１２、１１４は同時発生的に活動化することができる。その上、それぞれのライトシート１０２、１０４からの蛍光寄与の重大なオーバラップなしに連続画像を得るのに十分なだけ、それぞれのライトシート１０２、１０４の２つの焦点ボリュームをわずかに変位させることは可能である。一光子励起とは対照的に、ライトシートが幅広になりすぎると二光子励起は効果的に抑制されるので、照射経路に沿った蛍光信号寄与のボケは全く発生しない。
一光子励起の場合、４８８ｎｍで動作するレーザは、ショウジョウバエ胚のライブイメージングにおいて数百μＷの出力に設定することができる。これは、取得した画像対あたり約７〜１０μＪの光エネルギに試料を曝すことに対応し、或いは記録された時点ごとに試料全体の４ビュー画像データセットにおいてすべての画像を取得する場合は約１〜３ｍＪに対応する。二光子励起の場合、９４０ｎｍの励起波長でショウジョウバエ胚のライブイメージングを実行するために約３００ｍＷのレーザ出力を使用することができる。
ライトシート１０２、１０４は、図１Ｂに概略的に示されているように、生物試料１０１内で空間的及び時間的オーバラップが発生するように試料１０１を通って誘導される。最初に、ライトシート１０２、１０４は、図８Ａに示されているように基礎となるｘ−ｙ画像平面（ｚＡに位置する）に沿って誘導することができる。
生物試料１０１から放出された蛍光はカメラ１０６、１０８によって画像として検出され、この画像データは電子機器コントローラ１８０によって受け取られ、適切に処理され、次に計算システム１９０内で記録される（７１０）。
試料１０１のそれぞれのｘ−ｙ画像平面における蛍光は、試料１０１全体が捕捉されるまで記録される（７１０）。例えば、ｚＡ画像平面における蛍光が記録された後（図８Ａを参照）、生物試料１０１とライトシート１０２、１０４との間のｚ軸に沿った相対配置は、次のｘ−ｙ画像平面を記録できるようにｚ軸に沿って１ステップ分だけ変更される。このようにして、生物試料１０１から放出された蛍光は、生物試料１０１のｘ−ｙ画像平面のそれぞれにおいて増分式に記録される。
例えば、図８Ｂでは、ｚＢに位置するｘ−ｙ画像平面において蛍光が記録され、図８Ｃでは、ｚＣに位置するｘ−ｙ画像平面において生物試料１０１から放出された蛍光が記録され、図８Ｄでは、ｚＤに位置するｘ−ｙ画像平面において生物試料１０１から放出された蛍光が記録される。
いくつかの実現例では、ライトシート１０２、１０４及び検出サブシステム１１６、１１８を固定状態で維持しながら、生物試料１０１をｚ軸に沿って複数ステップで移動させることにより、生物試料１０１とライトシート１０２、１０４との間の相対配置を変更することができる。この方法の利点の１つは、生物試料１０１を移動させるリニアモータがライトシート１０２、１０４及び検出サブシステム１１６、１１８を制御するアクチュエータより大きいトラベルレンジを有するので、より大きいイメージングボリュームを記録することが可能であることである。
その他の実現例では、生物試料１０１を固定状態で維持しながら、ライトシート１０２、１０４及び検出サブシステム１１６、１１８をｚ軸に沿って複数ステップで同時発生的に移動させることにより、生物試料１０１とライトシート１０２、１０４との間の相対配置を変更することができる。このより高速のイメージング方法の利点の１つは、ライトシート１０２、１０４及び検出サブシステム１１６、１１８を制御するアクチュエータの方が生物試料１０１を作動させるリニアモータよりかなり高速であるので、イメージングするのにより高速になりうることである。このイメージング方法のもう１つの利点は、ｚ軸に沿ったそれぞれのステップで最適か又は改善された画像品質を提供するために移動している時にライトシート１０２、１０４の位置を調節することができ、従って、試料１０１の全域で画像品質の改善を提供することができることである。
カメラ１０６、１０８が科学用ＣＭＯＳ（ｓＣＭＯＳ）であるいくつかの実現例では、１つの画像を取得するために、カメラ１０６、１０８の露光時間を０．１〜１０ミリ秒（ｍｓ）に設定することができる。この場合、ｓＣＭＯＳカメラのトリガモードの特定の特性により、典型的な画像収集時間は、ライトシート１０２、１０４をスキャンし、処理のために画像のデータを計算システム１９０に転送するための時間を含む、約１０〜３０ｍｓの範囲を有する。
いくつかの実現例では、カメラ１０６、１０８の両方が同期化され、即ち、２つの画像が収集時間範囲内で同時に記録される。従って、ｓＣＭＯＳカメラの場合、２０４８×２０４８ピクセル、即ち、４メガピクセルの画像サイズで、約２×１００画像／秒の速度で記録することが可能である。
上記のより高速のイメージング方法を使用すると、１〜３秒の時間枠内で（ｚ軸に沿って）約２００μｍの厚さを有する生物試料１０１の３次元データセット全体を記録することが可能である（７１０）。
いくつかの実現例では、生物試料１０１全体の画像のデータ取得が完了した後、計算システム１９０は生物試料１０１の画像を作成する（７１６）。上述の通り、いくつかの実現例では、胚内で強い筋収縮が始まると画像のデータ取得を完了することができる。しかし、何をイメージングする必要があるかによって、発達中のこの時点より前又は後にデータ取得を停止することが可能である。
その他の実現例では、計算システム１９０は顕微鏡１１０によるデータの取得中にデータを処理する。例えば、顕微鏡１１０が次のｘ−ｙ画像平面において蛍光を記録し続けている間に計算システム１９０がデータを処理しているように、特定のｘ−ｙ画像平面において生物試料１０１全体からの蛍光が捕捉された後に記録された（７１０）すべてのデータを処理するように計算システム１９０をセットアップできることが可能である。画像の作成と蛍光の記録をマルチタスク処理するためのその他のセットアップも可能である。
単純にするために、以下の考察では、ステップ７１６でイメージングが完了し、生物試料１０１の画像を作成するためにすべてのデータが収集されたものと想定する。
図９も参照すると、顕微鏡システム１００は、取得され記録された（７１０）ｘ−ｙ画像平面のそれぞれにおいて生物試料１０１の画像を作成するための模範的な手順７１６を実行する。例えば、図８Ａ〜図８Ｄにそれぞれ示されているｚＡ、ｚＢ、ｚＣ、及びｚＤの模範的な値に対応するｘ−ｙ画像平面のそれぞれにおいて生物試料１０１の１つの画像が作成される。
最初に、検出サブシステムの１つがイメージングすべき第１のビューとして設定される（９００）。例えば、検出サブシステム１１６（図１０Ａに示されている通り）はイメージングすべき第１のビューとして設定することができる。
この設定ビュー（検出サブシステム１１６）で記録された生物試料１０１の画像が登録される（９０２）。これは、検出サブシステム１１６によって捕捉又は記録され、計算システム１９０内で記憶される画像が互いに位置合わせされることを意味する。特に、ライトシート１０２による生物試料１０１の照射から得られた画像がライトシート１０４による生物試料１０１の照射から得られた画像と位置合わせされる。
何らかの実現例では、設定ビューでの登録は以下の手順を伴う可能性がある。具体的には、画像収集ワークステーション６１０は、データ補間を実行し、ライトシート１０２による照射から得られた生物試料１０１の記録画像（ｒｅｃｏｒｄｅｄ ｉｍａｇｅ）とライトシート１０４の照射から得られた生物試料１０１の記録画像を包む３次元マスクを計算する。包絡線の平滑化のためにガウスフィルタを使用することができる。結合されたマスクを使用すると、入射ライトシートの軸（ｙ軸）に沿った生物試料１０１の幾何学的中心はｘ，ｚ平面内の位置の関数として計算される。結果として生じる２次元座標マトリックスは、光学照射光路のｙ中心を１次近似におけるｘ，ｚ平面内の位置の関数として示すものである。このマトリックスを使用すると、約１０ピクセルの厚さのスライスが抽出され、バックグラウンド補正され、両方の画像について登録される。サブピクセル精度のｚ並進及びｙ回転を唯一の自由度として考慮すると、最適変換設定が決定される。
この第１の登録ステップのために光学光路の中心でデータスライスを選択することは、ｘ，ｚ平面に関する左右光学相称を有する生物試料１０１（ショウジョウバエ及びゼブラフィッシュ胚など）に有用であり、生物試料１０１の３次元光学特性に関する詳細な知識がない場合に一般的に妥当な開始点になる。ライトシート１０２による照射から得られた記録画像の座標系は基準又は第１のチャネルを構成することができ、ライトシート１０４による照射から得られた画像のデータ（第２のチャネル）は登録スライスについて決定された変換パラメータのグローバル適用により基準チャネルの座標系に変換することができる。
画像処理ワークステーション６２０はその後、登録スライスにおける平均強度を決定し、対応する強度補正係数を第２のチャネルに適用する。
次に、設定ビューにおける登録画像を融合して（９０４）この設定ビューにおける融合画像（ｆｕｓｅｄ ｉｍａｇｅ）を形成し、これは、登録画像の情報内容が１つの画像の単一表現に結合されることを意味する。例えば、大きい物体の異なる部分又は構造物が異なる登録画像で捕捉され、これらの画像がそれぞれの情報内容に関して互いに補完する場合、これらの画像の融合は、同時にしかも寄与する個々の画像に存在する分解能又は詳細レベルでこれらの部分又は構造物のすべてを示す単一融合画像を生成する。
何らかの実現例では、設定ビューでの登録画像の融合は以下の手順を伴う可能性がある。画像処理ワークステーション６２０は、Ｄａｕｂｅｃｈｉｅｓ Ｄ４基底によるグローバル５レベルウェーブレット分解（最大品質の場合）、登録マトリックスの座標に対する２０ピクセル遷移領域における線形混合（複雑な光学特性を有する大型凸状試料の場合）、又はグローバル演算平均（最大速度の場合）という３つの方法のうちの１つによって２つのデータセットを融合する。
次に、イメージングされた生物試料１０１について他のビューが存在するかどうかが判断され（９０６）、存在する場合、他の検出サブシステムがイメージングすべきビューとして設定される（９０８）。例えば、検出サブシステム１１８（図１０Ｂに示されている通り）は次にイメージングすべきビューとしてステップ９０８で設定することができる。
この設定ビュー（検出サブシステム１１８）で記録された生物試料１０１の画像が登録され（９０２）、次に、上述の通り、この設定ビューにおける登録画像を融合して（９０４）この設定ビューにおける融合画像を形成する。
イメージングされた生物試料１０１について取られたその他のビューが全くないと判断された場合（９０６）、計算システム１９０は、それぞれのビューにおいて形成された融合画像（又は融合データセット）を登録する（９１０）。従って、２つのビューのみ存在する上記の例では、図１０Ｃに示されているように、検出サブシステム１１６によって取られたデータから得られた融合画像は検出サブシステム１１８によって取られたデータから得られた融合画像と位置合わせされる。
例えば、画像収集ワークステーション６１０は、包絡線の平滑化のためにガウスフィルタを使用して、２つの融合データセット内の記録された生物試料１０１を包む３次元マスクを計算する。結合されたマスクを使用すると、検出サブシステムの軸（ｚ軸）に沿った試料１０１の幾何学的中心は（ｘ，ｙ）の位置の関数として計算される。結果として生じる２次元座標マトリックスは、光学検出光路のｚ中心を１次近似における（ｘ，ｙ）の位置の関数として示すものである。次に、この座標マトリックスを使用して、融合データセットから１０ピクセルの厚さのスライスを抽出する。サブピクセル精度のｘ及びｙ並進並びにｚ回転を自由度として考慮すると、この２つのスライスの登録のための最適変換設定が決定される。
２つの検出サブシステム１１６、１１８は典型的にこの位置で比較可能な画像品質を提供するので、光学検出光路の中心にある領域を第２の登録ステップのために使用することができる。サブシステム１１６に関する融合データセットは基準データセットを構成する。サブシステム１１８に関する融合データセットは、登録スライスについて決定された変換パラメータのグローバル適用によって基準データセットの座標系に変換される。
次に、計算システム１９０は、これらの位置合わせされた（登録された）融合データセットを、生物試料１０１内でライトシート１０２、１０４の空間的及び時間的オーバラップに対応する試料１０１の画像ｘ−ｙ平面を表す最終画像に融合する（９１２）。
一例として、画像処理ワークステーション６２０は、２つの検出サブシステム１１６、１１８のそれぞれにおいて登録画像を融合するための上記の手順に対する直接類推で、これらの検出サブシステム１１６、１１８に関する位置合わせされた（登録された）融合データセットについて操作する。
例えば、図１１に示されているように、生物試料１０１から放出され、ｚＣに等しいｚに位置するｘ−ｙ画像平面において記録された蛍光の場合（図８Ｃに示されている通り）、最終画像１１１１は、ｚ＝ｚＣという値において生物試料１０１によるスライスについて作成される。生物試料１０１の画像は、ｚステップに沿ってイメージングされたそれぞれのｘ−ｙ画像平面について作成される。これらの画像のすべてについて最大値投影を作成して生物試料１０１の３次元画像を形成することは可能である。
同じく図１１に示されているように、記録画像１１１１の小領域１１１３について、任意の単位で測定された（ｔ（ｉ），ｔ（ｉ＋ １００），ｔ（ｉ＋２００），ｔ（ｉ＋３００），ｔ（ｉ＋４００））という特定の時間間隔で時系列が取られる。この時系列は、試料１０１の１つの分裂周期（第１３分裂周期など）中の核力学を示している。顕微鏡システム１００は、生物試料１０１全体で細胞核内の染色体を定量的に解明する、このような画像を生成することができる。この例では、模範的な時間間隔が示されているが、以下の諸例で述べるように、より多くの時間間隔を捕捉することができる。
要約すると、手順７００は同時４ビューイメージングデータを提供する。これは、計算システム１９０内の計算インフラストラクチャを大いに利用するためにマルチスレッドを使用し、完全処理モードで動作する時に２００メガバイト／秒の画像データ処理速度を達成し、補間変換パラメータを使用する時に４倍高い速度を達成する。
これらの変換パラメータの計算及び画像融合は、計算システム１９０内のワークステーションによって実行することができ、例えば、Ｍａｔｌａｂ及び／又はＣ＋＋などの任意の適切なプログラミング言語でコード化することができる。この概念分離により、それぞれのモジュールにおける特定のデータタイプに関連する自由度のみを考慮し、従って、マルチビュー融合をより効率的に実行することができる。
上述の通り、後処理を実行することができる（７１８）。後処理は、計算システム１９０によって実行されるステップを伴う場合もあれば、オペレータによって実行されるステップを伴う場合もある。
例えば、図１２Ａ及び図１２Ｂに関連して説明すると、アガロースゲル５０５内に埋め込むことができる生物試料１０１は、幼生１２０１の通常の孵化の制御のために解剖顕微鏡に転送することができる。生物試料１０１（ここでは幼生１２０１である）は生理学的発達を検証するためにモニターすることができるであろう。
もう１つの例として、計算システム１９０は、作成された２次元画像の「スタック」から単一画像を作成することができ、その画像のスタックはステップ９１２でそれぞれのｚステップについて作成されたそれぞれの画像に対応する。この単一画像は、スタック全体を通して最大ピクセル強度レベルを単一平面上に投影することによって作成することができる。この単一画像は、顕微鏡システム１００によって記録された３次元データの２次元可視化であると見なすことができ、記録の概要を提供することができる。
実施例
ショウジョウバエ胚のマルチビューイメージング
細胞レベル下の解像度で発達中のショウジョウバエ胚の同時マルチビューイメージングを実行するために顕微鏡システム１００を使用した。
図１３Ａを参照すると、顕微鏡システム１００を使用して一光子励起により核標識ステージ１６ショウジョウバエ胚（背部側が上）の同時マルチビューインビボ記録からの光学スライスが得られる。ステージ１６胚は、特定の数の発達サイクル（細胞分裂又は有糸分裂など）を経て、現在、特定の発達サイクルの最中にある胚である。このスライスはｚの別個の値において画像平面に沿って取られ、例えば、図１３Ａに示されている画像は、ｚ＝１６．２５μｍ、２６．４０μｍ、４２．６５μｍ、５４．８４μｍ、７７．１８μｍ、９１．４０μｍ、１２３．８９μｍ、１４８．２６μｍ、１５８．４２μｍ、及び１７６．７０μｍというｚの値（ページの上部から始まる）において取られたものである。全体では、単一の試料１０１についてより多くの画像が記録される。例えば、約１マイクロメートル（例えば、２．０３μｍ）の複数ステップで約１００枚の画像を記録することができる。図１３Ａに描写されているスライスは、試料１０１のボリュームの全域で記録されたスライスの総数のうちの小さいサブセットのみを表している。
図１３Ｂは、顕微鏡システム１００を使用して一光子励起により得られたステージ５ショウジョウバエ胚の記録の最大値投影を示している。白い四角形は、この投影の下に示されている時系列に対応する領域を示しており、２つの光学ビュー間の遷移領域に位置する。図１３Ｃは、図１３Ｂの四角形領域の第１３分裂周期中の核力学の時系列を示している。この核力学は、顕微鏡システム１００を使用して一光子励起により胚全体で定量的に解明される。図１３Ｄは、ショウジョウバエ胚上で顕微鏡システム１００を使用して一光子励起中に得られた蛍光の画像の最大値投影を示している。融合しバックグラウンド補正した３次元画像スタックの背部側及び腹部側について個別の投影が示されている。１時点あたり１５秒の収集期間を使用して、３０秒間隔で胚を記録した。完全な記録は、受精後３時間〜１８．５時間の間に記録された、約２，０００時点に関する百万枚の画像（１１テラバイト）を含む。ＰＣに対する言及は極細胞を示し、ＶＦに対する言及は腹部溝を示し、Ａに対する言及は羊漿膜を示し、ＰＳに対する言及は後部呼吸孔を示している。スケールバーは例のためにのみ示されている。
