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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop zur tomografischen Darstellung einer Probe, insbesondere einer lebenden biologischen Probe, wenigstens umfassend eine Probenkammer, ein Beleuchtungssystem mit einer Laserlichtquelle zur sequentiellen Fluoreszenzanregung einzelner Probenschichten mittels wenigstens eines schichtweise verschiebbaren Lichtblatts, und ein Abbildungssystem zur sequentiellen Abbildung der Probenschichten auf einen Bildsensor mittels aus der Probe emittierter Fluoreszenzstrahlung, wobei das Lichtblatt jeweils in die Brennebene wenigstens eines Abbildungsobjektivs des Abbildungssystems einstrahlbar ist. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur tomografischen Darstellung einer Probe.
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STAND DER TECHNIK
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Die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie, auch als Lichtscheiben-Fluoreszenzmikroskopie oder englisch light sheet fluorescence microscopy oder single plane illumination microscopy bezeichnet, ist ein fluoreszenzmikroskopisches Verfahren zur tomografischen Darstellung von biologischen Proben und findet vorwiegend in der Zellbiologie und zur Untersuchung lebender Organismen Verwendung.
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Das Verfahren beruht auf einer schichtweisen, sequentiellen Fluoreszenzanregung der Probe, typischerweise mittels Laserstrahlung, und der Detektion der emittierten Fluoreszenzstrahlung mittels eines Abbildungssystems, dessen Beobachtungsrichtung senkrecht auf die abzubildende Probenschicht gerichtet ist. Die über das Beleuchtungssystem eingestrahlte Anregungsstrahlung hat am Ort der Probe die Gestalt eines Lichtblatts mit einer minimalen Weite der Strahltaille von wenigen Mikrometern und einer lateralen Erstreckung in der Ebene der angeregten Probenschicht, die beispielsweise den gesamten Probenquerschnitt umfasst. Das eingestrahlte Lichtblatt und somit die angeregte Probenschicht befinden sich dabei in der Brennebene eines Abbildungsobjektivs des Abbildungssystems, d.h., die Beleuchtung der Probe erfolgt senkrecht zur optischen Achse des Abbildungsobjektivs. Die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie beruht somit auf der Weitfeld-Mikroskopie und ermöglicht die bildliche Darstellung der Probe auf der Grundlage von optischen Schnitten durch einzelne Probenschichten.
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Zur dreidimensionalen Abbildung wird entweder die Probe in der Probenkammer zweckmäßig verschoben oder rotiert, oder das Lichtblatt wird schichtweise entlang der optischen Achse des Abbildungsobjektivs verschoben, wobei auch eine entsprechende Verschiebung des Abbildungsobjektivs selbst erfolgt, um dessen Brennebene stets in das eingestrahlte Lichtblatt zu positionieren.
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Zur Formung des Lichtblatts sind im Stand der Technik unterschiedliche Ansätze bekannt. Beispielsweise kann ein aufgeweiteter, kollimierter Laserstrahl mit Hilfe einer Zylinderlinse in nur einer Richtung fokussiert werden. Im Wesentlichen äquivalent zu einer solchen Anregung mit einem „statischen“ Lichtblatt ist die schnelle Hin- und Her-Bewegung eines dünnen, rotationssymmetrischen Laserstrahls, beispielsweise eines Gauß-Strahls oder eines Bessel-Strahls, in der Brennebene des Abbildungsobjektivs. Im zeitlichen Mittel über einen Beobachtungszeitraum ergibt sich auch aus einem derartigen gescannten Laserstrahl effektiv die Form eines Lichtblatts, und im Rahmen der vorliegenden Anmeldung sollen sowohl die „statische“ als auch diese „dynamische“ Form der Anregungsstrahlung als Lichtblatt bezeichnet werden.
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Im Vergleich zu Verfahren der konfokalen Rastermikroskopie bestehen die Vorteile der Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie insbesondere in einer kürzeren Prozessdauer zur Erstellung der Tomogramme, sowie in einer geringeren Strahlendosis der Anregungsstrahlung, was die Gefahr des Ausbleichens der untersuchten biologischen Probe verringert. Ein weiterer Vorteil der Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie gegenüber der Rastermikroskopie ist ein erheblich größeres Sichtfeld, wodurch die simultane Darstellung intakter Gewebe oder ganzer Organismen erreicht werden kann.
