JP6781421B2

JP6781421B2 - 生物材料の観察方法および透明化方法

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Publication number: JP6781421B2
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Inventors: 猛今井; 孟岑柯
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Description

本発明は、生物材料の観察方法および透明化方法等に関する。

近年、生物組織を透明にすることで深部蛍光観察を可能にする技術が次々に開発されている。しかしながら、深部を高分解能で観察することは容易ではない。超解像顕微鏡をはじめとする高解像蛍光イメージングにおいては、サンプルによる散乱および球面収差の影響を極めて受けやすく、深部の観察が特に難しかった。そのため、生物組織の深部蛍光観察において、光散乱を減らすための透明化方法および透明化後に球面収差を減らすマウント剤のさらなる開発が求められてきた。

組織の透明化方法としては、例えば、尿素を用いるScale法（非特許文献１）およびCUBIC法（非特許文献２）、ならびに組織をアクリルアミドゲルに架橋したのち脂質を取り除くCLARITY法（非特許文献３）などが知られている。また、FocusClear^TMという試薬が市販されている（特許文献１）。また、フルクトースを用いるSeeDB法（非特許文献４）が知られている。

一方、マウント剤としては、これまでグリセリンを用いたものがよく用いられてきたが、屈折率は１．４６程度にとどまっていた。CLARITY法の変法では、ヒドロゲルモノマーに架橋して脂質を除去した後で屈折率調整を行うための試薬RIMS（イオヘキソール、リン酸バッファー、および界面活性剤Tween20を含む）が知られている（非特許文献５）。しかしながら、高分解能を達成することができる油浸対物レンズ（イマージョンオイルの屈折率は１．５１８）と屈折率１．５１８のカバーガラスとを用いて蛍光イメージングする際には、組織サンプルを同程度の高い屈折率の液体にマウントすることが望ましい。屈折率の高いマウント剤としては、２，２’−チオジエタノール（ＴＤＥ）を含むもの（屈折率１．５２）が知られている（非特許文献６）。

米国特許第６４７２２１６号明細書（特許日２００２年１０月２９日）

Hama, H., Kurokawa, H., Kawano, H., Ando, R., Shimogori, T., Noda, H., Fukami, K., Sakaue-Sawano, A. & Miyawaki, A. (2011) Nat. Neurosci., 14, 1481-1488. Susaki, E.A., Tainaka, K., Perrin, D., Kishino, F., Tawara, T., Watanabe, T.M., Yokoyama, C., Onoe, H., Eguchi, M., Yamaguchi, S., Abe, T., Kiyonari, H., Shimizu, Y., Miyawaki, A., Yokota, H. & Ueda, H.R. (2014) Cell, 157, 726-739. Chung, K., Wallace, J., Kim, S.Y., Kalyanasundaram, S., Andalman, A.S., Davidson, T.J., Mirzabekov, J.J., Zalocusky, K.A., Mattis, J., Denisin, A.K., Pak, S., Bernstein, H., Ramakrishnan, C., Grosenick, L., Gradinaru, V. & Deisseroth, K. (2013) Nature, 497, 332-337. Ke, M.T., Fujimoto, S. & Imai, T. (2013) Nat. Neurosci., 16, 1154-1161. Yang, B., Treweek, J.B., Kulkarni, R.P., Deverman, B.E., Chen, C.K., Lubeck, E., Shah, S., Cai, L. & Gradinaru, V. (2014) Cell, 158, 945-958. Staudt, T., Lang, M.C., Medda, R., Engelhardt, J. & Hell, S.W. (2007) Microsc. Res. Tech., 70, 1-9.

しかしながら、非特許文献１〜３の透明化方法は、透明度に優れるが、組織の微細な形態を変化させてしまう可能性がある。

特許文献１の透明化試薬を用いた場合は、サンプルが収縮するという問題がある。

非特許文献４の透明化方法は、微細な形態を保持したイメージングが可能であるが、蛍光タンパク質の長期安定性に関しては改良の余地があり、また高解像イメージングに関してはフルクトースの溶解度の制約から十分な効果が得られない可能性がある。

非特許文献５において、サンプルのマウントに用いているRIMSでは、屈折率は１．３８〜１．４８であり、イマージョンオイルおよびカバーガラスと同程度の屈折率は得られない。したがって、サンプル深部においては高い分解能および明るさを得ることができない。

非特許文献６のマウント剤は、蛍光タンパク質などを褪色させてしまうため、蛍光イメージングにおいて制約がある。

本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、生物材料の微細な形態を保持し、蛍光物質の蛍光を保持しながら、生物材料の光散乱を減らして透明化する方法、および顕微鏡観察における球面収差を減らす方法等を提供することにある。

本発明に係る生物材料の透明化方法は、界面活性剤と非イオン性有機ヨウ素化合物とを含む溶液に生物材料を浸漬して、当該生物材料を透明化する透明化工程Ａを含む。

本発明に係る生物材料の観察方法は、生物材料を、非イオン性有機ヨウ素化合物を含み屈折率が１．４８超である溶液に浸漬した状態で、顕微鏡によって観察する観察工程を含む。

本発明に係る透明化試薬は、生物材料用の透明化試薬であって、界面活性剤と非イオン性有機ヨウ素化合物とを含む溶液である。

本発明に係るマウント剤は、生物材料を顕微鏡によって観察する際に用いるマウント剤であって、非イオン性有機ヨウ素化合物を含み屈折率が１．４８超である溶液である。

本発明に係る生物材料の観察用キットは、生物材料を透明化して顕微鏡によって観察するために用いるキットであって、界面活性剤と非イオン性有機ヨウ素化合物とを含む第一の溶液と、非イオン性有機ヨウ素化合物を含み屈折率が１．４８超である第二の溶液とを備える。

本発明は、生物材料の微細な形態を保持し、蛍光物質の蛍光を保持しながら、生物材料の光散乱を減らして透明化する方法、および顕微鏡観察における球面収差を減らす方法等を提供することができる。

