KR20150043241A - 현미경적 분석을 위한 생물학적 표본을 준비하기 위한 방법과 조성물 - Google Patents

현미경적 분석을 위한 생물학적 표본을 준비하기 위한 방법과 조성물 Download PDF

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광훈 정
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더 보드 오브 트러스티스 오브 더 리랜드 스탠포드 쥬니어 유니버시티
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Abstract

현미경적 분석을 위한 생물학적 표본을 준비하기 위한 방법과 조성물이 제시된다. 이들 방법은 예로서, 질환 또는 이식편 이식을 진단하거나 또는 모니터링하고, 건강한 또는 병든 조직을 조사하고, 그리고 질환 변경에서 독성과 효능에 대해 후보 작용제를 스크리닝하는 것과 같은 의학과 연구에서 많은 용도를 발견한다. 또한, 대상 방법을 실시하는데 이용되는 시약, 장치, 키트와 이들의 시스템이 제시된다.

Description

현미경적 분석을 위한 생물학적 표본을 준비하기 위한 방법과 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR PREPARING BIOLOGICAL SPECIMENS FOR MICROSCOPIC ANALYSIS}
관련된 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2012년 8월 9일자 제출된 U.S. 특허 가출원 일련 번호 61/681,551의 출원인에 우선권을 주장하고, 상기 출원의 개시는 본원에 전체적으로 참조로서 편입된다.
발명의 분야
본 발명은 현미경적 분석을 위한 생물학적 표본을 준비하는 것에 관계한다.
발명의 배경
복잡한 장기와 조직, 예를 들면, 뇌와 종양을 조사하기 위해, 전체 조직에 걸쳐 이의 통합된 3-D 구조와 미세한 분자 상세를 이해하는 것이 필요하다. 어레이 단층촬영술 또는 일련의 블록-면 주사 전자 현미경검사에 의해 예시되는 현재의 방법은 세포이하 미세한 상세를 제공할 수 있지만, 금지적으로 비효율적이고 파괴적인 기계적 섹션화와 재건을 필요로 한다. 조직 명료화 방법과 합동된 광학 섹션화 기술이 개발되었는데, 여기서 광-산란이 감소되어 조직이 영상화될 수 있는 깊이를 증가시킨다. 이들 방법이 힘든 기계적 섹션화와 재건 과정을 우회할 수 있긴 하지만, 이들은 면역염색/분자 표현형과 적합하지 않다. 필요한 것은 조직 및 그 내에 세포이하 구조의 3-D 일체성을 유지하면서, 조직 내에 생체분자, 예를 들면, 단백질, 지질, 스테로이드, 핵산, 그리고 작은 분자를 조직 내에 더욱 심부 영역에서 분자 프로브로 표지화를 위해 접근하기 쉽도록 만드는, 현미경적 분석을 위한 생물학적 조직의 준비를 위한 기술이다. 본 발명은 이런 저런 문제를 해결한다.
발명의 요약
현미경적 분석을 위한 생물학적 표본을 준비하기 위한 방법과 조성물이 제시된다. 이들 방법은 예로서, 질환 또는 이식편 이식을 진단하거나 또는 모니터링하고, 건강한 또는 병든 조직을 조사하고, 그리고 질환 변경에서 독성과 효능에 대해 후보 작용제를 스크리닝하는 것과 같은 의학과 연구에서 많은 용도를 발견한다. 또한, 대상 방법을 실시하는데 이용되는 시약, 장치, 키트와 이들의 시스템이 제시된다.
일부 구체예에서, 본 발명은 현미경적 분석을 위한 생물학적 표본을 준비하는 방법을 제시하고, 이들 방법은 표본을 복수의 하이드로겔 아단위로 고정시키고; 하이드로겔 아단위를 중합화하여 하이드로겔-포매된 표본을 형성하고; 그리고 하이드로겔-포매된 표본을 명료화하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 하이드로겔-포매된 표본을 명료화하는 것은 복수의 세포 요소를 표본으로부터 실질적으로 제거하는 것을 수반한다. 일부 구체예에서, 세포 요소는 지질을 포함한다.
일부 구체예에서, 하이드로겔-포매된 표본을 명료화하는 것은 표본을 전기영동하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 표본은 이온성 계면활성제를 포함하는 완충액 용액을 이용하여 전기영동된다. 일부 구체예에서, 이온성 계면활성제는 황산도데실나트륨 (SDS)이다. 일부 구체예에서, 표본은 약 10 내지 약 60 볼트의 범위에서 변하는 전압을 이용하여 전기영동된다. 일부 구체예에서, 표본은 약 15분 내지 약 10일의 범위에서 변하는 기간 동안 전기영동된다. 일부 구체예에서, 이들 방법은 명료화된 조직의 굴절률 (refractive index)에 대등한 굴절률을 갖는 봉입제 (mounting medium)에서, 명료화된 표본을 배양하는 것을 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 봉입제는 표본의 광학 명료성 (optical clarity)을 증가시킨다. 일부 구체예에서, 봉입제는 글리세롤을 포함한다.
일부 구체예에서, 현미경적 분석은 광학 현미경검사, 레이저 현미경검사, 전자 현미경검사, 그리고 주사식 탐침 현미경검사이다. 일부 구체예에서, 표본을 고정시키는 것은 표본을 파라포름알데히드와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 하이드로겔 아단위는 아크릴아미드를 포함한다. 일부 구체예에서, 표본을 중합화하는 것은 열에 의한 교차결합을 포함한다.
일부 구체예에서, 이들 방법은 표본을 폴리펩티드, 핵산, 또는 작은 분자와 접촉시키는 것을 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 접촉시키는 것은 전기영동, 동수압, 초음파 진동, 용질 대비, 극초단파 복사, 또는 혈관 순환을 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드, 핵산, 또는 작은 분자는 표본이 현미경적으로 분석될 때 가시화될 수 있는 요소를 포함한다. 일부 구체예에서, 조직은 중추신경계 (CNS) 조직이다. 일부 구체예에서, CNS 조직은 전뇌이다.
일부 구체예에서, 본 발명은 생물학적 표본을 현미경검사에 의해 영상화하는 방법을 제시하고, 이들 방법은 전술한 바와 같은 생물학적 표본을 준비하고; 그리고 생물학적 표본을 현미경으로 영상화하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 현미경은 광학 현미경, 레이저 현미경, 전자 현미경, 또는 주사식 탐침 현미경이다. 일부 구체예에서, 표본의 세포 또는 세포이하 측면은 준비된 조직 내로 수송된 하나 또는 그 이상의 작은 분자, 핵산 또는 단백질로 표지화된다. 일부 구체예에서, 이들 방법은 준비된 조직 내로 미리 수송된 하나 또는 그 이상의 작은 분자, 핵산, 또는 단백질을 제거하는 것을 더욱 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 신경계 조직의 연결도를 맵핑하는 방법을 제시하고, 이들 방법은 전술한 바와 같은 신경계 조직 표본을 준비하고; 그리고 표본 내에 하나 또는 그 이상의 뉴론을 현미경으로 영상화하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 이들 대상 방법은 표본 내에 하나 또는 그 이상의 뉴론을 표본이 현미경적으로 분석될 때 가시화될 수 있는 요소로 표지화하는 것을 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 이들 뉴론은 조직을 고정하기에 앞서 표지화된다. 일부 구체예에서, 이들 뉴론은 하이드로겔을 중합화한 이후에 표지화된다.
일부 구체예에서, 본 발명은 현미경적 분석을 위한 조직을 준비하기 위한 키트를 제시하고, 이들 키트는 고정제; 그리고 복수의 하이드로겔 아단위를 포함한다. 일부 구체예에서, 이들 키트는 3-차원 하이드로겔-포매된 표본을 전기영동하여 복수의 세포 요소를 표본으로부터 실질적으로 제거하기 위한 기구를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 세포 요소는 지질을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 영상화를 위한 생물학적 표본을 준비하기 위한 시스템을 제시하고, 이들 시스템은 3-차원 하이드로겔-포매된 표본을 전기영동하여 복수의 세포 요소를 표본으로부터 실질적으로 제거하기 위한 기구; 전원 공급장치; 그리고 온도-제어된 완충액 순환기를 포함한다. 일부 구체예에서, 세포 요소는 지질을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 전기영동 조직 명료화 장치를 제시하고, 이들 장치는 3-차원 하이드로겔-포매된 표본을 내포하기 위한 전기영동 챔버; 복수의 전극; 전원 공급장치; 그리고 온도-제어된 완충액 순환기를 포함한다. 일부 구체예에서, 이들 대상 장치는 완충액 여과 요소를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 이들 대상 장치는 복수의 유체 입구 및/또는 출구 포트를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 이들 대상 장치는 하이드로겔-포매된 표본을 지지하도록 형성된 요소를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 요소는 2개 또는 그 이상의 전극 사이에서 발생된 전기장에 실질적으로 내재하는 위치에서 하이드로겔-포매된 표본을 지지하도록 형성된다. 일부 구체예에서, 전극 중에서 하나 또는 그 이상은 이들 전극에 의해 발생된 전기장의 크기를 증가시키기 위한 확장 요소를 포함한다. 일부 구체예에서, 확장 요소는 하나 또는 그 이상의 S-모양 벤드를 포함한다. 일정한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 전극의 길이와 너비는 대략 동등하다. 일부 구체예에서, 이들 대상 장치는 전기영동 챔버와 유밀한 및/또는 기밀한 밀폐를 형성하는 뚜껑을 더욱 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 생물학적 표본을 보존하는 방법을 제시하고, 이들 방법은 표본을 복수의 하이드로겔 아단위로 고정시키고; 하이드로겔 아단위를 중합화하여 하이드로겔-포매된 표본을 형성하고; 그리고 하이드로겔-포매된 표본을 명료화하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 이들 대상 방법은 명료화된 하이드로겔-포매된 표본을 봉입제 내에 보관하는 것을 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 이들 대상 방법은 병리학적 상태의 사정, 진단, 또는 예후를 위해, 명료화된 하이드로겔-포매된 표본을 분석하는 것을 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 표본은 생검 표본 또는 부검 표본이다. 일부 구체예에서, 병리학적 상태는 암, 면역계 기능장애, 신경정신병 질환, 내분비/생식 질환, 심혈관/폐 질환, 근골격 질환, 또는 위장 질환이다.
일부 구체예에서, 표본은 정상적인 조직을 포함하고, 그리고 이들 방법은 발생 동안을 비롯하여, 세포, 조직, 장기 또는 시스템 기능 및/또는 세포와 조직 사이에 관계를 사정하기 위해 표본을 분석하는 것을 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 이들 대상 방법은 표본 상에서 유전학적, 전사체학적, 유전체학적, 단백질체학적, 대사체학적 및/또는 약물 스크리닝 분석을 수행하는 것을 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 이들 대상 방법은 장래 분석, 평가, 또는 기능화를 위해 표본을 보관하는 것을 더욱 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 하이드로겔 단위체를 생물학적 조직 내로 주입하고 이들 단위체를 차후에 유발하여 원하는 강성도, 투명도, 공극 크기, 전도도, 또는 투과성 성질을 갖는 중합체, 겔, 메시, 또는 네트워크를 형성하기 위한 시스템을 제시하고, 이들 시스템은 생물학적 표본; 그리고 복수의 하이드로겔 아단위를 포함한다. 일부 구체예에서, 이들 대상 시스템은 나노규모 하드웨어 장치, 단백질, 올리고뉴클레오티드 및/또는 형광 염색 시약을 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 이들 시스템의 요소는 에너지 또는 외부 신호, 예를 들면, 열, 광선, 화학 트리거 및/또는 촉진제에 의해 활성화되거나 또는 기능화된다.