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Nachteilig hingegen ist die geringere laterale und axiale Ortsauflösung der Abbildung. Neben Drifteffekten in Aufbauten mit verschiebbaren oder rotierbaren Proben wird die Ortsauflösung insbesondere durch die detaillierte Form des Lichtblatts in der Probenschicht bestimmt. Der Idealfall eines den gesamten Probenquerschnitt umfassenden, homogenen Lichtblatts lässt sich in der Praxis nicht realisieren. Einerseits führt die Wechselwirkung des Lichtblatts mit der Probe, insbesondere in Form von Streuung, zu Aufweitungen und Inhomogenitäten, deren Ausmaß mit der von der Anregungsstrahlung durchlaufenden Strecke in der Probe zunimmt. Weiterhin sind auch hinsichtlich der Strahlformung technische Grenzen gesetzt, weshalb ein eingestrahltes Lichtblatt keine idealplanare Gestalt aufweist, sondern ausgehend von einer zentralen Profiltaille randseitig aufgeweitet ist. Zur Verbesserung der Ortsauflösung von Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopen sind im Stand der Technik unterschiedliche Ansätze bekannt.
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Beispielsweise offenbart die
US 9,404,869 B2 ein Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop mit zwei Beleuchtungssystemen, welche auf einander gegenüberliegenden Seiten der Probenkammer angeordnet sind, sodass Lichtblätter aus gegenüberliegenden Seiten in die Probe eingestrahlt werden können. Die einzelnen Lichtblätter können somit lateral kleiner dimensioniert werden und dadurch auch eine geringere Taillenweite aufweisen als bei der konventionellen Anregung der gesamten Probenschicht bzw. des gesamten Sichtfelds des Abbildungssystems mittels eines einzigen Lichtblatts. In der technischen Lehre der
US 9,404,869 B2 weist jedes Beleuchtungssystem eine eigene Laserlichtquelle und separate optische Elemente zur Strahlformung auf, woraus ein nachteilig hoher Synchronisationsaufwand resultiert.
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Weiterhin offenbart die
US 10,222,600 B2 ein Verfahren der Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie, bei welchem das Lichtblatt in der Probenschicht räumlich moduliert wird. Diese räumliche Modulation besteht in einer lateralen Verkleinerung der Lichtblätter auf Teilbereiche des Sichtfelds des Abbildungssystems und einer schnellen lateralen Verschiebung dieser Lichtblätter zur sukzessiven Überdeckung des gesamten Sichtfelds. Aufgrund der lateralen Verkleinerung der Lichtblätter können diese eine überaus geringe Taillenweite aufweisen. Dadurch können besonders dünne Probenschichten angeregt werden und aufgrund des geringen Wechselwirkungsvolumens derart modulierter Lichtblätter mit der Probe kommt es zu einer geringeren Aufweitung durch Streuung.
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Die
US 2011/0122488 A1 offenbart eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Durchführung von Multiphotonen-Lichtblattmikroskopie (MP-LISH), welche Multiphotonen-angeregte Fluoreszenz mit der orthogonalen Beleuchtung der Lichtblattmikroskopie kombiniert. MP-LISH bietet eine hohe räumliche und zeitliche Auflösung bei vergleichsweise geringer Phototoxizität zur 4D-Bildgebung von lebenden biologischen Systemen.
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In Reynaud et al., „Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists“, Nature methods, Vol. 12 No.1, 2015, S. 30 - 34, ist ein Überblick über diverse technologische Entwicklungen im Umfeld der Darstellung biologischer Proben mittels Lichtblattmikroskopie gegeben.
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Die
US 2016/0363752 A1 offenbart ein Lichtblattmikroskop umfassend ein optisches Beobachtungssystem und ein optisches Beleuchtungssystem, das so konfiguriert ist, dass es eine Probe aus einer Richtung senkrecht zu einer optischen Beobachtungsachse des optischen Beobachtungssystems beleuchtet. Das optische Beleuchtungssystem umfasst ein erstes optisches System, das so konfiguriert ist, dass es einen Lichtstrom emittiert, der eine vorgeschriebene Querschnittsform hat und der keine Lichtintensitätsverteilung innerhalb eines vorgeschriebenen Bereichs um den Schwerpunkt der Querschnittsform aufweist. Weiterhin umfasst das optische Beleuchtungssystem ein zweites optisches System mit einer Ablenkeinrichtung, die so konfiguriert ist, dass Licht, welches aus einer Richtung parallel zur optischen Beobachtungsachse eintritt, in Richtung der optischen Beobachtungsachse ablenkt wird. Das zweite optische System ist so konfiguriert, dass es aus dem Lichtstrom eine Vielzahl von Lichtblättern bildet, die parallel zu einer Ebene senkrecht zur optischen Beobachtungsachse verlaufen und die unterschiedliche Ausbreitungsrichtungen haben.
