CN111258045B - 一种用于观测自由活动斑马鱼的高分辨光片显微成像系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于观测自由活动斑马鱼的高分辨光片显微成像系统,包括按照光路依次设置的光源模块、横向视场扩展模块、扫描模块、照明模块和探测模块,光源模块产生的光经过横向视场扩展模块以获得扩展最终照明区域的有效视场,扫描模块将从横向视场扩展模块接收的线光束扫描成为面光束,照明模块和探测模块采用分束镜、照明单元、第一照明物镜和第二照明物镜使得透射的红外光携带斑马鱼样品的结构信息进入探测模块,探测模块采用红外相机和互补金属氧化物半导体相机分别实现近红外光和荧光探测成像。本发明不会对样本产生影响的,具有高横向和轴向分辨率和高成像速度。
Description
技术领域
本发明光学显微成像技术领域,具体涉及一种用于观测自由活动斑马鱼的高分辨光片显微成像系统。
背景技术
斑马鱼是一种模式生物,与人类基因组同源性高(利于建立疾病模型),因此是生物医学研究中常用的样本。由于其幼体通体透明,适合由光学显微成像系统进行成像研究。常规的对斑马鱼进行活体成像系统,在观察时将斑马鱼固定在琼脂糖凝胶中,防止其活动对成像的影响。主要原因是常规的成像方式下,分辨率和成像视场相互制约,获取高分辨率图像时,成像视场往往较小,需要将样本严格固定在视场范围内。然而这种将样品限制不动的成像方式在神经成像时,会影响其行动决策,无法获取对应的神经信息,不利于对其进行完善的研究。
目前用于自由活动斑马鱼成像的系统少有研究,文章(Kim,D.H.et al.Pan-neuronal calcium imagingwith cellular resolution in freelyswimmingzebrafish.Nat.Methods 14,1107–1114(2017).)采用一个二维电动平移台,在平移台上固定放有斑马鱼的样品池,斑马鱼可在样品池内自由活动,当其出动作时,二维平移台根据捕捉的图像及时抵消其运动,使得斑马鱼始终处于成像视场内,实现对自由活动的斑马鱼进行高速三维神经成像,其成像视场为1001×761μm。文章(Cong,L.etal.Rapid whole brain imagingofneural activity in freely behaving larval zebrafish(Danio rerio).Elife6,1–20(2017).)采用了类似的方法实现自由活动斑马鱼的成像。上述方法均基于运动补偿的方式实现对自由活动样品的成像,使得样本始终位于成像视场中。主要原因是它们的成像视场有限,无法对样本的整个活动区域成像,这种方式的缺点是动物样本会受到平台运动对其产生的作用力,从而影响其神经活动,并非真正意义上的的自由运动,并且当动物运动较快时,运动补偿机制容易产生误差,使得神经信号没有被捕捉到。针对这些问题,文章(Symvoulidis,P.etal.NeuBtracker-Imaging neurobehavioral dynamics in freelybehavingfish.Nat.Methods 14,1079–1082(2017).)使用一个大视场物镜,进行样本活动区域的全面成像,这种方式下成像不会对样本产生干扰。然而为了保证足够大视场,该系统采用的物镜数值孔径为0.04,导致成像分辨率较低,不足以进行高分辨神经成像研究。此外上述几种成像方式的探测光和照明光同轴,这样带来的问题是轴向分辨率普遍较低,且样品受到的光毒性和光漂白作用明显,不利于对样品进行长时间成像。然而对自由活动样本的研究往往需要长时间的观察,因此上述方法都存在一定弊端。