본 발명은 첨부된 도면과 공동으로 읽혀질 때, 하기 상세한 설명으로부터 최적으로 이해된다. 특허 또는 출원 파일은 유색으로 작성된 최소한 하나의 도면을 내포한다. 유색 도면(들)을 갖는 이러한 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 요구 및 수수료의 납부 시에 사무국에 의해 제공될 것이다. 통상의 관례에 따라, 이들 도면의 다양한 특질은 일정한 비율이 아닌 것으로 강조된다. 이에 반하여, 다양한 특질의 치수는 명료성을 위해 임의적으로 확대되거나 축소된다. 이들 도면에는 하기 도형이 포함된다.
도 1은 조직 섹션화 없이 조직의 영상화를 용이하게 하는, "CLARITY"로 명명된 과정의 개요를 보여주는 도해이다.
도 2는 전기영동 조직 명료화 (ETC) 장치 및 관련된 계기의 도해이다.
도 3은 CLARITY 과정을 이용하여 영상화된 무손상 성체 생쥐 뇌 시료로부터 영상의 수집이다.
도 4는 CLARITY를 이용하여 처리된 무손상 조직 체적에서 분자 표현형 결과를 보여주는 영상과 데이터의 수집이다.
도 5는 CLARITY를 이용하여 무손상 조직의 멀티-라운드 분자 표현형을 보여주는 영상의 수집이다.
도 6은 CLARITY를 이용한 인간 뇌 구조적 맵핑과 분자 표현형의 결과를 보여주는 영상과 데이터의 수집이다.
도 7은 CLARITY를 이용하여 영상화된 생쥐 뇌 조직으로부터 결과를 보여주는 영상의 수집이다.
도 8은 ETC 챔버 설계의 실례를 보여주는 도면의 수집이다. 표시된 치수는 밀리미터 단위이다.
도 9는 FocusClearTM과 글리세롤을 이용한 무손상 성체 생쥐 뇌의 광학 조직 명료화를 보여주는 영상의 수집이다.
도 10은 CLARITY-처리된 생쥐 뇌 조직의 전자 현미경 (EM) 영상화로부터 결과를 보여주는 영상의 수집이다. 이들 영상은 CLARITY 과정의 EM-적합성을 예증한다.
도 11은 전체 생쥐 뇌 분자 표현형으로부터 결과를 보여주는 영상의 수집이다.
도 12는 CLARITY 과정을 이용하여 영상화된 생쥐 뇌의 전전두엽 피질에서 TH-양성 뉴론의 축삭 섬유를 보여주는 영상의 수집이다.
도 13은 CLARITY 과정을 이용하여 영상화된 생쥐 뇌의 중격의지핵과 줄무늬체에서 TH-양성 뉴론의 축삭 섬유를 보여주는 영상의 수집이다.
도 14는 CLARITY 과정을 이용하여 영상화된 생쥐 뇌의 편도체에서 TH-양성 뉴론의 축삭 섬유를 보여주는 영상의 수집이다.
도 15는 상이한 깊이 (0-200 μm, 20 μm 간격)에서 PSD-95 부점의 평균 면역형광 횡단면을 보여주는 일련의 그래프이다.
도 16은 상이한 깊이 (0-200 μm, 20 μm 간격)에서 평균 PSD-95 부점을 보여주는 일련의 영상이다.
도 17는 CLARITY 과정을 이용하여 영상화된 1 mm-두께 생쥐 뇌 조직 시료 전역에서 치밀한 수지상 섬유와 뉴론 세포체의 균일한 표지화를 증명하는 미세관-결합된 단백질 2 (MAP2) 염색을 보여주는 영상의 수집이다.
도 18은 완전 성체 제브라피시 뇌 분자 표현형으로부터 결과를 보여주는 영상이다.
도 19는 자폐증을 앓는 개체로부터 뇌 조직 시료의 신피질에서 추적된 PV-양성 뉴론으로부터 결과를 보여주는 영상의 수집이다.
도 20은 정상적인 대조 개체로부터 뇌 조직 시료의 신피질에서 추적된 PV-양성 뉴론으로부터 결과를 보여주는 영상의 수집이다.
발명의 상세한 설명
현미경적 분석을 위한 생물학적 표본을 준비하기 위한 방법과 조성물이 제시된다. 이들 방법은 예로서, 질환 또는 이식편 이식을 진단하거나 또는 모니터링하고, 건강한 또는 병든 조직을 조사하고, 그리고 질환 변경에서 독성과 효능에 대해 후보 작용제를 스크리닝하는 것과 같은 의학과 연구에서 많은 용도를 발견한다. 또한, 대상 방법을 실시하는데 이용되는 시약, 장치, 키트와 이들의 시스템이 제시된다. 본 발명의 이런 저런 목적, 이점, 그리고 특질은 하기에 더욱 완전하게 설명된 조성물과 방법의 상세를 읽게 되면, 당업자에게 명백해질 것이다.
본 발명의 방법과 조성물을 설명하기에 앞서, 본 발명은 설명된 특정 방법 또는 조성물에 한정되지 않는 것으로 이해되는데, 그 이유는 이들이 변할 수 있기 때문이다. 또한, 본원에서 이용된 용어는 단지 특정 구체예를 설명하는 것을 목적으로 하고 제한하는 것으로 의도되지 않는 것으로 이해되는데, 그 이유는 본 발명의 범위가 첨부된 특허청구범위에 의해서만 한정될 것이기 때문이다.
값의 범위가 제공되는 경우에, 상기 범위의 상한선과 하한선 사이에 문맥에서 달리 지시되지 않으면 하한선 단위의 소수점까지 각 개재성 값 (intervening value) 역시 구체적으로 개시된 것으로 이해된다. 언급된 범위 내에 임의의 언급된 값 또는 개재성 값 사이에 각각의 더욱 작은 범위, 그리고 상기 언급된 범위 내에 임의의 다른 언급된 또는 개재성 값은 본 발명 내에 포함된다. 이들 더욱 작은 범위의 상한선과 하한선은 상기 범위 내에 독립적으로 포함되거나 배제될 수 있고, 그리고 어느 한쪽 또는 양쪽 한계가 이들 더욱 작은 범위 내에 포함되거나, 또는 어느 한쪽도 포함되지 않는 각 범위 역시 언급된 범위 내에 임의의 특정적으로 배제된 한계를 조건으로 하여 본 발명 내에 포함된다. 언급된 범위가 이들 한계 중에서 한쪽 또는 양쪽을 포함하는 경우에, 이들 포함된 한계 중에서 한쪽 또는 양쪽을 배제하는 범위 역시 본 발명에 포함된다.
달리 정의되지 않으면, 본원에서 이용된 모든 기술 용어와 과학 용어는 본 발명이 속하는 당해 분야의 평균적 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 비록 본원에서 설명된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법과 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 이용될 수 있지만, 일부 잠재적이고 바람직한 방법과 재료가 하기에 설명된다. 본원에서 언급된 모든 간행물은 인용된 이들 간행물과 관련된 방법 및/또는 재료를 개시하고 설명하기 위하여 본원에 참조로서 편입된다. 본 발명의 개시는 모순되는 경우에, 편입된 간행물의 임의의 개시보다 우선하는 것으로 이해된다.
본 개시를 읽은 당업자에게 명백한 바와 같이, 본원에서 설명되고 예시된 개별 구체예 각각은 본 발명의 범위 또는 기술적 사상을 벗어나지 않으면서, 다른 여러 구체예 중에서 한 가지의 특질로부터 쉽게 분리되거나 또는 이들과 쉽게 합동될 수 있는 구별된 요소와 특질을 갖는다. 임의의 언급된 방법은 언급된 사건의 순서에서 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서에서 수행될 수 있다. 방법의 임의의 단계는 임의선택적 보관 단계, 다시 말하면, 실온에서, 16℃, 4℃, -12℃, -20℃, -70℃, 또는 -130℃에서 보관에 의해 방법의 다른 단계로부터 분리될 수도 있다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서, 단수 형태는 문맥에서 달리 지시되지 않으면, 복수 지시대상 (plural referent)을 포함한다. 따라서 가령, "세포"에 대한 지시는 복수의 이런 세포를 포함하고, 그리고 "펩티드"에 대한 지시는 하나 또는 그 이상의 펩티드 및 당업자에게 공지된 이들의 등가물, 예를 들면, 폴리펩티드 등을 포함한다.
본원에서 인용된 간행물은 본원의 출원일에 앞서 그들의 개시 목적으로만 제공된다. 본원에서 어느 것도 본 발명이 선행 발명에 의하여 이런 간행물에 앞서는 권리가 없음을 인정하는 것으로 간주되지 않는다. 게다가, 제공된 공개 일자는 실제 공개 일자와 상이할 수 있고, 이것은 독립적인 확인이 필요할 수도 있다.
방법
발명의 측면에서, 현미경적 분석을 위한 생물학적 표본을 준비하기 위한 방법이 제시된다. "현미경적 분석"은 육안으로 관찰될 수 없는, 다시 말하면, 정상적인 눈의 해상도 범위 내에 있지 않은 표본의 측면의 가시화를 제공하는 기술을 이용한 표본의 분석을 의미한다. 이런 기술에는 제한 없이, 광학 현미경검사 (가령, 명시야, 사조, 암시야, 위상차, 차등 간섭 대비, 간섭 반사, 에피형광, 공초점 등, 현미경검사), 레이저 현미경검사, 전자 현미경검사, 그리고 주사식 탐침 현미경검사가 포함될 수 있다. "현미경적 분석을 위한 생물학적 표본을 준비하는" 것은 일반적으로, 표본 내에 무제한의 깊이에서 현미경적 분석에 적합하도록 표본을 렌더링 (rendering)하는 것을 의미한다.
대상 방법을 실시함에 있어서, 생물학적 표본은 하이드로겔 아단위의 존재에서 고정된다. 표본을 "고정하는" 것은 세포 요소가 서로에 교차결합되도록 표본, 다시 말하면, 표본의 세포를 고정제에 노출시키는 것을 의미한다. "하이드로겔" 또는 "하이드로겔 네트워크"는 물-불용성이고, 때때로 물이 분산 매체인 콜로이드성 겔로서 발견되는 중합체 사슬의 네트워크를 의미한다. 다시 말하면, 하이드로겔은 용해 없이 대량의 물을 흡수할 수 있는 일군의 중합성 재료이다. 하이드로겔은 99% 이상의 물을 내포할 수 있고, 그리고 자연 또는 합성 중합체, 또는 이들의 조합을 포함한다. 하이드로겔은 또한, 그들의 유의미한 물 함량으로 인하여, 자연 조직과 매우 유사한 정도의 유연성을 갖는다. 적절한 하이드로겔에 관한 상세한 설명은 본원에 참조로서 명백히 편입되는 공개된 U.S. 특허 출원 20100055733에서 찾아볼 수 있다. "하이드로겔 아단위" 또는 "하이드로겔 전구체"는 교차결합되거나, 또는 "중합화되어", 3-차원 (3D) 하이드로겔 네트워크를 형성할 수 있는 친수성 단위체, 프리중합체, 또는 중합체를 의미한다. 특정 이론에 한정됨 없이, 하이드로겔 아단위의 존재에서 생물학적 표본의 이러한 고정은 표본의 요소를 하이드로겔 아단위에 교차결합하고, 따라서 분자 요소를 정위시키고, 조직 체계와 세포 형태를 보존하는 것으로 생각된다.