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Die
WO 2018/089839 A1 offenbart die sogenannte Light Sheet Theta Mikroskopie, mittels welcher sich große Proben abbilden lassen, ohne dass die Abbildungstiefe oder die Bildqualität beeinträchtigt wird. Bei der entsprechenden optischen Anordnung ist ein Detektionsobjektiv senkrecht zur Probenoberfläche platziert, während die die Lichtblätter einstrahlenden Beleuchtungsobjektive in einem Winkel (theta) zur optischen Achse des Detektionsobjektivs angeordnet sind, der deutlich kleiner als 90 Grad ist, sodass die Lichtblätter von Seiten des Detektionsobjektivs in die Probe eintreten. Die Schnitte der Lichtblätter mit der Fokusebene des Detektionsobjektivs ergeben ein Linienbeleuchtungs-Detektionsprofil, das von einer Kamera erfasst wird.
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OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
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Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop und ein zugehöriges Verfahren zur tomografischen Darstellung einer Probe vorzuschlagen, welches eine räumlich und zeitlich hochaufgelöste Abbildung ermöglicht.
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Diese Aufgabe wird ausgehend von einem Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop gemäß Anspruch 1 sowie einem Verfahren gemäß Anspruch 7 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
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Die technische Lehre der Erfindung offenbart, dass das Beleuchtungssystems des erfindungsgemäßen Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskops zwei Beleuchtungsarme aufweist, über welche Paare von Lichtblättern von einander gegenüberliegenden Seiten der Probenkammer in die jeweilige Probenschicht einstrahlbar sind, und wobei das Beleuchtungssystem einen Lichtmodulator zur räumlichen Modulation der Lichtblätter in der jeweiligen Probenschicht aufweist, und wobei das Abbildungssystem zwei Abbildungsarme aufweist, in welche aus einander gegenüberliegenden Seiten der Probenkammer austretende Fluoreszenzstrahlung einstrahlbar ist, wobei die Abbildungsarme gegenüber den Beleuchtungsarmen rechtwinklig versetzt angeordnet sind, und wobei jeder Abbildungsarm ein Abbildungsobjektiv aufweist, und wobei erfindungsgemäß die Abbildungsarme mittels eines zweiten prismatischen Spiegels in das Abbildungssystem integriert sind, derart, dass die Fluoreszenzstrahlung nach dem Durchlaufen des jeweiligen Abbildungsarms mittels des zweiten prismatischen Spiegels auf den Bildsensor reflektierbar ist.
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Die Erfindung geht dabei von dem Gedanken aus, eine besonders kleinteilige Segmentierung der jeweils abzubildenden Probenschicht dadurch zu erzeugen, dass von gegenüberliegenden Seiten der Probe Paare räumlich modulierter Lichtblätter mit schnell wechselndem Modulationsmuster zur Überdeckung des gesamten Sichtfelds des Abbildungssystems eingestrahlt werden. Dies ermöglicht eine Strahlformung, welche Lichtblätter mit überaus geringer Taillenweite generiert und somit sowohl die axiale, als auch die laterale Ortsauflösung in der Abbildung der Probe signifikant verbessert. Insbesondere ist es damit möglich, nicht nur optisch geklärte Proben, sondern auch opake, lebende biologische Proben, bei welchen die Anregungsstrahlung einer starken Streuung unterliegt, hochauflösend abzubilden.
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Die Abbildungsobjektive sind dabei so positioniert, dass ihre Brennebenen mit der Einstrahlebene des Lichtblatts jeweils übereinstimmen. In dieser Ausführungsform wird folglich die in beide Halbräume oberhalb und unterhalb der Probe austretende Fluoreszenzstrahlung zur Abbildung der betreffenden Probenschicht verwendet. Daraus resultiert eine höhere Signalintensität und die Beleuchtungszeit je Probenschicht kann dementsprechend kürzer gewählt werden als bei einem konventionellen Aufbau mit nur einem Abbildungsarm. Weiterhin ist erfindungsgemäß ein einziger Bildsensor ausreichend, um die von den beiden gegenüberliegenden Abbildungsobjektiven erzeugten Bilder der Probenschicht aufzuzeichnen. Durch die derartige Integration von Beleuchtungs- und/oder Abbildungsarmen kann das erfindungsgemäße Mikroskop mit einer vergleichsweise geringen Anzahl an Komponenten aufgebaut sein, welche dementsprechend einfach untereinander synchronisierbar sind.
