CN108061677B - 用于生物材料的澄清试剂和其用途 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及用于生物材料的澄清试剂和其用途。根据本发明的用于使生物材料透明的澄清试剂是含有作为活性组分的选自由尿素和尿素衍生物组成的组的至少一种化合物，以提供新颖的用于使生物材料透明的澄清试剂的溶液。
Description
本申请是申请日为2011年03月11日，申请号为201180013354.4，发明名称为“用于生物材料的澄清试剂和其用途”的申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及用于使生物材料透明的澄清试剂(clearing reagent)和其用途。
背景技术
对于不透明组织的利用光学显微镜的内部观察来说，进行使用澄清试剂的预处理(用于使对象透明的澄清处理)。
作为澄清试剂和预处理方法的典型的例子，已经知道(i)在专利文献1和非专利文献1中由Ann-Shyn Chiang描述的Focus Clear(产品名称)溶液以及(ii)在非专利文献2中由Hans-Ulrich Dodt等人描述的组织澄清方法。这些都被用于使组织透明以用于对组织中存在的荧光物质的观察。
引用列表
[专利文献]
美国专利第6472216号(专利授权日：2002年10月29日)
[非专利文献]
非专利文献1
Ann-Shyn Chiang等人：Insect NMDA receptors mediate juvenile hormonebiosynthesis.PNAS 99(1)，37-42(2002)。
非专利文献2
Hans-Ulrich Dodt等人：Ultramicroscopy:three-dimensional visualizationof neuronal networks in the whole mouse brain.Nature Methods 4(4)，331-336(2007)。
发明概述
技术问题
Focus Clear溶液含有二甲亚砜(DMSO)和/或类似物作为用于使对象透明的活性组分，难以在活组织上使用。因此，可以对其应用Focus Clear溶液的对象主要地限于固定的样品。
此外，Focus Clear溶液具有非常复杂的组成，由此其制备是复杂的，并且其成本是非常高的。此外，虽然提出，Focus Clear溶液将允许使用荧光蛋白的观察，但是FocusClear溶液使神经组织收缩并且不足以使在深的区域的神经组织的混浊澄清。
同时，Dodt等人的组织澄清方法实质上要求在用于使对象透明的步骤中使用大量的有机溶剂。因此，该方法也难以在活组织上使用，并且可以对其应用该方法的对象主要地限于固定的样品。
此外，如上文描述的，因为组织澄清方法实质上要求使用大量的有机溶剂，所以该方法破环几乎所有的荧光蛋白。因而，使用该方法，难以进行使用荧光蛋白的组织观察。
此外，上文描述的组织澄清方法涉及经历澄清处理的组织的脱水，这是由于它们的组成的本质。然而，该过程导致组织的不可逆收缩。
作出本发明以解决以上的问题，并且本发明的一个目的是提供：新颖的用于使生物材料透明的澄清剂，所述澄清剂含有作为活性组分的具有较高的生物亲和性的组分；以及其用途。
问题的解决方案
为了解决以上的问题，本发明的发明人进行了努力的研究，得到了新的发现，即在具有优良的生物亲和性的组分中，尿素具有使生物材料透明的能力。基于这一点，本发明的发明人得出本发明。
具体地，根据本发明的用于使生物材料透明的澄清试剂包含作为活性组分的选自由尿素和尿素衍生物组成的组的至少一种化合物，所述澄清试剂是溶液。
本发明还提供用于进行使生物材料透明的澄清处理的体系，该体系包含：上文的澄清试剂中的任何澄清试剂；以及已经被分离的生物材料，澄清试剂已经渗透入生物材料中以使生物材料透明。
根据本发明的用于使生物材料透明的方法包括以下步骤：使上文的澄清试剂中的任何澄清试剂渗透入已经被分离的生物材料中，目的是使生物材料被制成透明的。
根据本发明的用于复原已经通过澄清处理被制成透明的的生物材料的方法包括以下步骤：使平衡盐溶液渗透入已经根据上文的方法被制成透明的的生物材料中，目的是使生物材料恢复至生物材料在澄清处理之前具有的状态。
本发明还提供用于进行使生物材料透明的澄清处理的试剂盒，该试剂盒包括上文的澄清试剂中的任何澄清试剂。
本发明的有益效果
本发明提供：新颖的用于使生物材料透明的澄清试剂，该澄清试剂含有作为活性组分的具有较高的生物亲和性的组分；以及其用途。
附图说明
图1
图1关于本发明的实施例，是示出了用根据本发明的用于使生物材料透明的澄清试剂处理的小鼠海马体的视图。
图2
图2关于本发明的另一个实施例，是示出了用根据本发明的用于使生物材料透明的澄清试剂处理的小鼠海马体的视图。
图3
图3关于本发明的又另一个实施例，是示出了用根据本发明的用于使生物材料透明的澄清试剂处理的整个小鼠大脑的视图。
图4
图4关于本发明的还又另一个实施例，是图示了(i)根据本发明的用于使生物材料透明的澄清试剂和(ii)用澄清试剂处理的生物材料的溶胀之间的关系的图。
图5
图5关于本发明的又一个实施例，是示出了用根据本发明的用于使生物材料透明的澄清试剂处理的整个小鼠大脑的视图。
图6
图6关于本发明的还又一个实施例，是示出了已经用根据本发明的用于使生物材料透明的澄清试剂处理的小鼠脑切片的透光度测量的结果的图。
图7
图7关于本发明的另外的实施例，是示出了用根据本发明的用于使生物材料透明的澄清试剂处理的小鼠胎儿的视图。
图8
图8关于本发明的又另外的实施例，是示出了对用根据本发明的用于使生物材料透明的澄清试剂处理的小鼠海马体中的神经祖细胞的观察的结果的视图。
图9
图9是用于在用根据本发明的用于使生物材料透明的澄清试剂或用常规的技术(BABB法)处理的小鼠大脑样品之间的比较的视图。
图10
图10是用于在具有在其中表达的各种荧光蛋白的希拉细胞的结果之间的比较的视图，希拉细胞已经用根据本发明的用于使生物材料透明的澄清试剂或用常规的技术(BABB法)处理。
图11
图11关于本发明的还又另外的实施例，是示出了对具有被移植于其的神经祖细胞的大脑皮层的观察的结果的视图，大脑皮层用根据本发明的用于使生物材料透明的澄清试剂处理。
图12
图12关于本发明的又另外的实施例，是示出了在(i)在使用根据本发明的用于使生物材料透明的澄清试剂的澄清处理之前的生物材料和(ii)在澄清处理之后恢复至它们在澄清处理之前具有的状态的生物材料上的免疫染色的结果的视图。
实施方案的描述
下文将详细地描述本发明的实施方案。