发明内容
本发明的目的在于提供一种不会对样本产生影响的、具有高横向和轴向分辨率、高成像速度的用于观测自由活动斑马鱼的高分辨光片显微成像系统。
为了实现上述目的,本发明采用的技术方案如下:
一种用于观测自由活动斑马鱼的高分辨光片显微成像系统,其特征在于,包括按照光路依次设置的光源模块、横向视场扩展模块、扫描模块、照明模块和探测模块,所述光源模块产生的光经过横向视场扩展模块以获得扩展最终照明区域的有效视场,所述扫描模块将从横向视场扩展模块接收的线光束扫描成为面光束;
所述照明模块包括分束镜、第一照明物镜、第二照明物镜、光束偏折中继系统、样品和照明单元,所述分束镜将所述扫描模块的面光束分为两路,其中一路直接经第一照明物镜聚焦到样品上进行荧光激发;另一路经过光束偏折中继系统后再经过第二照明物镜聚焦到样品上进行荧光激发,所述照明单元发射近红外光照射到样本上;
所述探测模块包括大视场高分辨物镜、第六透镜、变焦透镜、第七透镜、二向色镜、第八透镜、第九透镜、红外相机、微机电系统振镜、第五扫描透镜、第六扫描透镜和互补金属氧化物半导体相机,所述大视场高分辨物镜用于收集携带样本结构信息的近红外光以及激发的荧光,所述大视场高分辨物镜、第六透镜、变焦透镜、第七透镜、二向色镜、微机电系统振镜依次设置,经过二向色镜分光后,长波长的近红外光被反射经过第八透镜和第九透镜进入大靶面红外相机的探测单元成像,透过二向色镜的短波长荧光入射到微机电系统振镜上,后经过第五扫描透镜和第六扫描透镜,最终由互补金属氧化物半导体相机进行荧光探测成像。
优选地,所述光源模块包括依次设置的激光器、准直透镜和第一反射镜。
优选地,所述横向视场扩展模块包括依次设置的空间光调制器、第一透镜、掩膜版、第二透镜和第三透镜,所述空间光调制器用于接收第一反射镜反射的光束。
优选地,所述横向视场扩展模块包括依次设置的第五反射镜、电动液体变焦透镜、第十透镜和第十一透镜,所述第五反射镜用于接收第一反射镜反射的光束。
优选地,所述第二透镜和第三透镜组成第一4f中继系统,所述第十透镜和第十一透镜组成第四4f中继系统。
优选地,所述扫描模块包括依次设置的第一扫描振镜、第一扫描透镜、第二扫描透镜、第二扫描振镜、第三扫描透镜以及第四扫描透镜,所述第一扫描透镜和第二扫描透镜组成第二4f中继系统,所述第三扫描透镜和第四扫描透镜组成第三4f中继系统。
优选地,所述光束偏折中继系统包括依次设置的第二反射镜、第四透镜、第三反射镜、第五透镜和第四反射镜。
优选地,第一扫描振镜的镜面、第二扫描振镜的镜面、第一照明物镜的入瞳面和第二照明物镜的入瞳面四者为共轭面。
优选地,所述分束镜为50:50分束镜,第一照明物镜和第二照明物镜为相同型号的物镜且二者的入瞳面共轭。
优选地,第二扫描振镜的镜面与入射光线的角度为45度,电动变焦透镜的屈光度为0度。
本发明提出了一种用于在细胞级分辨率下观察自由活动斑马鱼的光片显微成像系统。将大视场高分辨率成像与光片照明相结合的显微镜系统,提升了轴向分辨率减小了光毒性和光漂白对样品的影响,并且对斑马鱼成像过程中不会对其产生任何影响。有益效果主要包括:
(1)本发明采用一个大视场物镜,对斑马鱼的整个活动区域成像,探测端分别采用两个相机,其中一个大靶面相机对斑马鱼进行定位,一个SCMOS相机对斑马鱼进行成像,并且在后续光路中利用一个振镜使得斑马鱼的荧光信号始终照在SCMOS相机靶面上,本发明的这种成像方式,不会对斑马鱼产生任何的干扰,在进行神经成像时,尤其是研究行为与神经之间的关系时,不会因物理位移对其神经信号产生影响,而导致结果不准确,此外振镜控制的视场偏转,响应速度上优于位移台的移动,具有更高的准确度;