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Vorzugsweise sind die Beleuchtungsarme mittels eines ersten prismatischen Spiegels in das Beleuchtungssystem integriert, derart, dass ein in einem Generationsabschnitt des Beleuchtungssystems erzeugtes Lichtblatt mittels des ersten prismatischen Spiegels in ein Paar vorzugsweise identischer Lichtblätter teilbar und als solches in die Beleuchtungsarme einstrahlbar ist. Damit ist es möglich, ein simultan in die Probe eingestrahltes Paar von räumlich modulierten Lichtblättern zu erzeugen mittels lediglich einer einzigen Laserlichtquelle, eines einzigen Lichtmodulators und eines einzigen Systems zur Formung und Verschiebung des Lichtblatts.
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Vorzugsweise ist der Lichtmodulator als eine phasenmodulierende Flüssigkristallanzeige ausgebildet, insbesondere basierend auf ferroelektrischen Flüssigkristallen. Die matrixartige Ansteuerung einer solchen Flüssigkristallanzeige erlaubt eine räumlich hochaufgelöste Phasenmodulation der reflektierten Laserstrahlung und somit eine räumlich hochaufgelöste Modulation der in die Probe eingestrahlten Lichtblätter bei überaus kurzen Schaltzeiten in der Größenordnung von 41 µs.
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Beispielsweise weisen die Lichtblätter in der Brennebene des Abbildungsobjektivs eine FWHM-Taillenweite von 1 µm bis 5 µm und/oder eine Rayleighlänge von 7 µm bis 170 µm auf. Diese Angaben entsprechen einer Einstrahlung der Lichtblätter in die leere Probenkammer, d.h. ohne eine Wechselwirkung mit einer Probe. Die Taillenweite entspricht der geringsten Weite im Strahlprofil, wobei die FWHM-Breite des zugrundeliegenden Einzelstrahls, insbesondere eines Gauß-Strahls, angegeben ist. Die Rayleighlänge betrifft die laterale Ausdehnung der Lichtblätter in Lichtausbreitungsrichtung und bezeichnet denjenigen Abstand von der Strahltaille, in welchem die Strahlweite auf das 1,4-fache der Taillenweite angestiegen ist.
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Vorzugsweise weist der Generationsabschnitt einen ersten Laserscanner zur Erzeugung eines Lichtblatts aus einem von der Laserlichtquelle emittierten Laserstrahl und/oder einen zweiten Laserscanner zum schichtweisen Verschieben des Lichtblatts auf, wobei die Laserscanner vorzugsweise als Galvanometerspiegel ausgebildet sind. Vorliegend wird ein Lichtblatt somit dynamisch erzeugt, das heißt mittels schnellen lateralen Verschiebens eines rotationssymmetrischen Laserstrahls in der Probenschicht mittels des ersten Laserscanners. Der zweite Laserscanner ermöglicht das sequentielle Verschieben des Lichtblatts in der Probe entlang der optischen Achse des Abbildungssystems.
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Mit weiterem Vorteil weist das erfindungsgemäße Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop ein Steuergerät basierend auf einem Field Programmable Gate Array auf, wobei das Steuergerät insbesondere zur Synchronisation des Lichtmodulators, der Laserscanner, des Bildsensors und der Abbildungsobjektive ausgebildet ist.
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Die Erfindung betrifft des Weiteren ein Verfahren zur tomografischen Darstellung einer Probe, insbesondere einer lebenden biologischen Probe, wobei zur Darstellung jeder Probenschicht wenigstens die folgenden Schritte durchgeführt werden:
- - komplanares Einstrahlen von Paaren räumlich modulierter Lichtblätter in die Probenschicht, wobei die Lichtblätter von zwei einander gegenüberliegenden Seiten eingestrahlt werden, und wobei die Lichtblätter die Probenschicht zur Fluoreszenz anregen, und
- - Abbilden der Probenschicht auf einen Bildsensor mittels der von der Probe emittierten Fluoreszenzstrahlung,
wobei ein erfindungsgemäßes Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop gemäß einer der vorgenannten Ausführungsformen zur Durchführung des Verfahrens verwendet wird.