(用于使生物材料透明的澄清试剂的活性组分)
根据本发明的“用于使生物材料透明的澄清试剂”是含有作为用于使生物材料透明的主要活性组分的“尿素”的溶液。
根据本发明的另一个方面的“用于使生物材料透明的澄清试剂”是含有作为用于使生物材料透明的主要活性组分的“尿素衍生物”的溶液。
尿素衍生物不限于任何具体的类型。具体地，例如，尿素衍生物是各种类型的烷基脲或由以下的式(1)表示的化合物中的任何化合物。注意，由式(1)表示的化合物包括烷基脲的一部分。根据本发明的用于使生物材料透明的澄清剂仅需要含有作为活性组分的选自由尿素和尿素衍生物组成的组的至少一种化合物。在这些中，澄清剂更优选地含有尿素。
在由式(1)表示的尿素衍生物中，R1、R2、R3和R4中的每个独立地是氢原子(注意，其中R1至R4中的全部都是氢原子的情况不被包括，因为其相应于尿素)、卤素原子或烃基。此外，在其中烃基具有多个碳原子的情况下，碳原子中的一部分可以被杂原子例如氮原子、氧原子或硫原子代替。烃基的实例包括链烃基和环烃基。
链烃基的实例包括链烷基、链烯基和链炔基。链烃基可以具有任何数量的碳原子。例如，链烃基可以是具有6个或更少的碳原子的直链的或支链的链烃基，优选地，具有1至3个碳原子的烷基。链烃基可以具有取代基例如卤素原子。链烷基的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、己基和辛基。
环烃基可以是例如环烷基或环烯基。环烃基可以具有取代基例如卤素原子。环烷基的实例包括具有3个或更多个并且优选地不多于6个碳原子的那些，例如环丙基、环丁基、环戊基和环己基。环烯基的实例包括具有3个或更多个并且优选地不多于6个碳原子的那些，例如环己烯基。
卤素原子的实例包括氟原子、氯原子、溴原子和碘原子。
以下的1)和2)是由式1表示的尿素衍生物的更优选的具体的实例：
1)选自R1至R4的任何三个基团是氢原子，并且另一个基团是(i)卤素原子或(ii)具有1至6个碳原子的链烃基，更优选地，另一个基团是具有(i)1至3个碳原子或(ii)1或2个碳原子的烷基。
2)选自R1至R4的任何两个基团是氢原子，并且其他的两个基团中的每个独立地是(i)卤素原子或(ii)具有1至6个碳原子的链烃基，更优选地，其他的两个基团二者都是各自具有(i)1至3个碳原子或(ii)1或2个碳原子的烷基。还更优选地，是氢原子的两个基团中的一个选自R1和R2，并且两个基团中的另一个选自R3和R4。
(尿素和/或类似物作为活性组分的用途的优点)
尿素是来源于活生物的极低毒性的物质。因此，根据本发明的“用于使生物材料透明的澄清试剂”具有以下的优点：1)本发明的澄清试剂可以用于不仅使固定的生物材料而且使非固定的(活着的(living))生物材料透明。2)尿素具有相对低的破环荧光蛋白和来自其荧光的猝灭的可能性，并且因此本发明的澄清试剂还适用于利用荧光蛋白对生物材料的观察。3)尿素是成本非常低的并且容易地可获得的，并且此外易于处理；因此，本发明的澄清试剂的使用允许澄清处理以极低的成本并且通过简单的程序被进行。
除了这些优点之外，根据本发明的澄清试剂还具有以下的优点：4)与常规的用于使生物材料透明的澄清试剂相比，本发明的澄清试剂可以很大地改进具有高光散射性质的不透明生物材料的透明度，由此实现对在超深的组织中存在的各种荧光蛋白和荧光物质的观察。5)特别地，对于脑组织来说，本发明的澄清试剂的使用使得以下成为可能：使已经是抵抗对深的部分的观察的阻挡物的白质层透明，由此实现对位于比白质层深的区域(例如胼胝体)的观察。6)使用本发明的澄清试剂的澄清处理是可逆的。具体地，仅通过将已经经受澄清处理的生物材料浸没在平衡盐溶液中，使生物材料恢复至生物材料在澄清处理之前具有的状态是可能的。此外，在澄清处理之前和之后，蛋白质和/或类似物的抗原性是未改变的并且被保持。这允许借助于一般的组织染色或免疫染色的测定。
注意，代替尿素使用上文描述的尿素衍生物可以提供相似的效果。
(表面活性剂)
如果必要的话，根据本发明的“用于使生物材料透明的澄清试剂”可以含有表面活性剂。表面活性剂优选地是非离子型表面活性剂，因为非离子型表面活性剂温和地帮助本发明的澄清试剂向生物组织中的侵入。非离子型表面活性剂的实例包括：脂肪酸表面活性剂，例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单硬脂酸酯和聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯；高级醇表面活性剂例如聚乙烯醇；和烷基酚表面活性剂例如聚氧乙烯辛基苯基醚。具体地，例如，表面活性剂可以是选自由以下组成的组的至少一种：Triton X(注册商标)系列，例如Triton X-100和Triton X-140；Tween(注册商标)系列，例如Tween-20、Tween-40、Tween-60和Tween-80；和NP-40(产品名称)。如果必要的话，两种或更多种类型的混合物可以用作表面活性剂。
这些表面活性剂可以增强尿素相对于生物材料的渗透性，由此改进澄清处理的效率。特别地，在对澄清处理对其是相对地困难的的生物材料(例如脑组织的白质层)的澄清处理中，澄清试剂优选地含有表面活性剂。
注意，如同尿素的情况一样，上文的表面活性剂可以增强尿素衍生物相对于生物材料的渗透性。
(水溶性的大分子化合物)
如果必要的话，根据本发明的“用于使生物材料透明的澄清试剂”还可以含有水溶性的大分子化合物。在此，大分子化合物是指具有例如约50,000至60,000的分子量并且基本上不侵入细胞中的大分子化合物。此外，大分子化合物优选地是不导致生物材料的变性或类似情况的大分子化合物。水溶性的大分子化合物的具体的实例包括交联的蔗糖大分子物质、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮和Percoll(产品名称；通过使用聚乙烯吡咯烷酮膜覆盖硅胶获得的大分子物质)。交联的蔗糖大分子物质的具体的实例包括通过使蔗糖与表氯醇交联(共聚)获得的并且具有约70,000的重均分子量的大分子物质，例如Ficoll PM70(产品名称)。
与尿素和尿素衍生物不同，这些水溶性的大分子化合物不侵入细胞中。此外，这些水溶性的大分子化合物是在水中可溶的。因此，这些水溶性的大分子化合物被认为有助于细胞的内侧和外侧之间的渗透压差的控制。因而，这些水溶性的大分子化合物中的每种帮助待经受澄清处理的生物材料保持其最初的形状，并且特别地有助于防止生物材料的溶胀。在其中根据本发明的澄清试剂具有相对高的渗透压的情况下，澄清试剂优选地含有这些水溶性的大分子化合物中的任何大分子化合物。然而，本发明不限于此。
