JP5967528B2 - 生物材料を透明化する方法および生物材料用透明化処理キット - Google Patents
生物材料を透明化する方法および生物材料用透明化処理キット Download PDFInfo
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Description
本発明は、生物材料を透明化する方法および生物材料用透明化処理キット等に関する。
生命科学の分野において、蛍光タンパク質を用いた蛍光イメージングは非常に有効な手法である。例えば、蛍光タンパク質を適当なプロモーターを用いて発現させたトランスジェニック動物を用いることによって、様々な組織の形態およびタンパク質の局在などを容易に観察することができる。しかし、通常、組織はかなりの厚みがあり、深部の蛍光の局在を知るためには、従来、物理的な切片を作製する必要があった。
近年、深部蛍光イメージングのための共焦点顕微鏡および多光子励起顕微鏡が普及してきている。例えば、多光子励起顕微鏡を用いることによって３００〜７００μｍ程度の深部イメージングが可能になっているが、それ以上の深度を観察することは困難である。
より深部の観察を可能とするために、現在までに、いくつかの組織透明化法が開発されてきた。例えば、ＢＡＢＢ（ベンジルアルコール：安息香酸ベンジル＝１：２混合物）、サリチル酸メチル、ジベンジルエーテルなどの芳香族の有機溶媒を用いる方法が知られている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。
また、２００９年にKleinfeldらのグループは、脳組織を７５％（ｗ／ｖ）スクロース水溶液に浸けることにより、多光子顕微鏡で最大１．５ｍｍの深度まで観察できることを示している（非特許文献５）。また、FocusClearTM（商品名）という組織透明化試薬も市販されている（特許文献１）。
さらに、最近、尿素とグリセリンとを含む水溶液を用いた透明化試薬が開発された（非特許文献６）。この透明化試薬は、多光子顕微鏡と組み合わせることで、脳組織で最大４ｍｍの深度までイメージング可能である。
Methods Cell Biol. 1991;36:419-41. Nature Methods - 4, 331 - 336 (2007) doi:10.1038/nmeth1036. Microsc Microanal. 2005 Jun;11(3):216-23. PLoS ONE 7(3): e33916. (2012) doi:10.1371/journal.pone.0033916 J. Neurosci, 18 November 2009, 29(46): 14553-14570; doi: 10.152. Nat Neurosci. 2011 Aug 30;14(11):1481-8. doi: 10.1038/nn.2928.
しかしながら、上述の有機溶媒を用いる方法は、予め脱水処理を行う必要があるが、蛍光タンパク質が蛍光を発するためには水分子が必要であるため、脱水処理によって蛍光タンパク質の蛍光強度が非常に低下する。
FocusClearTMは、透明度が十分ではない。また、サンプルが収縮する。
スクロース水溶液は、浸透圧の影響でサンプルが収縮する。また、透明度も十分ではない。
尿素とグリセリンとを含む水溶液を用いた透明化試薬は、変性剤を用いているので微細な構造およびタンパク質の抗原性が失われる虞がある。また、サンプルが膨潤する。
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、タンパク質を変性させずに生物材料を透明化する方法およびそのための生物材料用透明化処理キット等を提供することにある。
上記の課題を解決するために、本願発明者らは鋭意検討を行った。その結果、フルクトース溶液を用いることによって、生物材料を透明化することができること、またその際に蛍光タンパク質の蛍光強度が保たれていること、および生物材料の形態が良く保たれていることを見出し、本願発明に想到するに至った。
すなわち、本発明に係る生物材料を透明化する方法は、フルクトースを含む溶液を生物材料中に浸潤させて、当該生物材料を透明化する工程、を含むことを特徴としている。
本発明に係る生物材料を透明化する方法において、上記溶液は、上記フルクトースを５０％（ｗ／ｖ）以上で２００％（ｗ／ｖ）以下の範囲内の濃度で含むことが好ましい。
本発明に係る生物材料を透明化する方法において、上記溶液は、上記フルクトースを飽和濃度で含むことがより好ましい。
本発明に係る生物材料を透明化する方法において、上記溶液は、水溶液であることが好ましい。
本発明に係る生物材料を透明化する方法において、上記工程の前に、上記溶液より低い濃度でフルクトースを含む１以上の溶液を、濃度の低い順に、上記生物材料中に浸潤させる工程をさらに含むことが好ましい。
本発明に係る生物材料を透明化する方法において、上記溶液の何れもが、水溶液であることがより好ましい。
本発明に係る生物材料を透明化する方法において、上記生物材料は、多細胞動物由来の組織もしくは器官、またはヒトを除く多細胞動物の個体であることが好ましい。
本発明に係る生物材料を透明化する方法において、上記生物材料は、蛍光タンパク質を発現している細胞を含んでいることが好ましい。
本発明に係る透明化試薬は、生物材料用の透明化試薬であって、フルクトースを含む溶液であることを特徴としている。
本発明に係る生物材料用透明化処理キットは、フルクトースを含む溶液を備えることを特徴としている。
本発明は、タンパク質を変性させずに生物材料を透明化し、深部イメージングを可能にすることができるという効果を奏する。
〔生物材料の透明化方法〕
（概要）
本発明に係る生物材料の透明化方法は、生物材料を透明化する方法であって、フルクトースを含む溶液（以下、「透明化試薬Ａ」とする）を生物材料中に浸潤させて、当該生物材料を透明化する工程（以下、「浸潤工程Ａ」とする）を含む方法である。本発明に係る生物材料の透明化方法は、上記工程の前に、上記溶液より低い濃度でフルクトースを含む１以上の溶液（以下、「透明化試薬Ｂ」とする）を、濃度の低い順に、上記生物材料中に浸潤させる工程（以下、「浸潤工程Ｂ」とする）をさらに含むことが好ましい。
（概要）