Zum Abbilden wird dabei vorzugsweise die in beide Halbräume oberhalb und unterhalb der Probenschicht emittierte Fluoreszenzstrahlung verwendet.
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Beispielsweise werden je lateraler Erstreckung von 100 × 100 µm2 der Probenschicht zwei bis zehn Paare räumlich modulierter Lichtblätter eingestrahlt. Jedes Paar räumlich modulierter Lichtblätter wird beispielsweise für eine Beleuchtungsdauer von 1 ms bis 50 ms in die Probenschicht eingestrahlt.
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Beispielsweise kann mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens ein lebendiger Drosophila Embryo mit einem Volumen von ca. 190 × 190 × 500 µm3 in einer Zeit von lediglich 40 s mit einer korrigierten Ortsauflösung von 800 nm lateral und 1,6 µm axial abgebildet werden.
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BEVORZUGTES AUSFÜHRUNGSBEISPIEL DER ERFINDUNG
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Weitere, die Erfindung verbessernde Maßnahmen werden nachstehend gemeinsam mit der Beschreibung eines bevorzugten Ausführungsbeispiels der Erfindung anhand der Figuren näher dargestellt. Es zeigt:
- 1: eine isometrische Ansicht eines Lichtblatts,
- 2: eine Querschnittsansicht einer Probe zur Veranschaulichung des erfindungsgemäßen Verfahrens,
- 3a eine isometrische Ansicht eines erfindungsgemäßen Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskops,
- 3b eine Aufsicht zur 3a, und
- 3c ein Detail der 3b.
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1 zeigt eine isometrische Ansicht eines einzelnen Lichtblatts LB, dessen Ausbreitungsrichtung der x-Richtung entspricht. Übertragen auf die geometrischen Verhältnisse in einem erfindungsgemäßen Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop liegen die mit dem Lichtblatt LB anzuregenden Probenschichten parallel zur x-y-Ebene, und die Verschiebung des Lichtblatts LB zur sequentiellen Anregung von einzelnen Probenschichten erfolgt entlang der z-Richtung.
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Dabei entspricht das Profil des Lichtblatts LB in der x-z-Ebene dem Profil eines rotationssymmetrischen Laserstrahls, insbesondere eines Gauß-Strahls, und das Lichtblatt LB wird effektiv, d.h. im Zeitmittel über einen Abbildungszeitraum, gebildet durch ein schnelles Scannen eines solchen einzelnen Laserstrahls entlang der y-Richtung.
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Die in der 1 dargestellten Begrenzungslinien des Lichtblatts LB entsprechen der Full-Width-at-Half-Maximum (FWHM) Weite des zugrundeliegenden Laserstrahls. Die schmalste Stelle des Profils in der x-z-Ebene wird als die Strahltaille mit der Taillenweite w_z bezeichnet. Die Taillenweite w_z ist eine wesentliche Kennzahl für das räumliche Auflösungsvermögen des zugehörigen Mikroskops und beträgt in einem erfindungsgemäßen Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop beispielsweise 1 µm bis 5 µm. Die Rayleighlänge r_x bezeichnet denjenigen Abstand in Lichtausbreitungsrichtung, d.h. in x-Richtung, von der Strahltaille, in welchem die Weite des Strahlprofils auf den 1 ,4-fachen Wert der Taillenweite w_z angestiegen ist. Technisch ist eine große Rayleighlänge r_x, d.h. eine hohe Homogenität in der lateralen Erstreckung des Lichtblatts LB in der x-y-Ebene, nur auf Kosten einer großen Taillenweite w_z zu realisieren und umgekehrt. In der Praxis ist also stets ein geeigneter Kompromiss zu treffen zwischen der Großflächigkeit der Anregung, d.h. einem schnellen Abbildungsvorgang mit großem Sichtfeld, und der dabei erzielbaren Ortsauflösung. Daran setzt die vorliegende Erfindung an und schlägt vor, die anzuregende Probenschicht derart zu segmentieren, dass von gegenüberliegenden Seiten Paare räumlich kleinteilig modulierter Lichtblätter LB eingestrahlt werden, die jeweils eine geringe Taillenweite w_z und eine vergleichsweise geringe Rayleighlänge r_x aufweisen, die aber aufgrund eines schnellen Wechsels der Modulationsmuster effektiv ein großes Sichtfeld überdecken.