(其他的组分)
如果必要的话，根据本发明的“用于使生物材料透明的澄清试剂”可以含有“干燥抑制组分”，其是选自甘油、羧基乙烯聚合物(carboxy vinyl polymer)、羟丙基甲基纤维素、丙二醇和聚乙二醇的至少一种化合物。干燥抑制组分防止经受澄清处理的生物材料的干燥。具体地，在其中在澄清处理之后的生物材料可以在其光学显微观察之前被保持等待长时间段的情况下，或在其中生物材料的光学显微观察是耗时的的情况下，本发明的澄清试剂优选地含有上文的干燥抑制组分中的任何干燥抑制组分。
此外，如果必要的话，除了上文描述的“尿素和/或尿素衍生物”、“表面活性剂”和“水溶性的大分子化合物”之外，根据本发明的“用于使生物材料透明的澄清试剂”可以含有添加剂，例如pH调节剂和/或渗透压控制剂。
(溶剂)
根据本发明的“用于使生物材料透明的澄清试剂”是含有尿素在其中可溶的溶剂的溶液。溶剂不限于任何具体的类型，只要尿素在溶剂中是可溶的。优选地，水被用作主要溶剂；特别优选地，仅水被用作溶剂。注意，在本发明中，对于表达“水被用作主要溶剂”，其意指水对所使用的所有溶剂的体积百分数大于任何其他的溶剂的体积百分数，并且优选地，水以占所使用的所有溶剂的总体积的大于50％并且不多于100％的量被使用。通过使用水作为主要溶剂制备的“用于使生物材料透明的澄清试剂”被称为作为水溶液的“用于使生物材料透明的澄清试剂”。
在其中水被用作主要溶剂的情况下，例如，水可以与二甲亚砜(DMSO)混合以应用于固定的样品。预期，例如，DMSO和水的混合物的向固定的样品的使用提供效果，例如(i)澄清试剂相对于生物材料的渗透性的改进和(ii)关于具有角蛋白表面的组织的澄清处理的促进。
水作为溶剂的使用的主要的优点如下：1)是根据本发明的“用于使生物材料透明的澄清试剂”的活性组分的尿素在水中的可分解性是优良的；因此，水作为溶剂的使用使容易地并且以低成本制备用于使生物材料透明的澄清试剂成为可能。2)与其中有机溶剂被用作主要溶剂的情况相比，水作为溶剂的使用不涉及待经受澄清处理的生物材料的脱水；因此，水作为溶剂的使用可以防止生物材料的收缩的问题。3)与其中有机溶剂被用作主要溶剂的情况相比，水作为溶剂的使用显著地减小破环荧光蛋白的可能性；这使利用荧光蛋白观察已经经受澄清处理的生物材料成为可能。4)水作为溶剂的使用使将本发明的澄清试剂不仅应用于对固定的材料的澄清处理而且应用于对活着的材料的澄清处理成为可能。5)水作为溶剂的使用使澄清处理是可逆的(在下文描述)，即，水作为溶剂的使用可以将已经经受澄清处理的生物材料恢复至其在澄清处理之前具有的状态，如果必要的话。6)与其中有机溶剂被用作主要溶剂的情况相比，水作为溶剂的使用增强澄清试剂的处理的安全性。
根据本发明的“用于使生物材料透明的澄清试剂”可以是可以保持适合于待经受澄清处理的生物材料的pH的缓冲剂。此外，根据本发明的“用于使生物材料透明的澄清试剂”可以具有被调整至不导致待经受澄清处理的生物材料的变形并且允许尿素足够地穿透入生物材料中的程度的渗透压。
注意，如同尿素的情况一样，上文的溶剂还可以被用于尿素衍生物。
(组分之间的定量关系)
根据本发明的“用于使生物材料透明的澄清试剂”在被包含在其中的“尿素”的量方面不被特定地限制，只要具有该量的尿素的澄清试剂可以进行对生物材料的澄清处理。注意，澄清试剂中包含的尿素的量的上限由尿素相对于待使用的溶剂的溶解度决定。例如，具有相对少量的尿素的澄清试剂可以通过进行长时间的处理来进行所需要的处理，而具有相对大量的尿素的澄清试剂可以通过进行短时间的处理来进行所需要的处理，但这取决于待经受处理的生物材料的类型。然而，为了实现各种程度的澄清处理，本发明的澄清试剂中的尿素的浓度是优选地1M或更大并且不大于8.5M，更优选地3.5M或更大并且不大于8.5M，特别优选地4M或更大并且不大于8M。在其中尿素衍生物(或尿素和尿素衍生物的混合物)代替尿素使用的情况下，澄清剂中的尿素衍生物(或混合物)的量还可以被设置为与尿素的量相同的量。
在其中“表面活性剂”在本发明的澄清试剂中使用的情况下，澄清试剂在被包含在其中的表面活性剂的量方面不被特定地限制。优选地，表面活性剂以0.025(w/v)％或更大并且不大于5(w/v)％、更优选地0.05(w/v)％或更大并且不大于0.5(w/v)％、特别优选地0.05(w/v)％或更大并且不大于0.2(w/v)％的浓度被包含在其中。注意，单位“(w/v)％”代表所使用的表面活性剂的重量(w(克))相对于澄清试剂的体积(v(毫升))的百分数。
在其中“水溶性的大分子化合物”在本发明的澄清试剂中使用的情况下，澄清试剂在被包含在其中的水溶性的大分子化合物的量方面不被特定地限制。优选地，水溶性的大分子化合物以2.5(w/v)％或更大并且不大于40(w/v)％的浓度被包含在其中。此外，考虑到对于生物材料的溶胀防止效果和在澄清处理之后生物材料的折射率之间的平衡，上文的浓度是更优选地5(w/v)％或更大并且不大于25(w/v)％，还更优选地10(w/v)％或更大并且不大于20(w/v)％，特别优选地10(w/v)％或更大并且不大于15(w/v)％。注意，单位“(w/v)％”代表所使用的水溶性的大分子化合物的重量(w(克))相对于澄清试剂的体积(v(毫升))的百分数。
在其中“干燥抑制组分”例如甘油在本发明的澄清试剂中使用的情况下，澄清试剂在被包含在其中的干燥抑制组分的量方面不被特定地限制。优选地，干燥抑制组分以2.5(w/v)％或更大并且不大于20(w/v)％，更优选地5(w/v)％或更大并且不大于15(w/v)％，特别优选地8(w/v)％或更大并且不大于12(w/v)％的浓度被包含在其中。注意，单位(w/v)％代表所使用的干燥抑制组分的重量(w(克))相对于澄清试剂的体积(v(毫升))的百分数。
(受试生物材料)
使用本发明的“用于使生物材料透明的澄清试剂”的待经受澄清处理的生物材料不限于任何具体的类型。优选地，生物材料是来源于植物或动物的材料，更优选地来源于动物例如选自鱼、两栖动物、爬虫、鸟和哺乳动物的动物的材料，特别优选地来源于哺乳动物的材料。哺乳动物不限于任何具体的类型，其实例包括：实验动物，例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠和除了人类之外的灵长类；宠物动物例如狗和猫；家畜例如牛和马；以及人类。
可选择地，生物材料可以本身是个体(除了活的人类个体之外)。