ＳｅｅＤＢ２において微細形態および蛍光が維持されることを示す図である。（Ａ）様々な透明化媒体の、可視光波長における透過曲線。（Ｂ）様々な透明化プロトコルにより透明化された、マウス脳（生後２１〜２４日（Ｐ２１〜２４）、それぞれｎ＝３〜６）の大脳皮質の透過曲線。代表的な透明化画像を右に示す。ＲＩＭＳでは、サンプルの透明性が向上することなく収縮した。赤外線領域を含む全走査データは図６のＤおよびＥに示す。（Ｃ）ＣＬＡＲＩＴＹ、ＣＵＢＩＣ、ＳｃａｌｅＳおよびＳｅｅＤＢ２による光学的透明化における、透明化計画およびサンプルの大きさの変化。右に示す通り、マウス成体の脳切片（Ｐ４９〜５６、１．５ｍｍ厚、それぞれｎ＝３）を使用した。ＣＬＡＲＩＴＹ、ＣＵＢＩＣおよびＳｃａｌｅＳは、一時的な組織膨張を伴った。対照的に、ＳｅｅＤＢ２は透明化の過程において、サンプルの大きさの劇的な変化を伴わなかった。（Ｄ）様々なサンプルのＳｅｅＤＢ２による透明化前および後。マウス胚（Ｅ１２．５）、全脳（Ｐ５）、半脳（Ｐ７０）、および鼻骨（Ｐ８４）の、ＳｅｅＤＢ２による光学的透明化の前および後は各図で示す通りである。（Ｅ）神経微細構造の変形。僧帽細胞の側方樹状突起部分のねじれを定量し、ボックスプロット（３〜５匹から、それぞれｎ＝４３、８１、６８、５８、および８０）に示した。歪んだ樹状突起を矢頭で示した。バーは５〜９５パーセンタイルを表す。＊＊＊Ｐ＜０．００１（クラスカル・ウォリス検定）。Ｎ．Ｓ．は有意ではないの意である。透明化画像のマス目は２．６×３．２ｍｍである。スケールバーは５０μｍを表す。（Ｆ）様々な透明化媒体における蛍光タンパク質の蛍光励起（Ｅｘ、破線）および放射（Ｅｍ、実線）スペクトル。蛍光レベルはＰＢＳにおける最高強度に標準化した。ＴＤＥは全ての蛍光タンパク質の蛍光を消失させた。ＰｒｏＬｏｎｇＧｏｌｄは部分的にＥＧＦＰおよびＥＹＦＰのシグナルを消失させた。対照的に、全ての蛍光タンパク質はＳｅｅＤＢ２Ｓ中で安定であった。それぞれｎ＝３。（Ｇ）Ｔｈｙ１−ＹＦＰ−Ｇマウスの脳切断面におけるＥＹＦＰの安定性。ＣＵＢＩＣによる消光は図７のＤで評価される。（Ｈ）様々な光学的透明化法後のＴｈｙ１−ＹＦＰ−Ｈマウス（Ｐ７２〜８４）大脳皮質の共焦点イメージング（代表的な画像）。画像は２０×空気対物レンズを用いた同じ条件でのイメージングにより、半脳サンプルの表面から得られた。ＳｅｅＤＢ２Ｇは自家蛍光シグナルを低く保っている一方で、蛍光シグナルを最もよく保存していた。（ＳｅｅＤＢ２による種々の組織の透明化および染色を示す図である。（Ａ）ＳｅｅＤＢ２Ｇで透明化した成体Ｔｈｙ１−ＹＦＰ−Ｈマウス（Ｐ５８）の脳の光シート顕微鏡観察。１．３９ｍｍ×２．０４ｍｍ×１．４９ｍｍの容積を、２×３ブロック（それぞれ７４５枚の画像からなる）から再構成した。この画像を得るのに要した時間は〜６分であり、共焦点顕微鏡および二光子顕微鏡（数時間）よりもかなり速かった。（Ｂ）Ｒ２６−Ｈ２Ｂ−ＥＧＦＰマウス胚（Ｅ９．５）の二光子イメージ。胚全体の画像は４×５のブロックから再構成された。（Ｃ）Ｒ２６−Ｈ２Ｂ−ＥＧＦＰマウスの成体の腸および肝臓の光学的透明化。共焦点イメージを右に示す。（Ｄ）Ｔｈｙ１−ＹＦＰ−Ｈマウスの１．５ｍｍ厚の脳切片（大脳皮質）のＤＡＰＩ染色（Ｐ５６）。（Ｅ）Ｔｈｙ１−ＹＦＰ−Ｈマウスの脳切片（海馬）の抗ＧＡＤ６７免疫染色。（Ｆ）嗅球ホールマウント試料（Ｐ５６）の抗Ｒｅｅｌｉｎ免疫染色。（Ｄ）〜（Ｆ）はＳｅｅＤＢ２Ｇで透明化したサンプルの共焦点画像である。Ｌ５は第Ｖ層を表し、ＤＧは歯状回を表し、ＧＬは球状層を表し、ＭＣＬは僧帽細胞を表す。スケールバーは、（Ｂ）においては１ｍｍを表し、（Ｃ）〜（Ｆ）においては１００μｍを表す。ＳｅｅＤＢ２Ｓにおける改善された分解能および明るさを示す図である。（Ａ）様々な透明化およびマウント媒体における、蛍光ビーズ（直径１００ｎｍ）の点拡がり関数（ＰＳＦ）解析。共焦点顕微鏡（ピンホールサイズ、１ＡＵ）および油浸対物レンズ（１００×、ＮＡ１．４０、ＷＤ０．１３ｍｍ）を用いて得られた蛍光ビーズの蛍光画像を示す。（Ｂ）横方向およびｚ軸方向についての半値全幅（ＦＷＨＭ）における全長を示す。最良の分解能は、カバーガラスおよびイマージョンオイルと一致する屈折率のＳｅｅＤＢ２Ｓにより得られた。ｚ軸分解能はより屈折率の不一致に敏感であることに着目すること。それぞれｎ＝２０。（Ｃ）カバーガラス界面からのローダミン染料溶液の共焦点軸走査。屈折率が一致しない場合、球面収差のため、ＰＭＴにより検出される光子は深度が増すとともに減少する。対照的に、染料がＳｅｅＤＢ２Ｓに溶解している場合、蛍光強度は深度に依らず一定である。強度曲線は各条件における最も強い強度に標準化した。屈折率の不一致はカバーガラスと媒体の界面における光の屈折をも増大させ、明るさを減少させることに着目すべきである。（Ｄ、Ｅ）油浸対物レンズ（１００×、ＮＡ１．４０、ＷＤ０．１３ｍｍ）を用いたＴｈｙ１−ＹＦＰ−Ｈマウスの脳切片（大脳皮質）の高解像共焦点イメージング。ＰＢＳ中（Ｄ）およびＳｅｅＤＢ２Ｓ中（Ｅ）のサンプルを示す。ＳｅｅＤＢ２Ｓは高ＮＡ対物レンズによるイメージング可能な深度を拡張する。（Ｆ）ＩＲＥＳ−ＥＣＦＰで標識された遺伝子組み換え嗅覚受容体Ｉ７を発現する、嗅覚神経の軸索収束（参考文献：Imai et al. (2006). Science 314, 657-661）。嗅球サンプル（２月齢）をＳｅｅＤＢ２Ｇを用いて透明化し、６３×グリセロール浸対物レンズ（ＮＡ１．３０、ＷＤ０．３０ｍｍ）を用いてイメージングした。Ｚスタックイメージ（２６２μｍ厚、３×３タイル）を示す。（Ｇ）Ｔｈｙ１−ＹＦＰ−Ｈマウスの脳切片の海馬ＣＡ１領域（２３８μｍ×１２７μｍ×１３０μｍ）の、１００×油浸対物レンズ（ＮＡ１．４０、ＷＤ０．１３ｍｍ）を用いたイメージング。側面上および軸上両方の分解能が、ＥＹＦＰ標識された個々のニューロンをトレースするのに十分であった。（Ｈ）（Ｇ）に示す３Ｄイメージからの４つの錐体ニューロンの再構成。半自動のトレースソフトウェアであるＮｅｕｒｏｌｕｃｉｄａを用い、我々は高密度に標識された脳切片から完全に近い配線パターンを得た。マウスはＰ４８〜５６であった。スケールバーは、（Ａ）においては２００ｎｍ、（Ｄ、左）、（Ｅ、左）、（Ｆ）においては５０μｍ、（Ｄ、右）、（Ｅ、右）においては２μｍを表す。ＳｅｅＤＢ２Ｓで透明化された成体マウスの脳切片における樹状突起スパインの超解像イメージングを示す図である。（Ａ）ＳｅｅＤＢ２Ｓで透明化されたＴｈｙ１−ＹＦＰ−Ｈマウスの脳切片のＳＴＥＤ顕微鏡観察。皮質の錐体ニューロンの神経突起スパインが示されている（Ｚスタックイメージ）。共焦点イメージおよびＳＴＥＤイメージを比較した。ＳＴＥＤイメージはさらに右にデコンボリュートされた。典型的には回折限界を超えてしまうスパイン頸部の配置もＳＴＥＤ顕微鏡により良好に解像された。代表的なスパイン頸部のＦＷＨＭ（点線）は右に示される。（Ｂ）皮質の錐体ニューロンの樹状突起スパインはＦＶ−ＯＳＲ超解像システムを用いて実施した（Ｚ−スタック）。油浸対物レンズ（１００×、ＮＡ１．４０、ＷＤ０．１３ｍｍ）を使用した。ＦＶ−ＯＳＲはＳｅｅＤＢ２Ｓで透明化されたサンプルについいては分解能を向上させることができるが、ＰｒｏＬｏｎｇＧｏｌｄで透明化されたサンプルについては透明化できない。このことは、超解像画像を得るため、理論ＰＳＦを維持しなけなければならないことを意味する。（Ｃ）樹状突起スパインおよび軸索ブトンの微細構造を、Ａｉｒｙｓｃａｎ超解像システムを用いてイメージングした（Ｔｈｙ１−ＹＦＰ−Ｈマウスの大脳皮質、Ｚ−スタック）。油浸対物レンズ（１００×、ＮＡ１．４６、ＷＤ０．１３ｍｍ）。ボリュームレンダリングを左に示す。再構成を右に示す。（Ｄ）（Ｃ）の一部についての３ＤレンダリングおよびＶＡＳＴ再構成。スケールバーは、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｄ、右）においては１μｍを表し、（Ｃ）、（Ｄ、左）においては１０μｍを表す。ＳｅｅＤＢ２Ｓを用いた深部組織の超解像イメージングを示す図である。（Ａ）様々なマウント媒体における蛍光ビーズ（直径４０ｎｍ）のＰＳＦ解析を、油浸レンズ（１００×、ＮＡ１．４６、ＷＤ０．１３ｍｍ）を備えるＳＴＥＤ顕微鏡を用いて行った。２ＤＳＴＥＤを用いて得られた側面ＦＷＨＭを示す。それぞれｎ＝２０。（Ｂ）ＳｅｅＤＢ２Ｓで透明化したＴｈｙ１−ＹＦＰ−Ｈマウスの脳切片のＳＴＥＤ顕微鏡観察。皮質の錐体ニューロンの樹状突起スパインを示す（Ｚスタックイメージ）。共焦点イメージおよびＳＴＥＤイメージを比較している。ＳＴＥＤイメージはさらに右にデコンボリュート（ＤＣ）した。ＳｅｅＤＢにおいて、ＳＴＥＤ顕微鏡を用いて１００μｍまでの微細なスパインの形態が完全に解像された。それに対して、ＰｒｏＬｏｎｇＧｏｌｄでは、〜１０μｍの深度においてでさえ、超解像画像を得ることができなかった。（Ｃ）皮質の錐体ニューロンの代表的なＳＴＥＤ画像（〜６０μｍの深度）。矢印はスパイン頭部から伸びるフィロポディアを示す。（Ｄ）表面領域（２０〜３０μｍ）および深部領域（１０９〜１２２μｍ）におけるＳＴＥＤ顕微鏡の分解能を評価するために、スパイン頸部直径（回折限界以下であることが知られている）を定量した。スパイン頸部直径の側面ＦＷＨＭを２つの深度の間で比較したところ（〜１２０ｎｍ、データは平均±標準偏差；Ｎ．Ｓ．はＷｅｌｃｈ’ｓ検定において有意でないことを表す、それぞれｎ＝２０）、ＳＴＥＤ顕微鏡の均一な分解能が示唆された。マウスはＰ５６〜６４であった。（Ｅ）膜ＥＧＦＰを発現しているＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＤＡＰＩ（核）およびＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（ミトコンドリア）を用いて染色し、３ＤＳＲ−ＳＩＭを用いてイメージングした。光学的ｘ−ｚまたはｘ−ｙ断面（１μｍスタックイメージ）を示す。油浸対物レンズ（６３×、ＮＡ＝１．４０）を使用した。それゆえ、屈折率１．３３のＰＢＳサンプルにおいてはｚ軸スケールを拡張した。調整した深さを図に示す。細胞膜から伸びる微細なフィロポディアは、ＳｅｅＤＢ２Ｓで透明化したサンプルにおいてＰＢＳよりも良好に解像したことに着目すべきである。ＰｒｏＬｏｎｇＧｏｌｄおよびＴＤＥで透明化したサンプルでは、ＥＧＦＰシグナルが消光したため、ＳＲ−ＳＩＭ画像を連続的に得ることができなかった。マウス脳切片のＳＲ−ＳＩＭイメージを、図９のＣに示す。スケールバーは、（Ａ）においては１００ｎｍ、（Ｂ）〜（Ｄ）においては１μｍ、（Ｅ）においては２μｍを表す。ＳｅｅＤＢ２の最適化を示す図である。（Ａ）ＳｅｅＤＢ２の原理。高解像イメージングにおいて、光の散乱および球面収差は、深部領域の画像の分解能を減少させる。サンプルをＳｅｅＤＢ２Ｓで透明化すると、イマージョンオイル、カバーガラス、およびサンプルの屈折率が一致する（１．５１８）。これにより、収差のない高解像イメージングが可能になる。（Ｂ）Ｘ線造影剤として使用される非イオン性トリヨードベンゼンである、イオヘキソールの化学構造。（Ｃ）様々な濃度におけるイオヘキソール溶液の屈折率。濃度は％（ｗ／ｗ）で表されることに着目すること。（Ｄ）透明化試薬の可視光および赤外領域における透過曲線。（Ｅ）透明化された脳サンプル（生後２１〜２４日、大脳皮質）の可視光および赤外領域における透過曲線。（Ｆ）様々な界面活性剤のイオヘキソールによる透明化の補助に関する効果。サポニンが最も効果的であった。それに対し、以前にＲＩＭＳにおいて使用されたＴｗｅｅｎ２０は透明化を促進しなかった。（Ｇ）バッファーに関する、脳サンプル透明化の改善効果。特に屈折率１．５１８において、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファーは透明化を促進した。屈折率１．５１８において、透明度を透明化直後（第３日）および２週間保存の後に測定した。バッファーなしでＳｅｅＤＢ２Ｓを用い透明化した脳サンプルは、長期保存の後には透明度を維持できなかった。それぞれｎ＝３。ＳｅｅＤＢ２における明るさおよび分解能を示す図である。（Ａ）様々な透明化媒体における、４種のＡｌｅｘａ染色剤の蛍光スペクトル。蛍光レベルはＰＢＳにおける最大強度で標準化した。励起および放射波長は各パネルに示す。これらの染色剤は、超解像顕微鏡観察において一般的に使用されるマウント媒体である９７％ＴＤＥ中と比較して、ＳｅｅＤＢ２中においてより安定であることに着目すること。Ａｌｅｘａ５５５の蛍光は３つの透明化／マウント媒体において増加した。ＳｅｅＤＢ２ＳおよびＴＤＥ中におけるＡｌｅｘａ６４７のスペクトルシフトを発見した。それぞれｎ＝３。（Ｂ）ＳｅｅＤＢまたはＳｅｅＤＢ２Ｇ中で７日間インキュベートした野生型マウス脳切片における自家蛍光シグナル。大脳皮質の画像は同じ条件で撮影された。自家蛍光はＳｅｅＤＢにおいては蓄積したが、ＳｅｅＤＢ２においては蓄積しなかった。（Ｃ）ＳｅｅＤＢ２Ｇを用いて透明化されたＴｈｙ１−ＹＦＰ−Ｇマウスの脳サンプルにおける、ＥＹＦＰ蛍光シグナル（第０日および第５０日、室温保存）。僧帽細胞のＺスタックイメージ（２０μｍ）を示す。イメージングの条件はこれらの画像間で同じである。（Ｄ）ＳｅｅＤＢ２Ｇ（室温）およびＣＵＢＩＣ（３７℃）による透明化過程における蛍光変化の時間経過（それぞれｎ＝１４ＲＯＩ）。Ｔｈｙ１−ＹＦＰ−Ｇマウスの凍結切片を分析した。ＣＵＢＩＣでは蛍光レベルが徐々に減少したが、ＳｅｅＤＢ２Ｇでは減少しなかった。（Ｅ）ＳｅｅＤＢ２Ｓ中において４５日間室温で保存した後の蛍光タンパク質の蛍光スペクトル。それぞれｎ＝３。海馬ＣＡ１領域における錐体ニューロンの共焦点イメージングを示す図である。（Ａ）Ｔｈｙ１−ＹＦＰ−Ｈマウスの脳切片（大脳皮質，ＳｅｅＤＢ２Ｓにより透明化）における樹状突起スパインの蛍光イメージ。最も高い分解能は、理論的な予想の通り、高ＮＡの対物レンズを用いた共焦点イメージングにより得られた（ｄ＝０．６１λ／ＮＡ）。スケールバーは２μｍを表す。（Ｂ）図３のＧに示す再構成（海馬ＣＡ１の錐体ニューロン）の高倍率画像。樹状突起の分岐の定量およびスパインの定量を示す。大脳皮質錐体ニューロンの超解像イメージングを示す図である。（Ａ）Ａｉｒｙｓｃａｎおよび１００×油浸対物レンズ（ＮＡ＝１．４６、ＷＤ＝０．１３ｍｍ）を用いて得られる超解像イメージ（２μｍＺスタック）。ＳｅｅＤＢ２Ｓで透明化したＴｈｙ１−ＹＦＰ−Ｈマウスの脳切片における、皮質錐体ニューロンの樹状突起スパインを解析した。ＰｒｏＬｏｎｇＧｏｌｄでマウントしたサンプルからは超解像イメージを得られなかったことに着目すること。（Ｂ）Ａｉｒｙｓｃａｎおよび６３×油浸対物レンズ（ＮＡ＝１．４０、ＷＤ＝０．１９ｍｍ）を用いて得られる超解像イメージ（Ｚスタック）。（Ｃ）ＳＲ−ＳＩＭを用いて得られる超解像イメージ（２〜９μｍのＺスタック）。マウス皮質切片を用いて４０μｍまでよく解像した画像を得た。スケールバーは１μｍを表す。（Ａ）ＳＤ−ＯＳＲを用いて得られた超解像イメージ。（Ｂ）ＳＰ８ＨｙＶｏｌｕｔｉｏｎで得られた超解像イメージ。（Ｃ）ＳＰ８ＨｙＶｏｌｕｔｉｏｎを用いて得られた嗅覚ニューロンについての軸索の多色超解像イメージ。（Ｄ）抗Ｂａｓｓｏｏｎ（シナプス前マーカー）および抗Ｈｏｍｅｒ１（シナプス後マーカー）で免疫染色したマウス脳切片（大脳皮質）を、ＦＶ−ＯＳＲを用いてイメージングした。深度は２．４５〜３．５０μｍであった。これら２つのタンパク質は、既報（Dani, A., et al. (2010). Neuron 68, 843-856）のように超解像イメージにおいて分離した。（Ｅ）ＰＡＬＭイメージングについてのＬｉｆｅＡｃｔ−ｍＥｏｓ２のブリンキングイメージのスナップショット。ＬｉｆｅＡｃｔ−ｍＥｏｓ２を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞をイメージングした。（Ｆ）ＰＡＬＭを用いてイメージングしたＬｉｆｅＡｃｔ−ｍＥｏｓ２。超解像画像は１００００枚の画像から再構成した。アクチンフィラメントはＰＡＬＭによって良好に解像されている。（Ｇ）ＳｅｅＤＢ２について試験した種々の顕微鏡の有用性。スケールバーは、（Ａ）、（Ｂ）においては１μｍ、（Ｄ、左）においては５μｍ、（Ｅ、右）においては２００ｎｍ、（Ｃ）、（Ｆ、左）においては１０μｍ、（Ｆ、右）においては１μｍを表す。ＳｅｅＤＢ２Ｓによるニューロンのトレーシングの向上した性能を示す図である。（Ａ）Ａｉｒｙｓｃａｎ超解像顕微鏡でイメージングした蛍光ビーズ（直径１００ｎｍ）の点拡がり関数（ＰＳＦ）解析。横方向および軸方向のＦＷＨＭを示す。それぞれｎ＝２０である。（Ｂ）二光子顕微鏡、共焦点顕微鏡、およびＡｉｒｙｓｃａｎ顕微鏡を用いて得られた解像の比較（Ｔｈｙ１−ＹＦＰ−Ｈ、大脳皮質、Ｐ４８〜６４）。二光子顕微鏡で見られた“短くて太い”スパインは、Ａｉｒｙｓｃａｎでは“短くて太い”ものではなかった（左の２つの矢印）。Ａｉｒｙｓｃａｎで検出されたいくつかのスパインは、二光子顕微鏡で見られなかった（右の２つの矢印）。（Ｃ）ＰＢＳ、ＰｒｏＬｏｎｇＧｏｌｄおよびＳｅｅＤＢ２Ｓ中の成体Ｔｈｙ１−ＹＦＰ−Ｈマウスの（Ｐ１８１）の脳切片を、Ａｉｒｙｓｃａｎ超解像顕微鏡でイメージングした。樹状突起のｘ−ｙおよびｘ−ｚ投影画像を示す。ＳｅｅＤＢ２Ｓによって軸方向の解像がかなり向上している。（Ｄ）脳梁における高密度に標識された軸索のトレーシング（Ａｉｒｙｓｃａｎ）。子宮内エレクトロポレーションを用いて、Ｌａｙｅｒ２／３錐体ニューロンをｔｄＴｏｍａｔｏで標識した。交点のｘ−ｚ断面を下のボックスに示している。軸索シグナルの軸方向ＦＷＨＭは、平均±ＳＥＭである。Ｄは背側、Ｖは腹側、Ｌは外側、Ｍは内側を表す。（Ｅ）嗅覚ニューロンの軸索のトレーシングおよび定量（Ａｉｒｙｓｃａｎ）。軸索の直径データは平均±標準偏差である。背側嗅覚上皮および軸索束を、トランスジェニックＭＯＲ２９Ｂ−ＩＲＥＳ−ＥＹＦＰマウスから切り分け、ＳｅｅＤＢ２Ｓで透明化した。全ての標識した軸索を右側に再構成した。スケールバーは、（Ａ）においては２００ｎｍ、（Ｂ）においては５μｍ、（Ｃ）においては１０μｍ、（Ｄ、左）においては１００μｍ、（Ｄ、中央、右）においては２μｍ、（Ｅ、左）においては１μｍ、（Ｅ、右）においては１０μｍを表す。超解像顕微鏡を用いた、野生型ニューロンおよびＮＭＤＡＲ欠損ニューロンにおける興奮性シナプスおよび抑制性シナプスの３次元的定量解析を示す図である。（Ａ、Ｂ）子宮内エレクトロポレーションを用いて、Ｌ５ニューロンを細胞質ｔｄＴｏｍａｔｏおよびＥＹＦＰ−ゲフィリンで標識し、Ｐ２２において分析した（Ａｉｒｙｓｃａｎ）。Ｌ５錐体ニューロンの尖端樹状突起の基部の幹から伸びている、分岐のない斜めの樹状突起（１００〜２００μｍ長）を分析した。代表的な超解像画像をＶＡＳＴＬｉｔｅを用いて再構築し、ＰａｒａＶｉｅｗを用いて可視化した（解析の流れについては図１３を参照）。樹状突起スパインの微細構造ははっきりと解像され、樹状突起の軸とスパインとのゲフィリンの斑点は明瞭に画定される。野生型ニューロン（Ａ）およびＮＲ−１欠損ニューロン（Ｂ）の両方を解析した。（Ｃ）スパイン頭部のサイズに基づく３つのタイプのスパイン（ｆｉｌｏｐｏｄｉａ、ｔｈｉｎ、ｍｕｓｈｒｏｏｍ）の定義。（Ｄ）野生型およびＮＭＤＡＲ欠損ニューロンのスパイン頭部の密度の定量、（Ｅ）スパインの長さ、（Ｅ）スパインの直径。（Ｇ）野生型およびＮＭＤＡＲ欠損ニューロンにおけるＥＹＦＰ−ゲフィリンの斑点の密度。（Ｈ）ゲフィリン陽性のスパイン頭部のサイズ。（Ｉ）樹状突起スパインにおけるゲフィリンの斑点のサイズ。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（マン―ホイットニーＵ検定）。（Ｄ）および（Ｅ）においてＮ＝５０３および１０６８スパイン。（Ｆ）および（Ｇ)においてＮ＝５（野生型）および８（欠損型）樹状突起。（Ｈ）および（Ｉ）においてＮ＝２２（野生型）および９７（欠損型）スパイン。データは平均±ＳＥＭ。スケールバーは２μｍを表す。超解像コネクトミクスのための透明化および解析の流れを示す図である。（Ａ）透明化プロトコルの概略図。（Ｂ）マウス脳切片のためのマウント手順。（Ｃ）神経回路の解析のためのイメージング、再構成、および定量の流れ。

本願発明者らは鋭意検討を行った結果、界面活性剤と非イオン性有機ヨウ素化合物とを含む溶液を用いることによって、生物材料を透明化することができること、またその際に生物材料の形態が良く保たれていること、および蛍光物質の蛍光強度が保たれていること等を見出した。さらに、非イオン性有機ヨウ素化合物を含む溶液を顕微鏡のマウント剤として用いることによって、そのような状態を保ちつつ顕微鏡によって深部まで超解像イメージングすることができること等も見出した。これらの発見によって本発明に想到するに至った。

〔１．生物材料の透明化方法〕
（概要）
本発明に係る生物材料の透明化方法は、界面活性剤と非イオン性有機ヨウ素化合物とを含む溶液（以下、「透明化試薬Ａ」とする）に生物材料を浸漬して、当該生物材料を透明化する工程（以下、「透明化工程Ａ」とする）を含む。本発明に係る生物材料の透明化方法は、透明化された生物材料を、非イオン性有機ヨウ素化合物を含み屈折率が１．４８超である溶液（以下、「マウント剤」とする）に浸漬した状態で、顕微鏡によって観察する工程（以下、「観察工程Ａ」とする）をさらに含んでいてもよい。また、本発明に係る生物材料の透明化方法は、透明化工程Ａの前に、生物材料を、界面活性剤と透明化試薬Ａよりも低い濃度の非イオン性有機ヨウ素化合物とを含む１以上の溶液（以下、「透明化試薬Ｂ」とする）に浸漬して、当該生物材料を透明化する工程（以下、「透明化工程Ｂ」とする）をさらに含むことが好ましい場合がある。透明化工程Ｂにおいて、界面活性剤と透明化試薬Ａよりも低い濃度の非イオン性有機ヨウ素化合物とを含む溶液を２以上使用する場合は、非イオン性有機ヨウ素化合物の濃度が低いものから順に生物材料の浸漬に供することが好ましい。

（透明化試薬）
透明化試薬Ａおよび透明化試薬Ｂをまとめて「透明化試薬」と称して以下に説明する。

透明化試薬は、界面活性剤と非イオン性有機ヨウ素化合物とを含む溶液である。

界面活性剤としては、例えば、サポニン、Triton X-100（登録商標）、およびNonidet P-40（商品名）等が挙げられる。界面活性剤は、透明化の効果の高さ、生物材料の変形の低減および蛍光物質（蛍光タンパク質または蛍光性化学物質）の蛍光喪失の低減などの観点から、サポニン、Triton X-100およびNonidet P-40からなる群より選択される少なくとも一種であることが好ましく、サポニンまたはTriton X-100からなる群より選択される少なくとも一種であることがより好ましく、透明化の効果の高さおよび蛍光物質の蛍光喪失の低減の観点からサポニンであることがさらに好ましい。また、界面活性剤は、Tween20ではないことが好ましい。また、界面活性剤は、SDSではないことが好ましい。Triton X-100は、比較的小さな生物材料（例えば、ショウジョウバエの脳および培養細胞など）に特に好適に用いることができる。サポニンは、トリテルペンまたはステロイドの配糖体である。本発明の透明化試薬において、サポニンの種類は特に限定されないが、例えば、キラヤ科由来サポニン、大豆由来サポニン、カラヤガム由来サポニンおよびジギタリス由来サポニン（ジギトニン）等が挙げられ、好適な一例として、カラヤ科のQuillaja sapponaria由来サポニンが挙げられる。