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Dies wird demonstriert anhand der 2, welche eine Querschnittsansicht einer Probe P in der x-z-Ebene zeigt, wobei der Außendurchmesser der Probe P beispielsweise 200 µm beträgt und vom Sichtfeld eines erfindungsgemäßen Mikroskops gänzlich umfasst ist. Weiterhin dargestellt sind drei Paare von Lichtblättern LB, welche jeweils in unterschiedliche Probenschichten eingestrahlt sind. Jedes Lichtblatt LB ist räumlich moduliert, d.h. in seiner lateralen Erstreckung in x-Richtung derart eingeschränkt, dass es nicht den vollständigen Durchmesser der Probe P umfasst, sondern jeweils nur eine Rayleighlänge von ca. 15 µm aufweist. Weiterhin besteht die Modulation darin, dass die Position der Lichtblätter LB in der x-Richtung variiert. Jede Probenschicht wird während eines Beobachtungszeitraums durch räumliche Modulation der Lichtblätter LB vollständig angeregt, so dass ein großes Sichtfeld mit hoher Ortsauflösung abbildbar ist. In Kombination mit einem schnell schaltbaren Lichtmodulator kann dabei zudem auch eine hohe zeitliche Auflösung, beispielsweise bei der Abbildung lebender Proben, erzielt werden.
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In einem erfindungsgemäßen Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop mit zwei Abbildungsarmen wird sowohl die in den oberen Halbraum HR1, als auch in den unteren Halbraum HR2 emittierte Fluoreszenzstrahlung zur Abbildung der jeweiligen Probenschicht genutzt, wobei die optischen Achsen der zugehörigen Abbildungsobjektive kollinear zur z-Richtung verlaufen, und die Brennebenen parallel der x-y-Ebene angeordnet sind. Aufgrund dieser hohen Lichtausbeute sind bereits vergleichsweise kurze Bestrahlungsdauern ausreichend für eine hochwertige Abbildung.
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Die 3a bis 3c zeigen eine isometrische Ansicht bzw. zwei Aufsichten auf ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskops 100, jeweils mit einer schematischen Darstellung des Strahlengangs sowie sämtlicher essenzieller optischer Komponenten. Das Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop 100 weist das Beleuchtungssystem 110 zur Einstrahlung der Lichtblätter LB in die Probe P in der Probenkammer 1 auf, sowie das Abbildungssystem 120 zur sequentiellen Abbildung der angeregten Probenschichten auf den Bildsensor 3 mittels aus der Probe P emittierter Fluoreszenzstrahlung FS.
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Das Beleuchtungssystem 110 umfasst den Generationsabschnitt 113 zur Erzeugung eines räumlich modulierten Lichtblatts LB sowie die beiden Beleuchtungsarme 111, 112, über welche Paare von Lichtblättern LB von einander gegenüberliegenden Seiten in die Probenkammer 1 einstrahlbar sind. Das Abbildungssystem 120 weist die zwei Abbildungsarme 121, 122 auf, in welche aus einander gegenüberliegenden Seiten der Probenkammer 1 austretende Fluoreszenzstrahlung FS einstrahlbar ist und die gegenüber den Beleuchtungsarmen 111, 112 rechtwinklig versetzt angeordnet sind. Die Einstrahlung der Lichtblätter LB in die Probe P erfolgt in x-Richtung und die optischen Achsen der zur Detektion der Fluoreszenzstrahlung FS vorgesehenen Abbildungsobjektive 41, 42 verlaufen in z-Richtung.
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Ausgehend von der Laserlichtquelle 2 wird ein einzelner Laserstrahl LS, beispielsweise mit einer Wellenlänge von 488 nm, über zwei Linsen in Teleskopkonfiguration aufgeweitet auf einen Strahldurchmesser von beispielsweise 12 mm, was dem Durchmesser der Flüssigkristallanzeige 51 des Lichtmodulators 5 entspricht. Vor dem Lichtmodulator 5 ist der polarisierende Strahlteiler 52 angeordnet, der einen Teil der Laserstrahlung LS zur räumlichen Phasenmodulation auf die Flüssigkristallanzeige 51 reflektiert und anschließend mit einem nicht modulierten Strahlanteil überlagert, wobei mittels des λ/2-Plättchens 53 das Teilungsverhältnis am polarisierenden Strahlteiler 52 eingestellt werden kann. In der hinteren Brennebene der Sammellinse 54 ist die Lochblende 55 angeordnet, um störende Beugungsmuster basierend auf der inhärent pixelförmigen Struktur der Lichtmodulation herauszufiltern. Die anschließende Sammellinse 56 dient dem Konjugieren des von dem Lichtmodulator 52 erzeugten Musters.