図１４Ａを参照すると、顕微鏡システム１００により二光子励起を使用して核標識ステージ１６ショウジョウバエ胚（背部側が上）のインビボ記録の光学画像が取られている。この例のスライスはｚの別個の値において画像平面に沿って取られ、例えば、図１４Ａに示されている胚の画像は、ｚ＝１７．０５μｍ、３０．８６μｍ、４６．６９μｍ、６０．４９μｍ、７８．３６μｍ、１０３．１２μｍ、１２３．４２μｍ、１４０．４８μｍ、１５２．６６μｍ、及び１６６．４６μｍというｚの値（ページの上部から始まる）において取られたものである。全体では、単一の試料１０１についてより多くの画像を記録することができる。例えば、約１マイクロメートル（例えば、２．０３μｍ）の複数ステップで約１００枚の画像を記録することができる。図１４Ａに描写されているスライスは、試料１０１のボリュームの全域で記録されたスライスの総数のうちの小さいサブセットのみを表している。
図１４Ｂは、二光子励起方式を使用して顕微鏡システム１００により取られたショウジョウバエ胚発育の微速度撮影記録の最大値投影を示している。融合した３次元画像スタックの背部側及び腹部側について個別の投影が示されている。１時点あたり２０秒の収集期間を使用して、胚条収縮中の２時間の期間にわたり３０秒間隔で胚全体を記録した。完全な記録は３７，６２０枚の高解像度画像（３８７ギガバイト）を含む。図１４Ｃは、二光子励起方式を使用して顕微鏡システム１００により取られたショウジョウバエ胚発育の微速度撮影記録の最大値投影を示している。１時点あたり２０秒の画像収集期間を使用して、背部閉鎖及び腹部神経索形成中の３時間の期間にわたり３０秒間隔で胚全体を記録した。完全な記録は６８，４６０枚の高解像度画像（７０５ギガバイト）を含む。画像において、ｒＧＢという用語は収縮中の胚条を指し、Ａという用語は羊漿膜を指し、ＶＮＣという用語は腹部神経索を指し、ＢＬという用語は脳葉を指す。スケールバーは例のためにのみ示されている。
これらの画像から明らかなように、この記録には、順次マルチビューイメージングに固有の空間及び時間アーチファクトがなく、合胞性胞胚葉における総合的な核追跡を可能にする特性である核運動について優れた時間サンプリングを提供する。
一光子励起方式（その結果は図１３Ａ〜図１３Ｄに示されている）は、小さい浸入度について優れた信号対雑音比を提供するが、胚内部深くの構造物を捕捉することはあまりできなかった。対照的に、二光子励起方式（その結果は図１４Ａ〜図１４Ｃに示されている）は、一光子励起方式と比較した場合、自己蛍光を低減しており、後期発達段階についても胚についてほぼ完全な物理的適用範囲を提供した。二光子励起を使用した時に信号速度が潜在的により低くなるので、二光子励起方式は一光子励起方式より長い露光時間を必要とする可能性がある。
二光子励起方式を使用して胚全体について３０秒という時間分解能が得られ、これは胚条収縮、背部閉鎖、及び腹部神経索形成中にグローバルな細胞力学を捕捉した。
ショウジョウバエ胚における細胞追跡
発達中のショウジョウバエ胚全体における細胞追跡は、これまでは技術的に困難なものであった。細胞挙動に関する印象的な定量研究が存在するが、既存の方法は部分的な空間観察に限定され、画像処理に関する時間のかかる半自動手法に頼っており、完全な胚を分析するために拡大縮小される可能性がある。
図１５Ａ〜図１５Ｅを参照すると、基本的なイメージングに加えて、顕微鏡システム１００はショウジョウバエ胚全体における細胞追跡を可能にする。図１５Ａに示されているように、順次ガウス混合モデル手法を使用して自動追跡結果が重ねられたビデオによる生画像データからショウジョウバエ合胞性胞胚葉全体におけるグローバル核追跡が生成される。画像は、第１の時点においてランダムカラー方式を使用して、第１２分裂波の前であって第１３分裂波の後のスナップショットを示しており、これは追跡情報を使用して娘核に伝搬される。図１５Ｂに示されているように、ショウジョウバエ合胞性胞胚葉における第１３分裂波中の核分裂のグローバル検出が示されており、非分裂核はシアンで示され、分裂核はマゼンタで示されている。分裂核のカラーは５時点以内に次第に退色してシアンに戻る。図１５Ｃは、左側に核追跡情報と右側に形態学的核セグメント化を伴う再構築された胚の拡大図を示している。核追跡情報はランダムカラー方式から生成される（これは黒と白のランダムパターン方式に変換される）。図１５Ｄは、核分裂後の時間の関数としての平均核速度を示している。ｔ＝０における値はすべての分裂前の核を表している。０より大きいｔにおける値は有糸分裂後の時間ｔにおける分裂後の核を表している。平均値の小さい標準誤差（又はｓ．ｅ．ｍ．）（ライン厚に等しいか又はそれより小さい）は１時点あたり２，５００〜５，０００個以下の試料という大きい試料サイズから発生している。図１５Ｅは、最近接隣接核間の距離の分布を示している。分裂後の分布の平均及び標準偏差は、７．５７±１．３４μｍ（第１２波；ｎ＝１．４４×１０５）及び５．５２±０．９９μｍ（第１３波；ｎ＝４．６６×１０５）である。
改善された空間時間的分解能を利用することにより、ショウジョウバエ胚細胞核は、顕微鏡システム１００を使用して、合胞性胞胚葉全体において複数の分裂周期中に正常に再構築し追跡することができる。核は第１２及び第１３分裂波により追跡することができ、これは胚において最も速いグローバルプロセスのうちのいくつかを表す。核は、専門家によって評価されたように、偽陽性（検出されたが、存在しないもの）に関して９４．７４％±０．６８％、偽陰性（検出されないもの）に関してほぼ１００％の正確さで自動的に検出された。セグメント化は、（図１５Ａ及び図１５Ｂに示されている通り）核位置及びサイズ推定値を提供するガウス混合モデル（ＧＭＭ）の効率的な実現例と、（図１５Ｃに示されている通り）完全な核形態学をもたらす拡散勾配ベクトル場アルゴリズムの３次元実現例という２つの独立した方法を使用して得られた。ＧＭＭベースのセグメント化及び追跡はＧＰＵ上で実現され、これは１時点あたりわずか４０秒で胚全体において核力学の再構築を可能にした。
同時マルチビュー・ライトシート顕微鏡システム１００における高い時間分解能のために、追跡情報を得るために前の時点からの混合モデルによりそれぞれの時点を初期設定することで十分であった。この手法は９８．９８％±０．４２％のフレーム間追跡精度をもたらした。その分裂により核を追従するために、局所画像特徴に基づいて機械学習分級器を訓練した。この手法は、記録全体を通して９３．８１％±２．７１％の核分裂検出連係精度をもたらした。グローバル核変位、核分裂の同期波、及び高速局所核変位（分裂後の娘核分離）という３つの別個のタイプの動きが定量化された。
結果は図１５Ｄ及び図１５Ｅに要約されている。分裂波の定量分析は、平均核運動速度が核分裂直後に最高になり（第１２波で８．１２±２．５９μｍ／分及び第１３波で７．２１±２．２１μｍ／分の平均±標準偏差；ｎ＝２，７９８及び４，８５２のフーバー・ロバスト推定量）、分裂後２．１分及び５．０分で２つの顕著な局所極大（第１２波の場合；第１３波の場合は３．８分及び６．３分）を示し、これらは新しいパッキングパターン（図１５Ｄ）に向かうグローバル核個体群の緩和過程と関連することを明らかにしている。娘核間の平均距離は分離後最大１．２５分（第１２波）及び１．６７分（第１３波）に達し、これは胚内のグローバル平均最近接距離よりほぼ２倍高くなり（第１２波で７．５７±１．３４μｍ及び第１３波で５．５２±０．９９μｍの平均±標準偏差；ｎ＝１．４４×１０５及び４．６６×１０５のフーバー・ロバスト推定量）、それぞれの分裂波の終わりによって核数がほぼ２倍に増加することにより、分裂波１２の場合に８．７６μｍ及び分裂波１３の場合に５．６８μｍに緩和する。
核位置、核サイズ、及び核追跡の決定は、それぞれの画像をガウスの混合としてモデル化し、混合パラメータを時間全体について順次推定することにより、計算システム１９０内で実行された。ガウスにより核形状強度を近似すると、モデルの複雑さと形状情報との良好な兼ね合いが提供される。特に、それぞれの画像は以下のようにモデル化することができる。
ここで、Ｋは画像内の物体の数であり、μｋはそれぞれの核の中心位置であり、Σｋは共分散行列であり（それぞれの核の形状を楕円体として表す）、πｋは相対強度である。それぞれの画像が入力として与えられた場合、これらのパラメータは、例えば、期待値最大化アルゴリズムを使用して最尤法フレームワークで推定することができる。
同時マルチビュー・ライトシート顕微鏡システム１００によって達成された精細な時間分解能及び優れた空間適用範囲により、時点Ｔｉに関する初期設定として時間Ｔｉ−１からのそれぞれの解を使用した。画像内のそれぞれのガウスが前の時点のガウスから派生する場合、追跡情報は直接回復することができる。細胞分裂を処理するために、分裂中の細胞と分裂していない細胞とを含む１組の例が収集され、機械学習分級器は局所画像特徴に基づいて訓練される。
ガウス混合モデルを使用する追跡は、グラフィックス処理装置（ＧＰＵ）上で実現され、ＣＵＤＡ（ＴＭ）を使用して実現することができ、これは計算性能を増加し（その結果、１００倍加速することができ）、単一のＴｅｓｌａ ＧＰＵ（Ｎｖｉｄｉａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を備えた処理ワークステーションを使用して１時点あたりわずか４０秒で数千個の核及び数百万個のボクセルを有する胚全体における核位置及び運動の処理が可能になる。
ショウジョウバエ神経発達
図１６Ａ〜図１６Ｇを参照すると、顕微鏡システム１００を使用して、ショウジョウバエ神経系におけるニューロンタイプの特定化及び軸索ガイダンスを調査する。神経発生力学は、異なる発達段階における固定試料を比較することによって研究される場合が多いが、局所情況におけるライブイメージングによる場合もある。顕微鏡システム１００は、胚神経系全体の発達力学に関するデータを記録しイメージングすることができる。
図１６Ａは、試料１０１としてのヒストン標識ショウジョウバエ胚について一光子励起方式で顕微鏡システム１００を使用したイメージングの結果であって、受精後１２０〜３５３分間（時点０〜４００）に３つの神経芽細胞と１つの表皮芽細胞から手作業で再構築された系統が重ねられたものを示している。示されている追跡カラーは時間を符号化し、スケールバーは３０μｍに対応する。図１６Ｂは、図１６Ａで強調表示された追跡の拡大図を示している。緑色の球体は時点４００における細胞位置を示している。星印は２回の神経芽細胞分裂で生成された６つの神経節母細胞をマークしている。ＮＢという用語は神経芽細胞を指し、ＥＢという用語は表皮芽細胞を指している。
図１６Ｃ〜図１６Ｅは、一光子励起方式を使用して顕微鏡システムで記録されたショウジョウバエ胚神経系発達の最大値投影（背部側及び腹部側）を示している。ショウジョウバエ（例えば、ｅｌａｖ（Ｃ１５５）−ＧＡＬ４、ＵＡＳ−ｍＣＤ８：：ＧＦＰ遺伝子導入）の胚は、１時点あたり１５秒の画像収集期間を使用して、受精後９．５時間〜１５．３時間の期間にわたり３０秒間隔（約７００時点）で記録された。経時的なＧＦＰ信号の増加について補償するために、計算システム１９０内で強度正規化が実行された。自己蛍光卵黄膜は図１６Ｃにおいて計算的に除去された。
図１６Ｆは、図１６Ｅで強調表示されたエリアの拡大図を示している。図１６Ｇは、一光子励起方式を使用して顕微鏡システム１００で記録されたＦｔｚ−ｎｇ−ＧＡＬ４，１０ＸＵＡＳ−ＩＶＳ−ｍｙｒ：：ＧＦＰ遺伝子導入胚（フォールスカラー・ルックアップテーブル）内の軸索形態形成の最大値投影の経過を示している。これらの画像は全カバーボリュームのうちの０．３％の小領域を表している。ＶＮＣという用語は腹部神経索を指し、ＰＮＳという用語は末梢神経系を指し、Ｂという用語は脳を指し、ＶＭという用語は卵黄膜を指し、ＥＩＤという用語は複眼−触覚成虫原基を指し、ＶＳＣという用語は腹部感覚細胞を指し、ＬＳＣという用語は側部感覚細胞を指し、ＤＳＣという用語は背部感覚細胞を指し、Ａという用語は触覚を指し、ＢＣという用語は大脳交連を指す。星印はＶＮＣの短縮を示している。示されているスケールバーは例として提供されており、以下の通りである。即ち、図１６Ａ及び図１６Ｂではバーは長さ３０μｍであり、図１６Ｃ〜図１６Ｅではバーは長さ５０μｍであり、図１６Ｆではバーは長さ１０μｍであり、図１６Ｇではバーは５μｍである。
ｅｌａｖ（Ｃ１５５）−ＧＡＬ４及びＵＡＳ−ｍＣＤ８：：ＧＦＰを表す遺伝子導入胚を使用してすべての分裂後ニューロンを可視化し、２５秒及び３０秒の時間分解能で胚神経系全体について微速度撮影一光子イメージングを実行し、７００を超える時点について約４００，０００枚の高解像度画像（４テラバイト）で神経発達を捕捉した。胚全体の４ビュー・データセットを記録することは１時点あたりわずか２ｍＪの光エネルギを必要とし、ごくわずかな光退色を示した。結果として生じるデータセットは、中枢神経系及び末梢神経系の発達に関する詳細な情報を提供し（図１６Ｃ〜図１６Ｆを参照）、軸索成長の力学における精細な詳細を明らかにする。例えば、微速度撮影記録は、腹腔感覚器のいくつかの集団（背部、側部、及び腹部）並びに腹部神経索における連結部の形成を示している。著しいことに、異なるセグメントにわたるこれらの細胞の力学は非常に固定化されたもののように見え、グローバルな手掛かりという役割を示している。また、このイメージングは、試料１０１の頭部領域及び後部セグメントにおける感覚細胞の力学も捕捉する。複眼−触覚成虫原基の形態形成全体を追従することができ、これは胚の脳から分離して前部内側方向に移動する。どちらもそれぞれの最終位置を確立するので、触覚原基は幼生の眼（Ｂｏｌｗｉｇ器官）から分離する。最初に互いから分離された２つの左右相称神経原性領域として始まり、頭部退化とともに後方に移動し始める、深く埋め込まれた胚脳の形態形成を追従することさえ可能である。交連の発達は高い時間分解能で可視状態である。
更に、顕微鏡システム１００は、中枢神経系において希薄な発現を示すＦｔｚ−ｎｇ−ＧＡＬ４，１０ＸＵＡＳ−ＩＶＳ−ｍｙｒ：：ＧＦＰ胚により高解像度実験を実行した。空間サンプリングは６倍を超えて増加し、同じ高時間分解能を維持し、８．５時間の間、同じ時間間隔（３０秒）でイメージングし、約４６０，０００枚の画像又は４．６テラバイトのデータを提供する。これらの記録は、グローバルプロセスを追従する能力を保持し、同時に優れた空間時間的分解能で軸索形態形成中の詳細な糸状仮足力学を明らかにする（図１６Ｇを参照）。例えば、高速イメージング結果は、糸状仮足伸長及び探査のゾーンが長期間の間、成長円錐から近位に保持されることを示している。
更に、初期ショウジョウバエ胚における細胞力学の自動再構築を補完するために、試料１０１の後期発達段階における細胞追跡及び細胞系統分析のために顕微鏡システム１００を使用することができる。例えば、二光子励起方式を使用すると、収縮中の胚条の非表在層において手動細胞追跡を実行することができる。加えて、神経芽細胞及び表皮芽細胞系統を一光子励起方式で追従することができる。一光子データの高い信号対雑音比により、４００時点の全期間（約４時間；図１６Ａ及び図１６Ｂに示されている通り）について原腸胚形成及びその後の細胞分裂による胞胚葉細胞の追跡が可能になった。これらの再構築は、第１の神経節母細胞の神経芽細胞葉裂及び誕生を含む、神経系発達の初期段階における細胞力学を捕捉する。
計算システム１９０は、試料１０１内の核の形態の取得を可能にするために特定のアクションを実行する。特に、計算システム１９０によって作成される画像Ｉ（ｘ，ｙ，ｚ）は、流体流量式によって左右される媒体内に埋め込まれた引力（ｆ）として蛍光強度をシミュレートすることによりセグメント化される。勾配ベクトル場ｖ（ｘ，ｙ，ｚ）＝［ｕ（ｘ，ｙ，ｚ），ｖ（ｘ，ｙ，ｚ），ｗ（ｘ，ｙ，ｚ）］は、汎関数を最小限にする場として定義することができる。
ここで、Ｇσ（ｘ，ｙ，ｚ）は標準偏差σを有する３次元ガウスを表し、＊はたたみ込みを示す。簡単に言えば、変分法を使用すると、ｕ、ｖ、及びｗを時間の関数として扱うことによって解くことができる１組のオイラーの方程式が得られる。
これらの線形放物線型方程式の定常解はオイラーの方程式の解であり、必要な流れ場をもたらす。正則化パラメータμは、式（１）内の拡散成分（第１項）対移流成分（第２項）のバランスを取るものであり、即ち、これはアルゴリズムによって行使される平滑化の量を決定し、雑音の存在下では増加しなければならない。
傾斜磁場計算の後に傾度流追跡が行われ、その場合、同様のボクセル・グループは同じシンクに向かって「流れる」ものとして識別された。これは「モザイク」画像を生成し、それぞれのタイル（１つのシンクの水たまり）は１つの物体のみを含む。このセグメント化はそれぞれのタイルを適応的にしきい値処理することにより最終決定された。計算システム１９０は、前景及び背景という２つのクラスを分離する最適しきい値を計算し、従って、それぞれの結合されたクラス内分散は最小限になる（大津の方法）。このしきい値より小さい値を有するボクセルは背景と見なされた。
記録の高い時間分解能により、Ｔｉ−１において収束した解によって時点Ｔｉについて拡散勾配ベクトル場セグメント化アルゴリズムの初期設定が可能になった。この結果、２０倍を超える収束が加速し、高品質な形状情報を得るために不可欠であり、このアルゴリズムを大きい４Ｄデータセットに実用的なものにした。
計算システム１９０内に記憶され、画像（７１６）を作成するために処理されるデータセットはサイズが大きいものである（例えば、典型的に数十テラバイト以下になる可能性がある）。日常的にこれらのデータセットで作業する場合、顕微鏡システム１００のオペレータは、特定のカラーチャネル、視野角、試料、又はカメラ１０６、１０８から生じる画像及び／又は画像フレームのみの空間及び時間的サブセットを選択することができる。これが行われる場合、計算システム１９０は、便利で高速で拡張可能な方法でしかも最小限のネットワーク及び入出力負荷により、画像の編成、ブラウジング、及び処理を容易にする個別のプログラムを記憶し実行することができる。このために、このようなコンピュータプログラムは、（ａ）それによりユーザが高度なデータサブセット選択を行えるようにする仮想フォルダ、（ｂ）処理タスク定義がデータ選択から分離されること（再利用及びドキュメンテーションのため）、（ｃ）カスタム処理コードの容易な実現のためのプラグインシステム、（ｄ）Ｖａａ３Ｄ及びＩｍａｇｅＪという外部プログラムへの接続、及び（ｅ）仮想フォルダ及び処理タスクを定義するため並びにデータセットをブラウジングするため（画像及びそれに関連するメタ情報を閲覧するため）に便利なグラフィカルユーザインターフェースという概念を実現することができる。
