CN111880299B - 一种基于位相共轭反射镜的大视场数字扫描光片照明系统 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种基于位相共轭反射镜的大视场数字扫描光片照明系统，包括光源模块、空间光调制模块、扫描模块、照明模块和位相共轭模块，照明模块和位相共轭模块同轴设置，照明模块包括依次设置的照明物镜和样品池，位相共轭模块包括依次设置的激光放大器、光学位相共轭反射镜和第一反射镜，光源模块发出的光反射到空间光调制模块后经过扫描模块入射到照明模块的照明物镜的入瞳面上聚焦后在样品池内形成薄片光，激发荧光信号，透射的光经过激光放大器，增益的透射光经过光学位相共轭反射镜产生沿入射光的位相共轭的反射光波，反射的位相共轭的反射光波经过激光放大器再次增益放大，返回样品池，聚焦形成与入射光片重叠的薄状激发光片。

Description

一种基于位相共轭反射镜的大视场数字扫描光片照明系统

技术领域

本发明属于光学显微成像技术领域，具体涉及一种基于位相共轭反射镜的大视场数字扫描光片照明系统。

背景技术

传统的光片显微镜照明光路和成像探测光路相互垂直，照明光通过柱面镜或振镜扫描在照明物镜后焦面附近形成一薄片状光。只有薄片内激发荧光信息，相对落射荧光显微镜分辨率和对比度显著提高。传统的光片显微镜，由于分辨率与视场的矛盾，成像速度和光毒性矛盾等难题限制光片显微镜的发展。现有的光片显微镜采用的照明方案多为高斯光束照明或无衍射光束照明。对于高斯光束光片照明方案，高斯光束的瑞利长度和光束光斑大小相互制约，在保持高分辨率下，其视场大小受限严重。

为了解决视场大小和轴向分辨率的问题，无衍射光束被应用于光片照明。文章【Vettenburg,Tom.et al.Light-sheet microscopy using an Airy beam.Naturemethods.11.(2014)】采用无衍射的艾里光束照明，虽然能保持较高分辨率拓展视场，但由于其光束弯曲特性，造成图像扭曲畸变，需要后续的图像处理，不能实时成像。

而对于无衍射光束贝塞尔光照明，由于贝塞尔光主瓣能在较长传播范围内保持不变，相对高斯光束照明，可以一定程度拓展视场大小。但是想要保持较小的主瓣尺寸，拓展视场，贝塞尔光束的旁瓣数量显著增加，而主瓣能量急剧下降，这导致扫描成的光片轴向层析能力下降。

虽然有些文章提出采用相干光晶格光片照明方案【Betzig,Eric.Et al.LatticeLight Sheet Microscopy:Imaging Molecules to Embryos at High SpatiotemporalResolution.Science.346.(2014)】解决了贝塞尔光的旁瓣干扰，提高光片的层析能力，但是光片的能量密度很低，其有效视场限制在100um内，仍不能解决高分辨率下视场的拓展问题。

有文章【Jia,H.et al.Axial resolution enhancement of light-sheetmicroscopy bydouble scanning of Bessel beam and its complementarybeam.J.Biophotonics 12,1–10(2019).】利用空间光调制器，调制产生一束贝塞尔光和另外一束旁瓣相同，主瓣互补的光束，利用照明产生的图像相减得到没有旁瓣影响的图像。这种方式需要后续图像处理，不能实时成像。

发明内容

本发明的目的在于提供一种无须图像拼接处理，能够实时成像的，具有高横向和轴向分辨率的基于位相共轭反射镜的大视场数字扫描光片照明系统。

实现本发明上述目的的技术方案为：

一种基于位相共轭反射镜的大视场数字扫描光片照明系统，包括光源模块、空间光调制模块、扫描模块、照明模块和位相共轭模块，所述照明模块和位相共轭模块同轴设置，所述照明模块包括依次设置的照明物镜和样品池，所述位相共轭模块包括依次设置的激光放大器、光学位相共轭反射镜和第一反射镜，所述光源模块发出的光反射到空间光调制模块后经过扫描模块入射到照明模块的照明物镜的入瞳面上聚焦后在样品池内形成薄片光，激发荧光信号，透射的光经过激光放大器，增益的透射光经过光学位相共轭反射镜产生沿入射光的位相共轭的反射光波，反射的位相共轭的反射光波经过激光放大器再次增益放大，返回样品池，聚焦形成与入射光片重叠的薄状激发光片。