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Mittels des zweiten Laserscanners 72 wird das schichtweise Verschieben der Lichtblätter LB in der z-Richtung realisiert, und der erste Laserscanner 71 dient der Erzeugung der Lichtblätter LB mittels schnellen Scannens des Laserstrahls LS entlang der y-Richtung. Die Laserscanner 71, 72 sind als Galvanometerspiegel ausgebildet.
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Den Übergang vom Generationsabschnitt 113 in die Beleuchtungsarme 111, 112 markiert der erste prismatische Spiegel 61, welcher ein eingestrahltes Lichtblatt LB in ein Paar identischer Lichtblätter LB auftrennt und diese jeweils in einen Beleuchtungsarm 111, 112 einstrahlt. Über ein anschließendes Spiegel- und Linsensystem werden die Lichtblätter LB über die Beleuchtungsobjektive 91, 92 in die Probenkammer 1 eingestrahlt. Die in der jeweils bestrahlten Probenschicht angeregte Fluoreszenzstrahlung FS wird von den beiden Abbildungsobjektiven 41, 42 aufgenommen, wobei die Abbildungsobjektive 41, 42 mittels schneller piezoelektrischer Aktoren entlang der z-Richtung verschiebbar sind, um ihre Brennebene jeweils in die aktive Probenschicht zu verlagern. Über eine zweckmäßige Anordnung von Spiegeln und Linsen wird die Fluoreszenzstrahlung FS aus den beiden Beleuchtungsarmen 121, 122 auf den zweiten prismatischen Spiegel 62 geworfen und von diesem auf den Bildsensor 3 reflektiert. Dabei ist beispielsweise je eine Hälfte der aktiven Fläche des Bildsensors 3 einem Abbildungsarm 121, 122 zugeordnet. Der Bildsensor 3 ist vorliegend als ein CMOS-Sensor ausgebildet.
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Das Steuergerät 8 ist auf nicht dargestellte Art und Weise mit den diversen optischen Komponenten des Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskops 100 verbunden und fungiert als Hauptuhr für die Synchronisation der aktiven Komponenten, d.h. insbesondere des Lichtmodulators 5, der Laserscanner 71, 72, der Abbildungsobjektive 41, 42 sowie des Bildsensors 3. Das Steuergerät 8 basiert auf einem Field Programmable Gate Array, welches eine besonders schnelle Synchronisation ermöglicht.
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Die Erfindung beschränkt sich in ihrer Ausführung nicht auf die vorstehend angegebenen bevorzugten Ausführungsbeispiele. Vielmehr ist eine Anzahl von Varianten denkbar, welche von der dargestellten Lösung auch bei grundsätzlich anders gearteten Ausführungen Gebrauch macht. Sämtliche aus den Ansprüchen, der Beschreibung oder den Zeichnungen hervorgehenden Merkmale und/oder Vorteile, einschließlich konstruktiver Einzelheiten oder räumlicher Anordnungen oder Verfahrensschritte, können sowohl für sich als auch in den verschiedensten Kombinationen erfindungswesentlich sein.
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Bezugszeichenliste
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- 100
- Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop
- 110
- Beleuchtungssystem
- 111, 112
- Beleuchtungsarm
- 113
- Generationsabschnitt
- 120
- Abbildungssystem
- 121, 122
- Abbildungsarm
- 1
- Probenkammer
- 2
- Laserlichtquelle
- 3
- Bildsensor
- 41, 42
- Abbildungsobjektiv
- 5
- Lichtmodulator
- 51
- Flüssigkristallanzeige
- 52
- polarisierender Strahlteiler
- 53
- λ/2-Plättchen
- 54, 56
- Sammellinse
- 55
- Lochblende
- 61, 62
- prismatischer Spiegel
- 71, 72
- Laserscanner
- 8
- Steuergerät
- 91, 92
- Beleuchtungsobjektiv
- P
- Probe
- LB
- Lichtblatt
- LS
- Laserstrahlung
- FS
- Fluoreszenzstrahlung
- HR1, HR2
- Halbraum
- w_z
- FWHM-Taillenweite
- r_x
- Rayleighlänge
- x, y, z
- Raumrichtung