(2)现有的相关研究中进行成像都是照明光路和探测光路同轴的方法,导致成像时轴向分辨率有限,且样品受到的光毒性和光漂白作用明显,本发明采用照明光和探测光轴垂直的方式,即光片显微成像模式,提升了这种大视场高横向分辨率场景下的轴向分辨率,减小了样品所受光毒性和光漂白作用,适合进行长时间的成像研究。
附图说明
图1是本发明用于观测自由活动斑马鱼的高分辨光片显微成像系统图。
图2是横向视场扩展模块的第二种实施方式的构成图。
图3是斑马鱼在游动过程示意图。
图4是红外相机的探测靶面图。
图5是互补金属氧化物半导体相机的探测靶面图。
图6是第一扫描振镜的时序图。
图7是第二扫描振镜的时序图。
图8是变焦透镜的时序图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
以下结合具体实施例对本发明的实现进行详细的描述。
本发明提出了一种不会对样本产生影响的,具有高横向和轴向分辨率,高成像速度的用于观测自由活动斑马鱼的高分辨光片显微成像系统。采用光片照明的方式进行荧光激发,与照明光轴垂直的方向用一个特殊的大视场高分辨率物镜进行探测成像,以获取同时具有高分辨率和大视场范围的三维荧光图像,且对样本的光漂白和光毒性较小,探测端采用一个高灵敏度面阵相机探测荧光信号,并利用一个额外的大靶面相机对样本位置进行定位,结合一个二维振镜,使自由活动斑马鱼成像在探测相机的靶面。系统主要包括光源模块1,横向视场扩展模块2,扫描模块3,照明模块4,探测模块5。
如图1所示,激光器11发出的光经过准直透镜12准直为平行光,经第一反射镜13将光束反射到空间光调制器21上,调制后的光经第一透镜230聚焦后通过掩膜版22,经过第二透镜231以及第三透镜232组成的第一4f中继系统。此后光束由第一扫描振镜310扫描,经过第一扫描透镜320以及第二扫描透镜321组成的第二4f中继系统后,光束经过第二扫描振镜311扫描,然后经过第三扫描透镜322以及第四扫描透镜323后入射到分束镜41上。分束镜41将光束分为两路,其中一路直接经第一照明物镜440聚焦到样品45上进行荧光激发;另一路依次经过第二反射镜420,第四透镜430,第三反射镜421,第五透镜431,第四反射镜422组成的光束偏折中继系统,然后入射到第二照明物镜441上,经过第二照明物镜441聚焦到样品45上进行荧光激发。同时照明单元46发射近红外光,照射到样本45上,携带样本结构信息的近红外光以及经过双路激发的荧光由大视场高分辨物镜51同时收集,物镜51的像面560经过第六透镜520之后入射到变焦透镜53上,再经过第七透镜521使得像面位于561处,经过二向色镜57的分光,长波长的近红外光被反射经过第八透镜524和第九透镜525组成的中继透镜组进入大靶面红外相机551的探测单元成像。透过二向色镜57的短波长荧光入射到微机电系统(Micro-Electro-Mechanical System,MEMS)振镜54上,后经过第五扫描透镜522以及第六扫描透镜523,最终由高灵敏度的科研级互补金属氧化物半导体相机(Scientificcomplementary metal-oxide-semiconductor,SCMOS)550进行荧光探测成像。
具体地,如图1所示,模块1中激光器11可以采用连续光激光器,进行单光子荧光激发,也可以采用飞秒脉冲激光器,进行多光子荧光激发,激光器的类型对后续成像系统并无影响。通常平行的高斯光经物镜聚焦后焦深有限,远离焦点的光束直径会变大,光功率密度降低,只有焦点附近区域有较好的激发效果,因此传统照明方式下样品处的有效视场较小。