进一步地，所述光源模块包括依次设置的激光器、第一透镜、第二透镜和第二反射镜，所述第一透镜和第二透镜共焦设置。

进一步地，所述空间光调制模块包括依次设置的空间光调制器、第三透镜、掩膜版、第四透镜、第五透镜，所述空间光调制器接收第二反射镜反射来的光。

进一步地，所述第四透镜和第五透镜组成第一4f系统。

进一步地，所述扫描模块包括依次设置的第一扫描振镜、第六透镜、第七透镜、第二扫描振镜、第八透镜、第九透镜，所述扫描振镜接收透过第五透镜的光。

进一步地，所述第六透镜和第七透镜组成第二4f系统。

进一步地，所述第八透镜和第九透镜组成第三4f系统。

进一步地，所述第一扫描振镜沿水平方向扫描，所述第二扫描振镜沿垂直方向扫描。

进一步地，所述激光放大器包括激光增益介质和泵浦源，所述泵浦源泵浦增益介质，使得低能态的粒子数跃迁到高能态。

进一步地，所述第一反射镜为球面反射镜。

本发明提出了一种位相共轭技术与光片照明相结合的大视场光片照明技术，提高了光片的能量密度，有效提高光片激发荧光的效率，通过多光子激发模式，减少焦平面外荧光激发，提高成像对比度，在保持高轴向分辨率的情况下，大大提高了视场大小。与现有技术相比，技术效果主要包括以下几点：

(1)传统的光片显微镜高分辨的同时视场受限，本发明采用位相共轭技术与无衍射光束、光学晶格光片照明技术相结合的方案能够保持较细的光斑和很长的衍射不变距离而显著提高光束的能量密度；

(2)本发明采用多光子激发模式，能够有效减少能量密度低区域(如贝塞尔光的旁瓣)的影响，只留下能量密度高的主瓣的光束激发荧光信号，提高轴向分辨率的同时能够显著提高有效视场大小；

(3)现有的大视场成像，需要采取图像拼接或沿光轴移动光片，成像速度往往较慢，不利于实时成像，而本发明不需要额外的图像拼接处理或轴向扫描装置，能够有效提高系统的成像速度；

(4)传统的光片显微镜照明，透射光直接被透射浪费掉，本发明通过利用透射光产生位相共轭光波，并进行增益放大，提高了能量利用率，能够有效提高样品的荧光激发效率，提高了多光子激发的微弱荧光探测效率。

参照下面的附图，将对本发明作进一步详细的说明。

附图说明

图1为本发明基于位相共轭反射镜的大视场数字扫描光片照明系统的系统组成图。

图2为加载在空间光调制器上的位相图。

图3为掩膜版处的光强图。

图4为物镜焦面处贝塞尔光的横截面光强分布图。

图5为物镜焦面处贝塞尔光的横轴向光强分布图。

图6为共轭位相光波产生示意图。

具体实施方式

下面通过举实例并结合所列附图具体阐述本发明的技术内容，如下：

如图1所示，一种基于位相共轭反射镜的大视场数字扫描光片照明系统，在传统光片显微镜照明光路的另一端加入激光增益介质、自泵浦位相共轭镜，与照明光路同轴，将透射过样品池的激发光信号，形成激发光的带有增益的位相共轭光波。带有增益的位相共轭光波，与入射激发光互为时间反演，以入射光相同的波形再次返回样品池，与入射光形成重叠的光片，激发样品荧光信息。这种带有位相共轭反射镜的光片照明技术相比于传统光片照明技术，可以提高光片的能量密度，提高成像质量。本发明具体包括光源模块、空间光调制模块、扫描模块、照明模块和位相共轭模块。

光源模块的激光器11发出的光经过第一透镜12、第二透镜13准直扩束成平行光(第一透镜12、第二透镜13共焦)，经第二反射镜14，反射到空间光调制模块的空间光调制器21上，调制后的光经过第三透镜22，聚焦通过掩膜版23，经过第四透镜24、第五透镜25组成的4f中续系统。此后光束由扫描模块的第一扫描振镜31扫描，经过第六透镜32、第七透镜33组成的4f系统后，光束经过第二扫描振镜34，扫描光束经第八透镜35、第九透镜36组成的4f中续系统入射到照明模块的物镜41入瞳上，经物镜41聚焦，在样品池42内形成薄片光，激发荧光信号，透射的光经过位相共轭模块的激光放大器51，增益的透射光经过光学位相共轭反射镜52(光学位相共轭主要是由光波与介质非线性作用产生的，在数学上位相共轭光波与原光波在空间上互为复共轭的关系，两者为时间反演的关系)，产生沿入射光的位相共轭的反射光波，反射的位相共轭光波经过激光放大器51再次增益放大，返回样品池42，聚焦形成与入射光片重叠的薄状激发光片，53为球面反射镜，其作用是反射光学位相共轭反射镜52的晶体特定散射角的光。