本発明に係る生物材料の透明化方法は、生物材料を透明化する方法であって、フルクトースを含む溶液（以下、「透明化試薬Ａ」とする）を生物材料中に浸潤させて、当該生物材料を透明化する工程（以下、「浸潤工程Ａ」とする）を含む方法である。本発明に係る生物材料の透明化方法は、上記工程の前に、上記溶液より低い濃度でフルクトースを含む１以上の溶液（以下、「透明化試薬Ｂ」とする）を、濃度の低い順に、上記生物材料中に浸潤させる工程（以下、「浸潤工程Ｂ」とする）をさらに含むことが好ましい。
（フルクトースを含む溶液）
本発明に係る生物材料の透明化方法では、生物材料を透明化する必須の有効成分としてフルクトースを含む溶液を用いる。フルクトースは、Ｄ体、Ｌ体、およびそれらの混合物の何れでもよい。なお、以下の説明において、「透明化試薬Ａ」および「透明化試薬Ｂ」を「透明化試薬」と総称することがある。
本発明に係る生物材料の透明化方法では、生物材料を透明化する必須の有効成分としてフルクトースを含む溶液を用いる。フルクトースは、Ｄ体、Ｌ体、およびそれらの混合物の何れでもよい。なお、以下の説明において、「透明化試薬Ａ」および「透明化試薬Ｂ」を「透明化試薬」と総称することがある。
（有効成分としてフルクトースを用いる利点）
１）フルクトースは、毒性が極めて低い。そのため取り扱いの安全性が高い。２）フルクトースは、極めて安価で入手容易であるため、極めて低コストで透明化処理を行い得るものとなる。３）フルクトースは、非変性剤であるため、微細な構造の破壊、およびタンパク質の変性による抗原性の喪失が生じる虞が少ない。
１）フルクトースは、毒性が極めて低い。そのため取り扱いの安全性が高い。２）フルクトースは、極めて安価で入手容易であるため、極めて低コストで透明化処理を行い得るものとなる。３）フルクトースは、非変性剤であるため、微細な構造の破壊、およびタンパク質の変性による抗原性の喪失が生じる虞が少ない。
また、上記の利点に加えて、次の利点を有する。４）フルクトースを用いた場合、生物材料の収縮が生じないため、従来の透明化試薬を用いた場合と比較して、透明度が高い。そのため、超深部組織に存在する種々の蛍光タンパク質および蛍光物質の観察が可能となる。また、微細な構造の変化も生じにくい。５）フルクトースを用いた場合、生物材料の膨潤が生じないため、生物材料が破壊されにくい。そのため、脆弱な生物材料（例えば、新生児マウスの脳など）に適用することが可能となる。６）ＰＢＳ等の等張液に戻しても強度および細胞形態ともに影響を受けない。また、元に戻した生物材料を切片にして抗体染色を行っても、抗原性が保たれている。このように可逆性が高いため、透明化処理によるイメージングと組織染色とを組み合わせることが可能である。７）迅速な透明化を実現することも可能である。８）フルクトースを用いた場合、生物材料の膨潤が生じないため、顕微鏡の対物レンズの作動距離が限られている場合に、従来の透明化試薬と比べて実質的により深くまで画像取得できる。
（溶媒）
本発明で用いる「透明化試薬」は、フルクトースが可溶な溶媒を含む溶液である。溶媒の種類は、フルクトースが可溶な限り特に限定されないが、水を主溶媒として用いることが好ましく、水のみを溶媒として用いることが特に好ましい。「透明化試薬Ａ」は水溶液であることが好ましく、また、必要に応じて用いる「透明化試薬Ｂ」も水溶液であることが好ましい。「透明化試薬Ａ」および、必要に応じて用いる「透明化試薬Ｂ」の何れもが水溶液であることがより好ましい。なお、本発明において、「水を主溶媒として用いる」とは、使用される全溶媒に占める水の体積の割合が他の溶媒と比較して最も多いことを指し、好ましくは使用される全溶媒の体積の合計の５０％を超え１００％以下の量の水を用いることを指す。
本発明で用いる「透明化試薬」は、フルクトースが可溶な溶媒を含む溶液である。溶媒の種類は、フルクトースが可溶な限り特に限定されないが、水を主溶媒として用いることが好ましく、水のみを溶媒として用いることが特に好ましい。「透明化試薬Ａ」は水溶液であることが好ましく、また、必要に応じて用いる「透明化試薬Ｂ」も水溶液であることが好ましい。「透明化試薬Ａ」および、必要に応じて用いる「透明化試薬Ｂ」の何れもが水溶液であることがより好ましい。なお、本発明において、「水を主溶媒として用いる」とは、使用される全溶媒に占める水の体積の割合が他の溶媒と比較して最も多いことを指し、好ましくは使用される全溶媒の体積の合計の５０％を超え１００％以下の量の水を用いることを指す。
溶媒として水を用いる主な利点は、以下の通りである。１）本発明に用いる上記「透明化試薬」の有効成分であるフルクトースは水への溶解性が特に優れているため、透明化試薬の調製が容易かつ低コストとなる。２）有機溶剤を主溶媒として用いる場合と比較して、透明化処理時に処理対象となる生物材料の脱水を伴わない。そのため、生物材料が収縮するという問題を抑制可能となる。３）有機溶剤を主溶媒として用いる場合と比較して、蛍光タンパク質に損傷を与える可能性が著しく低減される。そのため、透明化処理を受けた生物材料を、蛍光タンパク質を用いて観察可能となる。４）固定化された材料に限定されず、生材料にも適用可能となる。５）後述するように透明化処理が可逆的となり、透明化処理後の生体試料を必要に応じて透明化処理前の状態に戻すことができる。６）有機溶剤を主溶剤として用いる場合と比較して、取り扱いの安全性がより高くなる。
上記フルクトースは、透明化処理の対象となる生物材料に好適なｐＨの維持が可能な緩衝液に溶解させてもよい。フルクトースを添加する緩衝液としては、例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳなどリン酸塩によって緩衝液化された平衡塩類溶液；トリス塩酸塩によって緩衝液化された平衡塩類溶液（ＴＢＳ）；等が挙げられる。緩衝液を低濃度含有することによって浸透圧調節を行い、一般的に浸透圧の影響を受けやすい生物試料（例えば、新生児マウス脳）について、より効果的に膨潤を防ぐことができる（例えば、８０％（ｗ／ｖ）フルクトース・０．１×ＰＢＳ）。また、「透明化試薬」が緩衝作用を有することによって、脆弱な生物材料の破壊および蛍光タンパク質の蛍光減弱をより防ぐことができる。
（浸潤工程Ａ）
浸潤工程Ａは、透明化試薬Ａを、生物材料中に浸潤させる工程である。より具体的には、例えば、透明化処理用の容器内で、生物材料に対して透明化試薬Ａを浸潤させる。
浸潤工程Ａは、透明化試薬Ａを、生物材料中に浸潤させる工程である。より具体的には、例えば、透明化処理用の容器内で、生物材料に対して透明化試薬Ａを浸潤させる。