要約すると、順次マルチビュー戦略の制限を克服し、大きい生きている試料における高速の動的事象について定量的な組織レベルのイメージングを可能にする、ライトシートベースの一光子及び多光子同時マルチビューイメージング及び画像解析を提供する完全な技術フレームワークについて説明してきた。このフレームワークは、試料サイズとは無関係に２０ミリ秒の最大タイムシフトで複数の相補的光学ビューの取得によりほぼ完全な物理的適用範囲を提供する。相補的ビューの時間的対応は３桁を上回る規模で改善され、イメージング速度は順次４ビューイメージングによるライトシート顕微鏡検査法より２０倍を超えて改善される。このシステムは、数日間までの間、３５０メガバイトｓ−１（１７５百万ボクセル／秒）での持続的データ取得のためにリアルタイム電子機器及び高度の計算インフラストラクチャを使用して、生理的条件下での高速長期イメージングのために設計されている。このシステムは、典型的に試料あたり数百万枚の高解像度画像及び数十テラバイト以下を含む、実験の高スループットマルチビュー画像融合及び画像データ管理のための計算上の解決策を含む。
その他の実現例では、照射サブシステム１１２、１１４内で生成されたライトシート１０２、１０４は、静的配置で生成することができ、従って、静的ライトシートになり得る。例えば、光学コンポーネント１３２、１３４は、望遠鏡レンズ対と、一方向のみに沿って光を集束させる円柱レンズとを含むことができる。
光源１２２、１２４は、パルスＴｉ：サファイアレーザ（カリフォルニア州サンタクララのＣｏｈｅｒｅｎｔ， Ｉｎｃ．によるＣｈａｍｅｌｅｏｎ Ｕｌｔｒａ ＩＩなど）を含むことができる。光源１２２、１２４とそれぞれの光学コンポーネント・セット１３２、１３４との間に追加のモジュールを配置することができる。追加のモジュールは、光源１２２、１２４の出力を変更することができ、レーザ強度変調及びＩＲビームスプリッティングを提供することができる。このモジュールは、ビーム減衰サブモジュール（例えば、ニュージャージー州ニュートンのＴｈｏｒｌａｂｓ Ｉｎｃ．によるＡＨＷＰ０５Ｍ−９８０装着無色半波長板及びＧＬ１０−Ｂグランレーザ偏光プリズム）、ドライバ付きポッケルスセル（コネチカット州ダンベリーのＣｏｎｏｐｔｉｃｓ Ｉｎｃ．によるＭｏｄｅｌ ３５０−８０−ＬＡ−０２ ＫＤ＊Ｐシリーズ電気光学変調器及びＭｏｄｅｌ ３０２ＲＭドライバ）、並びにＩＲビームスプリッタ（Ｍｅｌｌｅｓ ＧｒｉｏｔによるＰＢＳＨ−４５０−２０００−１００モデルなどの広帯域偏光キューブ型ビームスプリッタ及び中国のＣａｓｉｘ， Ｉｎｃ．によるＷＰＡ１３１２−２−７００−１０００モデルなどの無色２分の１波長板など）から構成される。
照射及び検出アームの切り換え
図１７を参照すると、顕微鏡システム１７００は、生きている生物試料１７０１をイメージングするために使用される。顕微鏡システム１７００は２つ以上の光学アーム（例えば、光学アーム１７２０及び１７４０）を有する光学顕微鏡１７１０を含み、それぞれのアームは照射サブシステム（光源ユニットともいう）と検出サブシステム（検出ユニットともいう）の両方を含み、光学アームのうちの少なくとも２つは非平行の（例えば、垂直な）光軸に沿って配置される。例えば、光学アーム１７２０は光源ユニット１７２２と検出ユニット１７２４とを含む。光源ユニットの少なくとも一部はその光学アームの検出ユニットとオーバラップし、その検出ユニットによって共用される。光学アームの軸は、それが光源ユニット及び検出ユニットのオーバラップ領域又は共用領域を通過する時に照射光の経路によって与えられる。光学アーム軸は、何らかの点で両者が交差する場合、他の光学アーム軸と非平行である。データ収集のために適切にセットアップされると、少なくとも２つの光学アーム軸は生物試料１７０１内で交差する。
それぞれの光学アームは、生物試料１７０１と光源ユニット及び検出ユニットとの間の光学データ分離装置（例えば、それぞれ、光学アーム１７２０及び１７４０の装置１７２３及び１７４３）を含み、光学分離装置は光源ユニットと検出ユニットとの間の光学データを分離してそれぞれの光学アームが照射機能と検出機能の両方を有することができるように構成される。光学データ分離装置は、光源ユニット及び検出ユニットの非オーバラップ領域によりこれらのユニットのオーバラップ領域を分離する。
顕微鏡システム１７００は、データ取得間に生物試料を回転させる必要なしに２つ以上の垂直方向に沿って３次元データセットの記録を可能にする。顕微鏡システム１７００は、生物試料の照射された平面の深さ全体にわたり均一照射を提供する。このようにして、それぞれの光学アーム内の照射サブシステムと検出サブシステムとの間で機能を切り換えることにより、追加の光学ビューが得られる。このような設計は、顕微鏡システム１７００の点広がり関数を変更せずに生物試料の等方性分解能を提供することができる。
顕微鏡システム１７００は生物試料１７０１を受け入れるように構成された試料領域１７９９を含む。顕微鏡システム１７００は少なくとも第１及び第２の光学アーム１７２０及び１７４０を含み、それぞれの光学アームは試料領域１７９９を横切る光路を有し、その光路は光学アーム軸を規定する。それぞれの光学アームは光源ユニットと検出ユニットの両方を含み、それぞれの光学アームはそれぞれの別個のアーム軸に沿って配置される。
図１７の設計では、光学顕微鏡１７１０は第１の光学アーム１７２０と第２の光学アーム１７４０とを含み、第１及び第２の光学アーム１７２０、１７４０のそれぞれのアーム軸は互いに平行ではない（この例では、互いに垂直であり、生物試料１７０１の内部で交わる）。第１の光学アーム１７２０は、光源ユニット１７２２及び検出ユニット１７２４と、第１のアーム軸１７２１に沿って試料領域１７９９を横切る光路とを含む。第２の光学アーム１７４０は、光源ユニット１７４２及び検出ユニット１７４４と、第２のアーム軸１７４１に沿って試料領域１７９９を横切る光路とを含む。
光源ユニット１７２２は、試料領域１７９９に向かう方向に沿って第１のアーム軸１７２１と平行な照射軸に沿って試料領域１７９９に向かって第１のライトシート１７０２Ａを生成し誘導するように配置された光源及び１組の照射光学装置を含む。また、光源ユニット１７２２は、１つ以上の照射光学装置に結合された１組のアクチュエータも含む。
光源ユニット１７４２は、試料領域１７９９に向かう方向に沿って第２のアーム軸１７４１と平行な照射軸に沿って試料領域１７９９に向かって第２のライトシート１７０２Ｂを生成し誘導するように配置された光源及び１組の照射光学装置を含む。また、光源ユニット１７４２は、１つ以上の照射光学装置に結合された１組のアクチュエータも含む。
検出ユニット１７２４は、第２の光学アーム１７４０の照射軸に垂直な検出軸に沿って試料領域１７９９内に受け入れた生物試料１７０１から放出された蛍光Ｆ２の画像を収集し記録するように配置されたカメラ及び１組の検出光学装置を含む。第２の光学アーム１７４０の照射軸は第２のアーム軸１７４１と平行であるので、第１の光学アーム１７２０（及び検出ユニット１７２４）の検出軸も第２のアーム軸１７４１に垂直である。また、検出ユニット１７２４は、カメラ及び検出光学装置のうちの１つ以上に結合された１組のアクチュエータも含む。生物試料１７０１から放出され、第１の光学アーム１７２０の検出ユニット１７２４によって収集された蛍光Ｆ２は、少なくとも部分的に第２のライトシート１７０２Ｂ（第２の光学アーム１７４０から放出されたもの）と生物試料１７０１との相互作用により発生する。特に、第２のライトシート１７０２Ｂは試料１７０１内の蛍光体をより高いエネルギ準位に励起し、その結果、蛍光光子Ｐのその後の放出が行われ、蛍光光子Ｐ（蛍光Ｆ２として示されている）は第１の光学アーム１７２０の検出ユニット１７２４によって検出される。
検出ユニット１７４４は、第１の光学アーム１７２０の照射軸に垂直な検出軸に沿って試料領域１７９９内に受け入れた生物試料１７０１から放出された蛍光Ｆ４の画像を収集し記録するように配置されたカメラ及び１組の検出光学装置を含む。第１の光学アーム１７２０の照射軸は第１のアーム軸１７２１と平行であるので、第２の光学アーム１７４０（及び検出ユニット１７４４）の検出軸も第１のアーム軸１７２１に垂直である。また、検出ユニット１７４４は、カメラ及び検出光学装置のうちの１つ以上に結合された１組のアクチュエータも含む。生物試料１７０１から放出され、第２の光学アーム１７４０の検出ユニット１７４４によって収集された蛍光Ｆ４は、少なくとも部分的に第１のライトシート１７０２Ａ（第１の光学アーム１７２０から放出されたもの）と生物試料１７０１との相互作用により発生する。特に、第１のライトシート１７０２Ａは試料１７０１内の蛍光体をより高いエネルギ準位に励起し、その結果、蛍光光子Ｐのその後の放出が行われ、蛍光光子Ｐ（蛍光Ｆ４として示されている）は第２の光学アーム１７４０の検出ユニット１７４４によって検出される。
第１の光学アーム１７２０は、試料領域１７９９と光源ユニット１７２２の少なくとも一部分及び検出ユニット１７２４の少なくとも一部分との間の経路上に配置された光学データ分離装置１７２３を含む。光学データ分離装置１７２３は光源ユニット１７２２と検出ユニット１７２４との間で光学データを分離する。例えば、光学データ分離装置１７２３は、光源ユニット１７２２及び検出ユニット１７２４のコンポーネント内で第１のライトシート１７０２Ａ及び蛍光Ｆ２を分離する。従って、光学データ分離装置１７２３は、蛍光Ｆ２が検出ユニット１７２４のカメラに向かって誘導されるが、光源ユニット１７２２の光源に向かって誘導されないことを保証し、光学データ分離装置１７２３は、第１のライトシート１７０２Ａが検出ユニット１７２４内に誘導されずに試料領域１７９９に向かって光源ユニット１７２２の光源から誘導されることを保証する。また、光学データ分離装置１７２３は、その他の光学アームからのライトシート（ライトシート１７０２Ｂなど）が検出ユニット１７２４に入るのを阻止するように構成することもできる。
第２の光学アーム１７４０も、試料領域１７９９と光源ユニット１７４２の少なくとも一部分及び検出ユニット１７４４の少なくとも一部分との間の経路上に配置された光学データ分離装置１７４３を含む。光学データ分離装置１７４３は光源ユニット１７４２と検出ユニット１７４４との間で光学データを分離する。例えば、光学データ分離装置１７４３は、光源ユニット１７４２及び検出ユニット１７４４のコンポーネント内で第２のライトシート１７０２Ｂ及び蛍光Ｆ４を分離する。従って、光学データ分離装置１７４３は、蛍光Ｆ４が検出ユニット１７４４のカメラに向かって誘導されるが、光源ユニット１７４２の光源に向かって誘導されないことを保証し、光学データ分離装置１７４３は、第２のライトシート１７０２Ｂが検出ユニット１７４４内に誘導されずに試料領域１７９９に向かって光源ユニット１７４２の光源から誘導されることを保証する。また、光学データ分離装置１７４３は、その他の光学アームからのライトシート１７０２が検出ユニット１７４４に入るのを阻止するように構成することもできる。
光学データ分離装置１７２３、１７４３は、２つのユニット（光源ユニット１７２２、１７４２及び検出ユニット１７２４、１７４４）の光路が交わる位置にある。光学データ分離装置１７２３、１７４３は、ダイクロイックミラー又はビームスプリッタなどの色分解装置にすることができる。光学データ分離装置１７２３、１７４３は、照射中のレーザ・ライトシート（比較的短い波長にすることができる）を透過し、放出された蛍光ライト（比較的長い波長にすることができる）を反射するように構成することができる。その他の実現例では、照射中のレーザ・ライトシートは放出された蛍光ライトの波長より比較的長い波長にすることができる。
顕微鏡システム１７００は、試料領域１７９９、光源ユニット１７２２、１７４２、及び検出ユニット１７２４、１７４４のうちの１つ以上に結合され、試料領域１７９９内に受け入れた生物試料１７０１を回転させずに、試料領域１７９９、光源ユニット１７２２、１７４２によって生成されたライトシート１７０２Ａ、１７０２Ｂ、及び検出ユニット１７２４、１７４４のうちの１つ以上を線形軸に沿って互いに対して並進させるように構成された並進システム１７７０も含む。
多くの生物試料のイメージングに必要ではないが、顕微鏡システム１７００は第３の光学アーム１７３０及び第４の光学アーム１７５０も含むことができる。第３及び第４の光学アーム１７３０、１７５０に関する簡単な説明は次に提供するが、多くのタイプの生物試料をイメージングするために２つの光学アーム（１７２０及び１７４０など）のみで十分である場合でも、図示され記載されている残りの実現例は４つの光学アーム１７２０、１７３０、１７４０、１７５０をすべて含んでいる。
第３の光学アーム１７３０は、第３の光学アーム１７３０の照射軸が第１の光学アーム１７２０の照射軸と平行になり、従って、第１のアーム軸１７２１と平行になるように、第１の光学アーム１７２０に対向して配置される。第３の光学アーム１７３０は、光源ユニット１７３２及び検出ユニット１７３４と、第１のアーム軸１７２１に沿って試料領域１７９９を横切る光路とを含む。第４の光学アーム１７５０は、第４の光学アーム１７５０の照射軸が第２の光学アーム１７４０の照射軸と平行になり、従って、第２のアーム軸１７４１と平行になるように、第２の光学アーム１７４０に対向して配置される。第４の光学アーム１７５０は、光源ユニット１７５２及び検出ユニット１７５４と、第２のアーム軸１７４１に沿って試料領域１７９９を横切る光路とを含む。
光源ユニット１７３２は、試料領域１７９９に向かう方向に沿って第１のアーム軸１７２１と平行な照射軸に沿って試料領域１７９９に向かって第３のライトシート１７０４Ａを生成し誘導するように配置された光源及び１組の照射光学装置を含む。また、光源ユニット１７３２は、１つ以上の照射光学装置に結合された１組のアクチュエータも含む。
光源ユニット１７５２は、試料領域１７９９に向かう方向に沿って第２のアーム軸１７４１と平行な照射軸に沿って試料領域１７９９に向かって第４のライトシート１７０４Ｂを生成し誘導するように配置された光源及び１組の照射光学装置を含む。また、光源ユニット１７５２は、１つ以上の照射光学装置に結合された１組のアクチュエータも含む。
小さく透明なサンプルの場合、第１の光学アーム１７２０からの第１のライトシート１７０２Ａ及び第２の光学アーム１７４０からの第２のライトシート１７０２Ｂのみを使用して生物試料１７０１の物理的適用範囲全体を得ることは可能である。生物試料１７０１内部の光散乱及び／又は光吸収により、より大きく透明ではない生物試料１７０１は、第１及び第２のライトシート１７０２Ａ、１７０２Ｂによって容易に到達できない空間領域を有することができる。第３の光学アーム１７３０及び第４の光学アーム１７５０は、このようなより大きいか及び／又は透明ではない試料に関する追加情報（より高いコントラスト及びより高い分解能など）を提供する。
検出ユニット１７３４は、第２の光学アーム１７４０及び第４の光学アーム１７５０の照射軸に垂直な検出軸に沿って試料領域１７９９内に受け入れた生物試料１７０１から放出された蛍光Ｆ３の画像を収集し記録するように配置されたカメラ及び１組の検出光学装置を含む。第２の光学アーム１７４０及び第４の光学アーム１７５０の照射軸は第２のアーム軸１７４１と平行であるので、第３の光学アーム１７３０（及び検出ユニット１７３４）の検出軸も第２のアーム軸１７４１に垂直である。また、検出ユニット１７３４は、カメラ及び検出光学装置のうちの１つ以上に結合された１組のアクチュエータも含む。生物試料１７０１から放出され、第３の光学アーム１７３０の検出ユニット１７３４によって収集された蛍光Ｆ３は、少なくとも部分的に第２のライトシート１７０２Ｂ（第２の光学アーム１７４０から放出されたもの）と生物試料１７０１との相互作用或いは第４のライトシート１７０４Ｂ（第４の光学アーム１７５０から放出されたもの）と生物試料１７０１との相互作用により発生する。
検出ユニット１７５４は、第１の光学アーム１７２０及び第３の光学アーム１７３０の照射軸に垂直な検出軸に沿って試料領域１７９９内に受け入れた生物試料１７０１から放出された蛍光Ｆ５の画像を収集し記録するように配置されたカメラ及び１組の検出光学装置を含む。第１の光学アーム１７２０及び第３の光学アーム１７３０の照射軸は第１のアーム軸１７２１と平行であるので、第４の光学アーム１７５０（及び検出ユニット１７５４）の検出軸も第１のアーム軸１７２１に垂直である。また、検出ユニット１７５４は、カメラ及び検出光学装置のうちの１つ以上に結合された１組のアクチュエータも含む。生物試料１７０１から放出され、第４の光学アーム１７５０の検出ユニット１７５４によって収集された蛍光Ｆ５は、少なくとも部分的に第１のライトシート１７０２Ａ（第１の光学アーム１７２０から放出されたもの）と生物試料１７０１との相互作用或いは第３のライトシート１７０４Ａ（第３の光学アーム１７３０から放出されたもの）と生物試料１７０１との相互作用により発生する。
追加の光学アーム１７３０、１７５０が顕微鏡システム１７００に含まれる場合、第１及び第２の光学アーム１７２０、１７４０のそれぞれの検出ユニット１７２４、１７４４は、以下のようにライトシート１７０４Ａ及び１７０４Ｂと生物試料とのそれぞれの追加の相互作用により放出された蛍光を検出するように構成される。特に、第１の光学アーム１７２０の検出ユニット１７２４は生物試料１７０１から放出された蛍光Ｆ２を収集し、蛍光Ｆ２は少なくとも部分的に第４のライトシート１７０４Ｂ（第４の光学アーム１７５０から放出されたもの）と生物試料１７０１との相互作用により発生することもできる。更に、第２の光学アーム１７４０の検出ユニット１７４４は生物試料から放出された蛍光Ｆ４を収集し、蛍光Ｆ４は少なくとも部分的に第３のライトシート１７０４Ａ（第３の光学アーム１７３０から放出されたもの）と生物試料１７０１との相互作用により発生することもできる。