임의의 편의한 고정제 (fixation agent), 또는 "고정제 (fixative)", 예를 들면, 포름알데히드, 파라포름알데히드, 글루타르알데히드, 아세톤, 에탄올, 메탄올 등이 하이드로겔 아단위의 존재에서 표본을 고정시키기 위해 고정제/하이드로겔 조성물에서 이용될 수 있다. 전형적으로, 고정제는 완충액, 예를 들면, 식염수, 인산염 완충액 (PB), 인산염 완충된 식염수 (PBS), 구연산 완충액, 칼륨 인산염 완충액 등에서, 통상적으로 약 1-10%, 예를 들면, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 또는 10%의 농도, 예를 들면, 4% 파라포름알데히드/0.1M 인산염 완충액; 2% 파라포름알데히드/0.2% 피크르산/0.1M 인산염 완충액; 0.1M 인산염 완충액에서 4% 파라포름알데히드/0.2% 과옥소산염/1.2% 리신; 인산염 완충액에서 4% 파라포름알데히드/0.05% 글루타르알데히드 등으로 희석될 것이다. 이용된 고정제의 유형 및 고정제에 대한 노출의 지속 기간은 고정제에 의한 변성에 대한 표본 내에 관심되는 분자의 민감성에 좌우되고, 그리고 당업자에게 알려져 있거나 또는 예로서, Buchwalow and B
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cker. Immunohistochemistry : Basics and Methods . Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2010에서 설명된 바와 같은 전통적인 조직화학적 또는 면역조직화학적 기술을 이용하여 쉽게 결정될 수 있다.
고정제/하이드로겔 조성물은 임의의 편의한 하이드로겔 아단위, 예를 들면, 하지만 제한 없이, 폴리(에틸렌 글리콜)과 이의 유도체 (가령, PEG-디아크릴레이트 (PEG-DA), PEG-RGD), 다중지방성 폴리우레탄, 폴리에테르 폴리우레탄, 폴리에스테르 폴리우레탄, 폴리에틸렌 공중합체, 폴리아미드, 폴리비닐 알코올, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리테트라메틸렌 산화물, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리아크릴아미드, 폴리(히드록시에틸 아크릴레이트), 그리고 폴리(히드록시에틸 메타크릴레이트), 콜라겐, 히알루론산, 키토산, 덱스트란, 아가로오즈, 젤라틴, 알기네이트, 단백질 중합체, 메틸셀룰로오스 등을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 하이드로겔 아단위는 하이드로겔에 특정한 성질을 추가하기 위해 변형될 수도 있다; 가령, 분해를 유도하거나 (예로서, West and Hubbell, 1999, Macromolecules, 32:241을 참조한다) 또는 세포 유착을 변경하기 위해 (예로서, Hem and Hubbell, 1998, J. Biomed. Mater. Res., 39:266을 참조한다), 펩티드 서열이 통합될 수 있다. 패턴성 (patternability)을 유지하면서 하이드로겔의 투과성을 향상시키기 위해, 친수성 나노입자, 예를 들면, 폴리-락트산 (PLA), 폴리-글리콜산 (PLG), 폴리(락트-코-글리콜산) (PLGA), 폴리스티렌, 폴리(디메틸실록산) (PDMS) 등과 같은 작용제가 이용될 수도 있다 (예로서, US 특허 출원 번호 13/065,030; Lee W. et al. 2010 Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 20709-20714를 참조한다). PEG, 분해성 PEO, 폴리(락트산) (PLA), 그리고 기타 유사한 재료의 블록 공중합체와 같은 재료가 하이드로겔에 특정한 성질을 추가하는데 이용될 수 있다 (예로서, Huh and Bae, 1999, Polymer, 40:6147을 참조한다). 교차결합제 (가령, 비스-아크릴아미드, 디아지린 등) 및 개시제 (가령, 아조비스이소부티로니트릴 (AIBN), 리보플라빈, L-아르기닌 등)는 후기 중합화 단계에서, 상호작용하는 거대분자 사이에 공유 결합을 증진하기 위해 포함될 수 있다.
전형적으로, 하이드로겔 아단위(들)와 조절제 (modifying agent)의 농도와 분자량은 선별된 중합체 및 그들이 중합화되는 하이드로겔 네트워크의 원하는 특징, 예를 들면, 공극 크기, 팽창 성질, 전도도, 탄력성/강성도 (영률), 생물분해성 지수 등에 좌우될 것이다. 가령, 하이드로겔은 하기에 더욱 상세하게 설명된 바와 같은 거대분자, 예를 들면, 단백질, 핵산, 또는 작은 분자의 표본 내로의 통과를 가능하게 할 만큼 충분한 크기의 공극을 포함하는 것이 바람직하다. 당업자는 공극 크기가 일반적으로, 하이드로겔 아단위의 농도가 증가함에 따라서 감소하고, 그리고 일반적으로, 하이드로겔 아단위 대 교차결합제의 비율이 증가함에 따라서 증가한다는 것을 인지하고, 그리고 이런 거대분자의 통과를 가능하게 하는 농도의 하이드로겔 아단위를 포함하는 고정제/하이드로겔 조성물을 준비할 것이다. 다른 실례로서, 하이드로겔은 예로서, 포매된 표본을 취급하는데 안정성을 제공하는 특정 강성도, 예를 들면, 약 2-70kN/m2, 예를 들면, 약 2 kN/m2, 약 4 kN/m2, 약 7 kN/m2, 약 10 kN/m2, 약 15 kN/m2, 약 20 kN/m2, 약 40 kN/m2, 하지만 전형적으로 약 70 kN/m2 이하의 영률을 갖는 것이 바람직하다. 당업자는 하이드로겔 네트워크의 탄력성이 중합체의 가지화, 하이드로겔 아단위의 농도, 그리고 교차결합의 정도를 비롯한 다양한 인자에 의해 영향을 받을 수도 있다는 것을 인지하고, 그리고 이런 원하는 탄력성을 제공하는 농도의 하이드로겔 아단위를 포함하는 고정제/하이드로겔 조성물을 준비할 것이다. 따라서, 예로서, 고정제/하이드로겔 조성물은 약 1% w/v 내지 약 20% w/v, 예를 들면, 약 2% 내지 약 15%, 약 3% 내지 약 10%, 약 4% 내지 약 8%의 농도에서 아크릴아미드 단위체, 그리고 약 0.01% 내지 약 0.075%, 예를 들면, 0.01%, 0.02%, 0.025%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 또는 0.075%의 범위에서 농도의 비스-아크릴아미드 교차결합제를 포함할 수 있고; 또는, 예로서, 고정제/하이드로겔 조성물은 최소한 약 2.5K 내지 약 50K, 예를 들면, 2.5K 또는 그 이상, 3.5K 또는 그 이상, 5K 또는 그 이상, 7.5K 또는 그 이상, 10K 또는 그 이상, 15K 또는 그 이상, 20K 또는 그 이상, 하지만 전형적으로, 약 50K 이하의 범위에서 변하는 분자량을 갖는 PEG 프리중합체를 약 1% w/w 내지 약 50% w/w, 예를 들면, 1% 또는 그 이상, 5% 또는 그 이상, 7.5% 또는 그 이상, 10% 또는 그 이상, 15% 또는 그 이상, 20% 또는 그 이상, 30% 또는 그 이상, 40% 또는 그 이상, 그리고 통상적으로, 약 50% 이하의 범위에서 농도로 포함할 수 있다. 원하는 하이드로겔 특징을 제공하는 하이드로겔 아단위와 조절제의 농도는 당분야의 방법에 의해 또는 하기 작업 실시예에서 설명된 바와 같이 쉽게 결정될 수 있다.
고정제/하이드로겔 용액은 임의의 편의한 방법, 예를 들면, 관류, 주사, 점적, 흡수, 도포, 담금/관수 등에 의해 표본에 전달될 수 있다. 표본은 전형적으로, 하이드로겔의 존재에서 15분 또는 그 이상, 예를 들면, 30분 또는 그 이상, 1시간 또는 그 이상, 2시간 또는 그 이상, 4시간 또는 그 이상, 6시간 또는 그 이상, 12시간 또는 그 이상, 일부 경우에, 16시간 또는 그 이상, 20시간 또는 그 이상, 또는 24시간 또는 그 이상 동안 고정될 것이다.
표본의 고정 이후에, 하이드로겔 아단위는 중합화되어, 다시 말하면, 공유적으로 또는 물리적으로 교차결합되어 하이드로겔 네트워크를 형성한다. 중합화는 열에 의한 교차결합, 화학적 교차결합, 물리적 교차결합, 이온성 교차결합, 광-교차결합, 방사선 교차결합 (가령, x-선, 전자 빔) 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 임의의 방법에 의해 달성되고, 그리고 이용된 하이드로겔의 유형 및 당분야의 지식에 기초하여 선별될 수 있다. 가령, 비-중합화된 또는 부분적으로 중합화된 수지와 특정한 교차결합 화학물질의 혼합은 교차결합을 형성하는 화학 반응을 유발한다. 교차결합은 방사선원, 예를 들면, 전자 빔 노출, 감마 방사, 또는 UV 선에 노출을 통해, 정상적으로 열가소성인 재료에서 유도될 수 있다; 가령, 전자 빔 처리가 C 유형의 교차결합된 폴리에틸렌을 중합화하는데 이용된다. 다른 유형의 교차결합된 폴리에틸렌은 압출 동안 과산화물의 첨가 (A 유형)에 의해 또는 압출 동안 교차결합 작용제 (가령, 비닐실란)와 촉매의 첨가에 의해, 그리고 이후, 압출후 경화 (post-extrusion curing)를 수행함으로써 만들어진다. 많은 중합체는 전형적으로 대기 중의 산소에 노출될 때, 산화성 교차결합을 겪는다. 일부 경우에, 반응은 원하는 것보다 빠르고, 따라서 중합화 반응은 산화성 교차결합의 형성을 지연시키기 위한 항산화제의 이용을 필요로 할 수도 있다. 다른 경우에, 예를 들면, 산화에 의한 교차결합의 더욱 빠른 형성이 바람직할 때, 수소 과산화물과 같은 산화제가 과정을 가속하는데 이용될 수도 있다. 중합화를 위한 시간 길이는 이용된 하이드로겔 아단위의 유형 및 선택된 중합화 방법에 좌우되지만, 전형적으로 약 15분 내지 약 48시간, 예를 들면, 15분 또는 그 이상, 1시간 또는 그 이상, 2시간 또는 그 이상, 3시간 또는 그 이상, 4시간 또는 그 이상, 6시간 또는 그 이상, 12시간 또는 그 이상, 16시간 또는 그 이상, 24시간 또는 그 이상, 또는 일부 경우에, 48시간일 것이다. 시약의 최적 시간과 조합은 당업자에게 알려져 있거나 또는 경험적으로 또는 다수의 공개적으로 가용한 자원 (가령, piercenet.com에서 월드와이드웹 상에서; 또한, Macroporous Polymers: Production Properties and Biotechnological/Biomedical Applications. Edited by Bo Mattiasson, Ashok Kumar, and Igor Yu. Galeaev. CRC Press 2010; 그리고 Crosslinking Reagents Technical Handbook, Pierce Biotechnology, Inc., 2006을 참조한다)으로부터 결정될 수 있다.