模块2的作用是扩展最终照明区域的有效视场,其方法包括但不限于调制高斯光成为具有光束性质不随传播距离改变的无衍射光,使得物镜聚焦后的光束具有较大焦深;或者加入周期性调焦装置,使得经过物镜后光束聚焦点沿着光轴方向扫描,以此扩展焦点覆盖的区域。如图1所示,采用的是空间光调制器调制产生无衍射光方案,以无衍射光中的贝塞尔光为例。其中空间光调制器21上施加贝塞尔光的相位,高斯光经过反射后经过第一透镜230聚焦,在透镜焦点处形成一个环形光斑,由环形掩膜版22滤除中心零级光斑以及环状光斑周围的杂散光,经过第二透镜231和第三透镜232组成的4f透镜组后进入后续光路,且在照明物镜440和441的聚焦点形成具有大焦深的贝塞尔光。如图2所示,横向视场扩展方案还可由变焦元件扫描变焦实现,该方案中模块2如下:其中光源的光经过第五反射镜24反射后进入电动液体变焦透镜25(或相似可调焦器件如可调声学梯度折射率指数透镜等),后经过第十透镜260和第十一透镜261组成的第四4f中继系统后进入后续光路,由于此模块引入的周期性变焦效果,在照明物镜440和441焦点处的光斑会沿着光轴进行扫描,使得有效照明视场范围得到扩展。
模块3中,第一扫描振镜310的扫描方向垂直于物镜51的光轴,其作用是将线光束扫描成为面光束,以达到光片照明的目的;第二扫描振镜311的扫描方向沿着物镜51的光轴,其作用是对样品进行深度方向扫进行描,并结合探测模块中5的电动变焦透镜53同步变焦,使得不同深度激发的荧光均能聚焦到探测器的靶面上,实现对样品进行三维成像。模块3中第一扫描透镜320和第二扫描透镜321组成第二4f中继系统,第三扫描透镜322和第四扫描透镜323组成第三4f中继系统,模块4中第四透镜430和第五透镜431组成第五4f中继系统,使得第一扫描振镜310的镜面、第二扫描振镜311的镜面、以及第一照明物镜440的入瞳面和第二照明物镜441的入瞳面四者为共轭面。
模块4中,分束镜41为50:50分束镜,第一照明物镜440和第二照明物镜441为相同型号的物镜,且二者的入瞳面共轭,使得光束能量均匀分成两份进入两个照明物镜进行同时照明,可以避免只有单侧光照明不均匀的问题。样品45为一透明的圆形样品池,其直径在5mm,其厚度为0.75mm,活体斑马鱼置于其中且可以自由活动。46为一近红外LED阵列,对透明的样品池及样品45照明,透射的红外光携带斑马鱼样品的结构信息进入探测模块。
模块5中,探测物镜51具有兼顾大视场与高分辨率的特点,在本实施例中以英国Mesolens Ltd公司的产品Mesolens为例,该物镜在保证视场为5mm的同时数值孔径在0.47,因此在探测绿色荧光时理论横向分辨率可达0.7μm。由于在此专利中可以不考虑物镜的尺寸,且不用为无穷远矫正,相似参数的物镜亦可通过自行设计实现。样品45发射的荧光以及携带结构信息的透射红外光经过物镜51成像到像面560,通过第六透镜520后为平行光,经过电动变焦透镜53与第二扫描振镜311的扫描同步变焦后,样品不同深度的信号均通过第七透镜521成像在像面561。二向色镜57为短波通型二向色镜,波长较短的荧光信号透射,经过MEMS振镜54,再经过透镜组522和523后到达SCMOS相机550的靶面上成像。其中MEMS振镜54可以通过一个镜面实现两个方向的扫描,SCMOS相机可以用于高速的探测微弱荧光信号,本实施例中采用的是滨松公司的Orca Flash4.0V3,其靶面大小为13.13mm,像素数为2048*2048;波长较长的红外光信号由二向色镜57反射,经过透镜组524和525到达相机551的靶面上成像,其中相机551相对于SCMOS相机具有靶面大,灵敏度较低的特点,用于对整个视场进行红外结构成像,达到对斑马鱼进行视场中的定位目的,本实施例中采用Vieworks公司的VC-25MC-M/C 30,其靶面大小为35mm,像素数为5120*5120。