非イオン性有機ヨウ素化合物としては、例えば、トリヨードベンゼン環を有するモノマー型の非イオン性有機ヨウ素化合物およびダイマー型の非イオン性有機ヨウ素化合物等が挙げられ、モノマー型の非イオン性有機ヨウ素化合物が好ましい。また、非イオン性有機ヨウ素化合物としてより具体的には、イオヘキソール、イオパミドール、イオペントール、イオビトリオール、イオプロミド、イオメプロール、イオベルソールおよびイオキシラン等のモノマー型の非イオン性トリヨードベンゼン化合物；ならびにイオトロランおよびイオジキサノール等のダイマー型の非イオン性トリヨードベンゼン化合物等が挙げられる。非イオン性有機ヨウ素化合物は、透明化の効果の高さおよび粘稠度の低さの観点から、モノマー型の非イオン性トリヨードベンゼン化合物が好ましく、中でも、イオヘキソールは安価で入手し易すいためより好ましい。

溶媒の種類は、非イオン性有機ヨウ素化合物が可溶な限り特に限定されないが、水を主溶媒として用いることが好ましく、水のみを溶媒として用いることが特に好ましい。透明化試薬Ａは水溶液であることが好ましく、また、必要に応じて用いる透明化試薬Ｂも水溶液であることが好ましい。透明化試薬Ａおよび、必要に応じて用いる透明化試薬Ｂの何れもが水溶液であることがより好ましい。なお、本発明において、「水を主溶媒として用いる」とは、使用される全溶媒に占める水の体積の割合が他の溶媒と比較して最も多いことを指し、好ましくは使用される全溶媒の体積の合計の５０％を超え１００％以下の量の水を用いることを指す。また、本発明において、「水溶液」とは、水を主溶媒として用いた溶液を指す。

溶媒として水を用いる主な利点は、以下のとおりである。１）有機溶剤を主溶媒として用いる場合と比較して、処理時に処理対象となる生物材料の脱水を伴わない。そのため、生物材料が収縮するという問題を抑制可能となる。２）有機溶剤を主溶媒として用いる場合と比較して、蛍光タンパク質に損傷を与える可能性が著しく低減される。そのため、処理を受けた生物材料を、蛍光タンパク質を用いて観察可能となる。３）固定化された材料に限定されず、生材料にも適用可能となる。４）後述するように透明化処理が可逆的となり、透明化処理後の生物材料を必要に応じて透明化処理前の状態に戻すことができる。５）有機溶剤を主溶媒として用いる場合と比較して、取り扱いの安全性がより高くなる。

透明化試薬は、対象となる生物材料に好適なｐＨの維持が可能な緩衝液を含んでいてもよい。緩衝液としては、例えば、トリス（Ｔｒｉｓ）、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（トリスとエチレンジアミン四酢酸とからなる緩衝液）、およびトリス緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）などのトリスバッファー（すなわち、トリス（トリス（ヒドキシメチル）アミノメタン）を含有し塩酸などの酸でｐＨ調整された緩衝液）；リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、およびハンクス液（ＨＢＳＳ）などのリン酸バッファー（すなわち、リン酸塩を含む緩衝液）；ならびにＨＥＰＥＳ（ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸）等が挙げられる。緩衝液は、中でも、トリスバッファーが好ましい。トリスバッファーに含まれるトリスの濃度は、例えば２〜４０ｍＭ、好ましくは５〜２０ｍＭ、より好ましくは約１０ｍＭであり得る。生物材料の透明度を保持する観点から緩衝液の塩濃度は低いことが好ましい。透明化試薬が緩衝作用を有することによって、脆弱な生物材料の破壊および蛍光物質の蛍光減弱をより防ぐことができる。また、緩衝液を含有する場合、より効果的に透明化の状態を維持することができる。緩衝液のｐＨは、生物材料の種類または目的に応じて適宜設定すればよいが、例えば、７〜８であることが好ましく、７．４〜７．６であることがより好ましい。なお、緩衝液は水溶液であり得、透明化試薬は水溶液であり得る。

透明化試薬は、必要に応じて、添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、アジ化ナトリウムなどの防腐剤、ＤＡＢＣＯなどの蛍光褪色防止剤、核染色のためのＤＡＰＩ、およびサンプルの形態保持のための低融点アガロース等が挙げられる。

２，２’−チオジエタノール（ＴＤＥ）は蛍光を消失させる作用がある。したがって、一実施形態において、透明化試薬はＴＤＥを含まない。

（透明化工程Ａ）
透明化工程Ａは、透明化試薬Ａに生物材料を浸漬して、当該生物材料を透明化する工程である。より具体的には、例えば、透明化処理用の容器内において、透明化試薬Ａに生物材料を浸漬する。

透明化工程Ａにおいて、生物材料は透明化する。ここで、「透明化」とは、本発明に係る生物材料の透明化方法（あるいは透明化工程）を適用する前の生物材料と比較して透明になることを指し、好ましくは本発明に係る生物材料の透明化方法（あるいは透明化工程）を適用する前の生物材料と比較して、４００〜１３００μｍの波長の光がより透過できるようになることを指す。

透明化試薬Ａに含まれる界面活性剤の濃度は特に限定されないが、生物材料が比較的厚いもの（例えば、マウスの胎児およびマウスの脳など）である場合、０．０１％（ｗ／ｖ）〜２０％（ｗ／ｖ）の範囲内であることが好ましく、０．５％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）の範囲内であることがより好ましく、２％（ｗ／ｖ）であることがさらに好ましい。生物材料が比較的薄いもの（例えば、培養細胞など）である場合、これよりも低い濃度とすることが好ましい。

透明化試薬Ａに含まれる非イオン性有機ヨウ素化合物の濃度は特に限定されず、顕微鏡観察において用いるイマージョン液の屈折率に近い屈折率が得られる濃度であることが好ましく、当該イマージョン液の屈折率と同じ屈折率が得られる濃度であることがより好ましい。透明化試薬Ａの屈折率は、例えば、１．４６以上、１．４８超、１．４９以上、１．５０以上、または１．５１以上であり、また、１．７０以下、１．６５以下、１．６０以下、１．５５以下、１．５４以下、１、５３以下、または１．５２以下である。より好ましい一例では、透明化試薬Ａの屈折率は約１．４６または約１．５１８であり、さらに好ましい一例では、透明化試薬Ａの屈折率は約１．５１８である。例えば、顕微鏡観察において屈折率１．５１８のイマージョン液（イマージョンオイル）を用いる場合、非イオン性有機ヨウ素化合物（特にはイオヘキソール）の濃度は、３０％（ｗ／ｗ）〜９０％（ｗ／ｗ）の範囲内であることが好ましく、４０％（ｗ／ｗ）〜８０％（ｗ／ｗ）の範囲内であることがより好ましく、７０．４％（ｗ／ｗ）であることがさらに好ましい。なお、所望の屈折率を有する透明化試薬Ａにおける非イオン性有機ヨウ素化合物の濃度は、例えば、図６のＣを参考に算出することができる。

なお、単位「％（ｗ／ｖ）」とは、溶液（透明化試薬等）の体積（ｖ（ミリリットル））に対する、溶質（界面活性剤あるいは非イオン性有機ヨウ素化合物等）の重量（ｗ（グラム））の百分率である。また、単位「％（ｗ／ｗ）」とは、溶液の重量（ｗ（グラム））に対する、溶質の重量（ｗ（グラム））の百分率である。

透明化工程Ａを行う際の温度は、特に限定されないが、微細な形態および蛍光色素を保持する観点から０℃以上で５０℃以下の範囲内であることが好ましい。透明化工程Ａを行う時間は、特に限定されず、生物材料の種類または厚さによって適宜設定すればよいが、例えば、１時間以上で９０日以内の範囲内であることが好ましく、２時間以上で１０日以内の範囲内であることがより好ましい。透明化工程Ａを行う圧力は特に限定されず、生物材料の由来または目的に応じて適宜設定すればよいが、例えば、常圧とすることができる。

（透明化工程Ｂ）
必要に応じて行われる透明化工程Ｂは、透明化工程Ａの前に、生物材料を、１以上の透明化試薬Ｂに浸漬して、生物材料を透明化する工程である。透明化工程Ｂにおいて、透明化試薬Ｂを２以上使用する場合は、非イオン性有機ヨウ素化合物の濃度が低いものから順に生物材料の浸漬に供することが好ましい。より具体的には、例えば、透明化処理用の容器内で、上記生物材料に対して１以上の透明化試薬Ｂを、非イオン性有機ヨウ素化合物の濃度が低いものから順に浸漬に供する。

透明化工程Ｂにおいて、生物材料は透明化する。ただし、透明化工程Ａよりも、達成される透明度は低い。非イオン性有機ヨウ素化合物の濃度が高くなるにつれて、透明度は高くなる。すなわち、透明化工程Ｂを行う場合、透明化工程Ｂから透明化工程Ａへと徐々に非イオン性有機ヨウ素化合物の濃度を高くすることで、生物材料の透明度を徐々に高くする。透明化工程Ｂを透明化工程Ａの前に行うことによって、非イオン性有機ヨウ素化合物の濃度の急激な上昇を抑えることができるため、生物材料へのダメージをより抑えることができる。

各透明化試薬Ｂに含まれる非イオン性有機ヨウ素化合物の濃度は、透明化試薬Ａに含まれる非イオン性有機ヨウ素化合物の濃度より低い限り特に限定されない。一実施形態において、互いに濃度が異なる２以上の透明化試薬Ｂを用いることが好ましく、互いに濃度が異なる３以上の透明化試薬Ｂを用いることがより好ましい。濃度をより細かく段階的に上げていくことによって、生物材料へのダメージをさらに抑えることができるからである。

顕微鏡観察において屈折率１．５１８のイマージョンオイルを用いる場合、例えば、透明化試薬Ｂとして、非イオン性有機ヨウ素化合物（特にはイオヘキソール）が１８．７％（ｗ／ｗ）、２８．１％（ｗ／ｗ）および５６．２％（ｗ／ｗ）の３つの溶液を用いることができる。この場合、続く透明化工程Ａでは、透明化試薬Ａとして、非イオン性有機ヨウ素化合物（特にはイオヘキソール）が７０．４％（ｗ／ｗ）の溶液を用いることが好ましい。

また、各透明化試薬Ｂに含まれる非イオン性有機ヨウ素化合物の種類は、屈折率の均一性を保持する観点から、透明化試薬Ａと同じものとすることが好ましい。

各透明化試薬Ｂに含まれる界面活性剤の種類および濃度、緩衝液の種類および濃度、ならびに透明化工程Ｂを行う際の温度の説明は、透明化工程Ａについての説明と同様である。各透明化試薬Ｂに含まれる界面活性剤の種類および濃度、緩衝液の種類および濃度、ならびに透明化工程Ｂを行う際の温度は、透明化試薬Ａおよび透明化工程Ａと同じであることが好ましい。また、透明化試薬Ｂが２つ以上ある場合、各濃度の透明化試薬Ｂにおける処理時間は特に限定されない。一例として、非イオン性有機ヨウ素化合物が１８．７％（ｗ／ｗ）の透明化試薬Ｂで６〜１０時間、２８．１％（ｗ／ｗ）の透明化試薬Ｂで６〜１０時間、および５６．２％（ｗ／ｗ）の透明化試薬Ｂで８〜１２時間処理することができる。透明化工程Ｂを行う圧力は特に限定されず、生物材料の由来または目的に応じて適宜設定すればよいが、例えば、常圧とすることができる。

透明化工程Ａおよび透明化工程Ｂにおいて、透明化処理用の容器内に「透明化試薬」と「生物材料」とを格納する順序は特に限定されない。透明化工程Ａおよび透明化工程Ｂを同一の容器内で連続的に行う場合の一例では、まず非イオン性有機ヨウ素化合物の濃度が最も低い「透明化試薬Ｂ」を容器内に格納し、次いで「生物材料」を格納する。次いで、濃度が最も低い透明化試薬Ｂを廃棄し、非イオン性有機ヨウ素化合物の濃度が２番目に低い透明化試薬Ｂを容器へ格納する。次いで、濃度が２番目に低い透明化試薬Ｂを廃棄し、非イオン性有機ヨウ素化合物の濃度が３番目に低い透明化試薬Ｂを容器へ格納する。これを繰り返して、非イオン性有機ヨウ素化合物の濃度が最も高い透明化試薬Ｂを容器へ格納し、廃棄する。最後に、透明化試薬Ａ（濃度が最も高い透明化試薬Ｂよりも濃度が高い）を容器へ格納し、廃棄する。透明化試薬の浸透性を高めるために生物材料を格納容器ごとシェーカーまたはローテータなどで混和してもよい。また、必要に応じて、濃度の異なる透明化試薬に変える間に、容器および／または生物材料を洗浄処理等する工程を設けてもよい。

上記の各透明化工程で用いた、透明化処理された生物材料を格納した処理容器は、後述する観察工程に供されるまで、例えば、室温または低温環境下で保存してもよい（透明化試料保存工程）。当該処理容器では、生物材料が透明化試薬Ａまたは透明化試薬Ｂに浸漬された状態であり得る。

（マウント剤）
マウント剤は、非イオン性有機ヨウ素化合物を含み屈折率が１．４８超である溶液である。

マウント剤に含まれる非イオン性有機ヨウ素化合物の種類の説明は、（透明化試薬）の項と同様である。マウント剤に含まれる非イオン性有機ヨウ素化合物の種類は、屈折率の均一性を保持する観点から、透明化試薬Ａと同じものとすることが好ましい。

マウント剤に含まれる非イオン性有機ヨウ素化合物の濃度は特に限定されず、顕微鏡観察において用いるイマージョン液の屈折率に近い屈折率が得られる濃度であることが好ましく、当該イマージョン液の屈折率と同じ屈折率が得られる濃度であることがより好ましい。例えば、顕微鏡観察において屈折率１．５１８のイマージョンオイルを用いる場合、非イオン性有機ヨウ素化合物（特にはイオヘキソール）の濃度は、３０％（ｗ／ｗ）〜９０％（ｗ／ｗ）の範囲内であることが好ましく、４０％（ｗ／ｗ）〜８０％（ｗ／ｗ）の範囲内であることがより好ましく、７０．４％（ｗ／ｗ）であることがさらに好ましい。なお、所望の屈折率を有するマウント剤における非イオン性有機ヨウ素化合物の濃度は、例えば、図６のＣを参考に算出することができる。

溶媒の種類は、非イオン性有機ヨウ素化合物が可溶な限り特に限定されないが、水を主溶媒として用いることが好ましく、水のみを溶媒として用いることが特に好ましい。溶媒として水を用いる主な利点は、上述のとおりである。

マウント剤は、対象となる生物材料に好適なｐＨの維持が可能な緩衝液を含んでいてもよい。緩衝液の説明は、（透明化試薬）の項と同様である。なお、緩衝液は水溶液であり得、マウント剤は水溶液であり得る。特に、高濃度の非イオン性有機ヨウ素化合物を使用する場合、マウント剤に含まれる緩衝液は、透明度の保持のために、透明化試薬Ａの緩衝液と同じものとすることが好ましい。

マウント剤は、必要に応じて、添加剤を含んでいてもよい。添加剤は、例えば、長期保存、褪色防止、核染色、またはサンプルの形態保持等の目的で添加されている。添加剤としては、例えば、アジ化ナトリウム、低融点アガロース、褪色防止剤、およびＤＡＰＩ等が挙げられる。添加剤の濃度は特に限定されず、目的に応じて適宜設定すればよいが、例えば、０．１％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）とすることができる。

また、マウント剤は、上記で挙げたような界面活性剤を含んでいてもよいが、界面活性剤を含まなくてもよい。すなわち、マウント剤は、非イオン性有機ヨウ素化合物を含み界面活性剤を含まない溶液であってもよい。界面活性剤を含まない場合、泡立ちを抑えることができるという利点を有する。

マウント剤の屈折率は、顕微鏡観察に用いるイマージョン液の屈折率に近いほど、より好ましい。マウント剤の屈折率は、非イオン性有機ヨウ素化合物自体の屈折率およびその濃度に依存する。マウント剤の屈折率は、例えば、１．４８超、１．４９以上、１．５０以上、または１．５１以上であり、かつ、１．７０以下、１．６５以下、１．６０以下、１．５５以下、１．５４以下、１、５３以下、または１．５２以下である。より好ましくは、マウント剤の屈折率は約１．５１８である。特に、高濃度の非イオン性有機ヨウ素化合物を使用する場合、マウント剤に含まれる非イオン性有機ヨウ素化合物の濃度は、透明度の保持のために、透明化試薬Ａに含まれる非イオン性有機ヨウ素化合物の濃度と実質的に同じであることが好ましい。

２，２’−チオジエタノール（ＴＤＥ）は蛍光を消失させる作用がある。したがって、一実施形態において、マウント剤はＴＤＥを含まない。

（観察工程Ａ）
観察工程Ａは、透明化された生物材料を、マウント剤に浸漬した状態で、顕微鏡によって観察する工程である。観察工程Ａは、透明化工程Ａよりも後に行われる。より具体的には、例えば、透明化工程Ａの後の生物材料を容器内においてマウント剤に浸漬して穏やかに転倒混和によって平衡化し、次いで新たな容器内において当該生物材料をマウント剤に浸漬して平衡化し、マウント剤に浸漬した状態でカバーガラスで封入して、顕微鏡観察を行う。