일단 중합화되면, 하이드로겔-포매된 (즉, 하이드로겔-혼성화된) 표본은 명료화될 수 있다. 표본을 "명료화"하는 것은 표본이 광에 실질적으로 투과성이 되는, 다시 말하면, 투명해 진다는 것을 의미한다. 다시 말하면, 표본을 조명하는데 이용되는 가시 (즉, 백색) 광, 자외선 또는 적외선 중에서 약 70% 또는 그 이상이 표본을 통과하고 그 내부에 단지 선별된 세포 요소만을 조명할 것이다, 가령, 75% 또는 그 이상의 광, 80% 또는 그 이상의 광, 85% 또는 그 이상의 광, 일부 경우에, 90% 또는 그 이상의 광, 95% 또는 그 이상의 광, 98% 또는 그 이상의 광, 예를 들면, 100%의 광이 표본을 통과할 것이다. 표본의 광학 성질에서 이러한 변화는 조직의 내부에 세포와 세포이하 구조의 가시화를 제공한다.
표본으로부터 세포 요소, 예를 들면, 지질을 강제하거나, 표본으로부터 세포 요소, 예를 들면, 지질을 끌어내거나, 또는 세포 요소, 예를 들면, 지질이 표본 내에서 분해되도록, 다시 말하면, 용해되도록 하는 임의의 처리, 예를 들면, 제한 없이, 유기 용매, 예를 들면, 자일렌, 에탄올 또는 메탄올에 노출, 세정제, 예를 들면, 사포닌, Triton X-100과 Tween-20에 노출, 이온성 계면활성제, 예를 들면, 황산도데실나트륨 (SDS)에 노출, 전기영동, 동수압, 초음파 진동, 용질 대비, 극초단파 복사, 혈관 순환 등이 표본을 명료화하는데 이용될 수 있다. 일부 경우에, 명료화는 형광 단백질을 소광하지 않는 용매를 이용하여 수행된다. 형광 단백질을 소광하는 것으로 알려져 있는 유기 용매의 실례에는 테트라히드로푸란, 헥산, 벤질알코올/벤질벤조산염 (BABB), 그리고 디벤질 에테르가 포함된다. 따라서 다양한 단백질의 형광을 보존하기 위해, 일부 구체예에서 명료화는 앞서 열거된 것들 이외의 용매를 이용하여 수행된다, 예를 들면, 비-유기 용매를 이용하여 수행된다.
일부 경우에, 명료화는 하전된 이온성 미셀을 명료화되는 표본의 외부로 능동적으로 수송함으로써 명료화 과정을 촉진하기 위해, 이온성 계면활성제, 예를 들면, SDS를 이용하여 수행된다. 명료화는 선별된 명료화 방법과 양립하는 당분야에 공지된 임의의 편의한 완충액, 예를 들면, 식염수, 인산염 완충액, 인산염 완충된 식염수 (PBS), 붕산나트륨 완충액, 붕산 완충액, 구연산 완충액 등에서 수행될 수 있고, 그리고 전형적으로, 표본의 센티미터 두께당 약 1-10일, 다시 말하면, 통상적으로 입방 센티미터당 약 1일, 일부 경우에 2일, 때때로 5일, 그리고 전형적으로 10일 이내가 소요될 것이다. 최적 시간은 명료성에 대한 표본의 시각적 검사에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
명료화 후, 시료는 일반적으로, 지질이 실질적으로 없을 것이다. "지질이 실질적으로 없는" 것은 명료화 이전에 시료 내에 존재하는 지질의 초기량이 대략 70% 또는 그 이상, 예를 들면, 75% 또는 그 이상, 예를 들면, 80% 또는 그 이상, 예를 들면, 85% 또는 그 이상, 예를 들면, 90% 또는 그 이상, 예를 들면, 95% 또는 그 이상, 예를 들면, 99% 또는 그 이상, 예를 들면, 100% 감소했다는 것을 의미한다.
본원에서 설명된 방법과 시스템에 이용하기 적합한 조직 표본은 일반적으로, 살아있는 또는 죽은 개체로부터 수집된 임의의 유형의 조직 표본, 예를 들면, 예로서 생검 표본과 부검 표본을 포함한다. 조직 표본은 본원에서 설명된 방법과 시스템을 이용하여 수집되고 처리되고, 그리고 처리 직후에 현미경적 분석에 종속되거나, 또는 보존되고, 그리고 장래 시점에서, 예를 들면, 연장된 기간 동안 보관 후 현미경적 분석에 종속될 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 방법은 조직 표본을 장래 분석을 위한 안정되고 접근가능한 완전 무손상 형태로 보존하는데 이용될 수 있다. 가령, 조직 표본, 예를 들면, 예로서 인간 뇌 조직 표본은 복수의 세포 요소, 예를 들면, 예로서 지질을 제거하기 위해 전술한 바와 같이 처리되고 명료화되고, 그리고 이후, 장래 분석을 위해 보관된다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 방법과 시스템은 미리 보존된 또는 보관된 조직 표본을 분석하는데 이용될 수 있다. 가령, 일부 구체예에서, CLARITY 과정에 종속되지 않은 미리 보존된 조직 표본은 본원에서 설명된 바와 같이 처리되고 분석된다.
일부 경우에, 현미경적 분석을 위한 표본의 추가적인 조작이 불필요할 것이다. 가령, 표본은 현미경검사에 의해 직접적으로 가시화될 수 있는 생체분자를 포함한다. "생체분자"는 일반적으로, 조직 또는 세포 내에 단백질, 지질, 스테로이드, 핵산 등을 의미한다. 이것의 한 가지 실례는 표본의 공급원인 생물체가 형광을 발하는 능력을 갖는 단백질, 다시 말하면, "형광 단백질", 또는 "FP"를 발현하는 경우일 것이다. "형광을 발하는" 것은 한 파장에서 에너지를 흡수하고 다른 파장에서 이를 방출한다는 것을 의미한다. 가령, 녹색 형광 단백질 (GFP)은 510 nm 또는 약 510 nm에서 방출 스펙트럼에서 피크를 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 다양한 파장에서 방출하는 다양한 FP가 당분야에 알려져 있다. 관심되는 FP에는 녹색 형광 단백질 (GFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 오렌지색 형광 단백질 (OFP), 시안색 형광 단백질 (CFP), 청색 형광 단백질 (BFP), 적색 형광 단백질 (RFP), 초적색 형광 단백질, 또는 근적외선 형광 단백질이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본원에서 이용된 바와 같이, 에쿼리아 (Aequorea) GFP는 에쿼리아 (Aequorea) 속으로부터 GFP 및 이들의 돌연변이체 또는 변이체를 지칭한다. 이런 변이체 및 다른 종, 예를 들면, 안토조아 (Anthozoa) 초산호, 아네모니아 (Anemonia) 말미잘, 레닐라 (Renilla) 바다 팬지, 갈락세아 (Galaxea) 산호, 아크로포라 (Acropora) 갈색 산호, 트라키필리아 (Trachyphyllia) 및 펙티미대 (Pectimidae) 돌산호 및 기타 종으로부터 GFP는 널리 알려져 있고 당업자에게 가용하다. 예시적인 GFP 변이체에는 BFP, CFP, YFP와 OFP가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 형광 단백질과 이들의 변이체의 실례에는 GFP 단백질, 예를 들면, Emerald (Invitrogen, Carlsbad, Calif.), EGFP (Clontech, Palo Alto, Calif), Azami-Green (MBL International, Woburn, Mass.), Kaede (MBL International, Woburn, Mass.), ZsGreen1 (Clontech, Palo Alto, Calif.), 그리고 CopGFP (Evrogen/Axxora, LLC, San Diego, Calif.); CFP 단백질, 예를 들면, Cerulean (Rizzo, Nat Biotechnol. 22(4):445-9 (2004)), mCFP (Wang et al., PNAS USA. 101(48):16745-9 (2004)), AmCyanl (Clontech, Palo Alto, Calif), MiCy (MBL International, Woburn, Mass.), 그리고 CyPet (Nguyen and Daugherty, Nat Biotechnol. 23(3):355-60 (2005)); BFP 단백질, 예를 들면, EBFP (Clontech, Palo Alto, Calif.); YFP 단백질, 예를 들면, EYFP (Clontech, Palo Alto, Calif.), YPet (Nguyen and Daugherty, Nat Biotechnol. 23(3):355-60 (2005)), Venus (Nagai et al., Nat. Biotechnol. 20(1):87-90 (2002)), ZsYellow (Clontech, Palo Alto, Calif), 그리고 mCitrine (Wang et al., PNAS USA. 101(48):16745-9 (2004)); OFP 단백질, 예를 들면, cOFP (Strategene, La Jolla, Calif.), mKO (MBL International, Woburn, Mass.), 그리고 mOrange; 그리고 기타 등등 (Shaner N C, Steinbach P A, and Tsien R Y., Nat Methods. 2(12):905-9 (2005))이 포함된다. 다른 부류의 형광 단백질에는 코랄리모프 디스코소마 (corallimorph Discosoma)로부터 단리된 적색 형광 단백질 디스코소마 (Discosoma) RFP (DsRed) (Matz et al., Nature Biotechnology 17: 969-973 (1999)), 그리고 임의의 다른 종, 예를 들면, 헤테락티스 (Heteractis) 초산호와 악티니아 (Actinia) 또는 엔타크메아 (Entacmaea) 말미잘로부터 적색 또는 초적색 형광 단백질뿐만 아니라 이들의 변이체 RFP, 예를 들면, 디스코소마 (Discosoma) 변이체, 예를 들면, 단위체성 적색 형광 단백질 1 (mRFP1), mCherry, tdTomato, mStrawberry, mTangerine (Wang et al., PNAS U S A. 101(48):16745-9 (2004)), DsRed2 (Clontech, Palo Alto, Calif.), 그리고 DsRed-T1 (Bevis and Glick, Nat. Biotechnol., 20: 83-87 (2002)), 안토메두사 (Anthomedusa) J-Red (Evrogen)와 아네모니아 (Anemonia) AsRed2 (Clontech, Palo Alto, Calif.)가 포함된다. 초적색 형광 단백질에는 예로서, 악티니아 (Actinia) AQ143 (Shkrob et al., Biochem J. 392(Pt 3):649-54 (2005)), 엔타크메아 (Entacmaea) eqFP611 (Wiedenmann et al. Proc Natl Acad Sci USA. 99(18):11646-51 (2002)), 디스코소마 (Discosoma) 변이체, 예를 들면, mPlum과 mRasberry (Wang et al., PNAS U S A. 101(48):16745-9 (2004)), 그리고 헤테락티스 (Heteractis) HcRed1과 t-HcRed (Clontech, Palo Alto, Calif.)가 포함된다.