具体地，如图1所示，光源模块中激光器11采用飞秒脉冲激光器，进行多光子荧光激发。输出光束为平行的高斯光束，但高斯光束的瑞利长度和光斑大小的平方成正比，若采用高斯光片照明，要保持很细的腰斑情况下，有效的视场很小。因此光束需要经过后续的调制进行远场调控。

空间光调制模块的作用是调制照明区域的光片，其方法包括但不限于调制高斯光束成为具有光束形状不随传播距离改变的无衍射光，以获得较长的视场范围，以及平铺型的光学晶格等。图1采用的是用空间光调制器21调制产生无衍射的贝塞尔光片方案。空间光调制器21上加载贝塞尔光的位相图，入射到空间光调制器上21的高斯光束经过调制后，经过第三透镜22聚焦，在焦面处形成明亮的圆环，再用环形掩膜版23滤除一级以外的衍射级次，经过第四透镜24、第五透镜25组成的4f系统进入后续的扫描模块，并在照明物镜41的焦点处形成具有一定焦深的贝塞尔光。图2-5分别为加载在空间光调制器21上的位相图，掩膜版23处的光强图，以及最终物镜41焦面处贝塞尔光的横截面、轴向光强分布图。

扫描模块中，第一扫描振镜31水平方向扫描(垂直探测方向)，将线状光束扫描成片状光，扫描光束经第六透镜32、第七透镜33组成的4f透镜系统入射到第二扫描振镜34上，第二扫描振镜34沿垂直方向(探测方向)扫描，经第八透镜35、第九透镜36组成的4f系统入射到物镜41的入瞳面上。

照明模块中，扫描光束经物镜41聚焦，在焦面处形成薄光片，只有薄片内荧光被激发，沿探测轴扫描光片，实现体积照明样品。样品池42为透光率高的材料做成的立方体腔，样品池内设置有内槽，利用琼脂凝胶将生物样品固定在内槽处，然后将水充满样品池。利用琼脂凝胶固定样品，是因为琼脂凝胶的折射率和水的折射率接近，减少像差的作用。样品池放置在三维位移台上，通过调节三维位移台使得生物样品处在物镜41的光焦点处。

位相共轭模块中，透射光经过激光放大器51，实现透射光放大增益。激光放大器由激光增益介质，泵浦源(激励源)构成，泵浦源泵浦增益介质，使得低能态的粒子数跃迁到高能态。入射激光诱导产生受激辐射，实现激光放大。对于不同入射波长的激光，可选择相应匹配的激光放大器。如，对于514.5nm、488nm波长的入射激光，激光增益介质可以是氩离子气体，氩离子激光放大器的核心部件就是充满氩气的管子，是由氧化铍陶瓷做成的；两端加有电极装置，其中两个空心电极之间产生很强的气体放电，从而产生很高密度的氩离子等离子体，实现粒子数反转(低能态粒子跃迁到高能态)。光学位相共轭反射镜52通过非线性耦合，产生与入射光位相共轭的反射光波。光学位相共轭反射镜52产生位相共轭光波的方法可以是利用光参量互作用的方法如三波混频、四波混频，或是受激作用方法如受激布里渊散射、受激拉曼散射。以514.5nm入射激光为例，产生位相共轭光波的晶体可以选为钾钠妮酸鳃钡晶体(KNSBN：Ce)【姜全忠等.钾钠铌酸锶钡系列晶体自泵浦位相共轭镜的研究[J].高技术通讯,1994(06):12-14】。如图6所示，入射光I1入射晶体，在晶体内产生特定方向的散射光I3，散射光I3经球形反射镜53，反射光I4进入晶体，通过四波混频作用产生I1的共轭光波I2,其中I1,I2,I3,I4光满足波矢匹配即:K1+K2+K3+K4＝0,K1,K2,K3,K4分别为I1,I2,I3,I4的波矢。光学位相共轭反射镜52为能够实现自泵浦位相共轭反射镜，其具体的实现方法原理包括但不限于上述的方法。反射光I2与入射光I1互为时间反演，以入射光I1的波形返回样品池42内，在物镜41焦面附近聚焦形成薄光片，与入射光片重叠，有效提高光片的能量密度。由于反射光波能实时跟踪入射光波，此模块中不需要添加额外的扫描装置。53为反射镜，此处选为球面反射镜，作用是反射晶体某一特定散射角的光，放置的位置应使其球心位于晶体出射光I3在晶体端面的出射处。