顕微鏡の種類は特に限定されないが、例えば、共焦点レーザー顕微鏡、光シート顕微鏡、多光子励起顕微鏡（一般的には２光子励起型）、ＳＴＥＤ顕微鏡、ＲＥＳＯＬＦＴ顕微鏡、ＳＩＭ顕微鏡、ＰＡＬＭ／ＳＴＯＲＭ顕微鏡、ベッセルビーム顕微鏡、および光格子シート顕微鏡等の光学顕微鏡、ならびに画像処理（デコンボリューション）を組み合わせた高解像画像取得等が挙げられる。また、油浸レンズ（または油浸対物レンズ）を用いた顕微鏡を使用することができる。本発明に係る透明化方法では、マウント剤の屈折率を１．５１８に調整することができ、かつ、蛍光タンパク質および蛍光性化学物質の褪色ならびに生物材料の微細な形態の変化を抑制することができるため、特に、近年開発が進んでいる、屈折率１．５１８のイマージョンオイルを用いる高解像イメージングあるいは超解像顕微鏡での観察にも好適に適用することができる。高解像イメージングとは、ＮＡの高い（１以上）油浸レンズを用いたイメージングを指し、光の回折限界に近い、高い分解能を得られる。超解像顕微鏡とは、光学顕微鏡の理論限界値（平面方向約２００ｎｍ）を超えた分解能での観察が可能な顕微鏡を指す。超解像顕微鏡としては、ＳＴＥＤ顕微鏡、ＳＩＭ顕微鏡、ＰＡＬＭ／ＳＴＯＲＭ顕微鏡、およびＡｉｒｙｓｃａｎ顕微鏡等が挙げられる。

顕微鏡観察する際の温度は、特に限定されないが、透明化工程Ａについて上述したのと同様の温度とすることができる。

（前処理工程）
本発明に係る生物材料の透明化方法の一実施形態では、透明化に先立って、界面活性剤を含み非イオン性有機ヨウ素化合物を含まない溶液（以下、「前処理溶液」とする）に上記生物材料を浸漬する工程（以下、「前処理工程」とする）をさらに含んでいてもよい。前処理工程は、透明化工程Ｂを行う場合には透明化工程Ｂの前に、透明化工程Ｂを行わない場合には透明化工程Ａの前に行う。

前処理工程を行うことによって、抗体染色およびin situハイブリダイゼーションなどの組織染色を行えるという利点がある。なお、前処理工程では、生物材料は透明化されない。

前処理溶液に含まれる界面活性剤の種類および濃度の説明は、透明化試薬Ａについての説明と同様である。前処理溶液に含まれる界面活性剤の種類および濃度は、透明化試薬Ａと同じであることが好ましい。

前処理溶液の溶媒の種類は、特に限定されないが、水を主溶媒として用いることが好ましく、水のみを溶媒として用いることが特に好ましい。

前処理溶液は、対象となる生物材料に好適なｐＨの維持が可能な緩衝液を含んでいてもよい。緩衝液としては、（透明化試薬）の項で列挙した緩衝液が挙げられる。緩衝液は、中でも、タンパク質の性状保持の観点から、ＰＢＳが好ましい。緩衝液のｐＨは、生物材料の種類または目的に応じて適宜設定すればよいが、例えば、３〜１１であることが好ましく、７〜８であることがより好ましい。なお、緩衝液は水溶液であり得、前処理溶液は水溶液であり得る。

前処理工程を行う際の温度は、特に限定されないが、組織形態保持の観点から０℃以上で５０℃以下の範囲内であることが好ましい。前処理工程を行う時間は、特に限定されず、生物材料の種類または厚さによって適宜設定すればよいが、例えば、１時間以上で３０日以内の範囲内であることが好ましく、２時間以上で１日以内の範囲内であることがより好ましい。前処理工程を行う圧力は特に限定されず、生物材料の由来または目的に応じて適宜設定すればよいが、例えば、常圧とすることができる。

前処理工程は、例えば、上述した透明化処理用の容器内で行うことができる。

（可視化処理工程）
観察工程Ａに供される生物材料は、必要に応じて、透明化工程Ａもしくは透明化工程Ｂ前に、または透明化工程Ａ後で観察工程前に、染色またはマーキング等の可視化処理工程が施されてもよい。

例えば、可視化処理工程に蛍光タンパク質を用いる場合には、透明化工程Ａもしくは透明化工程Ｂの前に、生きた生物材料に対して蛍光タンパク質遺伝子を導入して、蛍光タンパク質を発現させる。蛍光タンパク質としては、例えば、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＧＦＰ、およびtdTomato等が挙げられる。

また、可視化処理工程として、蛍光性化学物質（蛍光タンパク質は除く）の生物材料への注入、または蛍光性化学物質を用いた生物材料の染色を行う場合には、透明化工程Ａもしくは透明化工程Ｂの前に行うことが好ましいが、透明化工程Ａの後に行うこともできる。さらに、可視化処理工程として、蛍光性化学物質以外の化学物質を用いた染色を行うこともできる。

本発明に係る透明化方法によれば、深部においても染色またはマーキング等の褪色が低減される。そのため、より明瞭に生物材料に施された染色またはマーキング等を観察することができる。特に、本発明に係る透明化方法では分解能の低下が生じにくく、より深部のイメージングが可能であるため、生物材料の深部における染色またはマーキング等の観察が可能となる。一実施形態では、今までにはない深部での高分解能蛍光イメージングが可能である。

（その他の工程）
本発明に係る透明化方法の一実施形態では、上述の工程以外の工程をさらに含んでいてもよい。それ以外の工程としては、例えば、組織染色の効率を高める目的または脂質を除去する目的等で以下のような一般的な処理を行う工程が挙げられる。
１）エタノールやメタノール処理およびこれらと有機溶媒を組み合わせた処理（例えば、５０％メタノール、８０％メタノール、または１００％メタノールで処理）、
２）組織の凍結融解処理（例えば、液体窒素で凍結したのち融解を３回繰り返す）、または、
３）組織の熱処理（例えば、クエン酸緩衝液中で１２０℃１５分間処理する）
このような工程を行うタイミングは、適宜設定することができる。

本発明に係る透明化方法の一実施形態では、観察工程Ａに代わりに、透明化された生物材料を、非イオン性有機ヨウ素化合物を含み屈折率が１．４８以下である溶液に浸漬した状態で、顕微鏡によって観察する観察工程（観察工程Ａ’）を行ってもよい。当該溶液の説明は、屈折率に関連する箇所を除き、上述のマウント剤の説明と基本的に同じである。一例において、当該溶液の屈折率は１．４６である。この場合、透明化試薬Ａにおける非イオン性有機ヨウ素化合物（特にはイオヘキソール）の濃度は５６．２％（ｗ／ｗ）であることが好ましく、透明化試薬Ｂを用いる場合には、非イオン性有機ヨウ素化合物（特にはイオヘキソール）の濃度が１８．７％（ｗ／ｗ）および２８．１％（ｗ／ｗ）の２つの溶液を用いることが好ましい。

（対象となる生物材料）
本発明に係る透明化方法の対象となる生物材料の種類は特に限定されないが、生物材料の由来は、植物または動物であることが好ましく、魚類、両生類、爬虫類、鳥類または哺乳類（哺乳動物）等の動物であることがより好ましく、哺乳動物であることが特に好ましい。哺乳動物の種類は特に限定されないが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒトを除く霊長類等の実験動物；イヌ、ネコ等の愛玩動物（ペット）；ウシ、ウマ、ブタ等の家畜；ヒト；が挙げられる。

また、生物材料は、個体そのものであってもよいし（生きているヒト個体そのものは除く）、多細胞生物（ヒトであってもよい）の個体から取得された或いは人工的に培養された、器官、組織、または細胞であってもよい。例えば、疾患の診断のためにヒトまたはそれ以外の動物由来の病理サンプルを生物材料とすることができる。病理サンプルは、器官、組織、または細胞であり得る。また、ｉＰＳ細胞およびＥＳ細胞などの多能性細胞、ならびに多能性細胞から分化させた細胞および組織を生物材料として使用することもできる。本発明で用いる透明化試薬は優れた透明化処理能力を有するため、さらには、本発明のマウント剤はより深部のイメージングを可能とするため、生物材料が、多細胞動物由来の組織もしくは器官（例えば、脳全体または脳の一部）、またはヒトを除く多細胞動物の個体（例えば、胚等）そのものであっても、適用することが可能である。また、生物材料は脂質が除去されていないものであり得る。

本発明で用いる透明化試薬およびマウント剤は、生物材料の膨潤および収縮がほとんどなく（実施例も参照）、生物材料の変形を抑制する効果が極めて大きいため、脆弱な生物材料の透明化に特に好適である。ここで脆弱な生物材料としては、例えば、新生児マウスの脳、多細胞動物由来の組織の切片、発生初期段階の動物胚、ゼブラフィッシュなど小型魚類の脳、ショウジョウバエ等の無脊椎動物の脳、および卵母細胞等が挙げられる。

また、本発明で用いる透明化試薬およびマウント剤は、生物材料における微細な構造が破壊される虞が少なく、アーチファクトの可能性が抑えられる。そのため、神経回路等の微細な構造をより正確に観察することができる。したがって、本発明の方法は、神経回路を含んでいる組織（脳など）を生物材料とする場合にも、好適に利用され得る。

また、上記生物材料は、上述のように、例えば、蛍光性化学物質を注入した生体組織、蛍光性化学物質で染色を行った生体組織、蛍光タンパク質を発現した細胞を移植した生体組織、または蛍光タンパク質を発現した遺伝子改変動物の生体組織等であってもよい。すなわち、上記生物材料は、蛍光タンパク質または蛍光性化学物質で標識されていてもよい。本発明に係る透明化方法では、例えば高解像顕微鏡あるいは超解像顕微鏡を用いると５０〜２００μｍ程度の深度まで超解像イメージングが可能である。この深度は現在対物レンズの作動距離によって制約されているため、将来的にはさらに深部での観察も可能になる可能性がある。生物材料が膨潤しないため、同程度の深度のイメージングが可能な従来の方法（生物材料が膨潤する）と比較して、実質的には深度が深い。そのため、より深部の蛍光の局在をイメージングすることができる。

また、生物材料は、顕微鏡観察用にパラホルムアルデヒド等で固定化（fixed）処理された材料であってもよいし、固定化処理されていない材料であってもよいが、固定化処理された材料であることが好ましい。固定化処理は、例えば、従来公知の方法で行うことができる。

生物材料の厚みは特に限定されないが、例えば、１μｍ〜１０ｍｍとすることができ、１００μｍ〜２ｍｍであることが好ましい。本発明で用いる透明化試薬およびマウント剤は、より深部のイメージングを可能とするため、０．１ｍｍ以上の厚みであっても本発明を適用し得る。

（利点）
本発明の主な利点として、以下のことが挙げられる。

１）後述の実施例で示したとおり、生物材料における微細な構造の破壊が生じる虞が少ない。２）生物材料の収縮が生じないため、従来の透明化試薬を用いた場合と比較して、透明度が高い。そのため、超深部組織に存在する種々の蛍光タンパク質および蛍光物質の観察が可能となる。また、生物材料における微細な構造の変化も生じにくい。３）生物材料の膨潤が生じないため、生物材料が破壊されにくい。そのため、脆弱な生物材料（例えば、新生児マウスの脳など）に適用することが可能となる。４）生物材料をＰＢＳ等の等張液に戻しても強度および細胞形態ともに影響を受けない。このように可逆性が高いため、透明化処理によるイメージングと組織染色とを組み合わせることが可能である。５）従来の透明化方法（例えば、CLARITY法およびCUBIC法等）よりもはるかに短い時間で生物材料を透明化し得る。６）生物材料の膨潤が生じないため、顕微鏡の対物レンズの作動距離が限られている場合に、従来の透明化試薬と比べて実質的により深くまで画像取得できる。７）様々な蛍光タンパク質および蛍光性化学物質の蛍光を保持したまま高解像イメージングすることができる。８）アクリルアミドゲル架橋および脂質除去過程など煩雑な工程を経ることなく良好な透明度を達成することができる。９）自家蛍光シグナルを産生しないため、蛍光タンパク質および蛍光性化学物質の蛍光をより正確に観察することができる。１０）本発明のマウント剤は、従来の水溶性マウント剤（ProLong GoldおよびRIMSなど）と比べると、特に、深部において明るくかつ高解像顕微鏡または超解像顕微鏡の能力を最大限に引き出すことができるため、深部イメージングの発展に対する貢献度が高い。

（その他の応用）
本発明の透明化試薬を用いた透明化処理は可逆的である。そのため、透明化処理された生物材料は、例えば、平衡塩類溶液に浸漬することによって、透明化試薬の成分を取り除き、透明化処理前の状態に戻すことが可能である。平衡塩類溶液としては、例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳなどリン酸塩によって緩衝液化された平衡塩類溶液；トリス塩酸塩によって緩衝液化された平衡塩類溶液（ＴＢＳ）；ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓＦ−１２などの細胞培養用の基礎培地；等が挙げられる。

また、本発明のマウント剤は生物材料に与えるダメージが少ない。そのため、マウントされた生物材料は、例えば、平衡塩類溶液に浸漬することによって、マウント剤の成分を取り除き、マウント前の状態に戻すことが可能である。平衡塩類溶液としては、上記のものが挙げられる。

本発明で用いる透明化試薬は、透明化処理の前後において、または、透明化処理後に透明化処理前の状態に戻す場合において、生物材料に含まれるタンパク質等の変性等を招来しない。そのため、生物材料に含まれるタンパク質等の抗原性も変化せずに保存される。その上、本発明のマウント剤は生物材料に与えるダメージが少ない。そのため、例えば、生物材料を透明化処理して顕微鏡による観察を行った後に、当該生物材料を透明化処理前の状態に戻して公知の組織染色または免疫染色の手法を用いた詳細分析を行うことも可能である。

〔２．生物材料の観察方法〕
本発明に係る生物材料の観察方法は、生物材料を、非イオン性有機ヨウ素化合物を含み屈折率が１．４８超である溶液（マウント剤）に浸漬した状態で、顕微鏡によって観察する工程（以下、「観察工程Ｂ」とする）を含む。本発明に係る生物材料の観察方法の一実施形態では、透明化処理を行うことなく観察工程Ｂを行う。別の形態では、上記〔１．生物材料の透明化方法〕の項で説明した前処理工程の後に、観察工程Ｂを行う。さらに別の実施形態では、本発明の透明化方法以外の方法で透明化処理を行った後に、観察工程Ｂを行う。あるいは、またさらに別の実施形態における生物材料は、本発明の透明化方法で透明化処理を行った生物材料であってもよい。

本発明における観察工程Ｂでは、上述のように、球面収差を減らすことができ、より深部までのイメージングが可能である。そのため、例えば、透明化が必要ではない生物材料の場合、透明化処理を行うことなく本発明の観察工程Ｂに供することで、当該生物材料の深部イメージングが可能となる。透明化が必要ではない生物材料としては、比較的薄い生物材料が挙げられ、例えば、細胞（培養細胞等）、卵母細胞（マウス等の哺乳動物の卵母細胞等）、無脊椎動物（ショウジョウバエ等）の脳、５０μｍ程度以下にスライスした動物および植物の組織、ならびに酵母および大腸菌懸濁液等が挙げられる。

また、本発明の透明化方法以外の方法で透明化処理を行った生物材料であっても、本発明の観察工程Ｂに供することで、球面収差を減らすことができ、当該生物材料の深部イメージングが可能となり得る。本発明の透明化方法以外の方法としては、例えば、非特許文献１〜４および特許文献１に記載された方法等が挙げられる。対象となる生物材料は、本発明の透明化方法以外の方法で透明化を行えるものであれば、特に制限されない。

マウント剤は、上記〔１．生物材料の透明化方法〕の項で説明したとおりである。すなわち、非イオン性有機ヨウ素化合物、溶媒、緩衝液、添加剤および屈折率などの説明は、生物材料の透明化方法において用いるマウント剤の説明と同じである。

観察工程Ｂの説明は、上記〔１．生物材料の透明化方法〕の（観察工程Ａ）の項での説明と同様である。

また、観察工程Ｂに供される生物材料は、必要に応じて、観察工程前に、染色またはマーキング等の可視化処理工程が施されてもよい。可視化処理工程は、上記〔１．生物材料の透明化方法〕の（可視化処理工程）の項で説明したとおりである。また、上記〔１．生物材料の透明化方法〕の（その他の工程）の項で説明した工程が施されてもよい。

〔３．透明化試薬〕
本発明に係る透明化試薬は、生物材料用の透明化試薬であって、界面活性剤と非イオン性有機ヨウ素化合物とを含む溶液である。本発明に係る透明化試薬としては、上述の透明化試薬Ａおよび透明化試薬Ｂが挙げられる。これらの透明化試薬については、上記〔１．生物材料の透明化方法〕の項で説明したとおりである。

本発明に係る透明化試薬は、上述の「生物材料の透明化方法」に好適に用いることができる。

〔４．マウント剤〕
本発明に係るマウント剤は、生物材料を顕微鏡によって観察する際に用いるマウント剤であって、非イオン性有機ヨウ素化合物を含み屈折率が１．４８超である溶液である。本発明に係るマウント剤としては、上述のマウント剤が挙げられる。当該マウント剤については、上記〔１．生物材料の透明化方法〕の項で説明したとおりである。

本発明に係るマウント剤は、上述の「生物材料の透明化方法」および「生物材料の観察方法」に好適に用いることができる。

〔５．生物材料の観察用キット〕
本発明に係る生物材料の観察用キットは、生物材料を透明化して顕微鏡によって観察するために用いるキットであって、界面活性剤と非イオン性有機ヨウ素化合物とを含む第一の溶液（透明化試薬Ａ）と、非イオン性有機ヨウ素化合物を含み屈折率が１．４８超である第二の溶液（マウント剤）とを備える。本発明に係る生物材料の観察用キットは、界面活性剤と透明化試薬Ａよりも低い濃度の非イオン性有機ヨウ素化合物とを含む１以上の溶液（透明化試薬Ｂ）をさらに備えることが好ましい場合がある。透明化試薬Ａ、マウント剤および透明化試薬Ｂは、〔１．生物材料の透明化方法〕の項での説明したとおりである。