透明化試薬Ａに含まれるフルクトースの濃度は特に限定されないが、飽和濃度の２０％の濃度以上で１５０％の濃度以下の範囲内であることが好ましく、飽和濃度の５０％の濃度で１２０％の濃度以下の範囲内であることがより好ましく、飽和濃度の８０％の濃度で飽和濃度以下の範囲内であることがさらに好ましく、飽和濃度であることが特に好ましい。なお、単位％（ｗ／ｖ）で示した飽和濃度は温度に依存するが、本明細書において「飽和濃度」は浸潤工程Ａを行う際の温度におけるものである。したがって、当業者は、浸潤工程Ａを行う際の温度から、飽和濃度の透明化試薬Ａまたは飽和濃度の所望の％に相当する透明化試薬Ａを作製することができる。なお、単位（ｗ／ｖ）％とは、「透明化試薬」の体積（ｖ（ミリリットル））に対する、使用する「フルクトース」の重量（ｗ（グラム））の百分率である。
透明化試薬Ａに含まれるフルクトースの濃度は、５０％（ｗ／ｖ）以上で２００％（ｗ／ｖ）以下であることが好ましく、８０％（ｗ／ｖ）以上で１５０％（ｗ／ｖ）以下であることがより好ましく、１００％（ｗ／ｖ）以上で１４０％（ｗ／ｖ）以下であることがさらに好ましい場合がある。２５℃下では、１００％（ｗ／ｖ）以上で１２０％（ｗ／ｖ）以下であることが特に好ましい例示であり、中でも約１１０％（ｗ／ｖ）であることが特に好ましく、３７℃下では、１２０％（ｗ／ｖ）以上で１４０％（ｗ／ｖ）以下であることが特に好ましい例示であり、中でも約１３０％（ｗ／ｖ）であることが特に好ましい。
浸潤工程Ａを行う処理温度は特に限定されないが、飽和濃度の観点およびフルクトースの副反応の抑制の観点から０℃以上で４０℃以下の範囲内であることが好ましい。浸潤工程Ａを行う処理時間は、特に限定されないが、１時間以上で１４日以内の範囲内であることが好ましく、１２時間以上で３日以内の範囲内であることがより好ましい。透明化処理を行う圧力は特に限定されない。
（浸潤工程Ｂ）
必要に応じて行われる浸潤工程Ｂは、浸潤工程Ａの前に、透明化試薬Ａより低い濃度でフルクトースを含む１以上の透明化試薬Ｂを、濃度の低い順に、上記生物材料中に浸潤させる工程である。より具体的には、例えば、透明化処理用の容器内で、上記の生物材料に対して１以上の透明化試薬Ｂを、濃度の低い順に浸潤させる。
必要に応じて行われる浸潤工程Ｂは、浸潤工程Ａの前に、透明化試薬Ａより低い濃度でフルクトースを含む１以上の透明化試薬Ｂを、濃度の低い順に、上記生物材料中に浸潤させる工程である。より具体的には、例えば、透明化処理用の容器内で、上記の生物材料に対して１以上の透明化試薬Ｂを、濃度の低い順に浸潤させる。
透明化試薬Ｂに含まれるフルクトースの濃度は、透明化試薬Ａに含まれるフルクトースの濃度より低ければ特に限定されない。浸潤工程Ｂを浸潤工程Ａの前に行うことによって、フルクトースの濃度の急激な上昇を抑えることができるため、生物材料へのダメージをより抑えることができる。透明化試薬Ｂは、互いに濃度が異なる２つ以上であることが好ましく、互いに濃度が異なる３つ以上であることがより好ましく、互いに濃度が異なる４つ以上であることがさらに好ましい。濃度をより細かく段階的に上げていくことによって、生物材料へのダメージをさらに抑えることができるからである。
透明化試薬Ｂに含まれるフルクトースの濃度は、略均等に濃度を上げていくことが好ましい。一例として、透明化試薬Ａに含まれるフルクトースの濃度が１１０％（ｗ／ｖ）である場合、透明化試薬Ｂとして、フルクトースの濃度が２０％（ｗ／ｖ）、４０％（ｗ／ｖ）、６０％（ｗ／ｖ）、８０％（ｗ／ｖ）および１００％（ｗ／ｖ）の５つの溶液を用いることができる。
浸潤工程Ｂを行う処理温度は特に限定されないが、０℃以上で４０℃以下の範囲内であることが好ましい。浸潤工程Ｂを行う処理時間は、特に限定されないが、１時間以上で１４日以内の範囲内であることが好ましく、３時間以上で３日以内の範囲内であることがより好ましい。また、透明化試薬Ｂが２つ以上ある場合には、各濃度の透明化試薬Ｂにおける処理時間を略均等にすることが好ましいが、これに限定されない。一例として、フルクトースの濃度が２０％（ｗ／ｖ）、４０％（ｗ／ｖ）、６０％（ｗ／ｖ）、８０％（ｗ／ｖ）および１００％（ｗ／ｖ）の透明化試薬Ｂを用いる場合、それぞれの処理時間を８時間とし、合計で４０時間とすることができる。透明化処理を行う圧力は特に限定されない。
上記の浸潤工程Ａおよび浸潤工程Ｂにおいて、透明化処理用の容器内に「透明化試薬」と「生物材料」とを格納する順序は特に限定されない。浸潤工程Ａおよび浸潤工程Ｂを同一の容器内で連続的に行う場合の一例では、まず最も濃度が低い「透明化試薬Ｂ」を容器内に格納し、次いで「生物材料」を格納する。次いで、最も濃度が低い透明化試薬Ｂを廃棄し、２番目に濃度が低い透明化試薬Ｂを容器へ格納する。次いで、２番目に濃度が低い透明化試薬Ｂを廃棄し、３番目に濃度が低い透明化試薬Ｂを容器へ格納する。これを繰り返して、最も高い濃度の透明化試薬Ｂを容器へ格納し、廃棄する。最後に、透明化試薬Ａ（最も高い濃度の透明化試薬Ｂよりも濃度が高い）を容器へ格納し、廃棄する。また、必要に応じて、濃度の異なる透明化試薬に変える間に、容器および生物材料を洗浄処理等する工程を設けてもよい。
上記の各浸潤工程で用いた、透明化処理された生物材料を格納した処理容器は、後述する観察工程に供されるまで、例えば、室温または低温環境下で保存してもよい（透明化試料保存工程）。
（対象となる生物材料）
本発明に係る方法の対象となる生物材料の種類は特に限定されないが、例えば、多細胞生物の個体から取得した器官、組織、または細胞であってもよい。また、生物材料の由来は、植物または動物であることが好ましく、魚類、両生類、爬虫類、鳥類または哺乳類（哺乳動物）等の動物であることがより好ましく、哺乳動物であることが特に好ましい。哺乳動物の種類は特に限定されないが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒトを除く霊長類等の実験動物；イヌ、ネコ等の愛玩動物（ペット）；ウシ、ウマ、ブタ等の家畜；ヒト；が挙げられる。