还可选择地，生物材料可以是从多细胞生物的个体取得的器官、组织或细胞。本发明的“用于使生物材料透明的澄清试剂”具有优良的使对象透明的能力；因此，即使生物材料是来源于多细胞动物的组织或器官(例如脑的全部或一部分)或不是人类的多细胞动物的个体本身(例如胚胎)，生物材料也可以经受澄清处理。
此外，生物材料可以是(i)被固定用于望远镜观察的材料和(ii)非固定材料中的任一个。在使用固定材料的情况下，材料优选地在经受固定过程之后被充分地(例如24小时或更多)浸没在例如20(w/v)％蔗糖-PBS溶液中。此外，优选地，该材料被嵌入OCT化合物中并且被液氮冷冻，在PBS中解冻，并且然后再次被4(w/v)％PFA-PBS溶液固定。
生物材料的具体的实例包括：具有被注射于其的荧光化学物质的生物组织；被荧光化学物质染色的生物组织；具有被移植于其的经荧光蛋白表达的细胞的生物组织；以及从荧光蛋白在其中被表达的转基因动物取得的生物组织。
(用于生物材料的澄清试剂的特别优选的组成的实例)
下文将描述根据本发明的“用于使生物材料透明的澄清试剂”的特别优选的组成的实例。以下的澄清试剂非常适合于特别地对脑的全部或一部分(例如海马体或大脑的全部或一部分)或哺乳动物例如小鼠的胚胎的澄清处理。注意，在实施例1至9(在下文描述)中使用的用于使生物材料透明的澄清试剂还满足下文描述的澄清试剂(1)至(4)的以下的条件：
●用于使生物材料透明的澄清试剂(1)：
通过将尿素以4M或更大并且不大于8M的浓度溶解在水中获得的水溶液。
●用于使生物材料透明的澄清试剂(2)：
通过将(i)尿素以4M或更大并且不大于8M的浓度、(ii)非离子型表面活性剂(例如Triton X-100)以0.05(w/v)％或更大并且不大于0.2(w/v)％的浓度以及(iii)干燥抑制组分(例如甘油)以8(w/v)％或更大并且不大于12(w/v)％的浓度溶解在水中获得的水溶液。
●用于使生物材料透明的澄清试剂(3)：
通过将(i)尿素以4M或更大并且不大于8M的浓度、(ii)非离子型表面活性剂(例如Triton X-100)以0.05(w/v)％或更大并且不大于0.2(w/v)％的浓度、(iii)干燥抑制组分(例如甘油)以8(w/v)％或更大并且不大于12(w/v)％的浓度以及(iv)水溶性的大分子化合物(例如Ficoll)以5(w/v)％或更大并且不大于25(w/v)％的浓度溶解在水中获得的水溶液。
●用于使生物材料透明的澄清试剂(4)：
通过将(i)尿素以4M或更大并且不大于8M的浓度、(ii)非离子型表面活性剂(例如Triton X-100)以0.05(w/v)％或更大并且不大于0.2(w/v)％的浓度以及(iii)二甲亚砜(DMSO)以8(w/v)％或更大并且不大于12(w/v)％的浓度溶解在水中获得的水溶液。
在其中尿素衍生物(或尿素和尿素衍生物的混合物)代替尿素使用的情况下，澄清试剂(1)至(4)可以使用以与上文描述的尿素的浓度相同的浓度的尿素衍生物(或混合物)来制备。
(用于使生物材料透明的澄清试剂的制备)
用于制备根据本发明的“用于使生物材料透明的澄清试剂”的方法包括将(i)“尿素和/或尿素衍生物”和(ii)“表面活性剂”、“水溶性的大分子化合物”、“干燥抑制组分”和/或类似物(如果必要的话，其中的每种被使用)溶解在溶剂中。用于将组分溶解或混合在溶剂中的程序不被特定地限制。
(使用用于使生物材料透明的澄清试剂的澄清处理的方法的实例)
利用根据本发明的“用于使生物材料透明的澄清试剂”对生物材料澄清处理的方法包括用于使澄清试剂渗透入生物材料中的步骤(澄清处理步骤)。更具体地，该步骤使澄清试剂在用于澄清处理的容器中渗透入生物材料中。
在澄清处理步骤中，是澄清试剂还是生物材料首先被储存在用于澄清处理的容器中不被特定地限制。优选地，澄清试剂首先被储存在容器中，并且然后生物材料被储存在其中(即生物材料被放置入澄清试剂中)。
进行上文的澄清处理步骤的处理温度不被特定地限制；优选地，处理温度在15℃或更高并且不高于45℃的范围内。进行澄清处理的处理时间不被特定地限制；优选地，处理时间在两小时或更长并且不长于六个月、更优选地12小时或更长并且不长于七天的范围内。进行澄清处理的压力不被特定地限制。
在上文的澄清处理步骤中使用并且已经经受澄清处理的生物材料被储存在其中的用于澄清处理的容器可以被保藏，例如，在室温或在低温环境中，直到容器在下文描述的观察步骤中被使用。(用于在澄清处理之后保藏样品的步骤)
(用于对已经经受澄清处理的生物材料的观察的步骤)
然后对已经经受澄清处理的生物材料进行通过例如光学显微镜的观察步骤。对待经受观察步骤的生物材料，如果必要的话，可视化处理步骤(例如染色或标记)可以(i)在澄清处理步骤之前或(ii)在澄清处理步骤之后但是在观察步骤之前被进行。
例如，在其中可视化处理步骤涉及荧光蛋白的使用的情况下，荧光蛋白基因在澄清处理步骤之前被转移入活的生物材料中，使得荧光蛋白将在其中被表达。
在其中可视化处理步骤是(i)向生物材料中注射荧光化学物质(其不是荧光蛋白)或(ii)使用荧光化学物质染色生物材料的情况下，可视化处理步骤优选地在澄清处理步骤之前进行。然而，这样的可视化处理步骤可以在澄清处理步骤之后进行。可选择地，可视化处理步骤可以是使用不是荧光化学物质的化学物质染色生物材料。
观察步骤可以利用任何类型的光学显微镜来进行。例如，观察步骤可以通过采用三维超分辨率显微技术(例如STED、3D PALM、FPALM、3D STORM或SIM)来进行。优选地，观察步骤通过采用多光子激发型(通常是双光子激发型)光学显微技术来进行。
(其他的应用)
使用根据本发明的“用于使生物材料透明的澄清试剂”的澄清处理是可逆的。因而，已经经受澄清处理的生物材料可以恢复至其在澄清处理之前具有的状态，例如通过将生物材料浸没在平衡盐溶液中从而从其除去澄清试剂的组分。在此，平衡盐溶液的具体的实例包括：由磷酸盐缓冲的平衡盐溶液(例如PBS和HBSS)；由三盐酸盐缓冲的平衡盐溶液(TBS)；人工脑脊液(ACSF)；以及用于细胞培养的基础培养基，例如MEM、DMEM和Ham's F-12。
澄清试剂的使用在澄清处理之前和之后或在其中在澄清处理之后生物材料恢复至其在澄清处理之前具有的状态的情况下不导致生物材料中的蛋白质等等的变性或类似情况。因此，生物材料中的蛋白质等等的抗原性被维持为未改变的。因而，例如，在生物材料经受澄清处理和光学显微观察之后，生物材料可以恢复至其在澄清处理之前具有的状态，从而经受例如借助于通常使用的组织染色或免疫染色的详细的测定。
(用于进行使生物材料透明的澄清处理的试剂盒)