また、本発明に係る生物材料の観察用キットは、「キットの取扱説明書」をさらに備えることが好ましい。「キットの取扱説明書」には、例えば、上記〔１．生物材料の透明化方法〕で記載したような、透明化試薬Ａ、より好ましくはさらに透明化試薬Ｂを用いる生物材料の透明化工程、および、マウント剤を用いる生物材料の観察工程の手順等が記録されている。

さらに、本発明に係る生物材料の観察用キットは、生物材料の透明化および観察に必要な道具または試薬等をさらに備えていてもよく、例えば、上述の透明化工程で用いる処理容器、生物材料把持器具（ピンセット等）、上述の前処理溶液、スライドガラス、カバーガラス、イマージョン液、および観察後の生物材料を透明化処理前の状態に戻す平衡塩類溶液から選択される少なくとも１つを備えていてもよい。

本発明に係る生物材料の観察用キットは、上述の「生物材料の観察方法」に好適に用いられる。

〔６．生物材料の透明化用キット〕
本発明に係る生物材料の透明化用キットは、生物材料を透明化するためのキットであって、界面活性剤と非イオン性有機ヨウ素化合物とを含む溶液（透明化試薬Ａ）を備える。本発明に係る生物材料の透明化用キットは、界面活性剤と透明化試薬Ａよりも低い濃度の非イオン性有機ヨウ素化合物とを含む１以上の溶液（透明化試薬Ｂ）をさらに備えることが好ましい場合がある。透明化試薬Ａおよび透明化試薬Ｂは、〔１．生物材料の透明化方法〕の項での説明したとおりである。

また、本発明に係る生物材料の透明化用キットは、「キットの取扱説明書」をさらに備えることが好ましい。「キットの取扱説明書」には、例えば、上記〔１．生物材料の透明化方法〕の項で記載したような、透明化試薬Ａ、より好ましくはさらに透明化試薬Ｂを用いる、生物材料の透明化方法の手順等が記録されている。

さらに、本発明に係る生物材料の透明化用キットは、生物材料の透明化に必要な道具または試薬等をさらに備えていてもよく、例えば、上述の透明化工程で用いる処理容器、生物材料把持器具（ピンセット等）、上述の前処理溶液、および透明化処理後の生物材料を透明化処理前の状態に戻す平衡塩類溶液から選択される少なくとも１つを備えていてもよい。

本発明に係る生物材料の透明化用キットは、上述の「生物材料の透明化方法」に好適に用いられる。

〔７．まとめ〕
本発明に係る生物材料の透明化方法は、界面活性剤と非イオン性有機ヨウ素化合物とを含む溶液に生物材料を浸漬して、当該生物材料を透明化する透明化工程Ａを含む。

本発明に係る生物材料の透明化方法は、透明化された生物材料を、非イオン性有機ヨウ素化合物を含み屈折率が１．４８超である溶液に浸漬した状態で、顕微鏡によって観察する観察工程をさらに含んでいてもよい。

本発明に係る生物材料の透明化方法は、上記透明化工程Ａの前に、上記生物材料を、界面活性剤と上記透明化工程Ａにおける溶液よりも低い濃度の非イオン性有機ヨウ素化合物とを含む１以上の溶液に浸漬して、当該生物材料を透明化する透明化工程Ｂをさらに含んでいてもよく、ここで、界面活性剤と上記透明化工程Ａにおける溶液よりも低い濃度の非イオン性有機ヨウ素化合物とを含む溶液を２以上使用する場合は、非イオン性有機ヨウ素化合物の濃度が低いものから順に上記生物材料の浸漬に供する。

本発明に係る生物材料の透明化方法は、透明化に先立って、界面活性剤を含み非イオン性有機ヨウ素化合物を含まない溶液に上記生物材料を浸漬する工程をさらに含んでいてもよい。

本発明に係る生物材料の観察方法は、上記観察工程の前に、界面活性剤を含み非イオン性有機ヨウ素化合物を含まない溶液に上記生物材料を浸漬する工程をさらに含んでいてもよい。

以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１５−０５５３２５号の明細書および図面に記載される内容を取り入れるものとする。さらに本明細書で引用した全ての刊行物および特許をそのまま参照として本明細書に取り入れるものとする。

〔手順〕
（試薬）
ＳｅｅＤＢ２Ｇは、オムニパーク３５０（例えば、第一三共；７５．５％（ｗ／ｖ）または５６．２％（ｗ／ｗ）のイオヘキソール，Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液に溶解）を使用して調製した。ＳｅｅＤＢ２Ｓは、１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．６）と０．２６７ｍＭのＥＤＴＡとの混合溶液に、イオヘキソール粉末（Ｈｉｓｔｏｄｅｎｚ（シグマアルドリッチ）またはＮｙｃｏｄｅｎ（Axis-shield社））を７０．４％（ｗ／ｗ）の濃度で溶解して調製した。なお、ＳｅｅＤＢ２Ｓは「ｗ／ｖ」ではなく「ｗ／ｗ」に基づき調製した点に留意が必要である。溶液１および溶液２は、オムニパーク３５０を水で希釈し、サポニン（ナカライテスクまたはシグマアルドリッチ）を２％（ｗ／ｖ）で加えることによって調製した。サポニンはロットにより褐変レベルが異なる。褐色の色素は光の透過性を減少させるため、褐色の弱いロットを用いた。ＣＬＡＲＩＴＹ法のための試薬は和光純薬工業（株）から購入した。屈折率はアッベ屈折計（ＥｒｍａＩｎｃ．）および白色光源を用いて測定した。ＳｅｅＤＢ２ＧおよびＳｅｅＤＢ２ＳをまとめてＳｅｅＤＢ２と称する。

（ＳｅｅＤＢ２を用いたマウス脳組織の光学的透明化）
ＰＦＡで固定したマウス脳サンプルを、５ｍＬエッペンドルフチューブを用い、オーバーヘッドローテータ（ＴＡＩＴＥＣ）を用いて室温（２５℃）で穏やかに（〜４ｒｐｍ）回転させ、透明化した。まず、固定化された組織サンプルを、ＰＢＳに溶解した２％サポニン（シグマ）で一晩インキュベートした。次に、サンプルを、オムニパーク３５０（第一三共）と２％サポニンを溶解した水との１：２の混合物（溶液１）中で６〜１０時間インキュベートし、さらに、オムニパーク３５０と２％サポニンを溶解した水との１：１の混合物（溶液２）中で６〜１０時間インキュベートした。最後に、２％サポニンを溶解したオムニパーク３５０（溶液３）で、サンプルを１２時間以上インキュベートした。薄い脳切片はより短いインキュベート期間で透明化することができた。いくつかのサンプル（例えば、脂質を多く含む組織、および大きなサンプル）は、溶液３におけるインキュベーションを延長してさらに透明化してもよい。ＳｅｅＤＢ２Ｓを用いた透明化については、サンプルをさらに、２％サポニンを含むＳｅｅＤＢ２Ｓ（溶液４）中で１２時間以上インキュベートした。透明化された組織を、イメージングのため、サポニンを含まないＳｅｅＤＢ２ＧまたはＳｅｅＤＢ２Ｓに移した。サンプルの長期保存のため、保存剤として０．０１％のアジ化ナトリウムを加えてもよい。蛍光を消失させることがあるので、蛍光タンパク質サンプルに対し、化学的保存料（例えばＤＡＢＣＯ）の添加は推奨されない。サンプルは暗所で常温保存可能である。水分の蒸発により表面がべとつくことがあるので、透明化されたサンプルを長時間空気に晒すのは避けることが好ましい。

（ＳｅｅＤＢ）
ＳｅｅＤＢ（８０．２％（ｗ／ｗ）フルクトースおよび０．５％（ｖ／ｖ）α−チオグリセロールの水溶液）を、既報に記載のとおり調製した（参考文献：非特許文献４およびKe, M.T., and Imai, T. (2014). Curr Protoc Neurosci 66, Unit 2 22）。正立顕微鏡を用いた共焦点および二光子顕微鏡観察において、屈折率を一致させた２，２’−チオジエタノール水溶液をイマージョン液として使用した（参考文献：非特許文献４）。

（ＣＵＢＩＣ）
ＳｃａｌｅＣＵＢＩＣ−１（２５％（ｗ／ｗ）尿素、２５％（ｗ／ｗ）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（２−ヒドロキシプロピル）エチレンジアミン、および１５％（ｗ／ｗ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の水溶液）およびＳｃａｌｅＣＵＢＩＣ−２（５０％（ｗ／ｗ）スクロース、２５％（ｗ／ｗ）尿素、１０％（ｗ／ｗ）２，２’，２’’−ニトリロトリエタノール、および０．１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の水溶液）を既報に記載のとおり調製した（参考文献：非特許文献２）。

（ＣＬＡＲＩＴＹ）
ＣＬＡＲＩＴＹの受動的透明化プロトコル（参考文献：Tomer et al. (2014). Nat Protoc 9, 1682-1697）を使用した。電気泳動による脂質除去に基づくオリジナルのプロトコル（参考文献：非特許文献３）よりも形態がよく保存されることが報告されているからである。麻酔したマウスに、２０ｍＬの氷冷ＰＢＳを、次いで２０ｍＬのＨＭ溶液（４％アクリルアミド、０．０５％ビスアクリルアミド、４％ＰＦＡおよび０．２５％ＶＡ−０４４のＰＢＳ溶液）を経心的に潅流した。取り出した脳を２０ｍＬのＨＭ溶液に移し、４℃で１〜２日間インキュベートした。そして、重合をさせるために、サンプルを３７℃で一晩インキュベートした。その後、脳をヒドロゲルから切り取り、ＳＢＣバッファー（４％ＳＤＳの２００ｍＭホウ酸バッファー溶液、ｐＨ８．５）で１日間洗浄した。脳切片を作製するため、サンプルを４％低融点アガロースに包埋し、ビブラトームマイクロスライサー（ＤｏｓａｋａＥＭ）を用いてスライスした。透明化のために、サンプルを穏やかに震盪しながらＳＢＣバッファーでインキュベートした。透明化したサンプルを０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００のＰＢＳ溶液で洗浄し、ＦｏｃｕｓＣｌｅａｒ（ＣｅｌＥｘｐｌｏｒｅｒＬａｂｓ）を用いてマウントした。ＣＬＡＲＩＴＹ用の試薬は、和光純薬工業から購入した。

（ＳｃａｌｅＳ）
ＳｃａｌｅＳ０（２０％ソルビトール、５％グリセロール、１ｍＭメチル−β−シクロデキストリン、１ｍＭγ−シクロデキストリン、１％Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、および３％ＤＭＳＯ）、ＳｃａｌｅＳ１（２０％ソルビトール、１０％グリセロール、４Ｍ尿素、および０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、ＳｃａｌｅＳ２（２７％ソルビトール、２．７Ｍ尿素、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、および８．３％ＤＭＳＯ）、ＳｃａｌｅＳ３（３６．４％ソルビトール、２．７Ｍ尿素、および０．１％ＤＭＳＯ）、ならびにＳｃａｌｅＳ４（４０％ソルビトール、１０％グリセロール、４Ｍ尿素、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、および２０％ＤＭＳＯ）を既報に記載のとおり調製した（参考文献：Hama, H., et al. (2015). Nature neuroscience 18, 1518-1529）。

（マウスの株）
全ての動物実験は、理研神戸事業所の動物実験審査委員会に承認されている。C57BL/6Nバックグラウンドにおける、野生型（ICR, C57BL/6N、およびBDF1）、Thy1-YFP line G (JAX #014130)、Thy1-YFP line H (JAX #003782)（参考文献：Feng, G. et al. (2000). Neuron 28, 41-51）、MOR23プロモーター下I7-IRES-ECFP (RIKEN BRC #RBRC02931)（参考文献：Imai et al. (2006). Science 314, 657-661）、MOR29A-IRES-ECFP/MOR29B-EYFP BAC トランスジェニックライン line（参考文献：Tsuboi, A., et al. (2011). The European journal of neuroscience 33, 205-213）、およびR26-H2B-EGFP (Acc.No. CDB0238K; http://www.cdb.riken.jp/arg/reporter_mice.html)（参考文献：Abe et al. (2011). Genesis 49, 579-590）マウスを、イメージング実験に使用した。子宮内エレクトロポレーションのために、C57BL/6J (JAX #005246)と戻し交配したFloxed Grin1マウス（参考文献：Tsien, J.Z., et al. (1996). Cell 87, 1317-1326）を、ＩＣＲマウスと交配させた。メスおよびオスの両方をイメージング実験に使用した。

（マウス脳サンプル）
組織サンプルを得るため、過剰量のネンブタール（大日本住友ファーマ）を腹腔内投与することで、マウスを深く麻酔し、次いでリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解した４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を心臓から潅流した。取り出した脳または胚を、ＰＢＳに溶解した４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中において、４℃で一晩かけて固定した。脳切片（０．２〜２ｍｍ厚）を、マイクロスライサー（ＤｏｓａｋａＥＭ）を用いて切断した。

（子宮内エレクトロポレーション）
ＮＲ１（ＮＭＤＡレセプター機能に不可欠なサブユニット）をコードするGrin1の単一細胞ノックアウト解析を行うために、C57BL/6J×ICRで交配したバックグラウンドにおけるホモのfloxed Grin1マウスおよび野生型マウスを用いた。Ｅ１２において、pCAG-loxPNeo-loxP-tdTomato（１μｇ／μＬ）、pCAG-loxP-Neo-loxP-EYFP-Gephyrin（０．５μｇ／μＬ）、およびpCAG-Cre（０．５μｇ／μＬ）をＬ５錐体ニューロンに共エレクトロポレーションし、Ｐ２２において解析した。子宮内エレクトロポレーションは、鉗子型電極（直径５ｍｍ）およびCUY21EXエレクトロポレータ（BEX）を用いて、既報に記載のとおり行った（参考文献：Ke, M.T., Fujimoto, S. & Imai, T. (2013). Nat Neurosci 16, 1154-1161）。バックボーンプラスミドベクターpCAG-CreERT2およびpCAFNF-DsRedは、C. Cepko (Addgene plasmid #14797および#13771)から入手した。

（透明度の定量）
透明度の定量は、生後２１〜２４日の大脳皮質の光の透過を測定して行った。白質が不均等に光散乱するため、半前脳サンプルから視床および海馬を除去し、灰質の部分（大脳皮質）のみを使用した。透明化試薬および透明化された脳の光透過性は、スペクトロフォトメーター（日立、Ｕ−５１００）を用いて決定した。半脳の皮質サンプルの中央−側面軸に沿った透明度が定量化された。

（サンプルの大きさの変化の測定）
光学的透明化のプロセスにおける、サンプルの大きさの変化は、既報のとおり（参考文献：非特許文献４）、成体マウスの半脳サンプルを用いて定量化した。脳の平らな面をディッシュに載せ、立体顕微鏡を用いて上面からイメージングを実施した。線形の膨張量を、領域の面積変化の平方根から決定した。

（形態的損傷の定量）
光学的透明化の間の形態変化を定量するために、僧帽細胞の側方樹状突起（ｉｎｖｉｖｏでは突起はわずかで滑らかであった）を利用した。僧帽細胞を低密度で標識するために、ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ４８８−または６４７−ｄｅｘｔｒａｍ（１０ｋＤａ）を、既報に記載のとおり、ｉｎｖｉｖｏでマウスの嗅球にエレクトロポレーションした（参考文献：Ke, M.T., Fujimoto, S. & Imai, T. (2013). Nat Neurosci 16, 1154-1161）。ｉｎｖｉｖｏイメージング（ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ４８８）を、麻酔したマウスにおいて二光子顕微鏡を用いて取得した。嗅球を透明化および蛍光イメージング（ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ６４７）した後、僧帽細胞の側方樹状突起を、perisomaticな部位、分岐点、末端点、および画像野の端において分けた。次いで、セグメントの２つの端の間の最小距離（Ｄ）およびトレースした樹状突起の長さ（ｄ）を、Neurolucidaソフトウェア（MBF Bioscience）を用いて決定した。既報に記載のとおり、湾曲度を、ｄ／Ｄと定義した（参考文献：Ke, M.T., Fujimoto, S. & Imai, T. (2013). Nat Neurosci 16, 1154-1161）。

（脳組織薄片の蛍光の定量）
組織内での蛍光タンパク質の安定性を定量化するため、Ｔｈｙ１−ＹＦＰ−ＧまたはＴｈｙ１−ＹＦＰ−Ｈマウスの脳サンプルを使用した。２０μｍ厚の脳薄片をクリオスタット（Ｌｅｉｃａ、ＣＭ３０５０Ｓ）を用いて作製し、スライドガラスに収集した。薄片は４％ＰＦＡのＰＢＳ溶液で１５分間固定し、ＰＢＳで洗浄した。その後薄片を光学的透明化試薬を用いて２４時間までインキュベートした。組織内の蛍光タンパク質の蛍光強度を、冷却ＣＣＤカメラを備えた倒立蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、ＤＭＩ６０００Ｂ）を用いて定量化した。