本発明に係る方法の対象となる生物材料の種類は特に限定されないが、例えば、多細胞生物の個体から取得した器官、組織、または細胞であってもよい。また、生物材料の由来は、植物または動物であることが好ましく、魚類、両生類、爬虫類、鳥類または哺乳類（哺乳動物）等の動物であることがより好ましく、哺乳動物であることが特に好ましい。哺乳動物の種類は特に限定されないが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒトを除く霊長類等の実験動物；イヌ、ネコ等の愛玩動物（ペット）；ウシ、ウマ、ブタ等の家畜；ヒト；が挙げられる。
本発明で用いる「透明化試薬」は優れた透明化処理能力を有するため、生物材料が、多細胞動物由来の組織もしくは器官（例えば、脳全体または脳の一部）、またはヒトを除く多細胞動物の個体（例えば、胚等）そのものであっても、適用することが可能である。
本発明で用いる「透明化試薬」は、生物材料の膨潤および収縮がほとんどなく（実施例も参照）、生物材料の変形を抑制する効果が極めて大きいため、脆弱な生物材料の透明化に特に好適である。ここで脆弱な生物材料としては、例えば、新生児マウスの脳、多細胞動物由来の組織の切片、発生初期段階の動物胚、ゼブラフィッシュなど小型魚類の脳等が挙げられる。
本発明で用いる「透明化試薬」は、非変性剤であるフルクトースを有効成分としているため、微細な構造が破壊される虞が少なく、アーチファクトの可能性が抑えられる。そのため、神経回路等の微細な構造をより正確に観察することができる。したがって、本発明の方法は、特に神経回路を含んでいる組織（脳など）を生物材料とする場合に、有効に利用され得る。
また、上記生物材料は、具体的には例えば、蛍光性化学物質を注入した生体組織、蛍光性化学物質で染色を行った生体組織、蛍光タンパク質を発現した細胞を移植した生体組織、または蛍光タンパク質を発現した遺伝子改変動物の生体組織等であってもよい。蛍光タンパク質としては、例えば、ＹＦＰ、ＧＦＰ、tdTomato等が挙げられる。本発明で用いる「透明化試薬」は、例えば、多光子顕微鏡を用いると脳組織で４ｍｍ程度の深度までイメージング可能である。しかも、脳組織が膨潤しないため、同程度の深度のイメージングが可能な従来の方法（脳組織が膨潤する）と比較して、実質的には深度が深い。そのため、より深部の蛍光の局在をイメージングすることができる。
また、生物材料は、顕微鏡観察用にパラホルムアルデヒド等で固定化（fixed）処理された材料であってもよいし、固定化処理されていない材料であってもよいが、固定化処理された材料であることが好ましい。
生物材料の厚みは特に限定されないが、例えば、０．０５ｍｍ〜３０ｍｍとすることができ、０．２ｍｍ〜１０ｍｍであることが好ましい。本発明で用いる「透明化試薬」は、より深部のイメージングが可能であるため、０．１ｍｍ以上の厚みであっても適用し得る。
（透明化）
本発明に係る生物材料の透明化方法を用いることによって、生物材料は透明化される。ここで、「透明化」とは、本発明に係る生物材料の透明化方法を適用する前の生物材料と比較して透明になることを指し、好ましくは本発明に係る生物材料の透明化方法を適用する前の生物材料と比較して、４００〜１３００μｍの波長の光がより透過できるようになることを指す。
本発明に係る生物材料の透明化方法を用いることによって、生物材料は透明化される。ここで、「透明化」とは、本発明に係る生物材料の透明化方法を適用する前の生物材料と比較して透明になることを指し、好ましくは本発明に係る生物材料の透明化方法を適用する前の生物材料と比較して、４００〜１３００μｍの波長の光がより透過できるようになることを指す。
（透明化された生物材料の観察工程）
透明化された生物材料は、次いで、例えば、光学顕微鏡による観察工程に供される。観察工程に供される生物材料は、必要に応じて、本発明に係る生物材料の透明化方法（「透明化処理工程」）を施す前に、または透明化処理工程後で観察工程前に、染色またはマーキング等の可視化処理工程が施されてもよい。
透明化された生物材料は、次いで、例えば、光学顕微鏡による観察工程に供される。観察工程に供される生物材料は、必要に応じて、本発明に係る生物材料の透明化方法（「透明化処理工程」）を施す前に、または透明化処理工程後で観察工程前に、染色またはマーキング等の可視化処理工程が施されてもよい。
例えば、可視化処理工程に蛍光タンパク質を用いる場合には、透明化処理工程の前に、生きた生物材料に対して蛍光タンパク質遺伝子を導入して、蛍光タンパク質を発現させる。
また、可視化処理工程として、蛍光性化学物質（蛍光タンパク質は除く）の生物材料への注入、または蛍光性化学物質を用いた生物材料の染色を行う場合には、透明化処理工程の前に行うことが好ましいが、透明化処理工程の後に行うこともできる。さらに、可視化処理工程として、蛍光性化学物質以外の化学物質を用いた染色を行うこともできる。
観察工程は、あらゆる種類の光学顕微鏡を用いて行うことができる。例えば、観察工程は、３次元超分解顕微鏡技術を適用して行うこともできる。また、観察工程は、共焦点レーザー顕微鏡、デジタルスキャン光シート顕微鏡、または多光子励起型（一般的には２光子励起型）の光学顕微鏡技術を適用して行うことが好ましい。
また、観察工程を行う際の温度は特に限定されないが、フルクトースの析出抑制の観点から透明化処理工程を行った温度と同じ温度において行うことが好ましい場合がある。
（その他の応用）
本発明の「透明化試薬」を用いた透明化処理は可逆的である。そのため、透明化処理された生物材料は、例えば、平衡塩類溶液に浸漬することにより、透明化試薬の成分を取り除き、透明化処理前の状態に戻すことが可能である。平衡塩類溶液としては、例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳなどリン酸塩によって緩衝液化された平衡塩類溶液；トリス塩酸塩によって緩衝液化された平衡塩類溶液（ＴＢＳ）；ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２などの細胞培養用の基礎培地；等が挙げられる。
本発明の「透明化試薬」を用いた透明化処理は可逆的である。そのため、透明化処理された生物材料は、例えば、平衡塩類溶液に浸漬することにより、透明化試薬の成分を取り除き、透明化処理前の状態に戻すことが可能である。平衡塩類溶液としては、例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳなどリン酸塩によって緩衝液化された平衡塩類溶液；トリス塩酸塩によって緩衝液化された平衡塩類溶液（ＴＢＳ）；ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２などの細胞培養用の基礎培地；等が挙げられる。