부가적으로 또는 대안으로, 현미경적 분석에 앞서, 표본의 세포와 세포내 구조를 하나 또는 그 이상의 거대분자와 접촉시키는 것이 바람직할 수 있다. 가령, 특정 세포 생체분자, 예를 들면, 단백질, 지질, 스테로이드, 핵산 등 및 세포이하 구조의 가시화를 촉진하는 거대분자가 제공된다. 일부 구체예에서, 거대분자는 진단적이다. 일부 구체예에서, 거대분자는 예언적이다. 일부 구체예에서, 거대분자는 치료에 대한 반응성을 예언한다. 일부 구체예에서, 거대분자는 스크린, 예를 들면, 질환 등의 치료에서 질환의 진단 및/또는 예후를 보조하는 작용제에 대한 스크린에서 후보 작용제이다.
가령, 표본은 핵산 색소, 예를 들면, DAPI와 Hoechst와 접촉되는데, 이들은 DNA의 마이너 그루브 (minor groove)에 결합하고, 따라서 세포의 핵을 표지화한다. 특정한 세포 구조에 결합하고 형광 리포터로 유도체화된 약물 또는 독소, 예를 들면, 포유류 세포에서 액틴 섬유를 착색하는데 이용되는 형광 표지화된-팔로이딘이 이용될 수 있다. 형광단 또는 형광색소로 불리는 많은 형광 보고된 분자, 예를 들면, 플루오레세인, Alexa Fluors 또는 DyLight 488이 존재하는데, 이들은 시료 내에서 관심되는 표적 생체분자에 결합하는 분자에 화학적으로 연결될 수 있다.
다른 실례로서, 표본은 색 또는 면역형광에 의한 직접적인 또는 간접적인 표지화를 위해 특정 세포 생체분자에 특이적이고 이들에 결합하는 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드, 예를 들면, 항체, 표지화된 펩티드 등과 접촉될 수 있다. 면역형광은 세포 내에서 특정한 단백질 또는 기타 분자를 표지화하기 위해 항체의 항원 또는 결합 상대에 대한 고도로 특정한 결합을 이용하는 기술을 의미한다. 시료는 관심되는 생체분자에 특이적인 일차 항체로 처리된다. 형광단은 일차 항체 또는 펩티드에 직접적으로 접합될 수 있다. 대안으로, 첫 번째 항체에 특이적으로 결합하는 검출 모이어티 또는 형광단에 접합된 이차 항체가 이용될 수 있다. 추종될 수 있는 프로토콜의 실례에 대해, 예로서 Buchwalow and Bocker. Immunohistochemistry: Basics and Methods, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg 2010, 그리고 Hayat, M.A. Microscopy, Immunohistochemistry, and Antigen Retrieval Methods for Light and Electron Microscopy. Kluwar Academic Publishers, New York 2002를 참조한다. 표적 세포 생체분자에 특이적이고 형광단 또는 기타 검출 모이어티에 접합된 펩티드 역시 이용될 수 있다.
거대분자로서 제공될 수 있는 작용제 부류의 다른 실례는 핵산이다. 가령, 표본은 예로서, 표본의 세포에서 유전자 발현을 조사하기 위해 관심되는 유전자의 전사체에 상보적이고 여기에 특이적으로 혼성화하는 안티센스 RNA와 접촉될 수 있다. 다른 실례로서, 표본은 예로서, 유전자 돌연변이, 예를 들면, 이형접합성 상실 (loss of heterozygosity), 유전자 중복 (gene duplication), 염색체 역위 (chromosomal inversion) 등을 조사하기 위해 관심되는 유전체학적 재료에 상보적이고 여기에 특이적으로 혼성화하는 DNA와 접촉될 수 있다. 혼성화 RNA 또는 DNA는 검출 모이어티, 다시 말하면, 현미경에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 가시화될 수 있는 작용제에 접합된다. in situ 혼성화 기술의 실례는 예로서, Harris and Wilkinson. In situ hybridization: Application to developmental biology and medicine, Cambridge University Press 1990; 그리고 Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) Application Guide. Liehr, T, ed., Springer-Verlag, Berlin Heidelberg 1990에서 찾아볼 수 있다.
다른 실례로서, 표본은 작은 분자와 접촉될 수 있다. 가령, 표본이 β-갈락토시다아제 또는 알칼리성 포스파타아제를 포함하면, 이들 단백질을 발현하는 조직의 세포와 영역을 가시화하는 것이 바람직하다. 이를 위해, 표본은 β-갈락토시다아제에 대한 기질 (가령, X-gal, 4-트리플루오르메틸움벨리페릴-β-D-갈락토피라노시드 (TFMU-Gal), 레소루핀 β-D-갈락토피라노시드 (Res-gal), 4-메틸움벨리페릴 β-D-갈락토피라노시드 (MUG), 디-β-D-갈락토피라노시드 (FDG), 카르복시움벨리페릴 β-D-갈락토피라노시드 (CUG)) 또는 알칼리성 포스파타아제에 대한 기질 (가령, 니트로-블루 테트라졸륨 (NBT)/5-브로모-4-클로로-3'-인돌리인산염 (BCIP))과 β-갈락토시다아제 또는 알칼리성 포스파타아제 활성의 가시화를 가능하게 하는 기타 시약에 대한 기질과 접촉될 수 있다. 다른 실례로서, 예로서 CNS 표본에서 뉴론의 수지상 가지와 스핀을 가시화하는 것이 바람직할 수 있다. 이를 위해, 표본은 Golgi-Cox 함침에서 이용된 화학물질, 예를 들면, 3% 칼륨 중크론산염, 그 이후에 2% 질산은 용액에 노출될 수 있다.
일부 경우에, 제공된 거대분자에 의해 표적화된 생체분자는 세포에 내인성이다. 다른 경우에, 거대분자는 표본의 세포에 이소성으로 제공된 생체분자, 예를 들면, 일정한 세포 집단 또는 세포이하 구조를 표지화하기 위해 생체내에서 또는 탈체에서 표본에 도입된 작용제를 표적화/가시화하기 위해 표본에 제공될 수 있다. 가령, 생체내에서 또는 탈체에서 뉴론의 부분집합의 융기 및/또는 연결도를 표지화하거나 또는 "추적하는" 생체분자, 예를 들면, 단백질, 바이러스, 화학물질을 신경 조직에 제공하기 위해 입체 외과 (stereotactic surgery)가 종종, 신경과학의 분야에서 이용된다. 이러한 기술에서, 표지화 거대분자를 포함하는 바늘이 정확한 위치에서 CNS 조직 내로 하향되고, 그리고 표지화 분자가 조직 내로 방출된다. 분자는 주사 부위의 인근에서 뉴론을 채우고, 그리고 전달된 거대분자의 유형에 따라, 그들의 원심성 표적을 표적화 ("선행 추적")하기 위해 시냅스를 교차하여 및/또는 그들이 신호를 수용하는 구심성 뉴론을 표적화 ("역행 추적")하기 위해 수상돌기를 교차하여 수송될 수 있다. 예로서, 형광 단백질을 인코딩하는 핵산; 바이러스 추적자, 예를 들면, 단순 포진 바이러스 1형 (HSV)과 라브도바이러스; 밀-배아 아글루티닌 (WGA); 강낭콩 (Phaseolus vulgaris) 류코아글루티닌 (PHA-L); 양고추냉이 과산화효소-접합된 렉틴; 비오틴화된 덱스트란 아민 (BDA); 콜레라 독소 B; NEUROBIOTIN Tracer® (Vector labs)을 비롯하여, 뉴론을 뇌정위적으로 표지화하는데 이용될 수 있는 작용제의 실례는 당분야에 널리 알려져 있다. 이러한 방식으로 표지화된 표본은 이들 이소성으로 제공된 표지의 가시화를 촉진하는 거대분자, 예를 들면, 폴리펩티드 또는 화학물질과 접촉될 수 있다.
일부 경우에, 세포 생체분자 또는 세포이하 구조를 가시화하는데 이용되는 거대분자는 표본 내로 수동적으로 수송된다. 다시 말하면, 거대분자는 표본 내로 확산한다. 다른 경우에, 거대분자는 예로서, 전기천공, 동수압, 초음파 진동, 용질 대비, 극초단파 복사, 혈관 순환 등에 의해 표본 내로 능동적으로 수송된다. 일부 구체예에서, 표본은 표본이 명료화된 이후에, 거대분자와 접촉된다. 다른 구체예에서, 하이드로겔-포매된 표본은 표본의 명료화에 앞서, 거대분자와 접촉될 수도 있다. 이런 구체예에서, 거대분자와의 접촉은 표본을 투과성으로 만듦으로써, 다시 말하면, 표본의 거대분자에 대한 투과성을 향상시키기 위해 표본의 성질을 변화시킴으로써 조장될 수 있다. "투과화된" 표본은 표본에 적용된 거대분자의 약 50% 또는 그 이상이 표본의 가장 깊은 영역까지 침투한다는 것을 의미한다, 예를 들면, 거대분자의 60% 또는 그 이상, 거대분자의 70% 또는 그 이상, 또는 거대분자의 80% 또는 그 이상, 일부 경우에 거대분자의 85% 또는 그 이상, 거대분자의 90% 또는 그 이상, 또는 거대분자의 95% 또는 그 이상, 예를 들면, 거대분자의 98% 또는 그 이상, 예를 들면, 거대분자의 100%가 표본을 통과할 것이다. 표본, 그리고 그 내부에 세포의 투과화는 표본으로부터 세포 요소, 예를 들면, 지질의 제거를 위한 전술한 임의의 프로토콜에 의해, 또는 세포를 투과화하기 위한 당분야에 공지된 바와 같이 달성될 수 있다.
대상 방법에 의해 준비된 표본을 현미경적으로 가시화하기 위해, 일부 구체예에서 표본은 봉입제에서 포매된다. 봉입제는 전형적으로, 세포 생체분자를 가시화하는데 이용된 시약에 대한 적합성, 표본의 굴절률, 그리고 수행되는 현미경적 분석에 기초하여 선별된다. 가령, 위상차 작업의 경우에, 봉입제의 굴절률은 표본의 굴절률과 상이해야 하고, 반면 명시야 작업의 경우에, 굴절률은 유사해야 한다. 다른 실례로서, 에피형광 작업의 경우에, 현미경검사 또는 보관 동안 페이딩 (fading), 광퇴색 (photobleaching) 또는 소광 (quenching)을 감소시키는 봉입제가 선별되어야 한다. 일정한 구체예에서, 봉입제 또는 봉입 용액은 명료화된 조직 표본의 광학 명료성 (optical clarity)을 증강하거나 또는 증가시키도록 선별될 수 있다. 이용될 수 있는 적절한 봉입제의 무제한적 실례에는 글리세롤, CC/MountTM, FluoromountTM FluoroshieldTM, ImmunHistoMountTM, VectashieldTM, PermountTM, AcrytolTM, CureMountTM, FocusClearTM, 또는 이들의 등가물이 포함된다.