由于相机550用于最终的荧光成像,需满足奈奎斯特采样定律,物镜51分辨率为0.7μm,相机550的像元在物面的像需要小于或等于分辨率的一半,即0.7/2=0.35μm,因此相机550的视场大小为0.35*2048=716.8μm,其成像的放大倍率等于靶面大小除以视场大小,即13.13mm/716.8μm=18倍。而相机551只作为定位使用,需进行全视场成像,无需满足采样定律,其视场大小等于探测物镜的视场5mm,其成像的放大倍率为35mm/5mm=7倍。由放大倍率的关系可以确定模块5中各透镜的焦距关系,但不唯一,本实施例中:探测物镜自身放大率为4倍,第六透镜520焦距为100mm,第七透镜521焦距为150mm,两者组合放大率为150/100=1.5倍;透镜524焦距为60mm,透镜525焦距为70mm,两者组合放大率为70/60=1.17倍;透镜522焦距为100mm,透镜523焦距为300mm,两者组合放大率为300/100=3倍。因此对于相机550,总成像放大倍率为4*1.5*3=18倍;对于相机551总成像放大倍率为4*1.5*1.17=7倍,满足视场与放大倍率的要求。如图3所示为斑马鱼在游动过程示意图,图4表示相机551的探测靶面,图中深色方块表示探测得到的斑马鱼信号,因此获取斑马鱼相对于整个视场的位置信息,根据位置坐标自动对振镜54施加电压,将斑马鱼的图像偏转到视场中心,相机550的靶面如图5所示,靶面中心即为斑马鱼的中心,尽管斑马鱼游动,相机550始终能对斑马鱼成像。
在二维成像模式下,第二扫描振镜311的镜面与入射光线的角度保持为45度,电动变焦透镜53的屈光度保持为0度,此时只探测样品某一固定深度平面的荧光信号,相机550获取二维图像成像速度为100帧每秒。在三维成像模式下,第二扫描振镜311与电动变焦透镜53同步扫描,扫描速度为5Hz,此时探测一定深度内所有的荧光信号,每个三维体图像由20个面图像构成,三维成像速度为5个三维体每秒。
具体地,系统的控制时序如图6-8所示,图6为第一扫描振镜310时序,每个扫描周期内上升沿为有效扫描时间,下降沿为振镜从扫描边界回到扫描零偏位置的时间;图7为第二扫描振镜311的时序,其一个周期代表样品深度方向从上至下扫描一遍,该振镜的一个周期中可以包含多个第一扫描振镜310的周期,且不用与之保持明确的关系;图8为变焦透镜53的时序图,该器件的时序与第二扫描振镜311完全相同,以保证光片平面扫描到不同深度时探测物镜焦平面始终位于照明平面。变焦透镜53与第二扫描振镜311的配合,使得这两个器件一个周期实现一次三维扫描成像。系统的控制时序并非唯一,可以根据实际需求进行调整,如增加或减少第二扫描振镜311一个周期内的第一扫描振镜310周期数,或增加减少一个第二振镜扫描周期内二维的图像数量,均不会对系统的时序产生本质影响。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (10)
1.一种用于观测自由活动斑马鱼的高分辨光片显微成像系统,其特征在于,包括按照光路依次设置的光源模块(1)、横向视场扩展模块(2)、扫描模块(3)、照明模块(4)和探测模块(5),所述光源模块(1)产生的光经过横向视场扩展模块(2)以获得扩展最终照明区域的有效视场,所述扫描模块(3)将从横向视场扩展模块(2)接收的线光束扫描成为面光束;