本発明で用いる「透明化試薬」は非変性剤であるフルクトースを有効成分としているため、透明化処理の前後において、もしくは、透明化処理後に透明化処理前の状態に戻す場合において、生物材料に含まれるタンパク質等の変性等を招来しない。そのため、生物材料に含まれるタンパク質等の抗原性も変化せずに保存される。そのため、例えば、生物材料を透明化処理して光学顕微鏡による観察を行った後に、当該生物材料を透明化処理前の状態に戻して公知の組織染色または免疫染色の手法を用いた詳細分析を行うことも可能である。
〔生物材料用透明化処理キット〕
本発明に係る「生物材料用透明化処理キット」は、フルクトースを含む溶液（上記「透明化試薬Ａ」に相当する）を備える。本発明に係る「生物材料用透明化処理キット」は、上記溶液より低い濃度でフルクトースを含む１以上の溶液（上記「透明化試薬Ｂ」に相当する）をさらに備えることが好ましい。なお、フルクトースを含む溶液におけるフルクトースの濃度は、上述の「透明化試薬Ａ」および「透明化試薬Ｂ」について記載したとおりである。
本発明に係る「生物材料用透明化処理キット」は、フルクトースを含む溶液（上記「透明化試薬Ａ」に相当する）を備える。本発明に係る「生物材料用透明化処理キット」は、上記溶液より低い濃度でフルクトースを含む１以上の溶液（上記「透明化試薬Ｂ」に相当する）をさらに備えることが好ましい。なお、フルクトースを含む溶液におけるフルクトースの濃度は、上述の「透明化試薬Ａ」および「透明化試薬Ｂ」について記載したとおりである。
また、本発明に係る「生物材料用透明化処理キット」は、「キットの取扱説明書」をさらに備えることが好ましい。「キットの取扱説明書」には、例えば、上記〔生物材料の透明化方法〕（概要）欄に記載したような、透明化試薬Ａ、より好ましくはさらに透明化試薬Ｂを用いる、生物材料の透明化方法の手順等が記録されている。
さらに、上記の透明化処理工程で用いる「処理容器」、「生物材料把持器具（ピンセット等）」、および、透明化処理後の生物材料を透明化処理前の状態に戻す「平衡塩類溶液」から選択される少なくとも１つを備えていてもよい。
本発明に係る生物材料用透明化処理キットは、上記「生物材料の透明化方法」に好適に用いられる。
以下、実施例および比較例によって本発明をより詳細に説明する。
〔実施例１：フルクトースを用いたマウス脳および胎児の透明化〕
（方法）
生後７日齢の野性型（C57BL/6N）マウスを４％パラホルムアルデヒドで還流固定し、脳の一部（前脳）を取り出した。また、胎生１２日齢の野性型マウス胎児を母体から取り出した。次いで、これらを４℃において４％パラホルムアルデヒドで１２時間固定した。固定したサンプルを２５℃において順に２０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液に８時間、４０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液に８時間、６０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液に８時間、８０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液に８時間、１００％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液に８時間、１１０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液に２４時間浸漬した。なお、上記フルクトース水溶液は何れも、純水にフルクトースのみを溶解させたものである。
（方法）
生後７日齢の野性型（C57BL/6N）マウスを４％パラホルムアルデヒドで還流固定し、脳の一部（前脳）を取り出した。また、胎生１２日齢の野性型マウス胎児を母体から取り出した。次いで、これらを４℃において４％パラホルムアルデヒドで１２時間固定した。固定したサンプルを２５℃において順に２０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液に８時間、４０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液に８時間、６０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液に８時間、８０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液に８時間、１００％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液に８時間、１１０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液に２４時間浸漬した。なお、上記フルクトース水溶液は何れも、純水にフルクトースのみを溶解させたものである。
（結果）
フルクトース処理前およびフルクトース処理後の胎児および脳（前脳）を図１に示す。図１に示されるように、フルクトースによる処理によって、胎児および脳が透明化することがわかった。
フルクトース処理前およびフルクトース処理後の胎児および脳（前脳）を図１に示す。図１に示されるように、フルクトースによる処理によって、胎児および脳が透明化することがわかった。
〔実施例２：多光子顕微鏡による観察１〕
（方法）
生後１８日齢のThy1-YFP（line G）トランスジェニックマウス（Feng et al., Neuron 28, 41-51(2000)）を４％パラホルムアルデヒドで還流固定し、脳を取り出した。次いで、取り出した脳を４℃において４％パラホルムアルデヒドで１２時間固定した。固定した脳を２％アガロースに包埋し、適当にトリミングした。これを、２５℃において、順に２０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液（８時間）、４０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液（８時間）、６０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液（８時間）、８０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液（８時間）、１００％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液に８時間、１１０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液（２４時間）に浸漬した。なお、上記フルクトース水溶液は何れも、純水にフルクトースのみを溶解させたものである。
