DE102018005064A1

DE102018005064A1 - Verfahren für die 3D Pathologie

Info

Publication number: DE102018005064A1
Application number: DE102018005064.6A
Authority: DE
Inventors: Anmelder Gleich
Original assignee: DODT HANS ULRICH
Current assignee: Technische Universitaet Wien
Priority date: 2018-06-26
Filing date: 2018-06-26
Publication date: 2020-01-02
Also published as: WO2020002251A1

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren, mit dem es möglich ist, ganze Gewebsstücke nach Operationen mit zellulärer Auflösung dreidimensional sichtbar zu machen und aufzunehmen. Insbesondere soll so die komplette dreidimensionale hochaufgelöste Aufnahme von Tumorstücken nach Krebsoperationen möglich werden. Erreicht wird das durch ein Klärverfahren, daß den Tumor durchsichtig und die Zellen durch Autofluoreszens sichtbar macht gefolgt von anschließender schichtweise Aufnahme mit einem Lichtblatt Mikroskop. Hierdurch wird eine dreidimensionale Aufnahme des Gewebes mit hoher Auflösung möglich, so dass sämtliche Krebszellen im Gewebestück erkannt werden können. Durch die komplette Aufnahme des Gewebeblocks wird eine genauere und sichere Krebsdiagnostik möglich als mit der herkömmlichen Untersuchung dünner histologischer Schnitte. Da mit dieser Methode auch Informationen über die dreidimensionale Struktur desTumor erhalten wird, können so zusätzliche Informationen über die Bösartigkeit gewonnen werden.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Vorrichtungen und Verfahren zur schnellen und sicheren und vollständigen Diagnostik von menschlichen Operationspräparaten, insbesondere in der Tumorchirurgie bei Krebserkrankungen.
Stand der Technik
Die Diagnostik nach Operationen findet heute im wesentlichen durch die Untersuchung histologischer Schnitte des Operationsmaterials in der Pathologie statt. Dabei wird das Gewebe, z.B. ein Tumor, zunächst in ½ bis 1 cm dicke Scheiben geschnitten. Von jeder Scheibe wird ein wenige µm dicker histologischer Schnitt hergestellt, der nach Färbung des Gewebes unter dem Mikroskop untersucht wird, um die im Gewebe enthaltenen Zellen sowie deren Verteilung zu bestimmen. So wird eine Diagnose erstellt, ob sich zwischen Tumorgewebe und dem Rand des ausgeschnittenen Gewebeblocks ein ausreichend breiter Streifen gesunden Gewebes befindet. Dieser Sicherheitsabstand beträgt bei Brustkrebsoperationen z.B. 0,5 bis 1 cm und ist unter anderem dadurch bedingt, daß die Pathologen wegen der Größe des Gewebestücks nur alle ½ cm einen histologischen Schnitt herstellen und beurteilen.
Diese Schnitte werden dann zunächst mit mit Hämatoxilin und Eosin gefärbt (HE Färbung), worauf sich bei Bedarf noch weitere Immunologische Färbungen (IHC) an benachbarten Schnitten anschließen.
Diese Selektive Untersuchung des Gewebes läßt sich infolge der Größe des Gewebsstücks nicht umgehen, es wäre in der klinischen Routine nicht praktikabel tausende von histologischen Schnitten herzustellen und zu beurteilen. Allerdings wird der Tumor damit letztendlich nur stichprobenartig beurteilt. Aufgrund dieser Beurteilung wird dann entschieden, ob der Tumor im Gesunden entfernt wurde. Diese Beurteilung ist entscheidend dafür, ob sich an die Operation noch adjuvante Therapien wie Bestrahlung oder Chemotherapien anschließen. Wird fälschlich angenommen daß der gesmte Tumor entfernt wurde, sich in wirklichkeit aber in den nicht beurteilten Schichten noch randständige Tumoranteile befinden, so kommt es zu den gefürchteten Tumor Rezidiven.
Desweiteren kann bei der herkömmlichen Histologie fast keine Aussage über die 3 D Tumorstruktur gemacht werden, die auch noch eine Aussage über die Malignität der Tumors machen könnte und für die Frage der adjuvanten Therapie von Bedeutung ist.
Diese Nachteile der herkömmlichen pathologischen Diagnostik können nun durch die hier vorgeschlagene 3D Mikroskopie geklärter Tumore mit Lichtblattmirkoskopie vermieden werden.
Lösung des technischen Problems
Für die Lösung des technischen Problems stellt die Erfindung ein neuartiges chemischoptisches Verfahren bereit. Dieses beruht im wesentlichen auf der Kombination des Durchsichtigmachens von Tumorgewebe und der dreidimensionalen Registrierung dieses Gewebevolumens mit einem speziellen Lichtblattmikroskop.
Zunächst wird das bei der Operation entnommene Gewebe zur Fixierung in ein herkömmliches Fixiermittel gegeben, wie z.B. Paraformladehyd. Fakultativ kann gleichzeitig oder danach ein Mittel zur Fluoreszensfärbung des Gewebes oder zur Verstärkung seiner Fluoreszens zugegeben werden.
Danach wird das Gewebe entwässert, z.B. durch Einlegen in eine aufsteibende Reihe organischer Lösungsmittel wie z.B. Alkohol oder durch eine chemische Reaktion.
Danach wird das Gewebe durchsichtig gemacht durch Angleichung des optischen Brechungsindex in der Probe durch Einlegen in ein geeignetes Klärmittel wie z.B. Dibenzyl äther (DBE) oder ein Gemisch von Benzylalkokol und Benzlybenzoat (BABB).