図２１Ａも参照すると、それに沿って第１のライトシート１７０２Ａが誘導される方向とは反対に第１の光軸１７２１に沿って誘導される第３のライトシート１７０４Ａの使用により、照射軸（又は第１の光軸１７２１）に沿って互いに対してわずかに２つのライトシート１７０２Ａ及び１７０４Ａを変位させることが可能になり、同じく図１Ｂに関連して上述したように、この２つのライトシート１７０２Ａ、１７０４Ａが生物試料に沿って異なる軸位置でそれぞれのビームウェスト２１０５、２１１０（又は焦平面）に到達するようになっている。ビームウェストは最小値にあるビーム幅又はビーム径である。この戦略により、単一ライトシートによって可能になると思われるものより薄いライトシートで視野全体を覆うことができる。特に、集束ガウスビームがその直径内で十分均質である距離は、この直径の平方に比例し、従って、それぞれが１つのライトシートによって最適に覆われる２つの部分に視野を再分割することにより、単一シートの使用と比較してそれぞれのライトシートのビーム幅を２の平方根だけ低減することが可能になる。
要約すると、顕微鏡システム１７００は、それぞれの光学アーム１７２０、１７３０、１７４０、１７５０が光源ユニット及び検出ユニットの両方を装備し、例えば、少なくとも２つの光学アーム１７２０、１７４０が互いに垂直に配置されるようにセットアップされる。顕微鏡システム１７００は、そのボリューム全体にわたって生物試料１７０１から放出された蛍光を記録する。蛍光は、生物試料１７０１に誘導されたライトシートの波長に合わせて調整された蛍光体を含む、生物試料１７０１内の標識から放出される。このようにして、生物試料１７０１は第１のステージ（単一細胞など）から第２のステージ（胚など）に経時的に発達するので、生物試料１７０１内の細胞（例えば、ニューロン）などの生物学的構造物を追跡（即ち、トレース又は追従）することができる。取得した画像をまとめて融合し、等方性３次元分解能に近づく３次元データセットを得ることができる。
顕微鏡システム１７００は、第２の光軸１７４１と平行で、第１の光軸１７２１に垂直な検出軸に沿って、（生物試料に対して）以下により詳細に述べるようにライトシート及び対物レンズを並進させる二重照射／検出構成を含む。例えば、図２１Ａに示されているように、いくつかの実現例では、光源ユニット１７２２、１７３２はそれぞれのライトシート１７０２Ａ、１７０４Ａを生成し、生物試料１７０１に誘導することができ、検出ユニット１７４４、１７５４は生物試料１７０１から放出されたそれぞれの蛍光Ｆ４、Ｆ５を検出する。顕微鏡システム１７００は、アクティブな１対の光源ユニット（ユニット１７２２、１７３２）のスイッチを切り、他の光学アーム１７４０、１７５０内の他の１対の光源ユニット１７４２、１７５２（図２１Ｂに示されている通り）を活動化し、アクティブな１対の検出ユニット（ユニット１７４４、１７５４）のスイッチを切り、他の１対の検出ユニット１７２４、１７３４（図２１Ｂに示されている通り）を活動化するようにセットアップされる。次に、図２１Ｂに示されているように、検出ユニット１７２４、１７３４は、第１の光軸１７２１と平行な（しかも第２の光軸１７４１と平行であって、前にスキャンした検出軸に垂直な）検出軸に沿って、（生物試料１７０１に対して）以下に述べるようにライトシート１７０２Ｂ、１７０４Ｂ及び対物レンズを並進させることにより、そのボリューム全体にわたって生物試料１７０１から放出されたそれぞれの蛍光Ｆ２、Ｆ３を記録する。
図１８及び図１９を参照すると、光学顕微鏡１７１０の概念に基づく光学顕微鏡１８１０を含む顕微鏡システム１８００の模範的な一実現例が示されており、この実現例について次に説明する。
光学顕微鏡１８１０は４つの光学アーム１８２０、１８３０、１８４０、１８５０を含み、それぞれの光学アームはそれぞれのアーム軸に沿って配置され、それぞれの光学アーム１８２０、１８３０、１８４０、１８５０はそれぞれの光源ユニット１８２２、１８３２、１８４２、１８５２と、それぞれの検出ユニット１８２４、１８３４、１８４４、１８５３とを含む。光学アーム１８２０及び１８４０に関する詳細な説明は次に提供する。
第１の光学アーム１８２０は第１のアーム軸１８２１に沿って配置され、第２の光学アーム１８４０は第２のアーム軸１８４１に沿って配置される。第１のアーム軸１８２１はｙ軸と平行であり、第２のアーム軸１８４１はデカルト座標系のｚ座標と平行である。
第１の光学アーム１８２０の光源ユニット１８２２は、光源１９６０と、ライトシート１８０２Ａの選択的活動化を可能にする照射シャッタ及び目標波長範囲の外側の光を遮断する照射フィルタを含むことができる光学制御システム１９６１と、光学スキャナ装置（１つ以上の回転可能又は可動ミラーなど）１９６３（図１９に示す）を含むスキャン装置（ｓｃａｎｎｉｎｇ ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）１９６２と、ｆθレンズ１９６４（図１９に示す）とを含む。光学スキャナ装置１９６３の可動ミラーのうちの一方は、ｘ軸に沿って光源１９６０からの光ビームをスキャンしてライトシート１８０２Ａを生成するために使用することができ、光学スキャナ装置１９６３の可動ミラーのうちのもう一方は、ｘ軸に垂直な又は横向きの方向に沿ってライトシート１８０２Ａをスキャンするために使用することができる。光源ユニット１８２２によって生成されるライトシート１８０２Ａは、光源１９６０の出力をスキャンすることによって生成される。光源１９６０からの光ビームは光学スキャナ装置１９６３に誘導され、この光学スキャナ装置はｘ軸（図１８のページの外側にある）に沿って光ビームを偏向させてライトシートを形成し、このライトシートがｆθレンズ１９６４に向かって誘導される。光学スキャナ装置１９６３は入射レーザ光を偏向させて、試料１８０１内のｘ軸に沿ってライトシート１８０２Ａの高さを規定する角度範囲を生成する。次に、光学スキャナ装置１９６３はｆθレンズ１９６４の焦平面に位置するように位置決めされ、その結果、巨視的ライトシートを生成するので、光学スキャナ装置１９６３を出る光ビームの角度はｆθレンズ１９６４によってｘ軸に沿った変位に変換される。更に、ｘ軸スキャンの終わりに、光学スキャナ装置１９６３は光源１９６０からの光ビームを（ｘ軸に垂直な方向に沿って）横向きに移動させ、その結果、ライトシート１８０２Ａはｚ方向に沿って変位して生物試料１８０１内の隣接するｘ−ｙ画像平面を照射する。
第１の光学アーム１８２０の光源ユニット１８２２は、第１の光学アーム１８２０の検出ユニット１８２４と少なくとも１つのコンポーネントを共用する。これらの共用コンポーネントはチューブレンズ１９６５及び共用対物レンズ１９６６である。光源ユニット１８２２及び検出ユニット１８２４の共用コンポーネントは、この例では二色性ビームスプリッタ１８４３などの二色性光学素子である光学データ分離装置によってそれぞれの光源ユニット１８２２及び検出ユニット１８２４の非共用コンポーネントから分離される。
光源ユニット１８２２の非共用コンポーネントから生物試料１８０１に向かってライトシート１８０２Ａを通過させる場合、この１対のチューブレンズ１９６５及び共用対物レンズ１９６６はｆθレンズ１９６４からの巨視的ライトシート出力を試料１８０１における微視的ライトシート１８０２Ａに集束させる。共用対物レンズ１９６６は、単一のレンズ或いは複数レンズ及びその他の光学素子の組み合わせを含む、顕微鏡対物レンズにすることができる。
第１の光学アーム１８２０の検出ユニット１８２４はフィルタ１９６８とカメラ１９６９とを含む。従って、試料１８０１から放出された蛍光Ｆ２は、共用対物レンズ１９６６によって収集され、チューブレンズ１９６５を使用してカメラ１９６９上に集束される。フィルタ１９６８は、検出すべき蛍光Ｆ２の波長を中心とする波長帯域の外側の波長の光を拒絶する。その上、フィルタ１９６８は、フィルタホイール上の異なるフィルタを選択することにより拒絶した光の波長を変更できるように、別個の波長範囲を有するその他のフィルタとともにフィルタホイール上に装着することができる。フィルタ１９６８は、蛍光体に適用される励起のタイプ次第で、ショートパスフィルタ、ロングパスフィルタ、又はバンドパスフィルタにすることができる。例えば、蛍光体の一光子励起の場合、ライトシートの波長は一般に検出すべき蛍光の波長より短く、従って、二色性ビームスプリッタ１８２３はより長い波長をカメラ１９６９に透過するようにセットアップされ、従って、フィルタ１９６８はロングパスフィルタ又はバンドパスフィルタにすることができる。これに反して、蛍光体の二光子励起の場合、ライトシートの波長は検出すべき蛍光の波長より長く、従って、二色性ビームスプリッタ１８２３はより短い波長をカメラ１９６９に透過するようにセットアップされ、フィルタ１９６８はショートパスフィルタ又はバンドパスフィルタにすることができる。
第２の光学アーム１８４０の光源ユニット１８４２は、光源１９７０と、ライトシート１８０２Ｂの選択的活動化を可能にする照射シャッタ及び目標波長範囲の外側の光を遮断する照射フィルタを含むことができる光学制御システム１９７１と、光学スキャナ装置（１つ以上の回転可能又は可動ミラーなど）１９７３（図１９に示す）を含むスキャン装置１９７２と、ｆθレンズ１９７４（図１９に示す）とを含む。光源ユニット１８２２によって生成されるライトシート１８０２Ｂは、光源１９７０の出力をスキャンすることによって生成される。光源１９７０からの光ビームは光学スキャナ装置１９７３に誘導され、この光学スキャナ装置はｘ軸に沿って光ビームを偏向させてライトシートを形成し、このライトシートがｆθレンズ１９７４に向かって誘導される。光学スキャナ装置１９７３は入射レーザ光を偏向させて、試料１８０１内のｘ軸に沿ってライトシート１８０２Ｂの高さを規定する角度範囲を生成する。次に、光学スキャナ装置１９７３はｆθレンズ１９７４の焦平面に位置するように位置決めされ、その結果、巨視的ライトシートを生成するので、光学スキャナ装置１９７３を出る光ビームの角度はｆθレンズ１９７４によってｘ軸に沿った変位に変換される。更に、ｘ軸スキャンの終わりに、光学スキャナ装置１９７３は光源１９７０からの光ビームを（ｘ軸に垂直な方向に沿って）横向きに移動させ、その結果、ライトシート１８０２Ｂはｙ方向に沿って変位して生物試料１８０１内の隣接するｚ−ｘ画像平面を照射する。
第２の光学アーム１８４０の光源ユニット１８４２は、第２の光学アーム１８４０の検出ユニット１８４４と少なくとも１つのコンポーネントを共用する。これらの共用コンポーネントはチューブレンズ１９７５及び共用対物レンズ１９７６である。光源ユニット１８４２及び検出ユニット１８４４の共用コンポーネントは、この例では二色性ビームスプリッタ１８４３などの二色性光学素子である光学データ分離装置によってそれぞれの光源ユニット１８４２及び検出ユニット１８４４の非共用コンポーネントから分離される。
光源ユニット１８４２の非共用コンポーネントから生物試料１８０１に向かってライトシート１８０２Ｂを通過させる場合、この１対のチューブレンズ１９７５及び共用対物レンズ１９７６はｆθレンズ１９７４からの巨視的ライトシート出力を試料１８０１における微視的ライトシート１８０２Ｂに集束させる。
第２の光学アーム１８４０の検出ユニット１８４４はフィルタ１９７８とカメラ１９７９とを含む。従って、試料１８０１から放出された蛍光Ｆ４は、共用対物レンズ１９７６によって収集され、チューブレンズ１９７５を使用してカメラ１９７９上に集束される。フィルタ１９７８は、検出すべき蛍光Ｆ４の波長を中心とする波長帯域の外側の波長の光を拒絶する。その上、フィルタ１９７８は、フィルタホイール上の異なるフィルタを選択することにより拒絶した光の波長を変更できるように、別個の波長範囲を有するその他のフィルタとともにフィルタホイール上に装着することができる。フィルタ１９７８は、ロングパスフィルタ、ショートパスフィルタ、又はバンドパスフィルタにすることができる。
第３の光学アーム１８３０は、その光学アーム軸が第１のアーム軸１８２１と平行になるように第１の光学アーム１８２０の反対側に配置され、第４の光学アーム１８５０は、その光学アーム軸が第２のアーム軸１８４１と平行になるように第２の光学アーム１８４０の反対側に配置される。
第３の光学アーム１８３０は、光源１９８０、光学制御システム１９８１、並びに光学スキャナ装置１９８３及びｆθレンズ１９８４を含むスキャン装置１９８２という非共用コンポーネントを含む、第３の光源ユニット１８３２を含む。第３の光学アーム１８３０は、フィルタ１９８８及びカメラ１９８９という非共用コンポーネントを含む、第３の検出ユニット１８３４を含む。第３の光学アーム１８３０の共用コンポーネントは共用対物レンズ１９８６及びチューブレンズ１９８５である。光源ユニット１８３２及び検出ユニット１８３４の共用コンポーネントは、この例では二色性ビームスプリッタ１８３３などの二色性光学素子である光学データ分離装置によってそれぞれの光源ユニット１８３２及び検出ユニット１８３４の非共用コンポーネントから分離される。
第４の光学アーム１８５０は、光源１９９０、光学制御システム１９９１、並びに光学スキャナ装置１９９３及びｆθレンズ１９９４を含むスキャン装置１９９２という非共用コンポーネントを含む、第４の光源ユニット１８５２を含む。第４の光学アーム１８５０は、フィルタ１９９８及びカメラ１９９９という非共用コンポーネントを含む、第３の検出ユニット１８５４を含む。第４の光学アーム１８５０の共用コンポーネントは共用対物レンズ１９９６及びチューブレンズ１９９５である。光源ユニット１８５２及び検出ユニット１８５４の共用コンポーネントは、この例では多色性ビームスプリッタ１８５３などの多色性（例えば、二色性）光学素子である光学データ分離装置によってそれぞれの光源ユニット１８５２及び検出ユニット１８５４の非共用コンポーネントから分離される。
それぞれの光学アーム１８２０、１８４０、１８３０、１８５０内のそれぞれの共用対物レンズ１９６６、１９７６、１９８６、１９９６は、少なくとも光学顕微鏡１８１０の回折限界と同じ大きさの視野を有し、検出ユニット１８２４、１８４４、１８３４、１８５４によって追跡される生物試料１８０１内の構造物（細胞など）を解明するのに十分な開口数を有する。
光学顕微鏡１８１０は、中空スペースを規定するチャンバ１８１２及びその中に生物試料１８０１が配置される試料領域１８９９も含む。生物試料１８０１は、図５Ｂに関連して上述されているホルダ１６６のようなホルダ１８６６上に配置される。
光学顕微鏡１８１０は、試料領域１８９９並びに光学アーム１８２０、１８３０、１８４０、１８５０のコンポーネントのうちの１つ以上に結合され、試料領域１８９９内に受け入れた生物試料１８０１を回転させずに、試料領域１８９９、光源ユニット１８２２、１８３２、１８４２、１８５２によって生成されたライトシート１８０２Ａ、１８０２Ｂ、１８０４Ａ、１８０４Ｂ、及び検出ユニット１８２４、１８３４、１８４４、１８５４のうちの１つ以上を線形軸に沿って互いに対して並進させるように構成された並進システム１８７０も含む。
模範的な並進システム１８７０は図１９に示されている。並進システム１８７０は、それぞれの共用対物レンズ１９６６、１９７６、１９８６、１９９６に機械的に固定された１組の対物レンズ並進スキャナ１９１４、１９１５、１９１６、１９１７を含む。並進スキャナ１９１４及び１９１６はｙ軸（第１のアーム軸１８２１である）に沿ったいずれかの方向にそれぞれの共用対物レンズ１９６６、１９８６を並進（移動）させるように構成され、並進スキャナ１９１５及び１９１７はｚ軸に沿ったいずれかの方向にそれぞれの共用対物レンズ１９７６、１９９６を並進（移動）させるように構成される。対物レンズ並進スキャナは圧電制御することができる。例えば、対物レンズ並進スキャナ１９１４、１９１５、１９１６、１９１７は、Ｐｈｙｓｉｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｅ（ＰＩ）によって製作され、ＰＩによって製作されたＥ−６６５−ＣＲコントローラなどのＬＶＰＺＴピエゾアンプ／ポジションコントローラに接続されたＰ−６２８．１ＣＤ−８００μｍトラベルレンジ・ピエゾスキャナにすることができる。
また、並進システム１８７０は、それぞれの検出ユニット１８２４、１８３４、１８４４、１８５４のコンポーネントに結合された１組の検出並進スキャナ１９２４、１９２５、１９２６、１９２７も含むことができる。並進システム１８７０は、それぞれの光源ユニット１８２２、１８３２、１８４２、１８５２のコンポーネントに結合された１組の光源並進スキャナ１９３４、１９３５、１９３６、１９３７も含むことができる。
また、並進システム１８７０は、そのそれぞれの光源ユニット１８２２、１８４２、１８３２、１８５２内に光学スキャナ装置（回転可能又は可動ミラーなど）１９６３、１９７３、１９８３、１９９３も含む。光学スキャナ装置１９６３、１９７３、１９８３、１９９３は、ｘ軸に沿ってそれぞれの光源１９６０、１９７０、１９８０、１９９０からの光ビームをスキャンしてそれぞれのライトシート１８０２Ａ、１８０２Ｂ、１８０４Ａ、１８０４Ｂを形成するだけでなく、ｘ軸に垂直な方向に沿ってライトシート１８０２Ａ、１８０２Ｂ、１８０４Ａ、１８０４Ｂをスキャンするように構成される。従って、光学スキャナ装置１９６３はｚ軸に沿ってライトシート１８０２Ａをスキャンし、光学スキャナ装置１９８３はイメージング中にｚ軸に沿ってライトシート１８０４Ａをスキャンし、これらのライトシートがｘ−ｙ画像平面のそれぞれを通して移動するようになっている。その上、光学スキャナ装置１９７３はｙ軸に沿ってライトシート１８０２Ｂをスキャンし、光学スキャナ装置１９９３はイメージング中にｙ軸に沿ってライトシート１８０４Ｂをスキャンし、これらのライトシートがｚ−ｘ画像平面のそれぞれを通して移動するようになっている。
図２０を参照すると、電子機器コントローラ１８８０は、上記のリアルタイムコントローラ６５０などのリアルタイムコントローラ２００５を含むことができる。リアルタイムコントローラ２００５は、光学アーム１８２０、１８３０、１８４０、１８５０のそれぞれの内部に新しい光学及び機械コンポーネントのための追加のコンポーネントを含むことになるであろう。電子機器コントローラ１８８０は計算システム１８９０と通信して、同時画像収集ワークフローを調整する。電子機器コントローラ１８８０は、それぞれの光学アーム１８２０、１８３０、１８４０、１８５０内のカメラ１９６９、１９７９、１９８９、１９９９に直接接続するための専用のカメラリンク２０１０も含むことができる。