根据本发明的“用于进行使生物材料透明的澄清处理的试剂盒”包括上文描述的“用于使生物材料透明的澄清试剂”。“用于进行使生物材料透明的澄清处理的试剂盒”还可以包括选自以下的至少一种：在澄清处理步骤中使用的“用于澄清处理的容器”；“生物材料保持工具(例如镊子)”；用于将已经经受澄清处理的生物材料恢复至其在澄清处理之前具有的状态的“平衡盐溶液”；以及“试剂盒的使用说明书”。
(用于进行使生物材料透明的澄清处理的体系)
根据本发明的用于进行使生物材料透明的澄清处理的体系包括：根据本发明的“用于使生物材料透明的澄清试剂”；和已经被分离的上文描述的“生物材料”。此外，在该体系中，澄清试剂已经渗透入生物材料中从而使生物材料透明。即，该用于澄清处理的体系的概念包括例如(i)包含在澄清处理的中间阶段中的生物材料的处理体系或(ii)包含已经对其完成澄清处理的生物材料的处理体系。
(本发明的各种实施方案)
如上文描述的，根据本发明的用于使生物材料透明的澄清试剂包含作为活性组分的选自由尿素和尿素衍生物组成的组的至少一种化合物，澄清试剂是溶液。
在具有上文的配置的根据本发明的用于使生物材料透明的澄清试剂中，尿素更优选地作为活性组分被包含。
具有上文的配置的根据本发明的用于使生物材料透明的澄清试剂更优选地是水溶液。
具有上文的配置的根据本发明的用于使生物材料透明的澄清试剂更优选地包含表面活性剂。
在具有上文的配置的根据本发明的用于使生物材料透明的澄清试剂中，表面活性剂更优选地是非离子型表面活性剂。
在具有上文的配置的根据本发明的用于使生物材料透明的澄清试剂中，非离子型表面活性剂更优选地是选自由Triton X(注册商标)、Tween(注册商标)和NP-40(产品名称)组成的组的至少一种。
具有上文的配置的根据本发明的用于使生物材料透明的澄清试剂更优选地包含水溶性的大分子化合物。
在具有上文的配置的根据本发明的用于使生物材料透明的澄清试剂中，水溶性的大分子化合物更优选地是选自由Percoll(注册商标)、Ficoll(注册商标)、聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮组成的组的至少一种。
在具有上文的配置的根据本发明的用于使生物材料透明的澄清试剂中，尿素更优选地以1M或更大并且不大于8.5M的浓度被包含，表面活性剂更优选地以0.025(w/v)％或更大并且不大于5(w/v)％的浓度被包含，并且水溶性的大分子化合物更优选地以2.5(w/v)％或更大并且不大于40(w/v)％的浓度被包含。
根据本发明的用于使生物材料透明的澄清试剂更优选地还包含选自由甘油、羧基乙烯聚合物、羟丙基甲基纤维素、丙二醇和聚乙二醇组成的组的至少一种。
根据本发明的用于使生物材料透明的澄清试剂优选地使(i)来源于多细胞动物的组织或器官或(ii)不是人类的多细胞动物透明。
本发明还提供用于进行使生物材料透明的澄清处理的体系，该体系包含：上文的澄清试剂中的任何澄清试剂；以及已经被分离的生物材料，澄清试剂已经渗透入生物材料中以使生物材料透明。
根据本发明的用于使生物材料透明的方法包括以下步骤：使上文的澄清试剂中的任何澄清试剂渗透入已经被分离的生物材料中，目的是使生物材料被制成透明的。
根据本发明的用于复原已经通过澄清处理被制成透明的的生物材料的方法包括以下步骤：使平衡盐溶液渗透入已经根据上文的方法被制成透明的的生物材料中，目的是使生物材料恢复至生物材料在澄清处理之前具有的状态。
本发明还提供用于进行使生物材料透明的澄清处理的试剂盒，该试剂盒包括上文的澄清试剂中的任何澄清试剂。
[实施例]
下文将参照以下的实施例、比较实施例等等进一步具体地描述本发明。然而，本发明不限于这些。
[实施例1：对海马体的观察]
(用于灌注固定的步骤)
使用在出生后7至8星期龄的具有在其神经系统的神经元中表达的荧光蛋白YFP(YFP-H系：由美国哈佛大学的Josh Sanes教授提供[参考文献]Feng等人.Neuron,28：41-51,2000)的转基因小鼠。使用蠕动泵将冰冷的PBS从小鼠的左心室灌注，并且然后灌注冰冷的固定液(4％多聚甲醛-PBS，pH 7.4)，使得小鼠被全身地固定。
(用于生物材料的取出和固定的步骤)
然后，将颅骨从小鼠除去，并且将海马体从其小心地取出。然后，将被取出的海马体浸没在冰冷的固定液(4％多聚甲醛-PBS，pH 7.4)中在4℃下一个晚上。然后，将海马体转移入20％蔗糖-PBS溶液中，并且然后在4℃下轻轻地摇动24小时。
然后，在海马组织被20％蔗糖-PBS溶液完全地代替之后，海马体被嵌入OCT化合物中，并且然后被液氮冷冻。然后，将被冷冻的海马体放置入PBS中，并且在室温解冻。将被解冻的海马体在4％多聚甲醛-PBS中再固定一小时。
(用于生物材料的澄清处理和观察的步骤)
最后，将被再固定的海马体浸没在根据本实施例的用于使生物材料透明的澄清试剂中并且在室温摇动三天。澄清试剂是通过将4M尿素溶解在纯水中制备的水溶液。在当澄清处理已经前进的点(处理开始之后三天)，海马体被嵌在琼脂糖凝胶(浓度：0.5％(w/v)或更小)中，并且利用设置有具有920nm的波长的激光的直立双光子显微镜(产品名称：FV1000MPE，由Olympus Corporation制造)从其底部侧向顶部表面侧观察。注意，在观察中使用的物镜具有2mm的工作距离。
观察的结果在图1中示出。如图1中所示的，利用根据本实施例的澄清试剂进行澄清处理可以允许对在深度上约1.9mm的范围(相应于生物材料的厚度)的清楚的观察，该范围覆盖海马体的齿状回(DG)、CA 1和顶部表面。
[实施例2：对海马体的观察和对试剂的研究]
根据与实施例1的方法相同的方法观察小鼠海马体，除了以下之外：(i)实施例2使用通过将4M尿素、0.1％(w/v)Triton X-100和10％(w/v)甘油溶解在纯水中制备的水溶液(被称为SCALE-A2试剂)，作为在“用于进行使生物材料透明的澄清处理的步骤中”使用的澄清试剂，以及(ii)实施例2进行从海马体的顶部表面侧向底部侧的观察。
观察的结果在图2中示出。如图2中所示的，利用根据本实施例的澄清试剂的澄清处理可以允许对在深度上约2mm的范围(相应于生物材料的厚度)的清楚的观察，该范围覆盖海马体的顶部表面、CA 1、齿状回(DG)和底部。
[实施例3：对大脑的观察]
根据与实施例1的方法相同的方法观察小鼠大脑，除了以下的点1)至3)之外：
1)在实施例3的“用于生物材料的取出和固定的步骤”中，大脑的全部被取出和固定，并且被固定的大脑被用作生物材料。
2)在实施例3的“用于生物材料的澄清处理和观察的步骤”中，与在实施例2中使用的SCALE-A2试剂相同的SCALE-A2试剂被用作用于使生物材料透明的澄清试剂。