（方法）
生後１８日齢のThy1-YFP（line G）トランスジェニックマウス（Feng et al., Neuron 28, 41-51(2000)）を４％パラホルムアルデヒドで還流固定し、脳を取り出した。次いで、取り出した脳を４℃において４％パラホルムアルデヒドで１２時間固定した。固定した脳を２％アガロースに包埋し、適当にトリミングした。これを、２５℃において、順に２０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液（８時間）、４０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液（８時間）、６０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液（８時間）、８０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液（８時間）、１００％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液に８時間、１１０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液（２４時間）に浸漬した。なお、上記フルクトース水溶液は何れも、純水にフルクトースのみを溶解させたものである。
フルクトース処理したアガロースブロックの上にカバーグラスを載せ、正立多光子顕微鏡（Olympus FV1000MPE、対物レンズはXLPLN25XWMPを使用）を用いて嗅球を観察した。なお、観察に用いた対物レンズの作動距離（working distance）は２ｍｍであった。また、観察は２５℃で行った。
（結果）
観察の結果を図２に示す。図２は、嗅球の内側から外側までイメージングした顕微鏡画像を示す図である。図２の（ａ）は深度方向に切断した断面の画像を示す図であり、（ｂ）は４４７μｍの深度における断面の画像を示す図であり、（ｃ）は１２６６μｍの深度における断面の画像を示す図である。このように、嗅球の内側からイメージングをすると、外側（深度約１．７ｍｍ（屈折率補正をした実際の深度は約１．８ｍｍ））まで鮮明な像を得ることができた。
観察の結果を図２に示す。図２は、嗅球の内側から外側までイメージングした顕微鏡画像を示す図である。図２の（ａ）は深度方向に切断した断面の画像を示す図であり、（ｂ）は４４７μｍの深度における断面の画像を示す図であり、（ｃ）は１２６６μｍの深度における断面の画像を示す図である。このように、嗅球の内側からイメージングをすると、外側（深度約１．７ｍｍ（屈折率補正をした実際の深度は約１．８ｍｍ））まで鮮明な像を得ることができた。
嗅球を全体の３次元像を得るためには、従来、切片を作製しなければならなかった。しかし、本発明の方法を用いれば、このように深部まで鮮明な画像を得ることができるため、画像貼り合わせを行うことによって、嗅球を全体の３次元像として得ることも可能となる。
〔実施例３：サンプルの伸縮〕
（方法）
生後８週齢のThy1-YFP（line G）トランスジェニックマウスを４％パラホルムアルデヒドで還流固定し、脳を取り出した。次いで、取り出した脳を４℃において４％パラホルムアルデヒドで１２時間固定した。固定した脳を２５℃において順に２０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液に１２時間、４０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液に１２時間、６０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液に１２時間、８０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液に１２時間、１１０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液に１９日間浸漬した。その後、１×ＰＢＳに戻し、３日間浸漬した。なお、上記フルクトース水溶液は何れも、純水にフルクトースのみを溶解させたものである。
（方法）
生後８週齢のThy1-YFP（line G）トランスジェニックマウスを４％パラホルムアルデヒドで還流固定し、脳を取り出した。次いで、取り出した脳を４℃において４％パラホルムアルデヒドで１２時間固定した。固定した脳を２５℃において順に２０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液に１２時間、４０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液に１２時間、６０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液に１２時間、８０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液に１２時間、１１０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液に１９日間浸漬した。その後、１×ＰＢＳに戻し、３日間浸漬した。なお、上記フルクトース水溶液は何れも、純水にフルクトースのみを溶解させたものである。
比較例として、同様の条件で取り出して固定した脳を、２５℃において、試薬Ｓ（４Ｍ濃度の尿素、０．１％（ｗ／ｖ）濃度のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標）、１０％（ｗ／ｖ）濃度のグリセロールを純水に溶解した水溶液）に２１日間浸漬した。その後、１×ＰＢＳに戻し、３日間浸漬した。
フルクトースで処理した脳および試薬Ｓで処理した脳について、処理前（０日）、透明化処理０．５日後、１日後、１．５日後、２日後、２１日後、および戻してから１日後、２日後、３日後の伸縮を調べた。