光学顕微鏡１８１０内の光学、機械、及び電気コンポーネントのすべては、コントローラ２００５内のコンポーネントに接続され、顕微鏡１８１０の「アーム」のそれぞれでリアルタイム制御を提供する。コントローラ２００５は、１組のライトシート１８０２Ａ、１８０４Ａ及び１８０２Ｂ、１８０４Ｂ並びにそれぞれの焦平面の急速相対位置決め及び配向のための自動位置合わせモジュールも含む。コントローラ２００５は、光学顕微鏡の様々な光学、機械、及び電気コンポーネントを変更して、それぞれの検出ユニット１８２４、１８３４、１８４４、１８５４によって検出された蛍光信号Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５を最適化又は増加するために２０動作自由度を提供する。
一般的な一態様では、リアルタイム電子機器コントローラ２００５は、テキサス州オースティンのＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによるＰＸＩ−８１１０ ２．２ＧＨｚ Ｑｕａｄ Ｃｏｒｅ組み込みコントローラなどのリアルタイムコントローラである。このコントローラは、ＬａｂＶＩＥＷ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅオペレーティング・システムを実行することができ、ＢＮＣコネクタブロック（同じくＮａｔｉｏｎａｌ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓによるＢＮＣ−２１１０シールドコネクタブロックなど）にリンクされた３つの入出力インターフェースボード（同じくＮａｔｉｏｎａｌ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓによるＰＸＩ−６７３３高速アナログ出力８チャネルボードなど）並びにシリアルインターフェースボード（同じくＮａｔｉｏｎａｌ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓによるＰＸＩ−８４３２／２など）を装備している。リアルタイムコントローラ２００５は、ギガビット・イーサネットなどの高速データ伝送により計算システム１８９０と通信する。
リアルタイムコントローラ２００５に加えて、電子機器コントローラ１８８０は、個別のコントローラ上にモーションコントローラとアナログ及びデジタル入出力チャネルも含むことができる。モーションコントローラはＮａｔｉｏｎａｌ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓによるＰＸＩ−７３５４モーションコントローラにすることができ、これは、それぞれ８つのアナログ出力と８つのデジタル入出力チャネルとを有する、Ｎａｔｉｏｎａｌ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓによるＰＸＩ−６７３３コントローラなどの複数の入出力コントローラを含むことができる。
すべての時間制約型タスクは電子機器コントローラ１８８０内で実行することができ、残りのタスク（カメラによって記録されたフレームを収集し可視化することなど）は計算システム１８９０によって実行される。
計算システム１８９０は、データを記憶し、検索し、処理する能力を有するワークステーションなどのコンピュータを含むことができる。従って、このコンピュータは、モニター又はプリンタなどの１つ以上の出力装置２０１５と、キーボード、マウス、タッチディスプレイ、又はマイクロホンなどの１つ以上のユーザ入力インターフェース２０２０と、特定のタスクを実行するための専門ワークステーションを含む１つ以上の処理装置２０２５と、メモリ（例えば、ランダムアクセスメモリ又は読み取り専用メモリ或いは仮想メモリなど）２０３０と、ハードディスクドライブ、ソリッドステートドライブ、又は光ディスクなどの１つ以上の記憶装置２０３５などのハードウェアを含む。処理装置は、スタンドアロンプロセッサにすることができるか、或いは本来的にワークステーションなどのサブコンピュータにすることができる。
専門ワークステーションは、メモリに加えて、実装されている処理装置と、特定のタスクを実行するためのソフトウェアとを含む。専門ワークステーションとしては、画像収集ワークステーション２０４０、画像処理ワークステーション２０４５、及び任意選択の画像セグメント化追跡ワークステーション２０５０を含む。更に、専門ワークステーションとしては、得られたビューのそれぞれからのデータを結合するタスクを実行するマルチビュー画像位置合わせワークステーション２０５５を含む。データを結合することは、どのビューが追跡されている生物試料１８０１内の構造物の最も良好な又は最も明確な画像を提供するかを判断することを含むことができる。マルチビュー画像位置合わせワークステーション２０５５は、この位置合わせ及び結合を実行するためにビューのそれぞれからのデータセットについてマルチビュー・デコンボリューション・アルゴリズムを実行することができる。
記憶装置２０３５は、とりわけ、画像収集ワークステーション２０４０から情報を受け取り、追加の処理能力のためにそれ自体のプロセッサを受け入れるように装備されている画像データ管理記憶ユニット２０６０を含む。
ワークステーションはそれ自体のソフトウェアモジュールを含み、そのモジュールはそれぞれ、以下に述べるように、実行された時に電子機器コントローラ１８８０内のハードウェアに様々なアクションを実行させる１組の命令を含む。
計算システム１８９０は、数日間までの連続画像収集を伴う高速イメージング実験のために設計される。計算システム１８９０は、それぞれの記録画像が約１０メガバイト（ＭＢ）のサイズであり、記憶容量が１０ＴＢである場合に、例えば、試料あたり１０テラバイト（ＴＢ）の全データセットサイズで中断なしの高速イメージングセッションにおいて百万枚を超える高解像度画像を記録するようにセットアップすることができる。高速記録を可能にするために、画像収集ワークステーション２０４０を画像データ管理ユニット２０６０及びコントローラ２００５に接続するラインのそれぞれは、ガラスファイバ・ネットワークパイプラインとしてセットアップすることができ、それにより１０ギガビット／秒のデータ速度を提供し、従って、長期イメージングセッションのために一千万枚までの高解像度画像（例えば、それぞれの画像は１０ＭＢのサイズである）又は試料１８０１あたり１００テラバイト以上の記録を可能にすることができる。画像データ管理ユニット２０６０が１０：１という平均比率を有する３次元ウェーブレット圧縮技法を使用する場合、１ペタバイトの最大記録容量を実現することができる。
画像収集ワークステーション２０４０及びマルチビュー画像処理ワークステーション２０４５は、それぞれ内容ベースの画像登録及びマルチビュー画像融合のために開発され、これは約２００メガバイト／秒の速度で生画像データを処理するための光学実現例に関する従来の知識を効率的に取り入れている。画像収集ワークステーション２０４０は、リアルタイム画像登録が可能であり、大規模データ管理のために画像処理ワークステーション２０４５と統合される。計算システム１８９０は複数のビューを同時に取得するので、イメージングボリュームＩＶ内の基準マーカの必要なしに、画像収集ワークステーション２０４０内で高速かつ正確な画像登録（画像の位置合わせ）が達成される。
一実現例では、計算システム１８９０は、３．３ＧＨｚで動作する処理装置６０４内の１２個の物理的コアプロセッサを有し、メモリ６０６内の６４ギガバイト（ＧＢ）のＲＡＭにアクセスする、Ｗｉｎｄｏｗｓベースのパーソナルコンピュータである。計算システム１８９０は、Ｗｉｎｄｏｗｓ７（６４ビット）などの任意の適切なオペレーティング・システムを実行することができ、ＬａｂＶＩＥＷ開発スイート（６４ビット）などの任意の適切なアプリケーションを実行することができる。
以下の説明では、計算システム１８９０におけるワークフローについて短い説明を提供する。一般に、画像収集ワークステーション２０４０は画像の登録を実行し、これは対向する光学アーム内のカメラからの画像を位置合わせするプロセスである。従って、カメラ１９６９及び１９８９からの画像が位置合わせされ、カメラ１９７９及び１９９９からの画像が位置合わせされる。一般に、画像処理ワークステーション２０４５は、位置合わせされた画像の融合を実行し、これは登録画像を単一の表現又は画像に結合するプロセスである。特に、画像の情報内容を単一の画像に結合することによって画像が融合される。融合に関する詳細については以下に述べる。
画像データ管理ユニット２０６０は、６００メガバイト／秒の持続的データストリーミング、１００テラバイトサイズのデータセットの中断なしの長期画像収集、及びウェーブレットベースの損失なしの画像圧縮（例えば、１０倍）のための高スループット画像記憶パイプラインを提供する。
画像収集ワークステーション２０４０は、光ファイバにより生のマルチビューデータストリームを画像処理ワークステーション２０４５及び画像データ管理ユニット２０６０にリレーする。ワークステーションで使用されるソフトウェアは、高スループットマルチビュー画像処理及びリアルタイム画像データ管理を提供するために、例えば、Ｍａｔｌａｂ及びＣ＋＋で作成することができる。
光源１９６０、１９７０、１９８０、１９９０はいずれも、レーザシステムにすることができる同じ主光源１８９８からのものにすることができる。例えば、主光源１８９８は、２つのＯｍｉｃｒｏｎ ＳＯＬＥ−６エンジン（それぞれのエンジン内に４つの波長）並びに１本のデジタル信号伝送（オン／オフ）用ケーブルと波長及びＳＯＬＥあたり１本のアナログ信号伝送（レーザ出力など）用ケーブル、初期手動レーザ構成のためのＳＯＬＥあたり１本のＵＳＢケーブルという顕微鏡入出力ハブへの通信インターフェースを含むことができる。主光源１８９８からの出力は４つのビームに分割され、それぞれがそれぞれの光源１９６０、１９７０、１９８０、１９９０を構成する。その他の実現例では、それぞれの光源１９６０、１９７０、１９８０、１９９０のために専用のレーザシステム（又は光源）を設けることができ、それぞれの専用のレーザシステムは電子機器コントローラ１８８０及び計算システム１８９０によって個々に制御可能にすることができる。
それぞれの光源１９６０、１９７０、１９８０、１９９０からの出力は光シャッタ１９６１、１９７１、１９８１、１９９１を使用して制御することができ、それにより生物試料１８０１に到達する他のライトシートに対してそれぞれのライトシート１８０２Ａ、１８０２Ｂ、１８０４Ａ、１８０４Ｂのタイミングを制御する。この光シャッタ１９６１、１９７１、１９８１、１９９１はアパーチャを通して誘導される光を遮断することができ、この光の遮断は、適用例次第で、同期化、非同期化、又は制御することができる。
他の光学アーム内の光シャッタと組み合わせて、それぞれの光源ユニット１８２２、１８３２、１８４２、１８５２内の光シャッタは、どのライトシート（例えば、ライトシート１８０２Ａのみ、ライトシート１８０２Ｂのみ、又はライトシート１８０２Ａ及びライトシート１８０２Ｂの両方）が任意の一瞬に試料１８０１を照射するかを制御する。従って、試料１８０１での照射はいずれかの側から同期的に又は非同期的に実行することができる。電子機器コントローラ１８８０に接続されたドライバ又はアクチュエータは、電子機器コントローラ１８８０からの制御下でそれぞれのレーザシャッタ１９６１、１９７１、１９８１、１９９１を操作する。
多色性ビームスプリッタ１８２３、１８３３、１８４３、１８５３は、例えば、（バーモント州ベローズフォールズの）Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐによる多色性ビームスプリッタＺＴ４８８／５６１ｒｐｃ又はＺＴ４８８／５９４ｒｐｃモデルにすることができる。フィルタ１９６８、１９７８、１９８８、１９９８は、例えば、イリノイ州レークフォレストのＩＤＥＸ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの一部であるＳｅｍｒｏｃｋ， Ｉｎｃ．によるＢｒｉｇｈｔＬｉｎｅ蛍光フィルタにすることができる。共用対物レンズ１９６６、１９７６、１９８６、１９９６のそれぞれは、単一のレンズ或いは複数レンズ及びその他の光学素子の組み合わせを含む顕微鏡対物レンズにすることができる。
カメラ１９６９、１９７９、１９８９、１９９９は科学用ＣＭＯＳ（相補型金属酸化膜半導体）イメージセンサ（ｃＣＭＯＳセンサ）にすることができる。例えば、カメラ１９６９、１９７９、１９８９、１９９９は、ＣａｍｅｒａＬｉｎｋケーブルにより計算システム１８９０内のフレームグラバに接続されたＨａｍａｍａｔｓｕ Ｏｒｃａ Ｆｌａｓｈ ４．０ ｖ２ ｓＣＭＯＳカメラにすることができる。
照射光シャッタ１９６１、１９７１、１９８１、１９９１は、２つのＵｎｉｂｌｉｔｚ ＶＭＭ−Ｄ３ ３チャネルシャッタドライバ（ドライバあたり２つのシャッタで、第３のチャネルは空である）、顕微鏡入出力ハブへの通信インターフェース（電子機器コントローラ１８８０）、並びにデジタル信号（５Ｖ ＴＴＬ）を伝送するシャッタあたり１本のフライングリードケーブルによって制御されたＵｎｉｂｌｉｔｚ ＬＳ６ＺＭ２−１００レーザシャッタにすることができる。
検出ユニット内のフィルタ１９６８、１９７８、１９８８、１９９８並びに光源ユニットの光学制御システム内の照射フィルタに使用できるフィルタホイールは、Ｌｕｄｌフィルタホイール（照射用に４つと検出用に４つ）にすることができる。これらは、４つのデュアルチャネルＭＡＣ６０００ＤＣコントローラ（照射用に１つと、ＭＡＣ６０００ごとの検出フィルタホイール用に１つずつ）、顕微鏡入出力ハブへの通信インターフェース（電子機器コントローラ１８８０）、並びにフィルタホイールあたり１本のＲＳ−２３２シリアルケーブルによって制御することができる。
スキャン装置１９６２、１９７２、１９８２、１９９２は、１つのＣａｍｂｒｉｄｇｅ６２２０ ＸＹスキャナがそれぞれの光学アーム内のＭｉｃｒｏＭａｘシリーズ６７３ｘｘ二軸サーボドライバに接続されたガルバノメータドライバ、顕微鏡入出力ハブへの通信インターフェース（電子機器コントローラ１８８０）、並びにアナログ信号（０〜１０Ｖ）を伝送するスキャナあたり２本のケーブルを使用して駆動することができる。
サンプル１８０１は、３つのＰＩ Ｍ−１１１．２ＤＧ並進ステージ及び１つのＰＩ Ｍ−１１６回転ステージに接続された４軸モーションコントローラＰＩ Ｃ−８８４を含むサンプル位置決めシステム、並びに顕微鏡入出力ハブへの通信インターフェース（電子機器コントローラ１８８０）を使用して、チャンバ１８１２内に位置決めすることができる。
要約すると、顕微鏡システム１７００、１８００は、それぞれの光学アームがこの時点で光源ユニット及び検出ユニットの両方を装備するようにセットアップされる。顕微鏡システム１７００、１８００は、以下により詳細に述べるように、第２の光軸１７４１、１８４１と平行な検出軸に沿って（生物試料に対して）ライトシート及び対物レンズを並進させることにより、１つの照射／検出構成でそのボリューム全体にわたって生物試料１７０１、１８０１から放出された蛍光を記録する。例えば、図１７に関連して説明すると、光源ユニット１７２２、１７３２はそれぞれのライトシート１７０２Ａ、１７０４Ａを生成し、生物試料１７０１に誘導することができ、検出ユニット１７４４、１７５４は生物試料１７０１から放出されたそれぞれの蛍光Ｆ４、Ｆ５を検出する。顕微鏡システム１７００は、アクティブな１対の光源ユニット（ユニット１７２２、１７３２）のスイッチを切り、他の光学アーム１７４０、１７５０内の他の１対の光源ユニット１７４２、１７５２を活動化し、アクティブな１対の検出ユニット（ユニット１７４４、１７５４）のスイッチを切り、他の１対の検出ユニット１７２４、１７３４を活動化するようにセットアップされる。次に、顕微鏡システム１７００は、第１の光軸１７２１と平行な（しかも第２の光軸１７４１と平行であって、前にスキャンした検出軸に垂直な）検出軸に沿って、（生物試料に対して）以下に述べるようにライトシート及び対物レンズを並進させることにより、そのボリューム全体にわたって生物試料から放出された蛍光をもう一度記録する。
図２２を参照すると、手順２２００は、複雑な生物試料１８０１をイメージングするために顕微鏡システム１８００によって実行される。最初に、生物試料１８０１が準備される（２２０２）。生物試料１０１は、化学的かつ生物学的に試料を準備し、試料をホルダ１８６６に物理的に移送又は装着し、チャンバ１８１２の内部にホルダ１８６６を配置することにより、準備される（２２０２）。
次に、光学顕微鏡１８１０が準備される（２２０４）。例えば、光学顕微鏡は、ライトシート１８０２Ａ、１８０２Ｂ、１８０４Ａ、１８０４Ｂの特性（位置合わせなど）を調節することにより、準備することができる（２２０４）。
光学顕微鏡１８１０が準備されると（２２０４）、１つ以上の第１のライトシート１８０２Ａ、１８０４Ａが生成される（２２０６）。１つ以上の第１のライトシート１８０２Ａ、１８０４Ａは、試料１８０１内で空間的及び時間的オーバラップが発生するように、生物試料１８０１に向かって誘導される（２２０８）。１つ以上の第１のライトシート１８０２Ａ、１８０４Ａの時間的オーバラップは、光学顕微鏡１８１０の空間分解能限界に対応する分解能時間より小さい。しかも、このタイムシフト中に生物試料１８０１の追跡された構造物における空間的変位は光学顕微鏡１８１０の空間分解能限界より小さい。
１つ以上の第１のライトシート１８０２Ａ、１８０４Ａはそれぞれの経路に沿って誘導され、両方の経路は第１のアーム軸１８２１と平行な第１の照射軸と平行である。１つ以上の第１のライトシート１８０２Ａ、１８０４Ａは、ｘ−ｙ平面内にある第１の画像平面内で生物試料１８０１の少なくとも一部分と光学的に相互作用する。１つ以上の第１のライトシート１８０２Ａ、１８０４Ａは互いに異なる偏光状態を有することができる。
照射の開始及び蛍光の記録は、受精卵から複雑系への発達において生物試料１８０１のイメージングを可能にするために、受精卵が形成された瞬間に開始することができる。
生物試料１８０１から放出された蛍光Ｆ４、Ｆ５の画像は、それぞれの光学アーム１８４０、１８５０のカメラ１９７９、１９９９の検出軸に沿って、それぞれカメラ１９７９、１９９９によって複数の第１のビューのそれぞれにおいて記録される（２２１０）。これは、共用対物レンズ１９７６で蛍光Ｆ４を捕捉すること及び共用対物レンズ１９７６からのこの捕捉された蛍光Ｆ４を、蛍光Ｆ４の画像を記録するカメラ１９７９に誘導することを含む。また、これは、共用対物レンズ１９９６で蛍光Ｆ５を捕捉すること及び共用対物レンズ１９９６からのこの捕捉された蛍光Ｆ５を、蛍光Ｆ５の画像を記録するカメラ１９９９に誘導することも含む。蛍光Ｆ４、Ｆ５の画像は、それぞれの焦平面がライトシート１８０２Ａ、１８０４Ａの平面とオーバラップするようにそれぞれの光学アーム１８４０、１８５０の共用対物レンズ１９７６、１９９６が位置合わせされたことを保証することにより、カメラ１９７９、１９９９によって複数の第１のビューのそれぞれにおいて記録することができる。