3)在实施例3的“用于生物材料的澄清处理和观察的步骤”中，具有3mm的工作距离的物镜被用于进行从大脑顶部表面(大脑皮层)侧向海马体侧的观察。
观察的结果在图3中示出。如图3中所示的，利用根据本实施例的澄清试剂进行澄清处理可以允许对在深度上约3mm的范围(物镜的工作极限)的清楚的观察，该范围覆盖，当然，大脑皮层和层V-VI，并且还覆盖大脑皮层下方的白质区域(胼胝体)、海马体的纤维束(fiber tract)以及甚至构成齿状回(DG)的CA 1的细胞组等等。
注意，常规的澄清试剂不能够使大脑皮层下方的白质区域透明，并且因此不允许对比白质区域深的范围的观察。
[实施例4：对试剂的研究]
根据以下的条件，评估以下的项目：(i)SCALE-A2试剂溶胀生物材料的程度；以及(ii)与SCALE-A2试剂共同地使用Ficoll的溶胀防止测量的效果。
1)首先，小鼠大脑经受利用SCALE-A2试剂的澄清处理，根据与实施例3中描述的方法相同的方法，除了澄清处理被进行两天以外。然后，测量已经经受澄清处理的大脑的体积。注意，两天澄清处理足以使小鼠大脑透明至允许观察的程度。
2)小鼠大脑以与1)相同的方式经受澄清处理，除了分别具有被加入其中的5％(w/v)Ficoll和20％(w/v)Ficoll的SCALE-A2试剂被用作澄清试剂以外。然后，测量已经经受澄清处理的大脑的相应的体积。
3)作为对照，将小鼠大脑浸没在PBS中，并且在浸没之后立即地(在浸没之后0天)测量其体积。
观察的结果在图4中示出。图4示出了，与对照(在图4中被表示为“PBS”)相比，已经经受上文的处理1)的大脑(在图4中被表示为“SCALE-A2”)溶胀。同时，已经经受上文的处理2)的大脑的溶胀根据被加入的Ficoll的量被减少。具体地，具有被加入其中的20％(w/v)Ficoll的澄清试剂的使用将溶胀减少85％或更多(在图4中被表示为“SCALE-A2+20％Ficoll”)。
尚未溶胀或收缩的大脑是特别优选的；然而，已经溶胀或收缩的大脑也可以是作为样品被光学显微镜可观察的。
[实施例5]
根据与实施例1的方法相同的方法观察小鼠大脑，除了以下的点1)和2)以外：
1)在实施例5的“用于生物材料的澄清处理和观察的步骤”中，用于使生物材料透明的澄清试剂是通过将4M尿素、0.1％(w/v)Triton X-100、10％(w/v)甘油和10％(w/v)Ficoll溶解在纯水中制备的水溶液，并且澄清处理被进行三天。
2)在实施例5的“用于生物材料的澄清处理和观察的步骤”中，具有2mm的工作距离的物镜被用于进行从大脑顶部表面(大脑皮层)侧向海马体侧的观察。
观察的结果在图5中示出。如图5中所示的，利用根据本实施例的澄清试剂的澄清处理可以允许对在深度上约2.16mm的范围(物镜的工作极限)的清楚的观察，该范围覆盖，当然，大脑皮层和层V-VI，并且还覆盖大脑皮层下方的白质区域(胼胝体)、海马体的纤维束(fiber tract)以及甚至构成CA1的细胞组等等。
注意，常规的澄清试剂不能够使大脑皮层下方的白质区域透明，并且因此不允许对比白质区域深的范围的观察。
[实施例6：对透光度的评估]
将小鼠脑切片(厚度：60微米)分别使用(i)水、(ii)PBS、(iii)8M尿素水溶液(澄清试剂)、(iv)4M尿素水溶液(澄清试剂)、(v)澄清试剂SCALE-A2(包含4M尿素、0.1％(w/v)Triton X-100和10％(w/v)甘油的水溶液)和(vi)澄清试剂SCALE-D2(包含4M尿素+0.1％(w/v)Triton X-100和10％(w/v)DMSO的水溶液)处理一天。然后，测量每个小鼠脑切片的大脑皮层部分相对于具有200nm至1000nm的波长的光的透光度。注意，从200nm至1000nm的光波长带覆盖(i)在双光子显微观察中普遍地使用的激发波长范围和(ii)待观察的荧光蛋白的主要荧光波长的范围二者。
注意，透光度测量利用多通道检测器PMA-2(Hamamatsu Photonics K.K.)来进行。测量的结果在图6中示出。如图6中所示的，分别使用8M尿素水溶液、4M尿素水溶液、澄清试剂SCALE-A2和澄清试剂SCALE-D2处理的样品的透光度各自是80％或更多。即，这些样品展示澄清处理的突出的效果，与使用水或PBS处理的样品不同。
[实施例7：用于使小鼠胎儿透明的澄清处理]
将在13.5天的胎儿期的被Fucci-S-Green(Fucci-S/G2/M)表达的转基因小鼠胎儿(通过对由Laboratory for Cell Function Dynamics，Brain Science Institute，RIKEN生产的小鼠的繁殖获得[参考文献：Sakaue-Sawano等人，Cell，132(3)：487-98，2008.])使用4(w/v)％PFA-PBS固定两天，并且然后浸没在20(w/v)％蔗糖-PBS溶液中。然后，将胎儿一次冷冻，并且然后解冻。然后，将胎儿再次使用4(w/v)％PFA-PBS固定一小时。然后，将胎儿浸没在实施例2中描述的SCALE-A2中七天以进行澄清处理。
然后，将胎儿嵌在琼脂糖凝胶(浓度：0.5％(w/v)或更小)中，并且利用荧光立体显微镜(产品名称：MZ10F，由Leica Microsystems制造)观察。注意，在观察中使用的物镜具有70mm的工作距离。
观察的结果在图7中示出。如图7中所示的，通过进行利用根据本实施例的澄清试剂的澄清处理，小鼠胎儿的整个身体被制为突出地透明的，虽然仅其肝脏具有小的黄色部分被留下。注意，图7中示出的安装橡胶(mr)被用于支撑小鼠胎儿的头部。
[实施例8：对小鼠海马体中的神经祖细胞的观察]
(用于灌注固定的步骤)
使用在出生后六个星期龄的被Fucci-S-Green(Fucci-S/G2/M)表达的转基因小鼠(通过对由Laboratory for Cell Function Dynamics，Brain Science Institute，RIKEN生产的小鼠的繁殖获得[参考文献]Sakaue-Sawano等人，Cell，132(3)：487-98，2008.)。使用蠕动泵将冰冷的PBS从小鼠的左心室灌注，并且然后灌注冰冷的固定液(4％多聚甲醛-PBS，pH 7.4)，使得小鼠被全身地固定。
(用于生物材料的取出和固定的步骤)
然后，将颅骨从小鼠除去，并且将海马体的齿状回从其小心地取出。然后，将被取出的海马体的齿状回浸没在冰冷的固定液(4％多聚甲醛-PBS，pH 7.4)中在4℃下一个晚上。然后，将海马体的齿状回转移入20％蔗糖-PBS溶液中，并且然后在4℃下轻轻地摇动24小时。