Alternativ können auch andere bekannte Gewebeklärverfahren wie Clarity oder Cubic verwendet werden. Hierbei muß allerdings mit einem wochenlangen Klärprozess gerechnet werden, wogegen bei dem hier beschriebenen Klärprozess in eienm bis wenigen Tagen erfolgen kann.
Nach der Gewebeklärung folgt die 3D-Aufnahme im Lichtblattmikroskop. Vorteilhaft für die dreimensionale Auflösung ist hierbei die Verwendung eines Lichtblattes mit möglichst geringer Dicke und möglichst großer Ragleihlänge.
Das Licht kann entweder statisch über Zylinderlinsen in Kombination mir weiteren statischen optischen Elementen erzeugt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird es durch Parallelverschiebung eines dünnen Laserstrahls in der Probe (Scannen) erzeugt wodurch einzelne optische Schnitte entstehen.
Die Aufnahme der optischen Schnitte erfolgt durch ein Mikroskopobjektiv, dessen optische Achse bevorzugt senkrecht oder annähernd senktrecht zum optischen Schnitt steht.
Durch konsekutives Verschieben des Gewebestückes in Richtung der optischen Achse des Mikroskops kann ein Stapel von optischen Schnitten des Gewebes aufgenommen werden.
Diese 3D-Aufnahmen können dabei nacheinander mit Objektiven aufsteigender Vergrößerung macht werden. Dies erlaubt nach einer Übersichtsaufnahme Aufnahmen von z.B. auf Malignität verdächtigen Gewebeteilen mit anschließend höherer Vergrößerung.
Dafür ist das Lichtblattmikroskop vorteilhaft so aufgebaut, daß die Mikroskopobjektive von oben in die Klärlösung eintauchen, sodaß sie schnell nach oben herausgezogen und gewechselt werden können.
Die Probe kann über einen Rechner gesteuert in x,y und z positioniert werden, so daß auch Serien von optischen Schnittstapeln mit hoher Vergrößerung und Auflösung aufgenommen werden können, die dann nachher im Rechner zu einer Gesamtaufnahme der Probe zusammen gesetzt werden können.
Wenn das Lichtblatt dünn genug ist, können so große Tumorvolumen mit isotroper zellulärer Auflösung aufgenommen werden
Da sich der Eindruck der erhaltenen Aufnahmen von dem der üblichen histologischen Schnitte stark unterscheidet wird es nötig sein, histologische und optische Schnitte von genau der gleichen Gewebeebene zu vergleichen.
Dazu wird die Probe nach Klärung und Aufnahme des Fluoreszensbildes zunächst wieder rehydriert, z.B. über eine absteigende Alkoholreihe mit Ethanol oder Methanol, dann wieder in wässriges Medium wie z.B. Paraformaldeyd überführt und dann mit dem üblichen Verfahren in Paraffin eingebettet.
Anschließend werden die üblichen histologischen Schnitte hergestellt, wobei durch genaues Ausmessen und Positionieren der Probe die gleiche Schnittebene wie für die optischen Schnitte eingestellt wird. Bei der Berechnung der Höhe der Schnittebene in der Probe ist Schrumpfung und Ausdehnung der Probe beim Dehydrieren und Rehydrieren zu berücksichtigen.
Von den mechanisch hergestellten histologischen Schnitten werden dann diejenigen identifiziert, die am perfektesten den optischen Schnitten entsprechen. So kann von den Pathologen eine Art „Bibliothek“ erstellt werden, welches Muster im optischen Schnitt welchem bekannten Bild im histologischen Schnitt entspricht. Insbesondere können so die Muster im optischen Schnitt katalogisiert werden, die maligner Entartung, also Krebs, entsprechen.
Die verschiedenen Bildmuster mit ihren jeweiligen pathologischen Korrelaten werden im Rechner abgespeichert. Mit geeigneten Algorithmen des maschinellen Lernens (Deep learning) baut sich zunächst im Rechner eine umfangreiche software basierte Bibliothek pathologischer Veränderungen im optischen Schnittbild auf. Als Hilfe für den Pathologen kann der Rechner auch alle optischen Schnitte in einer vertrauten histologischen Fäbung darstellen. Anhand dieser Veränderung kann der Rechner schließlich für den gesamten Tumorblock eine Diagnose in Bezug auf Art und Malignität histologischer Veränderungen geben.
Bei unklarem Befund können immer noch nach Rehydrierung und Paraffineinbettung von dem suspekten Bereich histologische Schnitte erstellt werden, die dann nach HE- oder immunhistologischer Färbung herkömmlich beurteilt werden können.
Das Verfahren der 3D Mikroskopie geklärter Tumore kann auch schon während der Operation als Ersatz für den sogenannten Schnellschnitt eingesetzt werden, wenn die Geschwindigkeit von Tumorfärbung- und Klärung um 2 Größenordnungen gesteigert wird.
Eine solche wesentliche Steigerung um den Faktor 50x-100x kann durch die Applikation von Mirkowellen und/oder Ultraschallenergie erfolgen. Hierbei werden die vorgehend beschriebenen Schritte der Probenbehandlung in einer histologischen Mikrowelle durchgeführt, was zu einem stark beschleunigten Ablauf der chemischen Prozesse führt. Die Lagerung der Probe in einem Ultraschallfeld, das von einem piezoelektrischen Aktuator erzeugt wird, führt ebenfalls zu Beschleunigung der chemischen Reaktionen.
So kann Klärung und Aufnahme der Probe statt in 1-2 Tagen in einer ½ bis 1 Stunde erfolgen. So kann der Operateur schon während der Operation wissen, ob die Tumorentfernung tatsächlich vollständig war oder ob er noch mehr Gewebe entfernen muß.