ステップ２２０６〜２２１０は、生物試料１８０１全体をイメージングするために１つ以上の生成された第１のライトシート１８０２Ａ、１８０４Ａ及び光学アーム１８４０、１８５０の共用対物レンズ１９７６、１９９６がｚ軸に沿って複数ステップで並進される時にそれぞれのｚ位置で実行される。また、手順２２００は、ステップ２２０６〜２２１０がｙ方向及びｚ方向に実行された後に生物試料１８０１を再位置決めすることも含むことができる。
次に、１つ以上の第２のライトシート１８０２Ｂ、１８０４Ｂが生成される（２２１２）。以下に記載されているいくつかの実現例では、１つ以上の第１のライトシート１８０２Ａ、１８０４Ａの生成後（２２０６）、しかも１つ以上のそれぞれの光源ユニット１８２２、１８３２の非活動化後に、１つ以上の第２のライトシート１８０２Ｂ、１８０４Ｂが生成される（２２１２）。以下に記載されているその他の実現例では、１つ以上の第１のライトシート１８０２Ａ、１８０４Ａの生成中に（２２０６）、１つ以上の第２のライトシート１８０２Ｂ、１８０４Ｂが生成される（２２１２）。１つ以上の第２のライトシート１８０２Ｂ、１８０４Ｂは互いに異なる偏光状態を有することができる。
試料１８０１内で空間的及び時間的オーバラップが発生するように、１つ以上の第２のライトシート１８０２Ｂ、１８０４Ｂが生物試料１８０１に向かって誘導される（２２１４）。１つ以上の第２のライトシート１８０２Ｂ、１８０４Ｂの時間的オーバラップは、光学顕微鏡１８１０の空間分解能限界に対応する分解能時間より小さいタイムシフトの範囲内である。しかも、このタイムシフト中に生物試料１８０１の追跡された構造物における空間的変位は光学顕微鏡１８１０の空間分解能限界より小さい。
１つ以上の第２のライトシート１８０２Ｂ、１８０４Ｂは、１つ以上の第２のライトシート１８０２Ｂ、１８０４Ｂがｚ−ｘ平面と平行な第２の画像平面内で生物試料の少なくとも一部分と光学的に相互作用するように、第２のアーム軸１８４１と平行な第２の照射軸と平行であるそれぞれの経路に沿って誘導される。第２の照射軸は第１の照射軸と平行ではない。生物試料１８０１から放出された蛍光Ｆ２、Ｆ３の画像は、それぞれの光学アーム１８２０、１８３０のカメラ１９６９、１９８９の検出軸に沿って、それぞれカメラ１９６９、１９８９によって複数の第２のビューのそれぞれにおいて記録される（２２１６）。蛍光Ｆ２、Ｆ３の画像は、それぞれの焦平面がライトシート１８０２Ｂ、１８０４Ｂの平面とオーバラップするようにそれぞれの光学アーム１８２０、１８３０の共用対物レンズ１９６６、１９８６が位置合わせされたことを保証することにより、カメラ１９６９、１９８９によって複数の第２のビューのそれぞれにおいて記録することができる。
ステップ２２１２〜２２１６は、生物試料１８０１全体をイメージングするために１つ以上の生成された第２のライトシート１８０２Ｂ、１８０４Ｂ及びそれぞれの光学アーム１８２０、１８３０の共用対物レンズ１９６６、１９８６がｙ軸に沿って複数ステップで並進される間にそれぞれのｙ位置で実行される。また、手順２２００は、ステップ２２１２〜２２１６がｙ方向及びｚ方向に実行された後に生物試料１８０１を再位置決めすることも含むことができる。
生物試料１８０１のイメージング（ステップ２２０６〜２２１６を含む）は、生物試料の所定の時間の発達まで続行される。例えば、イメージングは、発達中の胚（生物試料）内で強い筋収縮が始まるまで続行することができ、その時点で、試料１８０１がより物理的にアクティブになり、イメージングするのがより困難になる可能性があるので、イメージングを停止することができる。しかし、この発達ポイントを過ぎてもイメージングを続行できることは可能である。
手順２２００中に、蛍光がもう一度記録される前に、１つ以上の第１のライトシート１８０２Ａ、１８０４Ａと生物試料１８０１との相対位置合わせ並びに１つ以上の第２のライトシート１８０２Ｂ、１８０４Ｂと生物試料１８０１との相対位置合わせをリセットすることは有用である可能性がある。生物試料１８０１のイメージングが完了する（即ち、蛍光画像のすべてが記録される２２１０及び２２１６）と、生物試料１８０１の画像が作成される（２２１８）。生物試料１８０１の画像は、その間に生物試料１８０１がスキャンされている時間の経過につれて発達する、生物試料１８０１内の１組の追跡された構造物（細胞など）を含む。従って、例えば、追跡された構造物は生物試料１８０１のある部分から生物試料１８０１の他の部分に移動する可能性があり、経路はイメージング中に可視化することができる。或いは、細胞などの追跡された構造物は有糸分裂により２つの細胞に分裂する可能性があり、この２つの細胞のそれぞれを追跡することができる。
ステップ２２０６〜２２１０を使用するイメージング（ライトシート１８０２Ａ、１８０４Ａ及び対物レンズ１９７６、１９９６をｚ軸に沿って並進させることを伴う）並びにステップ２２１２〜２２１６を使用するイメージング（ライトシート１８０２Ｂ、１８０４Ｂ及び対物レンズ１９６６、１９８６をｙ軸に沿って並進させることを伴う）から切り換えることは、ある程度の時間を要する。好ましくは、これらのイメージング方式のそれぞれから切り換えることはわずか数ミリ秒を要するものでなければならない。しかも、生物試料１８０１全体のスキャン（それぞれのｘ−ｙ平面及びそれぞれのｚ−ｘ平面において実行される）は、イメージング中の生物試料１８０１のボリューム及び画像平面の密度（スキャンされるそれぞれの画像平面間の距離である）次第で、数ミリ秒以上を要する可能性がある。
顕微鏡システム１８００には異なる複数の動作モードが存在し、これらの異なるモードは、手順２２００を使用して生物試料１８０１をスキャンしイメージングするための異なる方法である。動作モードは、情報の正確な分析を続行できるように、記録される情報（蛍光）が顕微鏡システム１８００によってどのように分離されるかによって左右される。計算システム１８９０は、情報を正確に分析するために蛍光がどのように生成されるかを区別できる必要がある。
いくつかの実現例では、記録された情報はカラー又はスペクトルスペースで分離することができ、これは、その情報が別個の波長になり得ることを意味する。例えば、１つ以上の第１のライトシート１８０２Ａ、１８０４Ａが１つ以上の第２のライトシート１８０２Ｂ、１８０４Ｂとは異なる波長である場合、１つ以上の第１のライトシート１８０２Ａ、１８０４Ａは、第１の波長で蛍光Ｆ４、Ｆ５を放出する生物試料１８０１内の第１の組の蛍光体を励起するように構成することができ、１つ以上の第２のライトシート１８０２Ｂ、１８０４Ｂは、第２の波長で蛍光Ｆ２、Ｆ３を放出する生物試料１８０１内の第２の組の蛍光体を励起するように構成することができる。第１の波長は第２の波長とは別個のものであるので、計算システム１８９０は、情報の分析中にどのライトシートがどの蛍光を生成するかを区別することができる。
その他の実現例では、記録された情報は時間的スペースで分離することができ、これは、その情報が順次得られることを意味する。情報が時間的スペースで分離される場合、別個の波長を操作する必要はない。更にその他の実現例では、記録された情報は空間的スペースで分離することができ、これは、その情報が共焦点アパーチャを使用して分離されることを意味する。情報が空間的スペースで分離される場合、別個の波長を操作する必要はない。
次に、生物試料１８０１をスキャンしイメージングするためのこれらの模範的な動作モードについて説明する。
図２３Ａ〜図２６を参照すると、第１の模範的な動作モードでは、１つ以上の第１のライトシート１８０２Ａ、１８０４Ａ及び１つ以上の第２のライトシート１８０２Ａ、１８０４Ａは同じ波長を有し、これらは順次操作されるので、情報は時間的スペースで分離される。
特に図２３Ａ〜図２３Ｃ及び図２４に関連して説明すると、第１の光学アーム１８２０の光源ユニット１８２２は第１のライトシートのうちの１つ１８０２Ａを生成するように活動化され、第３の光学アーム１８３０の光源ユニット１８３２は第１のライトシートのうちのもう１つ１８０４Ａを生成するように活動化され、これらは第１の照射軸（並びに第１のアーム軸１８２１及びｙ軸）と平行な経路に沿って反対方向に生物試料１８０１に誘導される。１つ以上の第１のライトシート１８０２Ａ、１８０４Ａは、図２３Ａ〜図２３Ｃに概略的に示されているように、試料１８０１内で空間的及び時間的にオーバラップする。最初に、１つ以上の第１のライトシート１８０２Ａ、１８０４Ａは、図２３Ａに示されているように、基礎となるｘ−ｙ画像平面に沿って誘導することができる。生物試料１８０１から放出された蛍光Ｆ４、Ｆ５はそれぞれのカメラ１９７９、１９９９によって画像として検出され、この画像データは電子機器コントローラ１８８０によって受け取られ、適切に処理され、次に計算システム１８９０内で記録される。
試料１８０１のそれぞれのｘ−ｙ画像平面における蛍光は、生物試料１８０１全体が捕捉されるまで記録される。例えば、図２３Ａに示されている画像平面における蛍光Ｆ４、Ｆ５が記録された後、生物試料１８０１と１つ以上の第１のライトシート１８０２Ａ、１８０４Ａとの間のｚ軸に沿った相対配置は、次のｘ−ｙ画像平面を記録できるようにｚ軸並進方式でｚ軸に沿って１つのステップ分だけ変更される。このようにして、生物試料１８０１から放出された蛍光は、生物試料１８０１のｘ−ｙ画像平面のそれぞれにおいて増分式に記録される。例えば、図２３Ｂでは、生物試料１８０１の中央領域付近に位置するｘ−ｙ画像平面において蛍光Ｆ４、Ｆ５が記録され、図２３Ｃでは、生物試料１８０１の最上部領域に位置するｘ−ｙ画像平面において生物試料１８０１から放出された蛍光Ｆ４、Ｆ５が記録される。
この時間の間、１つ以上の第１のライトシート１８０２Ａ、１８０４Ａは生物試料１８０１と相互作用し、蛍光Ｆ４、Ｆ５が記録されており、１つ以上の第２のライトシート１８０２Ｂ、１８０４Ｂが生成されないように、第２の光学アーム１８４０内の光源ユニット１８４２は非活動化され、第４の光学アーム１８５０内の光源ユニット１８５２は非活動化される。
生物試料１８０１から放出された蛍光Ｆ４、Ｆ５がそれぞれのｘ−ｙ画像平面において記録されると、第１の光学アーム１８２０内の光源ユニット１８２２は非活動化され、第３の光学アーム１８３０内の光源ユニット１８３２は非活動化される。次に、図２５Ａ〜図２５Ｃ及び図２６に示されているように、第２の光学アーム１８４０の光源ユニット１８４２は第２のライトシートのうちの１つ１８０２Ｂを生成するように活動化され、第４の光学アーム１８５０の光源ユニット１８５２は第２のライトシートのうちのもう１つ１８０４Ｂを生成するように活動化され、そのどちらも第２の照射軸（並びに第２のアーム軸１８４１及びｚ軸）と平行な経路に沿って反対方向に生物試料１８０１に誘導される。１つ以上の第２のライトシート１８０２Ｂ、１８０４Ｂは、図２５Ａ〜図２５Ｃに概略的に示されているように、試料１８０１内で空間的及び時間的にオーバラップする。最初に、１つ以上の第２のライトシート１８０２Ｂ、１８０４Ｂは、図２５Ａに示されているように、基礎となるｚ−ｘ画像平面に沿って誘導することができる。生物試料１８０１から放出された蛍光Ｆ２、Ｆ３はそれぞれのカメラ１９６９、１９８９によって画像として検出され、この画像データは電子機器コントローラ１８８０によって受け取られ、適切に処理され、次に計算システム１８９０内で記録される。
試料１８０１のそれぞれのｚ−ｘ画像平面における蛍光Ｆ２、Ｆ３は、生物試料１８０１全体が捕捉されるまで記録される。例えば、図２５Ａに示されている画像平面における蛍光Ｆ２、Ｆ３が記録された後、生物試料１８０１と１つ以上の第２のライトシート１８０２Ｂ、１８０４Ｂとの間のｙ軸に沿った相対配置は、次のｚ−ｘ画像平面を記録できるようにｙ軸並進方式でｙ軸に沿って１つのステップ分だけ変更される。このようにして、生物試料１８０１から放出された蛍光Ｆ２、Ｆ３は、生物試料１８０１のｚ−ｘ画像平面のそれぞれにおいて増分式に記録される。例えば、図２５Ｂでは、生物試料１８０１の中央領域付近に位置するｚ−ｘ画像平面において蛍光Ｆ２、Ｆ３が記録され、図２５Ｃでは、生物試料１８０１の最上部領域に位置するｚ−ｘ画像平面において生物試料１８０１から放出された蛍光Ｆ２、Ｆ３が記録される。
この第１の模範的な動作モードでは、スキャン及び記録は、それぞれの光学アーム１８４０、１８５０内の光源ユニット１８４２、１８５２の活動化及びそれぞれの光学アーム１８２０、１８３０内の検出ユニット１８２４、１８３４を使用する記録（その時間の間、光源ユニット１８２２、１８３２は非活動化される）と、それぞれの光学アーム１８２０、１８３０内の光源ユニット１８２２、１８３２の活動化及びそれぞれの光学アーム１８４０、１８５０内の検出ユニット１８４４、１８５４を使用する記録（その時間の間、光源ユニット１８４２、１８５２は非活動化される）との間で交互に行うことができる。その上、これらの２通りの垂直照射及び検出方式は、生物試料１８０１を通るそれぞれの完全なスキャンの後に交互に行うことができる。
代わって、この第１の模範的な動作モードでは、それぞれの方向のそれぞれのステップ（それぞれのｙステップ又はそれぞれのｚステップのいずれか）の後にこれらの２通りの垂直照射及び検出方式を交互に行うことにより、ｚ軸並進方式とｙ軸並進方式を織り交ぜることが可能である。例えば、１つのｚステップの後、次のｚステップに進む代わりに、スキャン及び記録がアームを切り換え、ｚステップが非アクティブになり、ｙステップが記録される。その後、スキャン及び記録がもう一度アームを切り換え、生物試料１８０１内のすべてのステップがスキャンされ記録されるまで、次のｚステップが記録される（ｙステップが非アクティブである間）。
従って、例えば、以下の模範的なシーケンスはこの織り交ぜ方式で発生する可能性がある。
Ｉ．スキャン及び記録は、１つ以上の第１のライトシート１８０２Ａ、１８０４Ａが生物試料１８０１に誘導され、カメラ１９７９、１９９９がそれぞれの蛍光Ｆ４、Ｆ５を記録するｘ−ｙ画像平面ＩＰ（ｘ−ｙ）１において行うことができる。
ＩＩ．スキャン及び記録は、１つ以上の第２のライトシート１８０２Ｂ、１８０４Ｂが生物試料１８０１に誘導され、カメラ１９６９、１９８９がそれぞれの蛍光Ｆ２、Ｆ３を記録するｚ−ｘ画像平面ＩＰ（ｚ−ｘ）１において行うことができる。
ＩＩＩ．スキャン及び記録は、１つ以上の第１のライトシート１８０２Ａ、１８０４Ａが生物試料１８０１に誘導され、カメラ１９７９、１９９９がそれぞれの蛍光Ｆ４、Ｆ５を記録するｘ−ｙ画像平面ＩＰ（ｘ−ｙ）２において行うことができる。
ＩＶ．スキャン及び記録は、１つ以上の第２のライトシート１８０２Ｂ、１８０４Ｂが生物試料１８０１に誘導され、カメラ１９６９、１９８９がそれぞれの蛍光Ｆ２、Ｆ３を記録するｚ−ｘ画像平面ＩＰ（ｚ−ｘ）２において行うことができる。
ｘ−ｙ画像平面ＩＰ（ｘ−ｙ）１及びＩＰ（ｘ−ｙ）２におけるスキャン及び記録の間、光源ユニット１８２２、１８３２は活動化され、光源ユニット１８４２、１８５２は非活動化され、ｚ−ｘ画像平面ＩＰ（ｚ−ｘ）１及びＩＰ（ｚ−ｘ）２におけるスキャン及び記録の間、光源ユニット１８４２、１８５２は活動化され、光源ユニット１８２２、１８３２は非活動化される。
図２７を参照すると、もう１つの動作モードでは、記録された情報はカラー又はスペクトルスペースで分離され、これは、情報が別個の波長であることを意味する。このモードでは、１つ以上の第１のライトシート１８０２Ａ、１８０４Ａは第１の照射波長λＩ１であり、１つ以上の第２のライトシート１８０２Ｂ、１８０４Ｂは第２の照射波長λＩ２である。このようにして、１つ以上の第１のライトシート１８０２Ａ、１８０４Ａは、波長λＩ１で励起された時にのみ蛍光Ｆ４、Ｆ５を放出する、生物試料１８０１内の第１の組の蛍光体を励起するように構成され、１つ以上の第２のライトシート１８０２Ｂ、１８０４Ｂは、波長λＩ２で励起された時にのみ蛍光Ｆ２、Ｆ３を放出する、生物試料１８０１内の第２の組の蛍光体を励起するように構成される。その上、第１の照射波長λＩ１の光によって励起された第１の組の蛍光体は第１の検出波長λＤ１で蛍光Ｆ４、Ｆ５を放出し、第２の照射波長λＩ２の光によって励起された第２の組の蛍光体は第２の検出波長λＤ２で蛍光Ｆ２、Ｆ３を放出する。第１の照射波長λＩ１は第２の照射波長λＩ２とは別個のものであり、第１の検出波長λＤ１は第２の検出波長λＤ２とは別個のものであるので、計算システム１８９０は、記録画像の分析中にどのライトシートがどの蛍光を生成するかを区別することができる。
この動作モードは、同じ実験で同じ生物試料１８０１から異なるタイプの近接情報を抽出する必要がある時に有用である可能性がある。光学顕微鏡１８１０の解像度は最善でも回折限界があるので、２つのタイプの情報の蛍光体は互いにより接近している可能性があり、これは何らかの情報分離なしに結果として生ずる画像データを容易に解釈するのを困難にする可能性がある。例えば、細胞核に関する形態学的情報をイメージングする必要があり、同時に細胞の外部形質膜に関する形態学的情報をイメージングする必要があり、これらの２つの細胞組織が互いに非常に接近しているので異なるスペクトル領域の使用なしに２つの構造物からの情報を分離することが困難になる。従って、これらの２つの細胞領域は、これらの近接構造物の分析を独立して可能にする有用な画像データを得るために、異なるスペクトル領域（波長）で標識を付けることができる。２つのタイプの細胞領域のもう１つの例は、微小管細胞骨格及びアクチン細胞骨格のための標識である。互いに接近している任意の構造物は、異なるスペクトル領域（波長）で標識が付けられると解明し易くなる。これに反して、胚のすべての細胞の核など、互いにより遠くに離れている構造物の場合、生物サンプル１８０１全体を通して単一のカラー標識（１つの波長）を使用し、その他の動作モードを使用してイメージングを実行することができる。同じカラーチャネルを使用して両方の構造物に標識を付ける時に別々の物体として識別可能になるために、少なくとも光学顕微鏡１８１０の軸方向分解能と同じ大きさの距離だけ互いに分離された場合、それらの構造物は互いに遠く離れることができる。