일부 경우에, 하이드로겔-포매된 표본은 영구적으로 봉입된다. 다시 말하면, 일단 봉입제에서 봉입되면, 하이드로겔-포매된 표본은 추가 조작을 위해 이동될 수 없다. 다른 경우에, 표본은 일시적으로, 또는 가역적으로 봉입된다. 다시 말하면, 하이드로겔-포매된 표본은 대안적/부가적 생체분자 또는 세포이하 구조를 가시화하기 위해, 봉입제로부터 이동되고 현미경검사 후 재-염색될 수 있다. 이런 경우에, 예로서 일정한 생체분자를 가시화하기 위해 표본에 미리 첨가된 거대분자는 예로서, 유기 용매, 예를 들면, 자일렌, 에탄올 또는 메탄올에 노출, 세정제, 예를 들면, 황산도데실나트륨 (SDS), 사포닌, Triton X-100과 Tween-20에 노출, 전기영동, 동수압, 초음파 진동, 용질 대비, 극초단파 복사, 혈관 순환 등에 의해 현미경적 분석 후 제거될 수 있다. 하이드로겔-포매된 표본은 이후, 다른 생체분자 또는 세포이하 구조에 특이적인 상이한 거대분자와 접촉된다. 따라서, 반복 염색이 동일한 표본에서 수행될 수 있다.
대상 방법을 이용하여 준비된 표본은 다수의 상이한 유형의 현미경검사, 예를 들면, 광학 현미경검사 (가령, 명시야, 사조, 암시야, 위상차, 차등 간섭 대비, 간섭 반사, 에피형광, 공초점 등 현미경검사), 레이저 현미경검사, 전자 현미경검사, 그리고 주사식 탐침 현미경검사에 의해 분석될 수 있다.
명시야 현미경검사는 모든 광학 현미경검사 기술 중에서 가장 단순하다. 시료 조명은 투과된 백색 광에 의한다, 다시 말하면, 아래로부터 조명되고 위로부터 관찰된다. 제약은 대부분의 생물학적 시료의 낮은 대비, 그리고 초점 물체의 외부의 흐림에 기인한 낮은 겉보기 해상도가 포함된다. 기술의 단순함 및 필요한 최소 시료 준비는 유의미한 이점이다.
사조 현미경검사에서, 표본은 측면으로부터 조명된다. 이것은 영상에 3-차원 외관을 제공하고 만약 그렇지 않으면 눈에 보이지 않는 특질을 두드러지게 할 수 있다. 이러한 방법에 기초된 더욱 최근의 기술은 세포 배양액에서 이용을 위한 도립 현미경에서 발견되는 시스템인 Hoffmann의 변조 대비이다. 비록 사조가 명시야 현미경검사에서와 동일한 제약 (많은 생물학적 시료의 낮은 대비, 그리고 초점 물체의 외부의 흐림에 기인한 낮은 겉보기 해상도)을 갖긴 하지만, 이것은 만약 그렇지 않으면 눈에 보이지 않는 구조를 두드러지게 할 수 있다.
암시야 현미경검사는 염색되지 않은, 투명한 표본의 대비를 향상시키기 위한 기술이다. 암시야 조명은 영상 면을 들어가는 직접-투과된 (산란되지 않은) 광의 양을 최소화하고 시료에 의해 산란된 광만을 수집하기 위해 조심스럽게 정렬된 광원을 이용한다. 암시야는 설비 셋업 또는 시료 준비를 거의 필요로 하지 않으면서, 영상 대비 (특히, 투명한 물체의)를 극적으로 향상시킬 수 있다. 하지만, 상기 기술은 많은 생물학적 시료의 최종영상에서 낮은 광 강도를 갖고, 그리고 여전히 낮은 겉보기 해상도에 의해 영향을 받는다.
위상차는 투명한 표본을 통과하는 광에서 위상 변이를 영상에서 명도 변화로 전환하는 광학 현미경검사 조명 기술이다. 다시 말하면, 위상차는 굴절률에서 차이를 대비에서 차이로서 보여준다. 위상 변이는 그 자체로는 인간 눈에 보이지 않지만, 그들이 명도 변화로서 도시될 때, 가시화될 수 있다.
차등 간섭 대비 (DIC) 현미경검사에서, 광학 밀도에서 차이는 선명함 (relief)에서 차이로서 나타날 것이다. 상기 시스템은 광을 정상 빔 (ordinary beam)과 비정상 빔 (extraordinary beam)으로 분할하는 집광렌즈에서 특수한 프리즘 (Nomarski 프리즘, Wollaston 프리즘)으로 구성된다. 이들 두 빔 사이에 공간적 차이는 최소한이다 (대물렌즈의 최대 해상도 미만). 표본을 통과한 후, 이들 빔은 대물렌즈 내에 유사한 프리즘에 의해 재결합된다. 동질성 표본에서는 이들 두 빔 사이에 차이가 없고, 그리고 어떤 대비도 발생하지 않는다. 하지만, 굴절 경계 (refractive boundary) (가령, 세포질 내에 핵) 인근에서, 정상 빔과 비정상 빔 사이에 차이는 영상에서 선명함을 유발할 것이다. 차등 간섭 대비는 편광 공급원이 기능할 것을 요구한다; 2개의 편광 필터는 하나가 집광렌즈 (편광자) 아래에, 그리고 다른 하나가 대물렌즈 (분석기) 위에, 광 경로에서 적합되어야 한다.
간섭을 이용한 다른 현미경적 기술은 간섭 반사 현미경검사 (일명, 반사 간섭 대비, 또는 RIC)이다. 이것은 상이한 굴절률을 갖는 2가지 물질 사이에 계면이 있을 때에는 언제든지 반사되는 좁은 범위의 파장의 편광을 이용하여, 세포의 유리 표면에 대한 유착을 조사하는데 이용된다. 세포가 유리 표면에 부착될 때에는 언제든지, 유리로부터 반사광 및 부착된 세포로부터 반사광은 간섭할 것이다. 유리에 부착된 세포가 없으면, 어떤 간섭도 없을 것이다.
형광 현미경은 유기 또는 무기 물질의 성질을 조사하기 위해 반사와 흡수 대신에, 또는 반사와 흡수에 추가하여, 형광과 인광을 이용하는 광학 현미경이다. 형광 현미경검사에서, 시료는 시료에서 형광을 여기하는 파장의 광으로 조명된다. 통상적으로, 조명보다 긴 파장인 형광을 발하는 광은 이후, 현미경 대물렌즈를 통해 영상화된다. 2가지 필터가 이러한 기술에서 이용될 수 있다; 조명이 단색에 가깝고 정확한 파장에 있도록 담보하는 조명 (또는 여기) 필터, 그리고 어떤 여기 광원도 검출기에 도달하지 않도록 담보하는 두 번째 방출 (또는 장벽) 필터. 대안으로, 이들 기능 둘 모두, 단일 이색성 필터에 의해 달성될 수도 있다. "형광 현미경"은 에피형광 현미경과 같은 비교적 단순한 셋업, 또는 더욱 높은 해상도의 형광 영상을 획득하기 위해 광학 섹션화를 이용하는 공초점 현미경과 같은 더욱 복잡한 설계인 지에 상관없이, 영상을 산출하기 위해 형광을 이용하는 임의의 현미경을 지칭한다.
공초점 현미경검사는 초점을 벗어난 (out-of-focus) 신호를 제거하기 위해 검출기의 앞에서 광학적으로 접합된 면에서 점 조명 (point illumination)과 핀홀 (pinhole)을 이용한다. 초점 면에 매우 가까운 형광에 의해 생산된 광만 검출될 수 있기 때문에, 특히 시료 심부 방향에서 영상의 광학 해상도는 광역장 현미경의 광학 해상도보다 훨씬 우수하다. 하지만, 시료 형광으로부터 많은 광이 핀홀에서 차단되기 때문에, 이러한 증가된 해상도는 감소된 신호 강도의 대가를 필요로 한다 - 따라서 긴 노출이 종종 요구된다. 시료 내에 단지 하나의 점만 한 시점에서 조명되기 때문에, 2D 또는 3D 영상화는 표본 내에 규칙적인 래스터 (즉, 병렬 주사선의 직사각형 패턴) 위에서 주사 (scanning)를 필요로 한다. 초점 면의 획득가능 두께는 대물렌즈의 개구수뿐만 아니라 표본의 광학 성질에 의해 분할된 이용 광의 파장에 의해 거의 규정된다. 가능한 얇은 광학 섹션화는 이들 유형의 현미경을 시료의 3D 영상화와 표면 프로파일링에서 특히 유효하게 만든다.
광 시트 현미경검사로서 알려져 있는 단일 면 조명 현미경검사 (SPIM)에서, 검출 대물렌즈의 초점 면에서 형광단만 조명된다. 광 시트는 한 방향에서 시준되고 다른 방향에서 집중되는 빔이다. 어떤 형광단도 검출기의 초점 면 외부로 여기되지 않기 때문에, 상기 방법은 또한, 내재성 광학 섹션화를 제공한다. 게다가, 전통적인 현미경검사와 비교할 때, 광 시트 방법은 감소된 광퇴색 및 더욱 낮은 광독성을 보이고, 그리고 종종, 표본당 훨씬 많은 스캔을 가능하게 한다. 표본을 회전함으로써, 상기 기술은 상이한 각도로부터 획득된 복수의 시야에서 사실상 모든 면을 영상할 수 있다. 하지만, 모든 각도에 대해, 표본의 단지 상대적으로 얕은 섹션만 고해상도로 영상화되고, 반면 더욱 깊은 영역은 점점 더 흐리게 보인다.
초-해상도 현미경검사는 광 현미경검사의 한 가지 형태이다. 광의 회절로 인하여, 전통적인 광 현미경검사의 해상도는 1873년에 Ernst Abbe에 의해 언급된 바와 같이 제한된다. 획득가능한 해상도의 효과적인 개산은 점상 확산 함수 (point spread function)의 FWHM (반-극대에서 전체 너비)이고, 그리고 높은 개구수와 가시 광을 갖는 정확한 광역장 현미경은 통상적으로 ~250 nm의 해상도에 도달한다. 초-해상도 기술은 회절 한계보다 높은 해상도에서 영상의 포착을 가능하게 한다. 이들은 2가지 넓은 범주, 소멸파 (evanescent wave)에 내포된 정보를 포착하는 "진정" 초-해상도 기술, 그리고 초-해상도 영상을 재구성하기 위해 실험적 기술 및 영상화되는 물질에 대한 공지된 제약을 이용하는 "기능적" 초-해상도 기술에 속한다.