（組み換え蛍光タンパク質および化学蛍光色素のスペクトル解析）
E.coli JM109(DE3)株を、ｐＲＳＥＴ_Ａ−ＥＣＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、またはｔｄＴｏｍａｔｏベクターでトランスフェクトした。得られた細菌培養物を、アンピシリンを添加した２×ＹＴ培地中において３０℃で１６時間、次いで２５℃で２０時間培養した。細菌ペレットをリゾチーム（シグマアルドリッチ）およびベンゾナーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）の存在下で４回の凍結融解サイクル処理を行い、組み換えタンパク質をＮｉ−ＮＴＡＳｐｉｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。精製された組み換えタンパク質を様々な透明化試薬で希釈し、室温で一晩インキュベートした。励起および放射スペクトルを、蛍光スペクトロフォトメーターモデルＦ２７００（日立）を用いて定量化した。Ａｌｅｘａ色素の定量化では、Ａｌｅｘａ色素と共役させたロバ抗マウス抗体（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。励起および放射曲線の決定のために使用した励起および放射波長はそれぞれ以下の通り（単位はｎｍ）：ECFP (435, 480), EGFP (480, 515), EYFP (505, 535), tdTomato (545, 590), Alexa 488 (480, 530), Alexa 555 (540, 580), Alexa 647 (640, 675)。

（マウス脳切片の免疫染色）
ＳｅｅＤＢ２による透明化の前に、免疫染色および対比染色を行ってもよい。抗体の浸透を容易にするため、サンプルを２％サポニンのＰＢＳ溶液中で、緩やかに回転（〜４ｒｐｍ）させながら４℃で２４時間インキュベートした。サポニンは、免疫染色のための界面活性剤として一般的に用いられるＴｒｉｔｏｎＸ−１００よりも良好に形態を維持させる。サンプルを３ｍＬのブロッキングバッファー（０．５％（ｗ／ｖ）スキムミルク、０．２５％（ｗ／ｖ）フィッシュゼラチン、２％（ｗ／ｖ）サポニン、０．５％（ｗ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（任意）、および０．０５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムのＰＢＳ溶液）の入った５ｍＬエッペンドルフチューブに移した。緩やかに回転させながら、ブロッキングを４℃で２４時間実施した。一次抗体との反応（５ｍＬエッペンドルフチューブを使用し、３ｍＬのブロッキングバッファー中で）は、ローテータ上で、４℃、２４時間かけて実施した。マウス抗ＧＡＤ６７（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＢ５４０６）、マウス抗Ｒｅｅｌｉｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＢ５３６４）、マウス抗Ｂａｓｓｏｏｎ（Ａｂｃａｍ、ＡＢ８２９５８、およびウサギ抗Ｈｏｍｅｒ１（ＳｙｎａｐｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓ、１６０００３）を１／２００に希釈して使用した。洗浄バッファー（２％サポニン、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００のＰＢＳ溶液）を用いて３回洗浄（各２時間）した後、二次抗体を含む３ｍＬのブロッキングバッファー中（抗体は１／２００希釈）で、サンプルを、ローテータ上で、４℃で１２〜１６時間インキュベートした。ロバ抗マウスＡｌｅｘａ６４７（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および抗ウサギＡｌｅｘａ５５５（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を１／２００希釈で使用した。ＤＡＰＩ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；１／５００希釈）またはＮｅｕｒｏＴｒａｃｅ６４０／６６０Ｄｅｅｐ−ＲｅｄＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＮｉｓｓｌＳｔａｉｎ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；１／２００希釈）を必要に応じ、二次抗体の反応中に適用した。次いで、サンプルを、洗浄バッファーを用いて３回洗浄（各２時間）した。その後、抗体染色された脳サンプルを、上述のとおりＳｅｅＤＢ２で透明化およびマウントした。

（ＳＲ−ＳＩＭのためのＨＥＫ２９３Ｔ細胞サンプル）
１０％ＦＢＳを含むＦｌｕｏｒｏＢｒｉｔｅＤＭＥＭ中で維持されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ポリ−Ｄ−リシンでコーティングされた３５ｍｍのガラス底ディッシュ（ＭａｔＴｅｋ）に播種し、０．４μｇのｐＣＡＧ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ２（ａｄｄｇｅｎｅｐｌａｓｍｉｄ＃１４７９７、C. Cepkoから入手した）および３．６μｇのｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ−ｌｏｘＰ−３×ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ−ｌｏｘＰ−ｇａｐＥＧＦＰでトランスフェクトした。ｇａｐＥＧＦＰは、ｇａｐ４３のＮ末端２０アミノ酸配列を含み、パルミトイル化反応に必要であり、細胞膜に偏在する（膜ＥＧＦＰ）。ＣｒｅＥＲはタモキシフェンを使用しない低頻度組み換えに使用した。トランスフェクションから２４時間後、細胞に５００ｎＭのＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒＲｅｄＣＭＸＲｏｓを４５分間ロードした。次いで、細胞を４％ＰＦＡで１５分間固定し、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００のＰＢＳ溶液に溶解したＤＡＰＩで１５分間染色した。細胞を溶液１で３０分間、溶液２で３０分間、溶液３で３０分間、溶液４で３０分間、ＳｅｅＤＢ２Ｓで３０分以上インキュベートし、ＳＲ−ＳＩＭイメージングを実施した。

（ＰＡＬＭおよびｄＳＴＯＲＭのためのＨＥＫ２９３Ｔ細胞サンプル）
ＰＡＬＭイメージングについては、３５ｍｍのガラス底ディッシュ（ＭａｔＴｅｋ）中のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、mEos2-Lifeact-7（addgene plasmid #54809、M. Davidsonから入手した）プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後、予熱した４％ＰＦＡｉｎＰＢＳで細胞を１５分間固定し、上述のとおりＳｅｅＤＢ２Ｓで透明化した。ｄＳＴＯＲＭサンプルについては、予熱した４％ＰＦＡｉｎＰＢＳでＨＥＫ２９３Ｔ細胞を固定し、抗αチューブリン（ＤＭ１Ａ、シグマ；１：５００）で免疫染色し、次いでＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７ロバ抗マウスＩｇＧ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ａ３１５７１）で免疫染色した。

（倒立顕微鏡を用いた共焦点イメージング）
イメージングの機構は既報のとおりである（参考文献：非特許文献４およびKe, M.T., and Imai, T. (2014). Curr Protoc Neurosci 66, Unit 2 22）。透明化されたホールマウント脳サンプルを、ＳｅｅＤＢ２で満たしたガラス底ディッシュに浸した。脳切片をマウントするため、適切な厚さのシリコンゴムシート（十川ゴム）および０．１７０±０．００５ｍｍ厚のカバーガラス（Ｍａｒｉｅｎｆｅｌｄ、Ｎｏ.１．５Ｈ）を使用した。共焦点イメージを、倒立顕微鏡ＦＶ１０００（Ｏｌｙｍｐｕｓ）、ＴＣＳＳＰ８Ｘ（ＬｅｉｃａＭｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＬＳＭ７８０（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ）、またはＬＳＭ８８０（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ）を用いて得た。ＦＶ１０００において、レーザーダイオード（４０５ｎｍ）、マルチＡｒレーザーライン（４５７、４８８、および５１５ｎｍ）、およびＨｅ−Ｎｅ（５４３および６３３ｎｍ）レーザーラインを使用した。２０×（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＵＰＬＳＡＰＯ２０Ｘ、ＮＡ０．７５、ＷＤ０．６０ｍｍ）空気対物レンズを使用した。光軸方向スケールはＳｅｅＤＢ２Ｇ（屈折率１．４６）で短縮されるので、実際の深度は見かけの深度に１．４６をかけることで求められる。校正した深度を全ての図に示している。高解像イメージングにおいて、１００×（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＵＰＬＳＡＰＯ１００ＸＯ、ＮＡ１．４０、ＷＤ０．１３ｍｍ）油浸対物レンズを使用した。市販のイマージョンオイル、イマーソル５１８Ｆ（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ）またはイマージョンオイルタイプＦ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）をイメージングに使用した（屈折率１．５１８）。ＴＣＳＳＰ８Ｘにおいて、白色光レーザーを励起に使用し、ＨｙＤ検出器を蛍光シグナルの検出に使用した。４０×油浸（Ｌｅｉｃａ, HC PL APO 40x OIL CS2, NA 1.3, WD 0.24 mm）および６３×グリセロール浸（Ｌｅｉｃａ, HC PL APO 63x/1.30 Glyc CORR CS2, NA 1.3, WD 0.30 mm）対物レンズを使用した。タイプＧ（屈折率１．４６）イマージョン媒体をＳｅｅＤＢ２Ｇサンプルに、タイプＦ（屈折率１．５１８）イマージョン媒体をＳｅｅＤＢ２Ｓサンプルに使用した。ＬＳＭ７８０またはＬＳＭ８８０において、２０×ドライレンズ（Plan-Apochromat 20x/0.8 M27, NA 0.80, WD 0.55）または４０×水浸レンズ（P-Apochromat 63x Oil DIC, NA 1.40, WD 0.19）およびＧａＡｓＰ検出器を用いてイメージを得た。

（光シート顕微鏡による観察）
透明化したマウス脳の光シート顕微鏡観察を、倒立共焦点顕微鏡に基づく市販の光シート顕微鏡、モデルＴＣＳＳＰ８ＤＬＳ（ＬｅｉｃａＭｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。成体Ｔｈｙ１−ＹＦＰ−Ｈマウス脳切片（厚さ２ｍｍ）をＳｅｅＤＢ２Ｇで透明化した後、カミソリ刃でより小さな断片に切断して、サンプルを用意した。２枚のカバーガラスを接着剤でガラス底ディッシュ上に垂直に立てて、切断した脳サンプルをその間に保持させた。イメージングのために、サンプルをＳｅｅＤＢ２Ｇに浸漬した。光シートの照射は５１４ｎｍ（Ａｒレーザー）で行い、対物レンズ、TwinFlect反射鏡装置（HC APO L10x/0.30W DLS）およびｓＣＭＯＳカメラを用いてＥＹＦＰシグナルを検出した。市販の対物レンズは水浸用に設計されている（屈折率１．３３）ため、屈折率１．４６のＳｅｅＤＢ２Ｇにおいて用いる場合と焦点面が異なる。したがって、特注の反射鏡装置（ＬｅｉｃａＭｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＳｅｅＤＢ２Ｇ溶液での焦点面における画像を検出した。

（正立顕微鏡を用いた共焦点および二光子イメージング）
正立顕微鏡のイメージングチャンバーを既報のとおり用意した（参考文献：Ke, M.T., and Imai, T. (2014). Curr Protoc Neurosci 66, Unit 2 22）。１〜６ｍｍの厚さのシリコンゴムシート（十川ゴム）をイメージングチャンバーの作製に使用した。サンプルおよびＳｅｅＤＢ２をチャンバーに入れ、ガラス底ペトリ皿で封をした（参考文献：Ke, M.T., and Imai, T. (2014). Curr Protoc Neurosci 66, Unit 2 22）。ＳｅｅＤＢ２Ｇサンプルについては、イマージョン媒体（６７％（ｖ／ｖ）２，２’−チオジエタノール水溶液、屈折率１．４６）をガラス底ディッシュに加えた。自動ステージ（Ｓｉｇｍａ−Ｋｏｋｉ）付正立共焦点／二光子顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ, FV1000MPE）を蛍光イメージングに使用した。高屈折率サンプル用に最適化された、特注の２５×対物レンズ（Ｏｌｙｍｐｕｓ, NA 0.9, WD 8.0 mm、屈折率１．４１〜１．５１用）をＳｅｅＤＢ２サンプルのイメージングに使用した（類似のレンズが現在ＸＬＳＬＰＬＮ２５ＸＧＭＰとしてＯｌｙｍｐｕｓから発売されている）。ＬＤ４７３レーザーをＥＹＦＰの一光子励起に使用した。ＩｎＳｉｇｈｔＤｅｅｐＳｅｅＤｕａｌ（Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ）をＥＧＦＰ（９２０ｎｍ）およびＥＹＦＰ（９５０ｎｍ）の二光子励起に使用した。

（超解像蛍光顕微鏡による観察）
ＳＴＥＤ顕微鏡観察は、市販のＳＴＥＤ顕微鏡、モデルＴＣＳＳＰ８ＳＴＥＤ３Ｘ（ＬｅｉｃａＭｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）および油浸対物レンズ（Ｌｅｉｃａ、ＨＣＰＬＡＰＯ１００ｘ／１．４０ＯＩＬＳＴＥＤＷＨＩＴＥ、ＮＡ１．４０、ＷＤ０．１３ｍｍ）を使用して実施した。ＥＹＦＰはマルチＡｒレーザー（５１４ｎｍ）を用いて励起し、５９２ｎｍＳＴＥＤレーザーを２ＤＳＴＥＤに使用した。蛍光をＨｙＤ検出器を用いて、ゲーテッドＳＴＥＤ機能で検出した。ＳＰ８−ＨｙＶｏｌｕｔｉｏｎを、TCS SP8X（Leica Microsystems）および６３ｘ油浸（Leica, HC PL APO 63x OIL CS2, NA 1.4, WD 0.14 mm）を用いて行った。ＥＣＦＰおよびＥＹＦＰは、それぞれレーザーダイオード（４４２ｎｍ）およびＷｈｉｔｅＬｉｇｈｔＬａｓｅｒを用いて励起した。蛍光シグナルは、ＨｙＤ検出器を用いて検出し、Huygens（Scientific Volume Imaging B. V.）を用いて処理した。ＳＲ−ＳＩＭは市販のセットアップ、モデルＥＬＹＲＡＰＳ．１（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ）、および１００×油浸対物レンズ（Carl Zeiss, alpha Plan-Apochromat 100x / 1.46 oil, NA 1.46, WD 0.11 mm）を用いて実施した。グレーティングは３ローテーションで実施した。アベレージングの回数は２である。ＦＶ−ＯＲＳ付ＦＶ１０００（Ｏｌｙｍｐｕｓ）においては、１００×油浸対物レンズ（Olympus, UPLSAPO 100XO, NA 1.40, WD 0.13 mm）を用いた。ＧａＡｓＰ検出器を用いて蛍光を検出し、２５〜３０回アベレージングを行った。ＣＳＵ−Ｗ１（Ｙｏｋｏｇａｗａ）に基づくＳＤ−ＯＳＲ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）においては、１００×油浸対物レンズ（Olympus, UPLSAPO 100XO, NA 1.40, WD 0.13 mm）を用いた。ＥＹＦＰは４８８ｎｍレーザーで励起させた。Ａｉｒｙｓｃａｎ（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ）付ＬＳＭ８８０においては、油浸対物レンズ６３×オイル（NA 1.4, WD 0.19 m）および１００×オイル（NA 1.46, WD 0.11 mm）を使用した。蛍光は、Ａｉｒｙｓｃａｎ検出器で超解像モード（ピンホールサイズ、１．２５ＡＵ）により検出した。ＥＧＦＰ、ＥＹＦＰおよびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８は４８８ｎｍで励起し、ｔｄＴｏｍａｔｏは５６１ｎｍで励起した。ＰＡＬＭ／ｄＳＴＯＲＭのイメージングは、１００×油浸対物レンズ（alpha Plan-Apochromat 100x Oil DIC M27, NA 1.46, WD 0.11 mm）およびＴＩＲＦ、ＨＩＬＯまたはＥｐｉ照射モードを使用してＥＬＹＲＡＰＳ.１（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ）により行った。屈折率が高いので、ＴＩＲＦ照射モードではＳｅｅＤＢ２ＳによるＴＩＲＦイメージングはできず、照射光がサンプル内に進入した。ＰＡＬＭイメージングでは、ｍＥｏｓ２を４０５ｎｍおよび５６１ｎｍのレーザーで照射した。

（ＰＳＦ解析）
ＰＳＦは、既報のとおり、０．１μｍ径（共焦点およびＡｉｒｙｓｃａｎ）または０．０４μｍ（ＳＴＥＤ顕微鏡）のＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ黄色−緑色蛍光ビーズ（Thermo Fisher, F8803およびF8795）を用いて決定した（参考文献：非特許文献４）。蛍光ビーズを１％（１００ｎｍビーズ）または４％（４０ｎｍビーズ）アガロースに埋め込み、透明化試薬を浸透させた。半値全幅（ＦＷＨＭ）をＦｉｊｉｐｌｕｇｉｎＭｅｔｒｏｌｏＪを用いてガウスフィッティングによって決定した。サンプルのサイズは全てのＰＳＦ解析において２０であった。

（Ｓｅａ応答解析）
軸共焦点走査により蛍光強度を評価するため、透明化試薬にローダミン６Ｇ（東京化学工業）を溶解した。イメージングチャンバー内で染色液をカバーガラス（Marienfeld, No. 1.5H）で密封し、１００×油浸レンズ（Olympus, UPLSAPO 100XO, NA 1.40, WD 0.13 mm）を用いて倒立共焦点顕微鏡（ＦＶ１０００（Ｏｌｙｍｐｕｓ））によりイメージングした。

（画像処理および定量）
蛍光イメージのボリュームレンダリングを、Ｎｅｕｒｏｌｕｃｉｄａ（ＭＢＦＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＩＭＡＲＩＳ（ｂｉｔｐｌａｎｅ）を用いて行った。ＬｅｉｃａＴＣＳＳＰ８Ｘ用ハイジーンデコンボリューションソフトウエアをＳＴＥＤおよびＳＰ８−ＨｙＶｏｌｕｔｉｏｎイメージに使用した。連続電子顕微鏡画像のためにもともと開発されたＶＡＳＴＬｉｔｅ（https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/vast/）を、超解像画像の再構成に用いた（参考文献：Kasthuri, N., et al. (2015). Cell 162, 648-661）。トレースされた画像の積み重ねをＭａｔｌａｂ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ）に出力し、表面メッシュを作成して、ＰａｒａＶｉｅｗ（http://www.paraview.org/）で可視化した。ＡｕｔｏＮｅｕｒｏｎおよびＡｕｔｏＳｐｉｎｅ機能付ＮｅｕｒｏｌｕｃｉｄａおよびＮｅｕｒｏｌｕｃｉｄａ３６０（ＭＢＦＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、半自動ニューロントレースおよびマウス錐体ニューロンにおける樹状突起スパインの定量のために使用した。５０μｍ長の神経突起部分について、神経突起の平均径をＮｅｕｒｏｌｕｃｉｄａを用いて決定した。これらの手順は図１３にまとめた。