Claims

Verfahren zur Diagnostik von Gewebestücken, insbesondere von humanen Operationspräparaten in der Krebschirurgie, gekennzeichnet durch die Kombination von Verfahren zur - zellulären Fluoreszensmarkierung, - dem Durchsichtigmachen des Gewebes und - der 3D Aufnahme des Gewebes mit Lichtblatt-Mikroskopie.
Verfahren nach Anspruch 1 wobei die Fluoreszensmarkierung des Gewebes durch Zugabe eines fluoreszierenden Färbemittels, durch Autofluoreszens aufgrund des Fixationsmittels oder durch immunhistologische Färbung erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1 und 2 wobei das Durchsichtigmachen des Gewebes durch Dehydration mittels aufsteigender Reihe eines Dehydrationsmittels (z.B. Alkohol oder Tetrahydrofuran) oder einer chemischen Reaktion erfolgt mit anschließendem Einlegen in ein Mittel wie z.B. Dibenzläther oder einer Mischung aus Benzylalkohol/Benzylbenzoat, zur Angleichung der optischen Brechungsindices in der Probe.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, wobei die Probe durch Lichtblattmikroskopie in 3D aufgenommen wird.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 4 wobei die Probe wieder rehydriert wird und konventionell histologische Schnitte in interessierenden Ebenen der Probe hergestellt werden unter Verwendung histologischer Färbungen wie HE oder IHC.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei aufgrund benachbarter optischer und histologischer Schnitte eine Bibliothek der den optischen Bildern entprechenden Befunden erstellt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ein Rechner über maschinelles Lernen eine software gestützte Bibliothek zur pathologischen Diagnostik von Gewebeblöcken verwendet.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Probenbehandlung durch Einsatz von Mikrowellenenergie und/oder Ultraschall wesentlich beschleunigt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verfahren während der Operation zur Schnelldiagnostik des entfernten Gewebes verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei andere bekannte Verfahren wie Cubic oder Clarity zur Gewebeklärung und Färbung verwendet werden.