図２７を参照すると、情報はスペクトルスペースで分離されるので、１つ以上の第１のライトシートと１つ以上の第２のライトシートを同時にスキャンし、蛍光Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５を同時に記録することは可能である。時間が経過するにつれて、１つ以上の第１のライトシート１８０２Ａ、１８０４Ａ及び光学アーム１８４０、１８５０の共用対物レンズ１９７６、１９９６はｚ軸並進方式でｚ軸に沿って複数ステップで並進され、１つ以上の第２のライトシート１８０２Ｂ、１８０４Ｂ及びそれぞれの光学アーム１８２０、１８３０の共用対物レンズ１９６６、１９８６はｙ軸並進方式でｙ軸に沿って複数ステップで並進される。従って、ｚ軸並進方式とｙ軸並進方式は同時に行われる。その上、この動作モードでは、１つ以上の第１のライトシート１８０２Ａ、１８０４Ａ及び１つ以上の第２のライトシート１８０２Ｂ、１８０４Ｂの両方が同時に生物試料１８０１に誘導され、従って、第１及び第２の組の蛍光体の両方がスキャン及び記録中に同時に励起されることは可能である。
従って、すべての光学アーム１８２０、１８３０、１８４０、１８５０は照射動作及び検出動作の両方を同時に実行する。この動作モードでの設計上の問題の１つは、光学アーム１８４０、１８５０の共用対物レンズ１９７６、１９９６が並進された時にそれぞれのライトシート１８０２Ｂ、１８０４Ｂの焦点がそれに応じてシフトされ、光学アーム１８２０、１８３０の共用対物レンズ１９６６、１９８６が並進された時にそれぞれのライトシート１８０２Ａ、１８０４Ａの焦点がそれに応じてシフトされることである。すべての照射動作及び検出動作が同時に実行されるので常に蛍光を検出しているそれぞれのカメラ１９６９、１９７９、１９８９、１９９９では検出された蛍光Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５が最適にイメージングされない可能性があり、このような焦点シフトなしに実行されたイメージングと比較した場合にこのような焦点シフトが軸方向分解能を低減する可能性があるので、顕微鏡システム１８００の動作には必要ではないが、この焦点シフトを補償することができる。例えば、ライトシートは視野の中心の周りに対称的に位置決めされるではなく、ボリュームスキャンの進行次第で一方の側又はもう一方の側に向かってシフトされるので、蛍光はそれぞれのライトシートの最も薄い部分の外側の蛍光体から生成されるために、軸方向分解能の低減が発生する可能性がある。
従って、顕微鏡システム１８００はそれぞれの光源ユニット１８２２、１８３２、１８４２、１８５２に追加の補償光学モジュールを含むことができる。図２９を参照すると、光学アーム１８２０の拡大図は、共用対物レンズ１９６６の後部焦平面に共役した平面において、二色性ビームスプリッタ１８２３とスキャン装置１９６２との間の経路内に配置された補償光学モジュール２９００を含む。補償光学モジュール２９００は、例えば、複数レンズによって側面が固められた電子チューナブルレンズを含むことができる。この電子チューナブルレンズは、スイス、ディエーティコンのＯｐｔｏｔｕｎｅ ＡＧによって製作された高速電気チューナブルレンズ型式番号ＥＬ−１０−３０にすることができる。補償光学モジュール２９００は、共用対物レンズ（図２９に示されている共用対物レンズ１９６６など）の並進によって生成された量に等しく反対の範囲まで共用対物レンズ１９６６の焦点を並進させる。
図３０を参照すると、もう１つの動作モードでは、記録された情報は空間的スペースで分離され、これは、情報がそれぞれの共焦点アパーチャ３０２５、３０３５、３０４５、３０５５を使用してそれぞれの光学アーム１８２０、１８３０、１８４０、１８５０内で分離され、１つ以上の第２のライトシート１８０２Ｂ、１８０４Ｂが１つ以上の第１のライトシート１８０２Ａ、１８０４Ａから空間的に互い違いに配置され、それらがそれぞれの非平行照射軸に沿って生物試料１８０１を通過する時にオーバラップしないようになっていることを意味する。この動作モードでは、１つ以上の第１のライトシート１８０２Ａ、１８０４Ａ及び１つ以上の第２のライトシート１８０２Ｂ、１８０４Ｂの両方は同じ照射波長λＩにすることができ、蛍光体は同じ検出波長λＤの光を放出することができる。その上、すべての光学アーム１８２０、１８３０、１８４０、１８５０は、図２８に関連して上述したように、この動作モードでは照射動作及び検出動作の両方を同時に実行することができる。
光学アーム１８２０の分解図を示す図２９を参照すると、共焦点アパーチャ３０２５はサンプル平面に共役した平面に配置される。共焦点アパーチャ３０２５は、カメラ１９６９に組み込むことができ、蛍光Ｆ２の位置を追従する経路を追跡するためにｚ軸に沿って並進するようにセットアップすることができる。図３１Ａを参照すると、共焦点アパーチャ３０２５は、それを通って光がカメラ１９６９のセンサ３１１５内に入る開口部（ｏｐｅｎｉｎｇ）３１１０を規定する。開口部３１１０は、センサ３１１５で検出されることになっている蛍光Ｆ２の経路に沿って移動し、図３１Ｂ及び図３１Ｃに示されているように、開口部３１１０の位置に集束される蛍光Ｆ２を通過させるのに十分な幅である。特に、蛍光Ｆ２は少なくとも部分的にサンプル１８０１とライトシート１８０２Ｂとの相互作用によるものであり、サンプル１８０１内のライトシート１８０２Ｂの焦点の位置から生じる任意の光（蛍光Ｆ２など）はアパーチャ３０２５の開口部３１１０を通ってセンサ３１１５に達するが、ライトシート１８０２Ｂ自体からの光は、図３１Ａ〜図３１Ｃに示されていないフィルタ１９６８によって遮断される。従って、ライトシート１８０２Ａは生物試料１８０１内でライトシート１８０２Ｂとオーバラップしないか又はそれを横切らないので、ライトシート１８０２Ａと相互作用する蛍光体から放出されたＦ４などの任意の蛍光は、アパーチャ３０２５によって遮断され、開口部３１１０を通過しない。
図３２を参照すると、共焦点アパーチャ３０２５を使用して、情報を分離するための空間的方法を提供するために、１つ以上の第２のライトシート１８０２Ｂ、１８０４Ｂが１つ以上の第１のライトシート１８０２Ａ、１８０４Ａから空間的に互い違いに配置され、それらが非平行照射軸に沿って生物試料１８０１を通過する時にオーバラップしないようになっている。図３２は、スキャン装置を使用してそれぞれの光学アーム内の光源からの光ビームがどのように形成され、互い違いに配置されるかを示している。それぞれの光学アーム１８２０、１８３０、１８４０、１８５０の４つのスキャン装置１９６２、１９８２、１９７２、１９９２は、生成されたそれぞれのライトシートがどのように互い違いに配置されるかを伝達するために例示目的のみで同じ照射軸に沿って誘導されているものとして図３２に示されている。この例のスキャン方向はｘ軸に沿っているが、４つのスキャン装置１９６２、１９８２、１９７２、１９９２は異なる照射軸に沿って配置されている。
この例では、第１の光学アーム１８２０の光源ユニット１８２２の光源１９６０からのビームはｆθレンズ１９６４に向かって光学スキャナ装置（回転可能又は可動ミラーなど）１９６３によってｘ軸に沿って偏向される（しかもそれを越えてスキャンされる）。更に、第３の光学アーム１８３０の光源ユニット１８３２の光源１９８０からのビームはｆθレンズ１９８４に向かって光学スキャナ装置（可動ミラー）１９８３によってｘ軸に沿って偏向される（しかもそれを越えてスキャンされる）。光学スキャナ装置１９６３、１９８３はｆθレンズ１９６４、１９８４の焦平面に位置するように位置決めされ、その結果、巨視的ライトシートを生成するので、光学スキャナ装置１９６３、１９８３を出る光ビームの角度はそれぞれのｆθレンズ１９６４、１９８４によってｘ軸に沿った変位に変換される。図示の通り、光学アーム１８２０、１８３０内で生成された巨視的ライトシートはオーバラップしており、互いに変位されない。これに反して、光学アーム１８４０、１８５０内で生成された巨視的ライトシートは、光学アーム１８２０、１８３０内で生成された巨視的ライトシートから変位Ｄだけ変位される。従って、図３１Ｂ及び図３１Ｃに示されているように、ライトシート１８０２Ｂのビームは生物試料１８０１内部で変位Ｄ’だけライトシート１８０２Ａのビームからオフセットされる。更に、図３１Ｂ及び図３１Ｃには示されていないが、ライトシート１８０４Ｂのビームもライトシート１８０２Ａのビーム及びライトシート１８０４Ａのビームからオフセットされ、ライトシート１８０２Ｂのビームはライトシート１８０４Ａのビームからもオフセットされる。
図３３を参照すると、手順２２１８を使用して生物試料１８０１の画像が作成される。手順２２１８は、１つ以上の第１のライトシート１８０２Ａ、１８０４Ａと生物試料１８０１との相互作用により生成される第１の画像を形成すること（３３０５）を含む。第１の画像を形成することは、それぞれの検出ユニット１８４４、１８５４のカメラ１９７９、１９９９で記録された情報の分析を伴う。この分析は手順７１６を使用して記載されている方法で進行し、図９に関連する説明が参照され、従って、ここでは繰り返さない。計算システム１８９０は位置合わせされた（しかも登録された）融合データセットを第１の画像に融合し、これは、生物試料１８０１内のライトシート１８０２Ａ、１８０４Ａの空間的及び時間的オーバラップに対応する生物試料１８０１の画像ｘ−ｙ平面を表す。
次に、手順２２１８は、１つ以上の第２のライトシート１８０２Ｂ、１８０４Ｂと生物試料１８０１との相互作用により生成される第２の画像を形成すること（３３１０）を含む。第２の画像を形成することは、それぞれの検出ユニット１８２４、１８４４のカメラ１９６９、１９８９で記録された情報の分析を伴う。この分析は手順７１６を使用して記載されている方法で進行し、図９に関連する説明が参照され、従って、ここでは繰り返さない。計算システム１８９０は位置合わせされた（しかも登録された）融合データセットを第２の画像に融合し、これは、生物試料１８０１内のライトシート１８０２Ｂ、１８０４Ｂの空間的及び時間的オーバラップに対応する生物試料１８０１の画像ｚ−ｘ平面を表す。
ステップ３３０５及び３３１０は、データセット全体が分析され、１組の第１及び第２の画像が作成されるまで、記録されるそれぞれのｘ−ｙ平面及び記録されるそれぞれのｚ−ｘ平面について実行される。一般に、生物試料１８０１は生きており、時間の関数として変化して移動し、２つの異なるビューにおけるイメージングは同時に実行されない可能性があるので、イメージングされたサンプルのｚボリューム（ステップ３３０５から得られる）内の追跡された構造物はイメージングされたサンプルのｙボリューム（ステップ３３１０から得られる）内の追跡された構造物と完全に同一になるわけではない。すべてのビューを単一の画像スタックに結合し、複数の視野角を結合することによって空間分解能を改善するための顕微鏡の潜在能力を利用するために、ステップ３３０５及び３３１０によるマルチビュー画像データが計算的に位置合わせされる（３３１５）。この計算的位置合わせは、例えば、それぞれのビューの画像内容を比較し、画像データが最良の全体対応（例えば、ボリュームの全域で最高の相関係数）を示すまで基準ビューに関して所与の変形モデル（並進又は非線形局所変形可能モデルなど）を使用してすべてのビューを変形することにより、実行することができる。或いは、この計算的位置合わせは、生物試料１８０１を取り囲むアガロースゲル内に混合される蛍光ビーズなどの基準マーカを使用して実行することができる。このビーズはすべてのビューにおいて幾何学的に位置合わせすることができ、それによりこれらのビューにおいて捕捉された生物試料の位置合わせも自動的に生成する。計算的位置合わせのための基準マーカの使用は、光散乱及び光学収差がイメージングプロセスに著しく影響しないことを想定している。そうではなく、光散乱及び光学収差は、異なるビューに沿ってイメージングプロセスにおける相対的違いを発生する可能性があり、ビーズは、光学摂動が発生する生物試料のボリュームの外側に位置する時にこれらの違いを捕捉できない可能性がある。
位置合わせ後、マルチビュー・デコンボリューション・アルゴリズムを使用してデータが結合される（３３２０）。特に、（それぞれのｘ−ｙ平面及びそれぞれのｚ−ｘ平面における）第１及び第２の画像のそれぞれからのデータが結合され、生物試料１８０１の最終画像を形成する（３３１５）。（ライトシート１８０２Ａ、１８０４Ａを介して）第１の照射軸に沿ったビュー及び（ライトシート１８０２Ｂ、１８０４Ｂを介して）第２の照射軸に沿ったビューの両方から生物試料内の同じ位置を観察することができる。マルチビュー・デコンボリューション・プロセスを使用して第１及び第２の画像（それぞれ非平行ビューから得られたもの）のそれぞれからのデータを結合することができる。マルチビュー・デコンボリューション・プロセスは、それぞれの条件付き確率（点広がり関数）の場合にすべての観察分布（ビュー）を最も良く説明する最も確度の高い基礎分布（解析された画像）を推定することができる。
その他の実現例では、光学顕微鏡１８１０は、空間内の第３の軸に沿ってイメージングを実行できるように。生物試料１８０１及びチャンバの上又は下に第５の光学アームを追加することにより、３つの相補的取得ステップに変更又は拡張することができる。
その他の実現例では、光源１９６０、１９７０のそれぞれから放出された光ビームに揺れ（ｗｏｂｂｌｅ）を加えることが可能である。光ビームに加えられた揺れは、ライトシート１８０２Ａ、１８０２Ｂのビームが生物試料１８０１内で大きい散乱又は吸収中心に遭遇した時に記録された画像内のストライピングアーチファクトを除去するために使用することができる。このモードでは、光源１９６０、１９７０のそれぞれから放出された光ビームはｘｙ−ガルバノメータ制御のミラーによって揺られ、次に揺れたビームは、それぞれのスキャン装置１９６２、１９７２に誘導される前に円柱レンズによって引き伸ばされて光のシートを作成する。従って、（それぞれの光源１９６０、１９７０からの単一のガウスビームの代わりに）光のシートがそれぞれのスキャン装置１９６２、１９７２に向かって誘導される。この光のシートは、ｘ軸に沿って光のシートをスキャンするそれぞれのスキャン装置１９６２、１９７２上に集束され、それぞれのスキャン装置１９６２、１９７２からの出力の結果、生物試料１８０１の平面（それぞれ、ｘ−ｙ画像平面又はｚ−ｘ画像平面）内のｘ軸スキャンライトシートが得られる。このようにして、ライトシート１８０２Ａ、１８０４Ｂの代わりに細長いライトシート１８０２Ａ’、１８０４Ｂ’が生物試料１８０１を通ってスキャンされる。
図３４を参照すると、その他の実現例では、顕微鏡システム３４００は、顕微鏡システム１７００によく似た設計になっているが、他の光学アーム３４２０、３４３０、３４４０、３４６０の光学アーム軸のいずれとも平行ではない光学アーム軸に沿って設計された少なくとも１つの追加の光学アーム３４６０も含む。従って、光学アーム３４６０は、その光学アーム軸がｘ軸に沿って延びた状態で位置決めすることができる。光学アーム３４６０は、生物試料３４０１の上及び／又は下に配置することができる。生物試料３０４１の下に配置された場合、ｘ−ｙ−ｚ軸に対して斜めの方向の１つに沿ってチャンバ（チャンバ１８１２など）内に試料ホルダ（１８６６など）を挿入することができる。光学アーム３４６０は、光学アーム１７２０、１７３０、１７４０、１７５０と同一である他の光学アーム３４２０、３４３０、３４４０、３４６０に似た設計になっている。従って、光学アーム３４６０は、検出及び照射を行うことができ、光源ユニット及び検出ユニット（光学アーム１７２０、１７３０、１７４０、１７５０内に見られるものなど）の両方を含む。並進システム３４７０は、追加の光学アーム３４６０内で光源ユニット及び検出ユニットにも結合され、試料領域内に受け入れた生物試料３４０１を回転させずに、光源ユニットによって生成されたライトシート及び光学アーム３４６０内の検出ユニットを線形軸に沿って並進させるように構成されるように、この実現例では変更されている。１つの追加の光学アーム３４６０を追加することにより、１つの追加のビューに沿って完全な１組の画像の捕捉が可能になる。
１つの追加の光学アーム３４６０が追加された場合、生物試料３４０１について１０通りの相補的ビューを得ることができる。
２つの追加の光学アーム３４６０が追加された場合、１２通りの相補的ビューを得ることができる。２つの光学アーム３４６０の追加により、ｘ軸に沿った２つの対物レンズ（Ｏｘ１、Ｏｘ２）、ｙ軸に沿った２つの対物レンズ（Ｏｙ１、Ｏｙ２）、及びｚ軸に沿った２つの対物レンズ（Ｏｚ１、Ｏｚ２）が配置される。更に、ｘ軸又はｙ軸のいずれかに沿って生成されたｘ−ｙ平面内の２つのライトシート（Ｌｘｙ＿ｘ及びＬｘｙ＿ｙ）、ｘ軸又はｚ軸のいずれかに沿って生成されたｘ−ｚ平面内の２つのライトシート（Ｌｘｚ＿ｘ及びＬｘｚ＿ｚ）、並びにｙ軸又はｚ軸のいずれかに沿って生成されたｙ−ｚ平面内の２つのライトシート（Ｌｙｚ＿ｙ及びＬｙｚ＿ｚ）という６通りの幾何学的配向のライトシートにより、６通りの幾何学的配向のライトシートを生成することができる。また、２つの光学アームの追加により１２通りのビューが可能になり、即ち、ライトシートＬｘｙ＿ｘ（Ｏｘ１及びＯｘ２によって生成されたもの）がＯｚ１及びＯｚ２により２つのビューを生成し、ライトシートＬｘｙ＿ｙ（Ｏｙ１及びＯｙ２によって生成されたもの）がＯｚ１及びＯｚ２により２つのビューを生成し、ライトシートＬｘｚ＿ｘ（Ｏｘ１及びＯｘ２によって生成されたもの）がＯｙ１及びＯｙ２により２つのビューを生成し、ライトシートＬｘｚ＿ｚ（Ｏｚ１及びＯｚ２によって生成されたもの）がＯｙ１及びＯｙ２により２つのビューを生成し、ライトシートＬｙｚ＿ｙ（Ｏｙ１及びＯｙ２によって生成されたもの）がＯｘ１及びＯｘ２により２つのビューを生成し、ライトシートＬｙｚ＿ｚ（Ｏｚ１及びＯｚ２によって生成されたもの）がＯｘ１及びＯｘ２により２つのビューを生成する。