然后，在海马体的齿状回被20％蔗糖-PBS溶液完全地代替之后，海马体的齿状回被嵌入OCT化合物中，并且然后被液氮冷冻。然后，将被冷冻的海马体的齿状回放置入PBS中，并且在室温解冻。将被解冻的海马体的齿状回在4％多聚甲醛-PBS中再固定一小时。
注意，在本实施例中使用的齿状回的血管被凝集素-德州红共轭物(Lectin-TexasRed conjugate)染色。
(用于生物材料的澄清处理和观察的步骤)
最后，将被再固定的海马体的齿状回浸没在根据本实施例的用于使生物材料透明的澄清试剂中三天并且在室温摇动。澄清试剂是通过将4M尿素、0.1％(w/v)Triton X-100和10％(w/v)甘油溶解在纯水中制备的水溶液。在当澄清处理已经前进的点(处理开始之后三天)，海马体的齿状回被嵌在琼脂糖凝胶(浓度：0.5％(w/v)或更小)中，并且利用设置有具有920nm的波长的激光的直立双光子显微镜(产品名称：FV 1000MPE，由OlympusCorporation制造)观察。注意，在观察中使用的物镜具有2mm的工作距离。观察在18个连贯的视场上进行，从海马体的腹面至1.7mm深度。然后，观察的结果被组合为集成的图像。
观察的结果在图8中示出。如图8中所示的，证实，利用根据本实施例的澄清试剂的澄清处理允许观察到Fucci-S-Green(Fucci-S/G2/M)-阳性的神经祖细胞围绕血管存在。
[实施例9：关于神经祖细胞的移植的观察]
获得来源于被荧光蛋白Venus表达的成年大鼠的海马体的神经祖细胞。然后，将所获得的神经祖细胞移植入Fischer F344-系大鼠(从Japan SLC,Inc.购买)的大脑皮层部分(在层V附近，在深度上约1.7mm)。
在神经祖细胞的移植之后三天，将Fischer F344-系大鼠根据在实施例8的(用于灌注固定的步骤)中描述的方法固定。然后，根据在实施例8的(用于生物材料的取出和固定的步骤)中描述的方法，固定Fischer F344-系大鼠的大脑皮层。注意，在本实施例中使用的大鼠大脑皮层的血管被凝集素-德州红共轭物染色。
然后，根据在实施例8的(用于生物材料的澄清处理和观察的步骤)中描述的方法，观察大脑皮层。观察的结果在图11中示出。如图11中所示的，进行利用根据本实施例的澄清试剂的澄清处理允许观察到，被荧光蛋白Venus表达的神经祖细胞已经聚集在血管(被凝集素德州红共轭物染色)附近。因此，本发明的方法适合于对细胞在移植之后的运动、形态的改变和类似物的观察。
[比较实施例1：与BABB法(1)的比较]
使用在出生后12星期龄的每个具有被在其神经系统中表达的荧光蛋白YFP(YFP-H系：由美国哈佛大学的Josh Sanes教授提供[参考文献]Feng等人.Neuron，28：41-51，2000)的转基因小鼠。从小鼠取出大脑。然后，将使用SCALE-A2试剂(本发明：见实施例2)的澄清处理与根据在非专利文献2中由Dodt等人描述的苯甲酸苄酯/苄醇(BABB)方法的澄清处理进行比较。
澄清处理中的每个以使得大脑被浸没在澄清处理溶液中两天的方式进行。在BABB法中使用的澄清处理溶液主要由苄醇和苯甲酸苄酯(其之间的组成比率＝1:2)组成。
结果在图9中示出。在图9中，被表示为“透射”和“YFP”的相应的柱的上部分示出了使用SCALE-A2试剂的处理的结果，而其下部分示出了根据BABB法的处理的结果。注意，柱“透射”示出了利用透射显微镜的观察的结果，而柱“YFP”示出了利用荧光显微镜对来自YFP的荧光的观察的结果。
如图9中所示的，对于使用SCALE-A2试剂的澄清处理，清楚地观察到由YFP发出的荧光是可能的。在另一方面，对于根据BABB法的澄清处理，大脑被关键地收缩，并且来自YFP的荧光显著地衰减。
[比较实施例2：与BABB法(2)的比较]
将编码各种荧光蛋白的基因分别转移入希拉细胞(由The Institute of MedicalScience，The University of Tokyo提供；Scherer等人，J.Exp.Med.97(5)：695-710，1953)中，使得相应的荧光蛋白被在其中表达。被表达的荧光蛋白是SECFP、EGFP、mAGl、Venus和DsRed(EGFP和DsRed的使用的许可证从Clontech Laboratories,Inc.获得；mAGl的使用的许可证从Medical&Biological Laboratories Co.,Ltd.获得；Venus和SECFP通过引入基于GFP的基因突变来产生，Laboratory for Cell Function Dynamics，Brain ScienceInstitute，RIKEN.[参考文献]SECFP，Hadjantonakis等人，BMC BiotechnoL，2:11，2002.：EGFP，Zhang等人Biochem.Biophys.Res.Commun.，227：707-711，1996.：Venus，Nagai等人，Nat.Botech.，20：87-90，2002.：mAG 1，Karasawa等人，J.Biol.Chem.，278(36)：34167-34171，2003.：Baird等人，PNAS.，97(22)：11984-11989，2000.)。
然后，以与比较实施例1中相同的方式，进行使用SCALE-A2试剂(见实施例2)的澄清处理以及根据在非专利文献2中由Dodt等人描述的苯甲酸苄酯/苄醇(BABB)方法的澄清处理，并且将这两种处理与彼此进行比较。
观察的结果在图10中示出。图10示出了在澄清处理之后来自荧光蛋白的荧光强度相对于在澄清处理之前来自荧光蛋白的荧光强度(＝100)的相对值。如从图10清楚的，在每种情况下，使用SCALE-A2试剂(本发明：见实施例2)的澄清处理保持来自荧光蛋白的荧光强度的80％或更多。在另一方面，在每种情况下，根据BABB法的澄清处理导致来自荧光蛋白的荧光强度的显著的减少。
[实施例10：在澄清处理之后的组织的复原]
从GFP转基因小鼠和YFP转基因小鼠(GFP-M系和YFP-H系，由美国的哈佛大学的Josh Sanes教授提供)的海马体，制备2.5mm-厚度切片。然后，这些切片经受使用SCALE-A2试剂(见实施例2)的澄清处理五天，使得切片被一次制成透明的。然后，将切片使用PBS漂洗三次，使得切片中的组织恢复至不透明状态。将在不透明状态中的切片在免疫染色性质的方面与尚未经受使用SCALE-A2试剂的澄清处理的切片进行比较。