所述照明模块(4)包括分束镜(41)、第一照明物镜(440)、第二照明物镜(441)、光束偏折中继系统、样品(45)和照明单元(46),所述分束镜(41)将所述扫描模块(3)的面光束分为两路,其中一路直接经第一照明物镜(440)聚焦到样品(45)上进行荧光激发;另一路经过光束偏折中继系统后再经过第二照明物镜(441)聚焦到样品(45)上进行荧光激发,所述照明单元(46)发射近红外光照射到样本(45)上;
所述探测模块(5)包括大视场高分辨物镜(51)、第六透镜(520)、变焦透镜(53)、第七透镜(521)、二向色镜(57)、第八透镜(524)、第九透镜(525)、红外相机(551)、微机电系统振镜(54)、第五扫描透镜(522)、第六扫描透镜(523)和互补金属氧化物半导体相机(550),所述大视场高分辨物镜(51)用于收集携带样本结构信息的近红外光以及激发的荧光,所述大视场高分辨物镜(51)、第六透镜(520)、变焦透镜(53)、第七透镜(521)、二向色镜(57)、微机电系统振镜(54)依次设置,经过二向色镜(57)分光后,长波长的近红外光被反射经过第八透镜(524)和第九透镜(525)进入大靶面红外相机(551)的探测单元成像,透过二向色镜(57)的短波长荧光入射到微机电系统振镜(54)上,后经过第五扫描透镜(522)和第六扫描透镜(523),最终由互补金属氧化物半导体相机(550)进行荧光探测成像。
2.根据权利要求1所述的高分辨光片显微成像系统,其特征在于,所述光源模块(1)包括依次设置的激光器(11)、准直透镜(12)和第一反射镜(13)。
3.根据权利要求2所述的高分辨光片显微成像系统,其特征在于,所述横向视场扩展模块(2)包括依次设置的空间光调制器(21)、第一透镜(230)、掩膜版(22)、第二透镜(231)和第三透镜(232),所述空间光调制器(21)用于接收第一反射镜(13)反射的光束。
4.根据权利要求2所述的高分辨光片显微成像系统,其特征在于,所述横向视场扩展模块(2)包括依次设置的第五反射镜(24)、电动液体变焦透镜(25)、第十透镜(260)和第十一透镜(261),所述第五反射镜(24)用于接收第一反射镜(13)反射的光束。
5.根据权利要求3所述的高分辨光片显微成像系统,其特征在于,所述第二透镜(231)和第三透镜(232)组成第一4f中继系统。
6.根据权利要求4所述的高分辨光片显微成像系统,其特征在于,所述第十透镜(260)和第十一透镜(261)组成第四4f中继系统。
7.根据权利要求5或6所述的高分辨光片显微成像系统,其特征在于,所述扫描模块(3)包括依次设置的第一扫描振镜(310)、第一扫描透镜(320)、第二扫描透镜(321)、第二扫描振镜(311)、第三扫描透镜(322)以及第四扫描透镜(323),所述第一扫描透镜(320)和第二扫描透镜(321)组成第二4f中继系统,所述第三扫描透镜(322)和第四扫描透镜(323)组成第三4f中继系统。
8.根据权利要求7所述的高分辨光片显微成像系统,其特征在于,所述光束偏折中继系统包括依次设置的第二反射镜(420)、第四透镜(430)、第三反射镜(421)、第五透镜(431)和第四反射镜(422)。
9.根据权利要求8所述的高分辨光片显微成像系统,其特征在于,第一扫描振镜(310)的镜面、第二扫描振镜(311)的镜面、第一照明物镜(440)的入瞳面和第二照明物镜(441)的入瞳面四者为共轭面。
10.根据权利要求9所述的高分辨光片显微成像系统,其特征在于,所述分束镜(41)为50:50分束镜,第一照明物镜(440)和第二照明物镜(441)为相同型号的物镜且二者的入瞳面共轭。
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