（統計解析）
Ｐｒｉｓｍ５ソフトウエア（ＧｒａｐｈＰａｄ）およびＲ（http://www.r-project.org/）を統計解析に使用した。図２のＣにおいて、正規分布を仮定して両側ウェルチ検定を用いた。図１のＥにおいて、非正規分布に基づくノンパラメトリック検定を用いた。テクニカルレプリケートに基づくデータを、平均値±標準誤差で示している。平均値±標準偏差を、生物学的ばらつきを示すために用いた。サンプルのサイズ（図面の凡例に特定されている）は、予備実験におけるデータの分布に基づき決定した。ニューロンの形態の定量化は非盲目であったが、サンプルのタイプ間の何らかの潜在的な偏りを避けるために、図１のＥでは全ての標識されたニューロンを定量化した。図１２では、明るく標識されたニューロンを解析のために選択し、尖端樹状突起の基部から伸びている斜めの樹状突起をトレースし、樹状突起の全長を定量した。

〔結果〕
（非イオン性有機ヨウ素化合物を用いた迅速かつ効率的な光学的透明化）
組織深部の高解像画像を得るため、光の散乱および球面収差の両方を最小にする必要がある（図６のＡ）。我々のグループおよびその他のグループの以前の研究により、透明化試薬の屈折率の最適な範囲は１．４５〜１．５５であることが判明している（参考文献：非特許文献４）。球面収差を最小にするため、サンプルおよびイマージョン媒体の屈折率は同じでなければならない。理論的に識別可能な点間の最小距離（ｄ）は開口数（ＮＡ）の増大に応じて上がり（d = 0.61λ/NA；レイリー基準による）、またＮＡはイマージョン媒体の屈折率（ｎ）の増大に応じて上がるため（NA = n sinα；αは対象物の半開口角）、高解像イメージングのための対物レンズは多くの場合油浸（屈折率＝１．５１８）用に設計されている。また、油浸オイルの屈折率は、カバーガラスの屈折率（屈折率＝〜１．５２）と一致するように設計されている。そのため、高解像イメージングのための理想的な透明化試薬は、１．５１８の屈折率である必要がある。従来、屈折率１．５１５の９７％ＴＤＥをこの目的でマウント媒体として使用されてきたが、ＴＤＥはほとんどの蛍光タンパク質および一般的に使用されるいくつかの化学染色液を消光させるので、ＴＤＥの実用性には限りがあった（参考文献：非特許文献６）。ＳｅｅＤＢ法（屈折率１．４９）（参考文献：非特許文献４）等の既存の透明化試薬においては、フルクトースの溶解性に上限があるため、この屈折率は達成されていない。グリセロール（屈折率１．４７）を含んでいる一般的に使用されるマウント媒体も、この屈折率を達成できない。市販の高屈折率のマウント媒体は、収縮を引き起こす、および／または消光の問題を有する。したがって、大規模な容積の超解像イメージングは長年の挑戦であった。高屈折率の水溶性試薬のスクリーニングにおいて、我々はヨウ素含有化合物に着目した。例えば、我々は７０．４％（ｗ／ｗ）イオヘキソール水溶液の屈折率が１．５１８に達することを発見した（図６のＣ）。したがって、我々は、イオヘキソール等の非イオン性有機ヨウ素化合物を用いて、新たな透明化試薬およびマウント剤を開発することを試みた。

近年には、Ｔｗｅｅｎ−２０およびリン酸バッファーを含むイオヘキソール溶液（屈折率１．４６）が、ＦｏｃｕｓＣｌｅａｒの安価な代替品として、ＣＬＡＲＩＴＹサンプルをマウントするために用いられている（ＲＩＭＳと命名）（参考文献：非特許文献５）。しかしながら、イオヘキソールおよびＲＩＭＳは何れも単独で、厚い脳サンプルを、単純浸漬で効率良く透明化することはできず、サンプルの収縮を起こす（図１のＡ〜Ｃ）。これは、イオヘキソール溶液がサンプル内に効率的には侵入しないからと考えられる。したがって、我々は、イオヘキソールの透明化能力を、０．５〜２％の、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｎｏｎｉｄｅｔ（商標）Ｐ−４０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商標）、およびサポニンを含む、様々な界面活性剤と組み合わせて試験した。我々は、弱い非イオン性界面活性剤として知られる２％のサポニンが、形態損傷を引き起こすことのないイオヘキソールによる透明化を最も効果的に促進できることを発見した（図６のＦ）。Ｔｗｅｅｎ２０、ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、およびサポニンは、ＳＤＳおよびＴｒｉｔｏｎＸ−１００と比べて、サンプルの変形および／または蛍光タンパク質の消光／喪失が抑えられていた。また、低濃度のＴｒｉｔｏｎＸ−１００は比較的薄いサンプルに使用することができた。サポニンおよびＴｒｉｔｏｎＸ−１００はより効果的にイオヘキソールによる透明化を促進した。バッファーを添加していないイオヘキソール溶液に浸漬した脳サンプルは、未解明の理由により徐々に不透明に戻るため、脳サンプルの透明性を維持するかを様々なバッファーで試験した。その結果、低濃度のＴｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファーが、イオヘキソールと組み合わせたときに、サンプルの高い透明度の維持により効果的であることを発見した（図６のＧ）。ここで、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファーの代わりに水またはＰＢＳを使用した場合には、高い透明度は得られず、時間の経過に伴って透明度が低下した。最適化された透明化プロトコルにおいては、２％サポニンおよびＴｒｉｓバッファーに溶解した、低濃度から高濃度のイオヘキソール中で、サンプルを連続的にインキュベートし、最終的に、ＳｅｅＤＢ２Ｓ（ＳはSuper-resolutionを表す）と命名された、７０．４％（ｗ／ｗ）のイオヘキソールを含むＴｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファー（屈折率１．５１８）で平衡させた（図１のＣ）。グリセロール浸対物レンズのために、屈折率１．４６（５６．２％（ｗ／ｗ）または７５．５％（ｗ／ｖ）イオヘキソール溶液；ＳｅｅＤＢ２Ｇと命名；Ｇはグリセロール浸レンズを表す）でサンプルを平衡させるプロトコルも作成した。より低い粘性と十分な透明度のため、ＳｅｅＤＢ２Ｇは大きなサンプルに適するが、油浸レンズを用いる高解像イメージングにはＳｅｅＤＢ２Ｓの方がより適している。大脳皮質サンプルの透過曲線は、ＳｅｅＤＢ２ＳおよびＳｅｅＤＢ２Ｇが、既知の透明化試薬であるＳｅｅＤＢおよびマウント媒体であるＲＩＭＳと比較してよりよくサンプルを透明化することを示す（図１のＢ）。鼻骨でさえも、ＳｅｅＤＢ２Ｓによって良好に透明化された（図１のＤ）。必要な合計のインキュベート時間は数時間（比較的薄いサンプル）から２日間（成体の半脳サンプル）であり、ＣＬＡＲＩＴＹおよびＣＵＢＩＣ等の他の透明化法よりはるかに短い（図１のＣ）。また、ＳｅｅＤＢ２は、無害であり、且つ、組織に易損性を与えなかった。

（ＳｅｅＤＢ２は神経の微細構造を保持する）
真の高解像の画像を得るためには、透明化の過程においてサンプルの微細な細胞構造を保持することが不可欠である。このことは他の透明化のプロトコルにおいていつでも考慮されているわけではない（参考文献：非特許文献４）。例えば、ＳｃａｌｅＡ２はサンプルの膨張を引き起こし、一方ＢＡＢＢは縮小を引き起こすが、両者とも神経突起の変形を引き起こす（参考文献：非特許文献４）。近年開発された透明化法であるＣＬＡＲＩＴＹ、ＣＵＢＩＣ、およびＳｃａｌｅＳもまた、最終的なサンプルの大きさは元と同等であるものの、一時的なサンプルの膨張を伴う（参考文献：非特許文献２〜５；Hama, H., et al. (2015). Nature neuroscience 18, 1518-1529；Tomer, R., et al. (2014). Nat Protoc 9, 1682-1697）。対照的に、我々のＳｅｅＤＢ２Ｇ／Ｓプロトコルは、サンプルの大きさは透明化の過程で保存された（図１のＣ）。結果として、サンプルの完全性が種々のサンプルにおいて良好に保存された。

透明化における微細形態の変化を評価するため、マウスの嗅球において低密度に標識された平滑な僧帽細胞の樹状突起の湾曲度を定量した（参考文献：非特許文献４）。ＣＬＡＲＩＴＹ、ＣＵＢＩＣまたはＳｃａｌｅＳで透明化した後、サンプルの大きさは元に戻ったにもかかわらず、ｉｎｖｉｖｏと比較して樹状突起の湾曲度は増加し、変形した（図１のＥ）。これは、細胞骨格等のタンパク質高次構造が等方位的に膨張および収縮しないことを考慮すれば、驚くべきことではない。対照的に、ＳｅｅＤＢ２を用いて透明化されたサンプルは、形態変化の証拠を一切示さなかった（図１のＥ）。それゆえ、ＳｅｅＤＢ２を用いることで、神経などのサンプルの微細形態の正確で定量的な解析が可能になる。

（ＳｅｅＤＢ２はより多くの蛍光を保存し、自家蛍光をほとんど生じない）
高解像蛍光イメージングにおいて、低解像イメージングと比較して１ピクセルあたりより少ない量の光から光子を得る必要があり、そのため蛍光体は明るく、安定している必要がある。それゆえさまざまな蛍光体の、ＳｅｅＤＢ２および現存するマウント剤中での安定性を実験により確認した。４つの蛍光タンパク質、ＥＣＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＹＦＰおよびｔｄＴｏｍａｔｏがＳｅｅＤＢ２Ｓにおいて安定で、かつＰＢＳ中と類似の励起および放射スペクトルを示した（図２のＡ）。さらに、ＳｅｅＤＢ２Ｓでは、自家蛍光シグナルが蓄積せずに、蛍光シグナルが長期間（１ヶ月以上）にわたって非常に安定していた（図７のＢ〜Ｅ）。それに対し、これらの蛍光タンパクは、屈折率の観点から現在の高解像顕微鏡のための最良のマウント剤である、９７％２，２−チオジエタノール（ＴＤＥ）中において、劇的に蛍光が消失した（参考文献：非特許文献６）。市販のマウント剤であるＰｒｏＬｏｎｇＧｏｌｄもまた、ＥＹＦＰの蛍光を相当に減少させた。３つの化学的蛍光体、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、５５５、および６４７もまた、ＳｅｅＤＢ２Ｓ中において安定であったが、９７％ＴＤＥはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光を顕著に減少させた（図７のＡ）。我々はＥＹＦＰを発現したマウスの脳切片を用いて類似の結果を得た（図２のＢ）。それゆえ、蛍光タンパク質および化学蛍光色素の両方が、一般的に使用される、共焦点および高解像顕微鏡用のマウント剤と比較して、ＳｅｅＤＢ２Ｓにおいて安定である。

我々は以前にフルクトースを基剤とする透明化試薬であるＳｅｅＤＢが、内因性の様々なアミンと反応するために、組織内で徐々に自家蛍光を蓄積することを報告している（メイラード反応として知られる）（参考文献：非特許文献４）。対照的に、ＳｅｅＤＢ２は自家蛍光シグナルを産生しない（図７のＢ）。加えて、蛍光シグナルはイオヘキソール溶液中での長期保存において非常に安定である（図７のＣ〜Ｅ）。Ｔｈｙ１−ＹＦＰラインＧ（Ｔｈｙ１−ＹＦＰ−Ｇ）マウスの脳サンプルは、ＳｅｅＤＢ２Ｇ中で室温で１ヶ月以上保存した後でも、十分なレベルのＥＹＦＰシグナルを保った（図７のＣ）。組み換え蛍光タンパク質は、ＳｅｅＤＢ２Ｓ中において、室温で少なくとも１ヶ月間安定である（図７のＥ）。

これらの点は、大きな組織においてかすかな蛍光シグナルをイメージングする際に有利である。Ｔｈｙ１−ＹＦＰラインＨの動物の大脳皮質において、第五層の錐体ニューロンから伸びた微細な樹状突起叢は、ＳｅｅＤＢ２において、蛍光レベルの高さと自己蛍光シグナルの低さに起因して、ＳｅｅＤＢ、ＣＵＢＩＣおよびＣＬＡＲＩＴＹと比較してより良いイメージングが可能である（図１のＨ、図７のＢ、図７のＤ）。光シート顕微鏡は、大脳皮質の迅速で大規模なイメージングを可能にした（図２のＡ）。ＳｅｅＤＢ２Ｇはまた、自己蛍光シグナルが低いため、他のタイプのサンプル（例えば、Ｒ２６−Ｈ２Ｂ−ＥＧＦＰノックイン遺伝子座を保有し、Ｈ２Ｂ−ＥＧＦＰを広範に比較的低レベルで発現している胚全体（Ｅ９．５））の、全ての核のイメージングを行うのに十分な力があった（図２のＢおよびＣ）（参考文献：Abe et al. (2011). Genesis 49, 579-590）。他の臓器もまた蛍光イメージングのために適切に透明化された（図２のＣ）。サポニンが巨大分子の浸透を容易にするため、ＳｅｅＤＢ２は組織切片の核対比染色および抗体染色と共用できる。ＤＡＰＩは１．５ｍｍ厚の成体の脳切片に浸透し（図２のＤ）、抗体は２００μｍ以下の深さまで成体マウスの脳切片を染色することができ（図２のＥ）、小スケールの高解像回路網マッピングに十分である。

（ＳｅｅＤＢ２Ｓ中において分解能および明るさは全ての深さにおいて維持される）
高解像蛍光イメージングにおけるＳｅｅＤＢ２Ｓの性能を評価するため、我々はまず、油浸レンズ（NA 1.40, WD 0.13 mm）を備える共焦点顕微鏡を用いて、アガロースゲルに包埋された蛍光ビーズ（直径１００ｎｍ）の点拡がり関数（ＰＳＦ）解析により空間的分解能を定量した。以前に、厚い脳組織を二光子顕微鏡を用いてイメージングを実施した。しかしながら、分解能（ｄ）は、励起波長（λ）に応じて増加するため（d = 0.61λ/NA）、同じＮＡにおいては、一光子励起は、二光子顕微鏡の２倍の分解能である（図８のＡ）。共焦点顕微鏡においては、ＮＡはイマージョン媒体の屈折率の増加に応じて増加する（NA = n sinα）ため、油浸対物レンズは水浸対物レンズより分解能が高い（図８のＡ）。それゆえ、光学的透明化および一光子イメージングは二光子顕微鏡よりも分解能の点で有利である。

次に、さまざまな透明化剤およびマウント剤において、分解能および明るさを、油浸対物レンズを用いて調査した。予想のとおり、ＰＳＦ解析により、屈折率が適切に調節されたＳｅｅＤＢ２でマウントした場合、全ての深さにおいて高い分解能が保たれることが示された（図３のＡおよびＢ）。しかしながら、屈折率が低い他のマウント剤においては、球面収差に起因して分解能は劣っていた。Ｚ軸分解能は屈折率の不一致により、より強く影響を受ける。Ｚ軸に沿った複数の繊維の交差の分析が容易になるため、ＳｅｅＤＢ２ＳにおけるＺ軸分解能の向上は、回路トレースにおいて重要である。深さに依存する蛍光強度の変化を評価するために、ローダミン６Ｇ染色溶液について、カバーガラス界面からの共焦点軸走査を実施した（Ｓｅａ応答）（参考文献：Hell, S. et al. (1993). Journal of Microscopy 169, 391-405）。ＳｅｅＤＢ２において、ローダミン蛍光レベルは全ての深さで維持された。しかしながら、最適化されていないマウント剤においては、球面収差のため、深さが増すのに従い徐々に明るさが減少した（図３のＣ）。ここで、ＳｅｅＤＢ２Ｇの屈折率は１．４６であり、ＳｅｅＤＢ２Ｓの屈折率は１．５１８である。屈折率がカバーガラスおよび／またはイマージョンオイルと一致するＳｅｅＤＢ２Ｓを用いて高い分解能および明るさが示された。

（高密度に標識された神経回路網の高解像共焦点イメージング）
従来の共焦点顕微鏡および高ＮＡ油浸対物レンズを用いて、対物レンズの作動距離（ＷＤ）までの、ＳｅｅＤＢ２Ｓで処理したマウスの脳断片の高解像画像を容易に得ることができた（図３のＤおよびＥ）。ＳｅｅＤＢ２Ｓにおいて全ての深さで分解能は一定であるので、微細な樹状突起スパインが全ての深さにおいて（２００μｍまで）鮮明に可視化された。より薄いサンプルについては、ＷＤが大きい（NA 1.30, WD 0.30 mm）高ＮＡグリセロール浸レンズと組み合わせたＳｅｅＤＢ２Ｇを用いることで、嗅球の糸球体に収束する嗅覚神経の軸索の、単軸索の分解能の高解像画像を得ることができた（図３のＦ）。