図３５Ａ〜図３５Ｃを参照すると、追加の検出サブシステムを追加することにより、顕微鏡システム１００（図１Ａ〜図６に関連して上述したもの）が追加の「ビュー」とともにセットアップされることが可能である。例えば、システム１００は、図３５Ｂ及び図３５Ｃに示されているように、試料１０１のいずれかの側にｘ軸に沿って位置決めすることができる１つ以上の追加の検出サブシステム３５１６、３５１８を含むことができる。１つの追加の検出サブシステム３５１６を使用することにより６通りの相補的光学ビューが可能になり、第１のビューはライトシート１０２と試料１０１との相互作用により放出された蛍光を検出する検出サブシステム１１６から得られ、第２のビューはライトシート１０４と試料１０１との相互作用により放出された蛍光を検出する検出サブシステム１１６から得られ、第３のビューはライトシート１０２と試料１０１との相互作用により放出された蛍光を検出する検出サブシステム１１８から得られ、第４のビューはライトシート１０４と試料１０１との相互作用により放出された蛍光を検出する検出サブシステム１１８から得られ、第５のビューはライトシート１０２と試料１０１との相互作用により放出された蛍光を検出する検出サブシステム３５１６から得られ、第６のビューはライトシート１０４と試料１０１との相互作用により放出された蛍光を検出する検出サブシステム３５１６から得られる。
２つの追加の検出サブシステム３５１６、３５１８を使用することにより、８通りの相補的光学ビューが可能になる。第４の検出サブシステム３５１８を追加するには、試料１０１の位置決めシステムに対して又はチャンバ１６８の設計に対して何らかの変更が必要になる可能性がある。４つ以上の相補的ビューを有する実現例では、試料１０１を側面からチャンバ内に挿入するか又は異なる設計のチャンバ内に配置することができる。
追加の検出サブシステム３５１６、３５１８は、検出サブシステム１１６、１１８と同じように電子機器コントローラ１８０及び計算システム１９０に接続される。手順７００、具体的には、ライトシート１０２、１０４がどのように生成され誘導されるか並びに蛍光がどのように記録されるかは、この拡大図の顕微鏡１１０において以下のように変更される。ライトシート１０２、１０４は、それぞれの検出サブシステム３５１６、３５１８内で検出対物レンズ３５５０、３５５２を利用するために傾斜している。従って、図３６に関連して説明すると、手順３６００は以下のように手順７００から変更される。
最も効率的に蛍光を見るために、検出対物レンズ３５５０、３５５２は、ライトシート１０２、１０４の細長い側に面して、検出対物レンズ３５５０、３５５２の焦平面及びライトシート１０２、１０４が共面になることを保証する必要がある。検出対物レンズ３５５０、３５５２が試料１０１からの蛍光を効率的に捕捉できるようにするために、ライトシート１０２、１０４は、図３５Ｃに示されているように、照射軸（ｙ軸）の周りで９０度傾斜している。図３５Ｃに示されている９０度の傾斜は、光学スキャナ装置１４０を使用して遂行することができ、これは、上述の通り、チップ／チルトステージ上又はガルバノメータスキャナ上に装着された１つ以上の可動ミラー１４０によって形成することができる。従って、例えば、図５Ａに示されているものなど、ｘ軸に沿って前後に動いて光ビームをスキャンする代わりに、光ビームはｚ軸に沿って前後に動いてスキャンされ、図３５Ｂにおいてライトシートに対して９０度傾斜して配向されるライトシートを形成する。
図３５Ｂ及び図３５Ｃに示されている６ビュー配置では、ライトシート１０２及び１０４は図３５Ｂに示されている配向で生成され、対物レンズ１５０及び１５２を使用して画像を記録する（７１０）。ｚ軸に沿った画像の完全なスタックはこの構成で取得される。次に、ライトシート１０２、１０４は図３５Ｃに示されている配向に対して９０度傾斜しており（３６３１）、対物レンズ３５５０及び３５５２を使用して画像を記録する（３６３２）。この目的のために、ｘ軸に沿った画像の完全なスタックが取得される。ｘ軸に沿ってこのような容積イメージングを実行するために、試料１０１及びライトシート１０２、１０４の相対位置はｘ軸に沿って変更される。試料１０１のイメージングを続行しなければならないと判断された場合（７１２）、顕微鏡システム１００は（計算システム１９０及び電子機器コントローラ１８０の制御により）ライトシート１０２、１０４の配向を図３５Ｂに示されているものにリセットし（３６１３）、ライトシート１０２、１０４と検出サブシステムとの相対位置もリセットする（３６１４）。
５通り又は６通りの対物レンズの実現例において９０度の傾斜のライトシートで記録された追加のビューは、９０度の傾斜点広がり関数（顕微鏡検査法において点状の物体の画像がどのように見えるかを判断する関数である）により試料１０１の追加の画像情報を提供する。軸方向範囲、即ち、検出軸に沿った範囲が横方向範囲、即ち、検出軸に垂直な範囲より長いので、点広がり関数は、通常、異方性である。これは、検出対物レンズ（複数も可）の限られた物理的集光角によるものである。軸方向は、本出願で述べられている４対物レンズ光学構成におけるｚ軸である。従って、他の軸（ｘ軸）への拡張は、試料１０１の物理的適用範囲の増加を提供するだけでなく、典型的に、図２に示されているものなどの４ビュー実現例の標準的ビューと比較して、ｚ軸に沿った空間分解能も改善する。

Claims (33)

  1. 試料をイメージングする方法であって、
    １つ以上の第１のライトシートが第１の画像平面において前記試料の少なくとも一部分と光学的に相互作用するように第１の照射軸と平行なそれぞれの経路に沿って前記１つ以上の第１のライトシートを誘導することと、
    複数の第１のビュー方向のそれぞれにおいて、前記１つ以上の第１のライトシートと前記試料の一部分との前記光学的な相互作用により、前記試料から第１の検出軸に沿って放出された蛍光の画像を記録することと、
    １つ以上の第２のライトシートが第２の画像平面において前記試料の少なくとも一部分と光学的に相互作用するように第２の照射軸と平行なそれぞれの経路に沿って前記１つ以上の第２のライトシートを誘導することと、
    複数の第２のビュー方向のそれぞれにおいて、前記１つ以上の第２のライトシートと前記試料の一部分との前記光学的な相互作用により、前記試料から第２の検出軸に沿って放出された蛍光の画像を記録することと、を含み、
    前記第２の画像平面における前記１つ以上の第２のライトシートと前記試料の前記少なくとも一部分との前記光学的な相互作用が、前記第１の画像平面における前記１つ以上の第１のライトシートと前記試料の前記少なくとも一部分との前記光学的な相互作用と同時に起こり、
    前記第２の照射軸が前記第１の照射軸と平行ではない、
    方法。
  2. ２つの第１の光源ユニットを活動化して２つの第１のライトシートを生成することを更に含み、
    前記１つ以上の第１のライトシートが前記第１の画像平面において前記試料と光学的に相互作用するように前記試料を通って前記第１の照射軸と平行なそれぞれの経路に沿って前記１つ以上の第１のライトシートを誘導することが、互いに平行であるが互いに反対方向を指しているそれぞれの経路に沿って前記生成された２つの第１のライトシートを誘導することを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記生成された２つの第１のライトシートが前記第１の画像平面に沿って前記試料内で空間的かつ時間的にオーバラップする、請求項２に記載の方法。
  4. ２つの第２の光源ユニットを活動化して２つの第２のライトシートを生成することを更に含み、
    前記生成された１つ以上の第２のライトシートが前記第２の画像平面において前記試料と光学的に相互作用するように前記試料を通って前記第２の照射軸と平行なそれぞれの経路に沿って前記１つ以上の第２のライトシートを誘導することが、互いに平行であるが互いに反対方向を指しているそれぞれの経路に沿って前記生成された２つの第２のライトシートを誘導することを含む、請求項３に記載の方法。
  5. 前記生成された２つの第２のライトシートが前記第２の画像平面に沿って前記試料内で空間的かつ時間的にオーバラップする、請求項４に記載の方法。
  6. 前記第１のビュー方向のそれぞれが前記第１の照射軸に垂直であり、前記第２のビュー方向のそれぞれが前記第２の照射軸に垂直である、請求項１に記載の方法。
  7. 前記１つ以上の第１のライトシート及び前記１つ以上の第２のライトシートが同じ波長である、請求項１に記載の方法。
  8. 前記第１の検出軸に沿って放出された前記蛍光を第１の対物レンズで捕捉し、前記捕捉された蛍光を前記第１の対物レンズから第１のサンプル画像平面に共役した平面に配置された第１のアパーチャを通って誘導して、前記第１のビュー方向において前記蛍光の画像を記録する前に、焦点が合っていない蛍光の少なくとも一部分を遮断することと、
    前記第２の検出軸に沿って放出された前記蛍光を第２の対物レンズで捕捉し、前記捕捉された蛍光を前記第２の対物レンズから第２のサンプル画像平面に共役した平面に配置された第２のアパーチャを通って誘導して、前記第２のビュー方向において前記蛍光の画像を記録する前に、焦点が合っていない蛍光の少なくとも一部分を遮断することと、
    を更に含む、請求項７に記載の方法。
  9. 前記第１の検出軸に沿って放出された前記蛍光が前記第１のアパーチャを通過し、かつ記録されるように、前記第１の検出軸に対して垂直な方向に沿って前記第１のアパーチャを並進させることと、
    前記第２の検出軸に沿って放出された前記蛍光が前記第２のアパーチャを通過し、かつ記録されるように、前記第２の検出軸に対して垂直な方向に沿って前記第２のアパーチャを並進させることと、
    を更に含む、請求項８に記載の方法。
  10. 前記第１の照射軸に対して横向きの方向に沿って第１の光源から放出された第１の光ビームをスキャンして前記第１のライトシートを生成することにより、それぞれの第１のライトシートを生成することと、
    前記第２の照射軸に対して横向きの方向に沿って第２の光源から放出された第２の光ビームをスキャンして前記第２のライトシートを生成することにより、それぞれの第２のライトシートを生成することであって、前記第１のライトシートの前記第１の光ビームが前記試料内で前記第２のライトシートの前記第２の光ビームと交差しないようになっていることと、
    を更に含む、請求項１に記載の方法。
  11. 前記１つ以上の第１のライトシートの生成中に、
    前記試料の少なくとも一部分に及ぶ１組の第１の画像平面に沿って前記１つ以上の第１のライトシートが前記試料と光学的に相互作用するように、増分ステップにより、前記試料、前記１つ以上の第１のライトシート、及び前記蛍光が記録される前記第１のビュー方向のうちの１つ以上を、前記第１の照射軸と垂直な第１の線形軸に沿って互いに対して並進させることと、
    それぞれの第１の画像平面について、前記試料によって生成された蛍光を前記第１のビュー方向において記録することと、
    を更に含む、請求項１に記載の方法。
  12. 前記試料、前記１つ以上の第１のライトシート、及び前記蛍光が記録される前記第１のビュー方向のうちの１つ以上を、増分ステップにより前記第１の線形軸に沿って互いに対して並進させることが、
    前記試料の位置を維持することと、
    前記１つ以上の第１のライトシート及び前記蛍光が記録される前記第１のビュー方向を前記第１の線形軸に沿って並進させることと、
    を含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記１つ以上の第２のライトシートの生成中に、
    前記試料の少なくとも一部分に及ぶ１組の第２の画像平面に沿って前記１つ以上の第２のライトシートが前記試料と光学的に相互作用するように、増分ステップにより、前記試料、前記１つ以上の第２のライトシート、及び前記蛍光が記録される前記第２のビュー方向のうちの１つ以上を、前記第２の照射軸と垂直な第２の線形軸に沿って互いに対して並進させることと、
    それぞれの第２の画像平面について、前記試料によって生成された蛍光を前記第２のビュー方向において記録することと、
    を更に含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記試料、前記１つ以上の第２のライトシート、及び前記蛍光が記録される前記第２のビュー方向のうちの１つ以上を、増分ステップにより前記第２の線形軸に沿って互いに対して並進させることが、
    前記試料の位置を維持することと、
    前記１つ以上の第２のライトシート及び前記蛍光が記録される前記第２のビュー方向を前記第２の線形軸に沿って並進させることと、
    を含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記第１及び第２のビュー方向において前記記録された蛍光の前記画像を位置合わせすることにより前記試料の画像を作成することと、マルチビュー・デコンボリューション・アルゴリズムを使用して、前記位置合わせされた画像を結合することを更に含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記第１のビュー方向のそれぞれにおいて記録することが、前記第１の照射軸に垂直な前記第１の検出軸に沿って記録することを含む、請求項１に記載の方法。
  17. 前記第２の照射軸が前記第１の照射軸と垂直である、請求項１に記載の方法。
  18. 試料をイメージングするための顕微鏡システムであって、
    １つ以上の第１の光源ユニットであって、それぞれの第１の光源ユニットが、第１の画像平面において第１のライトシートが前記試料の少なくとも一部分と光学的に相互作用するように第１の照射軸と平行なそれぞれの経路に沿って前記第１のライトシートを誘導する、１つ以上の第１の光源ユニットと、
    複数の第１の検出ユニットであって、それぞれが、前記１つ以上の第１のライトシートと前記試料の一部分との前記光学的な相互作用により、前記試料から第１の検出軸に沿って放出された蛍光の画像を、第１のビュー方向において記録するように構成される、複数の第１の検出ユニットと、
    １つ以上の第２の光源ユニットであって、それぞれの第２の光源ユニットが、第２の画像平面において第２のライトシートが前記試料の少なくとも一部分と光学的に相互作用するように第２の照射軸と平行なそれぞれの経路に沿って前記第２のライトシートを誘導する、１つ以上の第２の光源ユニットと、
    複数の第２の検出ユニットであって、それぞれが、前記１つ以上の第２のライトシートと前記試料の一部分との前記光学的な相互作用により、前記試料から第２の検出軸に沿って放出された蛍光の画像を、第２のビュー方向において記録するように構成される、複数の第２の検出ユニットと、を含み、
    前記第２の画像平面における前記１つ以上の第２のライトシートと前記試料の前記少なくとも一部分との前記光学的な相互作用が、前記第１の画像平面における前記１つ以上の第１のライトシートと前記試料の前記少なくとも一部分との前記光学的な相互作用と同時に起こり、
    前記第２の照射軸が前記第１の照射軸と平行ではない、
    顕微鏡システム。
  19. 前記試料を受け入れるように構成された試料領域を更に含む、請求項１８に記載のシステム。
  20. それぞれの光源ユニットが、それぞれの照射軸に沿って前記試料領域に向かってライトシートを生成し誘導するように配置された１つの光源及び１組の照射光学装置と、１つ以上の照射光学装置に結合された１組のアクチュエータとを含み、
    それぞれの検出ユニットが、前記照射軸のうちの１つ以上に垂直なそれぞれの検出軸に沿って前記試料領域内に受け入れた試料から放出された蛍光の画像を収集し記録するように配置された１つのカメラ及び１組の検出光学装置と、前記カメラ及び前記検出光学装置のうちの１つ以上に結合された１組のアクチュエータとを含む、請求項１９に記載のシステム。
  21. 前記試料領域、前記光源ユニット、及び前記検出ユニットのうちの１つ以上に結合され、前記試料領域内に受け入れた試料を回転させずに、前記試料領域、前記光源ユニット内の前記ライトシート、及び前記検出ユニットのうちの１つ以上を線形軸に沿って互いに対して並進させるように構成された並進システムを更に含む、請求項１９に記載のシステム。
  22. 前記試料領域内に位置するようにその上に前記試料が装着される試料ホルダを更に含む、請求項１９に記載のシステム。
  23. それぞれの第１の光源ユニットと、１つの第２の検出ユニットとによって１つの光学アームが画定され、それぞれの第２の光源ユニットと、１つの第１の検出ユニットとによって１つの光学アームが画定される、請求項１９に記載のシステム。
  24. それぞれの光学アーム内の光学データ分離装置を更に含み、前記光学データ分離装置は、当該光学アーム内の前記光源ユニットおよび前記検出ユニットと、前記試料領域との間の経路上に配置され、当該光学アームの前記光源ユニットと前記検出ユニットとの間で光学データを分離するように構成される、請求項２３に記載のシステム。
  25. 前記光学データ分離装置が、前記光源ユニット及び前記検出ユニットの少なくとも１つの共用コンポーネントと残りのコンポーネントとの間に二色性光学素子を含む、請求項２４に記載のシステム。
  26. 少なくとも１つのコンポーネントがそれぞれの光学アームの前記光源ユニットと前記検出ユニットとの間で共用される、請求項２４に記載のシステム。
  27. 前記少なくとも１つの共用コンポーネントが顕微鏡対物レンズを含む、請求項２６に記載のシステム。
  28. 前記少なくとも１つの共用コンポーネントが前記光学データ分離装置と前記試料領域との間に配置される、請求項２７に記載のシステム。
  29. それぞれの光学アーム内の前記顕微鏡対物レンズが他の光学アーム内の他の顕微鏡対物レンズと同じ焦平面を有する、請求項２８に記載のシステム。
  30. それぞれの検出ユニットが、カメラと、アパーチャとを含む、請求項２７に記載のシステム。
  31. 前記アパーチャが、前記カメラに組み込まれ、かつ、前記顕微鏡対物レンズと前記カメラのセンサとの間にある、請求項３０に記載のシステム。
  32. 前記少なくとも１つの共用コンポーネントがチューブレンズを含む、請求項２７に記載のシステム。
  33. １つの光学アームが少なくとも１つの他の光学アームに対して垂直に配置される、請求項２４に記載のシステム。
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