레이저 현미경검사는 다른 형태의 현미경검사에서 레이저 조명 공급원을 이용한다. 가령, 생물학적 적용에 집중된 레이저 현미경검사는 비선형 현미경검사, 포화 현미경검사, 그리고 다광자 형광 현미경검사, 예를 들면, 2-광자 여기 현미경검사 (매우 높은 깊이, 예를 들면, 1 밀리미터까지 생존 조직의 영상화를 가능하게 하는 형광 영상화 기술)를 비롯한 다양한 기술에서 초단 펄스 레이저, 또는 펨토초 레이저를 이용한다.
전자 현미경검사 (EM)에서, 전자의 빔이 표본을 조명하고 확대된 영상을 생산하는데 이용된다. 전자 현미경은 광-파워 광학 현미경보다 높은 해상력을 갖는데, 그 이유는 전자가 가시 광 (광자)보다 약 100,000배 짧은 파장을 갖기 때문이다. 이들은 50 pm보다 우수한 해상도 및 약 10,000,000x까지의 배율을 달성할 수 있는 반면, 통상의 비-공초점 광 현미경은 약 200 nm 해상도까지 회절 및 2000x 미만의 유용한 배율에 의해 제한된다. 전자 현미경은 전자 빔을 제어하고 이를 집중시켜 영상을 형성하기 위해 정전과 전자기 "렌즈"를 이용한다. 이들 렌즈는 광을 표본 상에 또는 표본을 통해 집중함으로써 확대된 영상을 형성하는 광학 현미경의 유리 렌즈와 유사하지만 상이하다. 전자 현미경은 미생물, 세포, 큰 분자, 생검 시료, 금속, 그리고 결정을 비롯한 넓은 범위의 생물학적 표본과 무기 표본을 관찰하는데 이용된다. 산업적으로, 전자 현미경은 종종, 품질 관리와 실패 분석에 이용된다. 전자 현미경검사의 실례에는 투과 전자 현미경검사 (TEM), 주사 전자 현미경검사 (SEM), 반사 전자 현미경검사 (REM), 주사 투과 전자 현미경검사 (STEM) 및 저-전압 전자 현미경검사 (LVEM)가 포함된다.
주사식 탐침 현미경검사 (SPM)는 표본을 주사하는 물리적 프로브를 이용하여 표면의 영상을 형성하는 현미경검사의 한 분과이다. 표면의 영상은 표본의 래스터 스캔에서 프로브를 선에서 선으로 기계적으로 이동하고, 그리고 프로브-표면 상호작용을 위치의 함수로서 기록함으로써 획득된다. SPM의 실례에는 원자력 현미경검사 (ATM), 탄도 전자 방출 현미경검사 (BEEM), 화학력 현미경검사 (CFM), 전도성 원자력 현미경검사 (C-AFM), 전기화학적 주사 터널 현미경 (ECSTM), 정전력 현미경검사 (EFM), 유체력 현미경 (유체FM), 힘 변조 현미경검사 (FMM), 특징-지향성 주사식 탐침 현미경검사 (FOSPM), 켈빈 탐침력 현미경검사 (KPFM), 자기력 현미경검사 (MFM), 자기 공명력 현미경검사 (MRFM), 근접장 주사 광학 현미경검사 (NSOM) (또는 SNOM, 주사 근접장 광학 현미경검사, SNOM), 압전감응력 현미경검사 (PFM), PSTM, 광자 주사 터널 현미경검사 (PSTM), PTMS, 광열 미세분광학/현미경검사 (PTMS), SCM, 주사 전기용량 현미경검사 (SCM), SECM, 주사 전기화학적 현미경검사 (SECM), SGM, 주사 게이트 현미경검사 (SGM), SHPM, 주사 홀 프로브 현미경검사 (SHPM), SICM, 주사 이온-전도도 현미경검사 (SICM), SPSM 회전 편광 주사 터널 현미경검사 (SPSM), SSRM, 주사 확산 저항 현미경검사 (SSRM), SThM, 주사 열 현미경검사 (SThM), STM, 주사 터널 현미경검사 (STM), STP, 주사 터널 전위차법 (STP), SVM, 주사 전압 현미경검사 (SVM), 그리고 싱크로트론 x-선 주사 터널 현미경검사 (SXSTM)가 포함된다.
시약과 키트
또한, 전술한 방법 중에서 하나 또는 그 이상을 실시하기 위한 시약과 이들의 키트가 제시된다. 시약과 키트에는 하기 중에서 하나 또는 그 이상이 포함될 수 있다: 고정제; 하이드로겔 아단위; 명료화 시약; 검출 거대분자, 예를 들면, 표지화된 및/또는 표지화되지 않은 항체, 핵산 프로브 (올리고뉴클레오티드, 벡터 등), 화학물질 등; 완충액, 예를 들면, 표본을 고정, 세척, 명료화 및/또는 염색하기 위한 완충액; 봉입제; 포매 주형; 해체 도구 등. 대상 시약과 이들의 키트는 매우 다양할 수 있다.
또한, 예로서 세포와 세포이하 수준에서 조직을 조사하는데 이용하기 위해 대상 방법에 의해 준비된 표본이 제시된다. 가령, 고정되고 중합화된 표본, 또는 고정되고, 중합화되고, 그리고 명료화된 표본은 관심되는 유전자의 발현을 조사하는데 이용하기 위해, 관심되는 세포 및/또는 세포이하 구조를 표적으로 하는 후보 작용제를 식별하기 위한 스크린을 위해, 기타 등등을 위해 제공된다. 이런 준비된 표본은 또한, 본원에서 설명된 바와 같은 키트 또는 시스템 중에서 하나에서 양성 대조 (positive control)로서 제공될 수도 있다.
상기 요소에 더하여, 대상 키트는 대상 방법을 실시하기 위한 사용설명서를 더욱 포함할 수 있다. 이들 사용설명서는 대상 키트 내에 다양한 형태로 존재할 수 있고, 하나 또는 그 이상이 키트 내에 존재할 수 있다. 이들 사용설명서가 존재할 수 있는 한 가지 형태는 키트의 포장, 포장 삽입물 등에서 적절한 매체 또는 기질 상에 인쇄된 정보, 예를 들면, 정보가 인쇄된 한 장 또는 여러 장의 종이이다. 또 다른 수단은 컴퓨터 판독가능 매체, 예를 들면, 디스켓, CD, 디지털 저장 매체 등인데, 여기에 정보가 기록된다. 존재할 수 있는 또 다른 수단은 인터넷을 통해 멀리 떨어진 위치에서 정보에 접근하는데 이용될 수 있는 웹사이트 주소이다. 임의의 편의한 수단이 키트 내에 존재할 수 있다.
장치와 시스템
또한, 대상 방법의 측면을 수행하기 위한 장치가 포함된다. 대상 장치에는 예로서, 표본을 고정, 명료화 및/또는 염색하기 위한 전기영동 기구, 초음파, 극초단파, 바늘, 배관, 관류 펌프 등이 포함될 수 있다.
특히 관심되는 한 가지 장치는 표본으로부터 세포 요소, 예를 들면, 하이드로겔 네트워크에 교차결합되지 않은 세포 요소를 제거하는데 이용하는데 적합한 전기영동 장치이다. "전기영동"은 시료, 예를 들면, 생물학적 시료에 전기장의 적용을 의미한다. 전기영동은 시료 내에 생물학적 거대분자, 예를 들면, 핵산, 단백질을 기동시켜, 이들 거대분자를 분리하고 분석하는데 가장 통상적으로 이용된다. 모세관 전기영동, 겔 전기영동, 종이 전기영동, 그리고 면역전기영동을 비롯한 다양한 전기영동 기술이 개발되었다. 가령, 겔 전기영동에서, 아가로오즈 또는 폴리아크릴아미드와 같은 화합물을 이용하여 하이드로겔이 형성된다. 원하는 거대분자를 내포하는 혼합물은 겔의 한쪽 단부에 위치 (또는 적하)되고, 그리고 겔은 이후, 액체 완충액과 접촉하여 배치된다. 이러한 액체 완충액은 염을 내포하는데, 이것은 용해될 때, 완충액 내에 이온을 형성한다. 생물학적 분자는 예로서, 전기영동 완충액과 접촉될 때, 전형적으로 하전된다. 가령, DNA는 중추 내에 인산염 기로 인해 통상의 전기영동 완충액에서 음으로 하전된다. 이런 이유로, 전류가 겔의 단부에 가해질 때, 생물학적 분자는 한쪽 단부에서 다른 단부로 겔을 통해 이동한다.
전기영동 장치와 겔 전기영동의 방법의 실례는 예로서, US 특허 번호 3129158, 3208929, 3346479, 3375187, 3616454, 3616457, 3616454, 3616457, 3563880, 3576727, 3674678, 3865712, 4088561, 4151065, 4292161, 4339327, 4375401, 4415418, 4479861, 그리고 4588491; 그리고 Martin, Robin. Gel electrophoresis: nucleic acids. BIOS Scientific, 1996; Hames, B.D. Gel Electrophoresis of Proteins: A Practical Approach, Oxford University Press 1998; 그리고 Burmeister, M. and Ulanovsky, L. Pulsed-field Gel Electrophoresis, The Humana Press Inc. 1992에서 찾아볼 수 있고, 이들의 개시는 본원에 참조로서 편입된다.
대상 방법에서 이용하기 적합한 전기영동 장치는 일반적으로, 완충액 용액 및 하이드로겔-포매된 표본이 배치될 수 있는 전기영동 챔버를 포함할 것이다. 예로서, 도 2와 도 8을 참조한다. 전기영동 챔버는 일반적으로, 관심되는 하이드로겔-포매된 시료를 수용하는데 적합한 임의의 크기이고, 그리고 용액을 챔버 내에 유지하는 임의의 재료, 예를 들면, 유리와 플라스틱, 예를 들면, 예로서 아크릴릭, 폴리카보네이트, 폴리스티렌, 폴리메틸 메타크릴레이트, 폴리에틸렌, 폴리플루오르에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리우레탄, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리테트라플루오르에틸렌 등으로 구성될 수 있다. 일부 구체예에서, 챔버는 특정 적용을 위해 적절하면, 주조되거나 또는 기계로 가공되고, 또는 수지 또는 경성 플라스틱으로부터 달리 형성될 수도 있다. 일정한 구체예에서, 전기영동 챔버는 하이드로겔-포매된 시료를 지지하도록 형성된 요소, 예를 들면, 예로서 플랫폼을 전기영동 챔버 내에 더욱 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 전기영동 장치는 챔버를 닫기 위해 전기영동 챔버 위에 맞춤되는 뚜껑을 포함할 수 있다. 본 발명의 구체예에 따른 뚜껑은 뚜껑이 전기영동 챔버에 커플링될 때, 챔버의 몸체와 유밀한 및/또는 기밀한 밀폐를 형성하는 밀폐제를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 밀폐 요소는 뚜껑에 부착되거나, 챔버에 부착되거나, 또는 뚜껑과 챔버 둘 모두에 부착될 수 있다. 뚜껑이 챔버에 커플링될 때, 밀폐 요소는 유밀한 및/또는 기밀한 밀폐를 형성할 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에 따른 전기영동 장치는 챔버 내에 전기장을 발생시키기 위해 전류가 가해지는 전기영동 챔버와 작동가능하게 연결된 반대 극성의 2개 또는 그 이상의 전극 (즉, "아노드" (음으로 하전된) 및 최소한 하나의 "캐쏘드" (양으로 하전된))를 포함할 수 있다. 전극은 전류의 전극에 대한 적용 시에 전기장이 확립되도록 결과하는 임의의 재료로 구성될 수 있고, 챔버 내에, 그리고 예로서 핵산 또는 단백질 전기영동의 분야에서 널리 공지된 바와 같이, 그 내부에 배치된 표본을 교차하여 전기장의 확립을 촉진하는 임의의 편의한 방식으로 표본이 배치되는 위치에 상대적으로 형성될 수 있다. 예로서, US 특허 번호 3129158, 3208929, 3346479, 3375187, 3616454, 3616457, 3616454, 3616457, 3563880, 3576727, 3674678, 3865712, 4088561, 4151065, 4292161, 4339327, 4375401, 4415418, 4479861, 그리고 4588491; 그리고 Martin, Robin. Gel electrophoresis: nucleic acids. BIOS Scientific, 1996; Hames, B.D. Gel Electrophoresis of Proteins: A Practical Approach, Oxford University Press 1998; 그리고 Burmeister, M. and Ulanovsky, L. Pulsed-field Gel Electrophoresis, The Humana Press Inc. 1992를 참조한다. 가령, 전극은 표본에 실질적으로 접하도록 챔버 내에 형성될 수 있다.