（結果）
サンプルの伸縮の結果を図３に示す。図３の（ａ）はそれぞれの日数における脳の全体の画像を示す図である。図３の（ｂ）は０日の脳のサイズを１とした場合の、それぞれの日数における伸縮比（１次元）を示すグラフである。図３の（ａ）および（ｂ）に示されるように、試薬Ｓを用いた場合では、時間の経過と共に脳が膨潤し、ＰＢＳに戻すと収縮した。それに対して、フルクトースを用いた場合では、濃度を上げてもほとんど膨潤および収縮しなかった。また、ＰＢＳに戻してもほとんど変化しなかった。
サンプルの伸縮の結果を図３に示す。図３の（ａ）はそれぞれの日数における脳の全体の画像を示す図である。図３の（ｂ）は０日の脳のサイズを１とした場合の、それぞれの日数における伸縮比（１次元）を示すグラフである。図３の（ａ）および（ｂ）に示されるように、試薬Ｓを用いた場合では、時間の経過と共に脳が膨潤し、ＰＢＳに戻すと収縮した。それに対して、フルクトースを用いた場合では、濃度を上げてもほとんど膨潤および収縮しなかった。また、ＰＢＳに戻してもほとんど変化しなかった。
このように、フルクトースを用いると、ほとんど体積を変化させることなく、透明化することができた。
〔実施例４：細胞形態および抗原性の変化〕
（方法）
生後８週齢のThy1-YFP（line G）トランスジェニックマウスを４％パラホルムアルデヒドで還流固定し、脳を取り出した。次いで、取り出した脳を４℃において４％パラホルムアルデヒドで１２時間固定した。固定した脳を２５℃において順に２０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液に８時間、４０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液に８時間、６０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液に８時間、８０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液に８時間、１００％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液に８時間、１１０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液に２４時間浸漬した。その後、１×ＰＢＳに戻し、３０％（ｗ／ｖ）スクロースで処理して、凍結組織包埋剤（O.C.T. compound）に包埋した。次いで、脳を１時間凍結してから、２０μｍの切片を作成した。抑制性ポストシナプスのマーカータンパク質であるGephyrinを染色した。具体的には、抗Gephyrinウサギ抗体（Abcam社）（２００倍希釈）で１時間反応させたのち、ＰＢＳで３回洗浄し、Alexa Fluor647標識抗ウサギ抗体（２００倍希釈）で４０分反応させ、ＰＢＳで３回洗浄した。DAPIで核染色を行った。なお、上記フルクトース水溶液は何れも、純水にフルクトースのみを溶解させたものである。
（方法）
生後８週齢のThy1-YFP（line G）トランスジェニックマウスを４％パラホルムアルデヒドで還流固定し、脳を取り出した。次いで、取り出した脳を４℃において４％パラホルムアルデヒドで１２時間固定した。固定した脳を２５℃において順に２０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液に８時間、４０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液に８時間、６０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液に８時間、８０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液に８時間、１００％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液に８時間、１１０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液に２４時間浸漬した。その後、１×ＰＢＳに戻し、３０％（ｗ／ｖ）スクロースで処理して、凍結組織包埋剤（O.C.T. compound）に包埋した。次いで、脳を１時間凍結してから、２０μｍの切片を作成した。抑制性ポストシナプスのマーカータンパク質であるGephyrinを染色した。具体的には、抗Gephyrinウサギ抗体（Abcam社）（２００倍希釈）で１時間反応させたのち、ＰＢＳで３回洗浄し、Alexa Fluor647標識抗ウサギ抗体（２００倍希釈）で４０分反応させ、ＰＢＳで３回洗浄した。DAPIで核染色を行った。なお、上記フルクトース水溶液は何れも、純水にフルクトースのみを溶解させたものである。
比較例として、同様の条件で取り出して固定した脳を、試薬Ｓ（４Ｍ濃度の尿素、０．１％（ｗ／ｖ）濃度のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標）、１０％（ｗ／ｖ）濃度のグリセロールを純水に溶解した水溶液）に２１日間浸漬した。その後、１×ＰＢＳに戻し、同様に染色した。
フルクトースで処理した脳の切片および試薬Ｓで処理した脳の切片について、倒立型蛍光顕微鏡（ライカ、型番DMI6000B）を用いて蛍光を観察した。比較例である試薬Ｓで処理したサンプルのＹＦＰ蛍光は著しく減弱していたため、他のサンプルよりも露光時間を長くしてＹＦＰ画像を取得している。
（結果）
顕微鏡の画像を図４に示す。参考として、透明化処理をしていない脳の切片の画像も示している（Control）。図４に示されるように、フルクトースでは、試薬Ｓと比較して、細胞形態および抗原性の変化が抑えられている。
顕微鏡の画像を図４に示す。参考として、透明化処理をしていない脳の切片の画像も示している（Control）。図４に示されるように、フルクトースでは、試薬Ｓと比較して、細胞形態および抗原性の変化が抑えられている。
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
〔実施例５：多光子顕微鏡による観察２〕
（方法）