本发明不需要额外的图像拼接处理或轴向扫描装置，能够有效提高系统的成像速度(由于分辨率和视场存在着相互限制的矛盾，很难在大视场的同时保持高分辨率。现在的光片显微镜常用解决方案是将一个较薄的(越薄意味着轴向分辨率越高)而长度较短的光片轴向移动或采取多幅图拼接实现较高分辨的情况下拓展视场；光片的形成是由于模块3中振镜31、34摆动将物镜41聚焦的线状光扫描形成片状的光，线状光位置变化，本发明利用光学位相共轭技术，由于共轭光波与入射光波互为时间反演的关系，反射光可实时跟踪样品池42内聚焦线光的位置，所以不需要额外的扫描和跟踪装置。利用空间光调制器调制主瓣很小无衍射距离大的贝塞尔光，会产生有很多旁瓣，这些旁瓣携带大量的能量，导致主瓣能量降低，而光片的形成主要是通过扫描主瓣形成的(无贝塞尔光主瓣是一条很细的线状光)，利用本发明的激光放大器51补偿贝塞尔光的能量密度，而旁瓣的影响可以通过双光子模式激发消除，从而实现大视场，高分辨率，高能量密度的光片照明。成像速度取决于振镜扫描速度和相机的成像速度，较添加额外的轴向移动光片的装置和后续图像处理实现大视场成像速度快。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种基于位相共轭反射镜的大视场数字扫描光片照明系统，其特征在于，包括光源模块、空间光调制模块、扫描模块、照明模块和位相共轭模块，所述照明模块和位相共轭模块同轴设置，所述照明模块包括依次设置的照明物镜(41)和样品池(42)，所述位相共轭模块包括依次设置的激光放大器(51)、光学位相共轭反射镜(52)和第一反射镜(53)，所述光源模块发出的光反射到空间光调制模块后经过扫描模块入射到照明模块的照明物镜(41)的入瞳面上聚焦后在样品池(42)内形成薄片光，激发荧光信号，透射的光经过激光放大器(51)，增益的透射光经过光学位相共轭反射镜(52)产生沿入射光的位相共轭的反射光波，反射的位相共轭的反射光波经过激光放大器(51)再次增益放大，返回样品池(42)，聚焦形成与入射光片重叠的薄状激发光片；

所述光源模块包括依次设置的激光器(11)、第一透镜(12)、第二透镜(13)和第二反射镜(14)，所述第一透镜(12)和第二透镜(13)共焦设置；

所述空间光调制模块包括依次设置的空间光调制器(21)、第三透镜(22)、掩膜版(23)、第四透镜(24)、第五透镜(25)，所述空间光调制器(21)接收第二反射镜(14)反射来的光。

2.根据权利要求1所述的基于位相共轭反射镜的大视场数字扫描光片照明系统，其特征在于，所述第四透镜(24)和第五透镜(25)组成第一4f系统。

3.根据权利要求1或2所述的基于位相共轭反射镜的大视场数字扫描光片照明系统，其特征在于，所述扫描模块包括依次设置的第一扫描振镜(31)、第六透镜(32)、第七透镜(33)、第二扫描振镜(34)、第八透镜(35)、第九透镜(36)，所述扫描振镜(31)接收透过第五透镜(25)的光。

4.根据权利要求3所述的基于位相共轭反射镜的大视场数字扫描光片照明系统，其特征在于，所述第六透镜(32)和第七透镜(33)组成第二4f系统。

5.根据权利要求4所述的基于位相共轭反射镜的大视场数字扫描光片照明系统，其特征在于，所述第八透镜(35)和第九透镜(36)组成第三4f系统。

6.根据权利要求4所述的基于位相共轭反射镜的大视场数字扫描光片照明系统，其特征在于，所述第一扫描振镜(31)沿水平方向扫描，所述第二扫描振镜(34)沿垂直方向扫描。

7.根据权利要求1所述的基于位相共轭反射镜的大视场数字扫描光片照明系统，其特征在于，所述激光放大器(51)包括激光增益介质和泵浦源，所述泵浦源泵浦增益介质，使得低能态的粒子数跃迁到高能态。

8.根据权利要求1所述的基于位相共轭反射镜的大视场数字扫描光片照明系统，其特征在于，所述第一反射镜(53)为球面反射镜。

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