この分解能は高密度に標識された神経回路網をトレースするのに十分なものであった。我々は、ＳｅｅＤＢ２Ｓを用いて透明化された、Ｔｈｙ１−ＹＦＰ−Ｈマウスの脳切片サンプルから得られた２８３μｍ×１２７μｍ×１３２μｍの大脳皮質ブロックから高解像蛍光イメージを得た（図３のＧ）。半自動の神経トレースソフトウェアを用いて、海馬ＣＡ１錐体ニューロンの樹状突起の回路構造を、ほぼ完全に抽出し、３Ｄに再構成した（図３のＨ、図８のＢ）。それゆえ、ＳｅｅＤＢ２Ｓを用いることで、以前には時間のかかるアレイ断層撮影（ＡＴ）により行われていた（参考文献：Micheva, K.D., and Smith, S.J. (2007). Neuron 55, 25-36）、高解像神経マッピングを容易に行うことができる。

（マウス脳切片の超解像顕微鏡観察）
回折限界を超えて樹状突起スパインおよびシナプスの配置を解明するため、超解像顕微鏡の１つであるＳＴＥＤ顕微鏡がよく使用される。しかしながら、標準的なＳＴＥＤ顕微鏡は、球面収差のため標本の表面の超解像画像しか得ることができない。組織深部の超解像画像を得るためには、特別な光学的調整（参考文献：Urban, N.T. et al. (2011). Biophys J 101, 1277-1284）または二光子励起ＳＴＥＤ（参考文献：Ding, J.B. et al. (2009). Neuron 63, 429-437）が必要である。

ここで、市販のＳＴＥＤ顕微鏡を用い、ＳｅｅＤＢ２Ｓにより透明化したＴｈｙ１−ＹＦＰ−Ｈマウスの脳切片のイメージングを実施した。対物レンズの作動距離（ＷＤ）で定められる上限である、１００μｍの深さまでの超解像画像を得ることができた（図４のＡ）。実際に、スパイン頸部の直径は理論的な回折限界（〜２００ｎｍ）を下回ることが多く、以前にもそのように報告されてきた（参考文献：Tonnesen, J. et al. (2014). Nature Neuroscience 17, 678-+）。我々は神経の機能を理解する上で不可欠な情報である、樹状突起スパインおよびスパイン頸部の微細な配置を可視化した。一般的な市販のマウント剤である、ＰｒｏＬｏｎｇＧｏｌｄに浸漬したサンプルでは、球面収差のため、サンプルの表面領域を可視化できたに過ぎなかった。加えて、このサンプルにおいては蛍光シグナルが弱かったため、レーザーの出力を上げる必要があった。その結果、超解像のＺスタック蛍光画像が得られる前に、サンプルが光退色を起こすことがしばしばあった。それゆえ、ＳｅｅＤＢ２Ｓにより、ＳＴＥＤ顕微鏡を用いてイメージングが可能な深度が劇的に深くなった。

Ａｉｒｙｄｉｓｃイメージのデコンボリューション（ＦＶ−ＯＳＲおよびＡｉｒｙｓｃａｎ）に基づく市販の超解像システムも検討した。その結果、再度、油浸対物レンズの作動距離が許す深度までの（〜１００μｍまたは〜１７０μｍ）樹状突起スパインの超解像画像を得ることができた（図４のＢおよびＣ、図９のＡおよびＢ）。光退色が最小限であるため、Ａｉｒｙｓｃａｎシステムは大規模な３Ｄ超解像イメージを得るのに有用であった（図４のＣ）。

（細胞生物学における３次元的な超解像顕微鏡観察）
超解像顕微鏡観察は細胞生物学においてよく行われる手法である。しかしながら、細胞生物学における適用においても、球面収差は、イメージング可能な深度を表面近傍に制限する大きな問題である。例えば、市販の超解像構造化照明顕微鏡（ＳＲ−ＳＩＭ）は、数μｍまでのサブ回折画像を得ることができるが、細胞１つのみの厚み（１０〜２０μｍ）を可視化するのにさえ十分ではない。ＤＡＰＩ、膜ＥＧＦＰ、およびＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒで標識されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ＰＢＳ中において、充分に解像された。ＰｒｏＬｏｎｇＧｏｌｄまたはＴＤＥでマウントした同一サンプルは、これらの媒体においては蛍光レベルがはるかに低く、より強いレーザー出力が必要であるため、イメージング中に光退色が起きた。しかしながら、我々のＳｅｅＤＢ２Ｓでマウントした場合には、これらの細胞の全ての厚さにおいて構造の超解像画像を得ることができた（図５のＥ）。全ての深度において細胞膜から伸びる微細なフィロポディアが解像された。

（ＳｅｅＤＢ２Ｓを使用した深部組織超解像顕微鏡観察）
我々は次に、超解像顕微鏡観察におけるＳｅｅＤＢ２Ｓの性能を評価した。我々は、油浸対物レンズ（ＮＡ１．４０，ＷＤ０．１３ｍｍ）を用い市販の誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）顕微鏡を試験した。様々な深度における水平方向のＰＳＦを決定するため、アガロースゲルに埋包された直径４０ｎｍの蛍光微粒子を用いた。ＳｅｅＤＢ２Ｓおよび９７％ＴＤＥにおいて、ｘ−ｙにおける５０〜６０ｎｍのＦＷＨＭは深度１００μｍまで維持された。しかしながら、ＰｒｏＬｏｎｇＧｏｌｄおよびＰＢＳにおいて、分解能は急激に低下し、蛍光微粒子は２０μｍより大きい深度においては視認できなかった（図５のＡ）。

次に、Ｔｈｙ−ＹＦＰ−Ｈマウス脳切片をＳｅｅＤＢ２Ｓを用い透明化し、同一のＳＴＥＤレーザー条件下でイメージングし、対物レンズのＷＤにより設定される上限である深度１１０μｍまでのサブ回析イメージを得ることができた（図１１のＢ）。我々は、シナプスの機能の理解に不可欠な情報である、樹状突起スパインの頭部および頸部の微細構造を可視化することができた（図５のＣ)。さらに、既存の顕微鏡を用いて解像するのが困難である、スパイン頭部から伸びているフィロポディアを時折観察した（図５のＣ）。脳組織の様々な深度における解像を評価するため、回折限界よりも小さいことが知られているスパイン頸部の直径（参考文献：Tonnesen, J., et al. (2014). Nature Neuroscience 17, 678-+）を決定した。我々は、脳切片の表面領域（〜３０μｍ）および深部領域（〜１１０μｍ）において定量したスパイン頸部の直径に差が無いことを発見した（図５のＤ）。このように、ＳｅｅＤＢ２Ｓは標準的なマウント条件下において以前より大きな深度のＳＴＥＤ顕微鏡観察を可能とするものである。なお、深部組織のＳＴＥＤ顕微鏡観察は二光子励起ＳＴＥＤ（参考文献：Ding, J.B., et al. (2009). Neuron 63, 429-437；Moneron, G., and Hell, S.W. (2009). Opt Express 17, 14567-14573）または手動光学較正（参考文献：Urban, N.T., et al. (2011). Biophys J 101, 1277-1284）によってのみ達成されたこと、および後者において、大規模３Ｄ画像を得るために手動で屈折率のミスマッチを各ｚ位置において修正することは現実的ではないことに留意すべきである。

（細胞生物学における容積測定超解像イメージング）
種々のタイプの超解像顕微鏡、構造化照明顕微鏡（ＳＩＭ）は、多色イメージングが可能であり、細胞生物学への応用にしばしば使用されていた。そこで、我々は、ＳｅｅＤＢ２Ｓサンプルのイメージングのために、油浸対物レンズ（ＮＡ１．４６，ＷＤ０．１１ｍｍ）を備える市販の超解像（ＳＲ）ＳＩＭシステムを用いた。膜ＥＧＦＰ、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ、およびＤＡＰＩで標識されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（厚さ１０μｍ以下）を、３ＤＳＲ−ＳＩＭを用いてＳｅｅＤＢ２Ｓ中で完全に解像することができたが、ＰＢＳ中においてはできなかった。例えば、細胞膜から伸長する微細フィロポディアは、ＳｅｅＤＢ２Ｓ中においてより良好に解像された（図５のＥ）。

（コネクトミクスにおけるボリュメトリック超解像イメージング）
大規模超解像イメージングは蛍光タンパク質と組み合わせてコネクトミクスにおける応用において特に強力である可能性がある。そこで、マルチアレイＧａＡｓＰ検出器およびピクセル再割り当てに基づく市販の新型の超解像顕微鏡Ａｉｒｙｓｃａｎ（参考文献：Huff, J. (2015). Nat Methods 12）を用いた。Ａｉｒｙｓｃａｎは、様々な超解像顕微鏡のうちで、光子束が比較的高く、光退色が低いため、分解能はＳＴＥＤに及ばないものの、大規模イメージングに有用である。ＰＳＦ解析において、油浸レンズ（ＮＡ１．４０，ＷＤ０．１９ｍｍ）を使用し、高分解能（ｘｙにおいて〜１５０ｎｍ、ｚにおいて〜３６０ｎｍ）が全ての深度において維持された（図１１のＡ）。

我々は、二光子顕微鏡、共焦点顕微鏡、およびＡｉｒｙｓｃａｎを用いた、Ｔｈｙ１−ＹＦＰ−Ｈマウス脳切片の同一の領域の画像を比較した。励起波長が長いほど分解能は低くなるため（ｄ＝０．６１λ／ＮＡ）、二光子顕微鏡は高分解能イメージングに適さない。ＡｉｒｙｓｃａｎはＥＹＦＰで標識された密な神経回路を最も良く解像した（図１１のＢ）。二光子顕微鏡観察において見逃されることが多いフィロポディアおよび細いスパインは、Ａｉｒｙｓｃａｎにおいて確実に同定することができた。二光子イメージング研究においてよく確認される“短くて太い”スパインは、Ａｉｒｙｓｃａｎにおいては（少なくともＬ５ニューロンにおいては）観察されず、おそらく低い軸分解能に起因する細い／キノコ型スパインのアーチフェクトの投影である（参考文献：Tonnesen, J., et al. (2014). Nature Neuroscience 17, 678-+）。また、ＳＤ−ＯＳＲ（参考文献：Hayashi, S., and Okada, Y. (2015). Mol Biol Cell 26, 1743-1751）およびＳＰ８−ＨｙＶｏｌｕｔｉｏｎを用いた大規模超解像画像も得られた（図１０のＡ〜Ｃ）。

軸分解能が優れているため、ｚ軸に伸びている樹状突起スパインは、ＳｅｅＤＢ２Ｓで確実に検出できたが、他のマウント媒体では球面収差に起因して検出できなかった（図１１のＣ）。ＳｅｅＤＢ２Ｓは、細い軸索のトレーシングおよび定量にも有用であった。脳梁において、子宮内エレクトロポレーションで標識されたＬ２／３脳梁軸索はＳｅｅＤＢ２Ｓ中で良好に解像したが、ＳｃａｌｅＳ中では解像しなかった（図１１のＤ）。ＳｅｅＤＢ２Ｓにおける軸分解能の向上は、回路のトレーシングに特に重要である。ｘ軸に沿った複数の繊維の交差を分析するのをより容易にするからである。嗅覚神経の軸索束において、MOR29B-IRES-EYFP導入遺伝子で標識された、ミエリン化されていない細い軸索繊維（直径２００〜３００ｎｍであり、先行の電子顕微鏡研究と一致する）が、ＳｅｅＤＢ２Ｓ中で良好に解像されて、解析された（図１１のＥおよび図１０のＣ）。大脳皮質（厚さ１００μｍ、成体Ｔｈｙ１−ＹＦＰ−Ｈマウス）の大規模な超解像画像において、全ての深度における樹状突起スパインおよび軸索束を確実に同定し（図４のＣ）、それらを３Ｄに再構成する（図４のＤ）ことができた。このように、ＳｅｅＤＢ２Ｓと超解像顕微鏡との組み合わせは、大規模なシナプスのマッピングに有用である。

（ＮＭＤＡ受容体欠損ニューロンの樹状突起における包括的なシナプスマッピング）
多くの認知および精神障害はシナプスの異常によって引き起こされるため、シナプスの超解像マッピングは学習に関連するシナプスの変化およびその病理を理解するための強力なツールになり得る。我々は、野生型ニューロンおよびＮＭＤＡ受容体欠損Ｌ５錐体ニューロン（不可欠なＮＲ１サブユニットがノックアウトされている）の興奮性および抑制性シナプスを、子宮内エレクトロポレーションを用いてマッピングした（図１２のＡおよびＢ）（参考文献：Tsien, J.Z., et al. (1996). Cell 87, 1317-1326）。興奮性シナプスはＬ５ニューロンにおいて成熟した樹状突起スパインの先端に位置し、そのサイズはスパイン頭部の直径と相関することが知られている。スパイン頭部の直径に基づき、樹状突起スパインを３つのタイプに分類した：フィロポディア（＜２５０ｎｍ）、細いスパイン（２５０〜５００ｎｍ）、およびキノコ型スパイン（＞５００ｎｍ）（図１２のＣ）。抑制性シナプスのシナプス後の構造を可視化するため、ＥＹＦＰ−ゲフィリンを用いた（参考文献：Chen, J.L., et al. (2012). Neuron 74, 361-373）。ＥＹＦＰ−ゲフィリン斑点は樹状突起軸およびスパイン頭部のサブセットに見られ、この２つのタイプは我々の超解像イメージにおいて明確に区別された（図１２のＡおよびＢ）。我々は、定量における偏りを避けるために、近位端から遠位端まで全て、先端の樹状突起の胴部から伸びている１００〜２００μｍ長の分岐のない斜めの樹状突起に焦点を当てた。

ＮＲ−１欠損ニューロンにおいて、全スパイン密度および平均スパイン長に変化はなかった（図１２のＤおよびＥ）が、スパイン頭部の直径の分布は野生型と異なっていた（図１２のＣ、ＤおよびＦ）。スパイン頭部直径の平均値の増加は、皮質特異的ＮＲ１ノックアウトマウスを用いた先行研究と一致する（参考文献：Ultanir, S.K., et al. (2007). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, 19553-19558）。ＥＹＦＰ−ゲフィリン斑点について、軸における密度は有意な影響を受けなかったものの、スパイン頭部における密度はノックアウトにおいて増加した（図１２のＧ）。また、ＥＹＦＰ−ゲフィリン斑点はＮＲ１ノックアウトニューロンにおいて大きなスパイン頭部に蓄積する傾向があることを発見した（図１２のＨおよびＩ）。それゆえ、ＮＭＤＡ受容体ノックアウトは、直接的または間接的に、興奮性シナプスのみならず抑制性シナプスにも影響を与える。ＮＲ１欠損ニューロンにおける大きなスパインへの抑制性シナプスの漸増は、これらのシナプスにおける抑制性シナプス新生の、活性に依存する恒常性作用によるものであり得る（参考文献：Baho, E. & Di Cristo, G. (2012). Journal of Neuroscience 32, 911-918）。

本発明は、例えば、生物材料を透明化して顕微鏡で観察する際に利用することができる。

Claims

界面活性剤と非イオン性有機ヨウ素化合物とを含む溶液に生物材料を浸漬して、当該生物材料を透明化する透明化工程Ａと、
透明化された生物材料を、非イオン性有機ヨウ素化合物を含み屈折率が１．４８超である溶液に浸漬した状態で、顕微鏡によって観察する観察工程とを含み、
上記溶液は、２，２’−チオジエタノールを含まないことを特徴とする、生物材料の透明化方法。
上記透明化工程Ａの前に、上記生物材料を、界面活性剤と上記透明化工程Ａにおける溶液よりも低い濃度の非イオン性有機ヨウ素化合物とを含む１以上の溶液に浸漬して、当該生物材料を透明化する透明化工程Ｂをさらに含み、ここで、界面活性剤と上記透明化工程Ａにおける溶液よりも低い濃度の非イオン性有機ヨウ素化合物とを含む溶液を２以上使用する場合は、非イオン性有機ヨウ素化合物の濃度が低いものから順に上記生物材料の浸漬に供することを特徴とする、請求項１に記載の生物材料の透明化方法。
透明化に先立って、界面活性剤を含み非イオン性有機ヨウ素化合物を含まない溶液に上記生物材料を浸漬する工程をさらに含む、請求項１または２に記載の生物材料の透明化方法。
生物材料を、非イオン性有機ヨウ素化合物を含み屈折率が１．４８超である溶液に浸漬した状態で、顕微鏡によって観察する観察工程を含み、
上記溶液は、２，２’−チオジエタノールを含まないことを特徴とする、生物材料の観察方法。
上記観察工程の前に、界面活性剤を含み非イオン性有機ヨウ素化合物を含まない溶液に上記生物材料を浸漬する工程をさらに含む、請求項４に記載の生物材料の観察方法。
生物材料を顕微鏡によって観察する際に用いるマウント剤であって、
非イオン性有機ヨウ素化合物を含み屈折率が１．４８超である溶液であり、
上記溶液は、２，２’−チオジエタノールを含まないことを特徴とする、マウント剤。
生物材料を透明化して顕微鏡によって観察するために用いるキットであって、
界面活性剤と非イオン性有機ヨウ素化合物とを含む第一の溶液と、
非イオン性有機ヨウ素化合物を含み屈折率が１．４８超である第二の溶液とを備え、
上記第一の溶液および第二の溶液はいずれも、２，２’−チオジエタノールを含まないことを特徴とする、生物材料の観察用キット。