免疫染色被如下地进行：作为一级抗体，使用(i)识别在不成熟神经细胞的表面上存在的PSA-NCAM的聚唾液酸的小鼠源抗唾液酸神经细胞粘附分子(PSA-NCAM)单克隆抗体(Millipore Corporation)以及(ii)识别对星形神经胶质特异的中间丝状体GFAP的兔子源抗胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)多克隆抗体(Sigma-Aldrich)，并且使它们与切片中的它们的相应的靶蛋白在4℃下反应24小时。然后，使用PBS漂洗切片。然后，使抗PSA-NCAM单克隆抗体与Alexa Fluor 546标记的抗小鼠IgM抗体(Invitrogen，Molecular Probes)(被用作二次抗体)在室温下反应三小时；并且使GFAP多克隆抗体与Alexa Fluor 633标记的抗兔IgG抗体(Invitrogen,Molecular Probes)(被用作二次抗体)在室温下反应三小时。以这种方式，切片被免疫组织化学染色。因为来自这些切片的荧光不衰减，所以获得三重荧光(包含GFP和YFP的荧光)染色图像。观察利用倒置共焦激光显微镜(FV500，OlympusCorporation)使用20倍率物镜(UplanApo20，Olympus Corporation)来进行。
如图12中所示的，在使用SCALE-A2的处理之前(图12中的“SCALE之前”)和之后(图12中的“复原之后”)，(i)在海马体的齿状回中存在的不成熟神经元和(ii)从不成熟神经元向CA3区域延伸的苔藓纤维被抗PSA-NCAM单克隆抗体染色，基本上没有问题。相似地，星形神经胶质也被抗GFAP多克隆抗体染色，没有任何问题。
本发明不限于上文的实施方案和实施例的描述，但是可以被技术人员在权利要求的范围内改变。基于在不同的实施方案中所公开的技术手段的合适的组合的实施方案被包括在本发明的技术范围内。
工业实用性
本发明提供：新颖的用于使生物材料透明的澄清试剂，澄清试剂包含作为活性组分的具有较高的生物亲和性的组分；以及其用途。
Claims (21)
1.一种用于观察生物材料的方法，包括以下步骤：
使澄清试剂渗透入已经被分离的生物材料中的澄清处理步骤，目的是使所述生物材料被制成透明的，其中，荧光蛋白基因在所述澄清处理步骤之前被转移入活的生物材料中，使得所述荧光蛋白将在其中被表达，所述澄清试剂包含作为活性组分的选自由尿素和尿素衍生物组成的组的至少一种化合物，所述澄清试剂是溶液，并且所述澄清试剂还包含非离子型表面活性剂；以及
利用光学显微镜观察来自处于已经被制成透明的所述生物材料的内部的所述荧光蛋白的荧光的观察步骤。
2.如权利要求1所述的方法，其中：
尿素作为所述活性组分被包含。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述澄清试剂是水溶液。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述澄清试剂是水溶液。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述非离子型表面活性剂以0.025w/v％或更大并且不大于5w/v％的浓度被包含。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述非离子型表面活性剂以0.05w/v％或更大并且不大于0.2w/v％的浓度被包含。
7.如权利要求6所述的方法，其中：
所述非离子型表面活性剂是选自由Triton X-100、Triton X-140、Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80和NP-40组成的组的至少一种。
8.如权利要求3-4和6-7中任一项所述的方法，所述澄清试剂还包含水溶性的大分子化合物。
9.如权利要求5所述的方法，所述澄清试剂还包含水溶性的大分子化合物。
10.如权利要求8所述的方法，其中：
所述水溶性的大分子化合物是选自由如下组成的组中的至少一种：通过使用聚乙烯吡咯烷酮膜覆盖硅胶获得的大分子物质、通过使蔗糖与表氯醇交联或共聚获得并且具有约70,000的重均分子量的大分子物质、聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮。
11.如权利要求9所述的方法，其中：
所述水溶性的大分子化合物是选自由如下组成的组中的至少一种：通过使用聚乙烯吡咯烷酮膜覆盖硅胶获得的大分子物质、通过使蔗糖与表氯醇交联或共聚获得并且具有约70,000的重均分子量的大分子物质、聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮。
12.如权利要求10或11所述的方法，其中：
所述尿素以1M或更大并且不大于8.5M的浓度被包含，所述非离子型表面活性剂以0.025w/v％或更大并且不大于5w/v％的浓度被包含，并且所述水溶性的大分子化合物以2.5w/v％或更大并且不大于40w/v％的浓度被包含。
13.如权利要求1-4、6-7和9-11中任一项所述的方法，所述澄清试剂还包含：
选自由甘油、羧基乙烯聚合物、羟丙基甲基纤维素、丙二醇和聚乙二醇组成的组的至少一种。
14.如权利要求5所述的方法，所述澄清试剂还包含：
选自由甘油、羧基乙烯聚合物、羟丙基甲基纤维素、丙二醇和聚乙二醇组成的组的至少一种。
15.如权利要求8所述的方法，所述澄清试剂还包含：
选自由甘油、羧基乙烯聚合物、羟丙基甲基纤维素、丙二醇和聚乙二醇组成的组的至少一种。
16.如权利要求12所述的方法，所述澄清试剂还包含：
选自由甘油、羧基乙烯聚合物、羟丙基甲基纤维素、丙二醇和聚乙二醇组成的组的至少一种。
17.如权利要求1-4、6-7、9-11和14-16中任一项所述的方法，其中：
所述澄清试剂使(i)来源于多细胞动物的组织或器官或(ii)不是人类的多细胞动物透明。
18.如权利要求5所述的方法，其中：
所述澄清试剂使(i)来源于多细胞动物的组织或器官或(ii)不是人类的多细胞动物透明。
19.如权利要求8所述的方法，其中：
所述澄清试剂使(i)来源于多细胞动物的组织或器官或(ii)不是人类的多细胞动物透明。
20.如权利要求12所述的方法，其中：
所述澄清试剂使(i)来源于多细胞动物的组织或器官或(ii)不是人类的多细胞动物透明。
21.如权利要求13所述的方法，其中：
所述澄清试剂使(i)来源于多细胞动物的组织或器官或(ii)不是人类的多细胞动物透明。
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