生後３週齢のThy1-YFP（line G）トランスジェニックマウスを４％パラホルムアルデヒドで還流固定し、脳を取り出した。次いで、取り出した脳を４℃において４％パラホルムアルデヒドで１２時間固定した。固定した脳を２％（ｗ／ｖ）アガロースに包埋し、適当にトリミングした。これを、２５℃において、順に２０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液（８時間）、４０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液（８時間）、６０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液（８時間）、８０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液（８時間）、１００％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液（８時間）、１１０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液（２４時間）に浸漬した。なお、上記フルクトース水溶液は何れも、純水にフルクトースのみを溶解させたものである。
（方法）
生後３週齢のThy1-YFP（line G）トランスジェニックマウスを４％パラホルムアルデヒドで還流固定し、脳を取り出した。次いで、取り出した脳を４℃において４％パラホルムアルデヒドで１２時間固定した。固定した脳を２％（ｗ／ｖ）アガロースに包埋し、適当にトリミングした。これを、２５℃において、順に２０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液（８時間）、４０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液（８時間）、６０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液（８時間）、８０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液（８時間）、１００％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液（８時間）、１１０％（ｗ／ｖ）フルクトース水溶液（２４時間）に浸漬した。なお、上記フルクトース水溶液は何れも、純水にフルクトースのみを溶解させたものである。
フルクトース処理したアガロースブロックの上にカバーグラスを載せ、正立多光子顕微鏡（Olympus FV1000MPE、対物レンズはXLPLN25XSVMPを使用）を用いて大脳皮質を観察した。なお、観察に用いた対物レンズの作動距離（working distance）は４ｍｍであった。また、観察は２５℃で行った。
（結果）
観察の結果を図５に示す。図５は、大脳皮質の側面表層からイメージングした顕微鏡画像を示す図である。５６３μｍ、１１１３μｍ、２０１３μｍ、２９１３μｍ、３５１３μｍの深度における断面の画像をそれぞれ示している。このように、深度３．５ｍｍ（屈折率補正をした実際の深度は３．８ｍｍ）（ほぼ対物レンズの作動距離により制約）まで鮮明な像を得ることができた。将来的に作動距離のもっと長い対物レンズが開発されれば、さらに深くまで観察できる可能性がある。
観察の結果を図５に示す。図５は、大脳皮質の側面表層からイメージングした顕微鏡画像を示す図である。５６３μｍ、１１１３μｍ、２０１３μｍ、２９１３μｍ、３５１３μｍの深度における断面の画像をそれぞれ示している。このように、深度３．５ｍｍ（屈折率補正をした実際の深度は３．８ｍｍ）（ほぼ対物レンズの作動距離により制約）まで鮮明な像を得ることができた。将来的に作動距離のもっと長い対物レンズが開発されれば、さらに深くまで観察できる可能性がある。
本発明に係る生物材料を透明化する方法、生物材料用の透明化試薬および生物材料用透明化処理キットは、タンパク質を変性させずに生物材料を透明化する際に利用することができる。
Claims (15)
- 生物材料を透明化する方法であって、
フルクトースを含む溶液を生物材料中に浸潤させて、当該生物材料を透明化する工程、を含むことを特徴とする生物材料の透明化方法。 - 上記溶液は、上記フルクトースを５０％（ｗ／ｖ）以上で２００％（ｗ／ｖ）以下の範囲内の濃度で含むことを特徴とする請求項１に記載の生物材料の透明化方法。
- 上記溶液は、上記フルクトースを飽和濃度で含むことを特徴とする請求項１または２に記載の生物材料の透明化方法。
- 上記溶液は、水溶液であることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載の生物材料の透明化方法。
- 上記工程の前に、上記溶液より低い濃度でフルクトースを含む１以上の溶液を、濃度の低い順に、上記生物材料中に浸潤させる工程をさらに含むことを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載の生物材料の透明化方法。
- 上記溶液の何れもが、水溶液であることを特徴とする請求項５に記載の生物材料の透明化方法。
- 上記生物材料は、多細胞動物由来の組織もしくは器官、またはヒトを除く多細胞動物の個体であることを特徴とする請求項１〜６の何れか１項に記載の生物材料の透明化方法。
- 上記生物材料は、蛍光タンパク質を発現している細胞を含んでいることを特徴とする請求項７に記載の生物材料の透明化方法。
- 生物材料用の透明化試薬であって、
フルクトースを含む溶液であることを特徴とする透明化試薬。 - 上記溶液は、上記フルクトースを５０％（ｗ／ｖ）以上で２００％（ｗ／ｖ）以下の範囲内の濃度で含むことを特徴とする請求項９に記載の透明化試薬。
- 上記溶液は、上記フルクトースを飽和濃度で含むことを特徴とする請求項９または１０に記載の透明化試薬。
- 上記溶液は、水溶液であることを特徴とする請求項９〜１１の何れか１項に記載の透明化試薬。
- 生物材料用透明化処理キットであって、
フルクトースを含む溶液を備えることを特徴とする生物材料用透明化処理キット。 - 上記溶液より低い濃度でフルクトースを含む１以上の溶液をさらに備えることを特徴とする請求項１３に記載の生物材料用透明化処理キット。
- 上記溶液の何れもが、水溶液であることを特徴とする請求項１４に記載の生物材料用透明化処理キット。
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