일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 전극은 전극 사이에서 발생되는 전기장의 크기를 확장하는데 이용되는 확장 요소를 포함할 수 있다. 가령, 일정한 구체예에서, 전극은 한번 꺾어 접히는 복수의 S-모양 벤드를 형성하는 전극의 뱀모양 포션의 형태에서 확장 요소를 포함할 수 있다. 뱀모양 확장 요소를 포함하는 전극의 실례는 도 2, 패널 c (참고 번호 103a와 103b)에서 발견될 수 있다. 확장 요소는 전체 3-차원 조직 표본이 전기장 내에 배치될 수 있도록, 전압이 전극에 가해질 때 발생되는 전기장의 크기를 확장한다. 확장 요소의 길이와 너비는 다양한 치수의 조직 표본을 수용하기 위해 필요에 따라 조정될 수 있다. 가령, 일정한 구체예에서 확장 요소를 포함하는 전극의 길이와 너비는 도 8, 패널 e에서 도시된 바와 같이 대략 동등하다.
일정한 구체예에서, 전기영동 챔버는 예로서, 고체 칸막이에 의해 또는 공기에 의해 2개의 상이한 영역으로 분할될 수 있고, 여기서 각 영역은 완충액 내에 하나의 전극을 포함하고, 그리고 표본은 표본이 이들 두 영역에 미치거나 또는 걸치도록, 전극에 의해 발생된 전기장이 표본을 통해 발생되도록 완충액 내에 배치된다. 일부 경우에, 챔버는 하이드로겔-포매된 표본이 그 위에 또는 그 내로 배치된 플랫폼 또는 지지 구조, 예를 들면, 2개의 전극 사이에 플랫폼, 전극을 포함하는 챔버의 영역에 걸쳐있는 플랫폼 등을 포함할 수 있다.
전기영동 기구는 전압이 전극에 가해질 수 있는 전력원에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 경우에, 전력원은 전기영동 기구로부터 분리될 수 있다, 다시 말하면, 전기영동 기구는 전력원으로부터 독립된 모듈일 수 있다. 다른 경우에, 전력원은 전기영동 기구 내로 통합될 수도 있다, 다시 말하면, 전기영동 기구는 전력원을 포함할 것이다.
일부 경우에, 전기영동 챔버 내에 완충액을 교체하거나 또는 재순환시키는 것이 바람직할 수 있다. "순환된" 또는 "재순환된" 완충액은 완충액이 챔버로부터 제거되고, 이후 예로서, 냉각 유닛 (냉장 유닛, 얼음조 등), 가열 유닛, 필터 등을 통과한 후, 챔버로 반송된다는 것을 의미한다. "교체된"은 완충액이 챔버로부터 제거되고, 그리고 새로운 완충액이 그 자리에 첨가된다는 것을 의미한다. 가령, 전기영동 챔버 내에 완충액의 온도를 제어하거나 (가령, 챔버가 하이드로겔이 탈중합화하거나 또는 표본 내에 생체분자가 변성하도록 유발할 지도 모르는 온도, 예를 들면, 35℃ 또는 그 이상, 40℃ 또는 그 이상, 또는 50℃ 또는 그 이상, 60℃ 또는 그 이상, 70℃ 또는 그 이상, 80℃ 또는 그 이상, 90℃ 또는 그 이상, 또는 100℃ 또는 그 이상에 도달하는 것을 예방하거나); 거대분자가 표본을 빠져나감에 따라서 이들을 완충액으로부터 제거하거나; 완충액의 이온 강도를 변화시키거나; 기타 등등이 바람직하다. 이를 위해, 전기영동 기구는 완충액이 챔버를 들어가고 및/또는 빠져나가는 하나 또는 그 이상의 포트를 임의선택적으로 포함할 수 있다. 일부 경우에, 챔버는 2개 또는 그 이상의 포트, 예를 들면, 완충액이 챔버를 들어가는 첫 번째 포트 및 완충액이 챔버를 빠져나가는 두 번째 포트를 포함할 수 있다.
완충액은 하나 또는 그 이상의 포트 및 임의선택적으로, 배관, 펌프, 밸브, 또는 임의의 다른 적절한 유체 취급 및/또는 유체 조작 설비, 예를 들면, 장치의 하나 또는 그 이상의 요소에 제거가능하게 부착되거나 또는 영구적으로 부착된 배관의 이용에 의해 추가/제거/재순환/교체될 수 있다. 가령, 첫 번째와 두 번째 단부를 갖는 첫 번째 튜브는 첫 번째 포트에 부착될 수 있고, 그리고 첫 번째와 두 번째 단부를 갖는 두 번째 튜브는 두 번째 포트에 부착될 수 있고, 여기서 첫 번째 튜브의 첫 번째 단부는 첫 번째 포트에 부착되고 첫 번째 튜브의 두 번째 단부는 용기, 예를 들면, 냉각 유닛, 가열 유닛, 여과 유닛, 폐기물 용기 등에 작동가능하게 연결되고; 그리고 두 번째 튜브의 첫 번째 단부는 두 번째 포트에 부착되고 두 번째 튜브의 두 번째 단부는 용기, 예를 들면, 냉각 유닛, 얼음 위에서 비커, 여과 유닛, 폐기물 용기 등에 작동가능하게 연결된다.
다른 실례로서, 첫 번째와 두 번째 단부를 갖는 하나의 튜브가 첫 번째와 두 번째 포트 둘 모두에 제거가능하게 부착될 수 있다, 다시 말하면, 튜브의 첫 번째 단부는 첫 번째 포트에 제거가능하게 부착되고 튜브의 두 번째 단부는 두 번째 포트에 제거가능하게 부착되고, 여기서 배관은 예로서, 냉장 유닛 (가령, 배관이 상기 유닛을 통과한다), 필터 (가령, 배관이 필터를 포함한다), 완충액 저장소 (가령, 배관이 예로서, 분배기를 거쳐 저장소로부터 교체 완충액을 받아들인다) 등에 작동가능하게 연결된다. 일부 경우에, 배관은 또한, 배관을 통한 액체의 움직임을 조장하고, 전기영동 챔버로부터 완충액의 첨가/제거/재순환을 조장하고, 기타 등등을 조장하는 펌프, 예를 들면, 연동 펌프, 전기-삼투성 펌프, 진동 펌프, 격막 펌프 등에 작동가능하게 연결될 것이다. 이러한 방식으로, 전기영동 기구는 냉각 유닛, 가열 유닛, 여과 유닛, 완충액 저장소/용기, 펌프 등에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 구체예에서, 냉장 유닛, 가열 유닛, 여과 유닛, 완충액 저장소/용기, 펌프 등은 전기영동 기구 내로 통합될 것이다. 다시 말하면, 전기영동 기구는 냉장 유닛, 가열 유닛, 여과 유닛, 완충액 저장소/용기, 펌프 등을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 냉장 유닛, 가열 유닛, 여과 유닛, 완충액 저장소/용기, 펌프 등은 전기영동 기구로부터 독립된 모듈일 수 있다.
도 2로 눈을 돌리면, 대표적인 전기영동 조직 명료화 장치가 도시된다. 실례 장치 101은 뚜껑 102, 첫 번째 전극 103a, 두 번째 전극 103b, 기부 104, 출구 포트 105, 입구 포트 106, 첫 번째 전극 연결기 107a 및 두 번째 전극 연결기 107b를 포함한다.
본 발명은 또한, 대상 방법을 실시하기 위한 시스템을 제시한다. 시스템은 본원에서 설명된 하나 또는 그 이상의 모듈, 예를 들면, 전기영동 기구, 전원 공급장치, 냉장 유닛, 가열 유닛, 펌프 등을 포함할 수 있다. 시스템은 또한, 본원에서 설명된 임의의 시약, 예를 들면, 고정제; 하이드로겔 아단위; 명료화 시약; 검출 거대분자, 예를 들면, 항체, 핵산 프로브 (올리고뉴클레오티드, 벡터 등), 화학물질 등; 완충액, 예를 들면, 표본을 고정, 세척, 명료화 및/또는 염색하기 위한 완충액; 봉입제; 포매 주형 등을 포함할 수 있다. 일정한 구체예에 따른 시스템은 또한, 현미경 및/또는 관련된 영상화 설비, 예를 들면, 카메라 요소, 디지털 영상화 요소 및/또는 영상 포착 설비, 하나 또는 그 이상의 사용자 입력에 따라 영상을 수집하도록 형성된 컴퓨터 프로세서 등을 포함할 수 있다.
적용
대상 방법, 시약, 키트, 시스템과 장치를 이용하여, 당업자는 현미경적 분석을 위한 임의의 생물학적 조직을 준비할 수 있을 것이다. 방법, 시약, 키트, 시스템과 장치는 유전자도입 동물, 예를 들면, 척추동물 또는 무척추동물, 예를 들면, 곤충, 웜, 제노푸스, 제브라피시, 포유동물, 예를 들면, 말, 소, 양, 개, 고양이, 뮤린, 설치류, 비-인간 영장류 또는 인간이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 임의의 식물 또는 동물로부터 표본을 준비하는데 이용될 수 있다. 조직 표본은 살아있는 개체 (가령, 생검 시료)로부터 수집되거나 또는 죽은 개체 (가령, 부검 또는 검시 시료)로부터 수집될 수 있다. 표본은 임의의 조직 유형, 예를 들면, 조혈, 신경 (중추 또는 말초), 신경교, 간엽, 피부, 점막, 간질, 근육 (골격, 심장, 또는 평활), 비장, 세망내피, 상피, 내피, 간, 신장, 췌장, 위장, 폐, 섬유아세포, 그리고 기타 세포 유형일 수 있다. 일부 경우에, 표본은 완전한 생물체, 예를 들면, 웜, 곤충, 제브라피시이다. 다른 경우에, 표본은 전체 장기, 예를 들면, 설치류의 전뇌이다. 다른 경우에, 표본은 장기의 일부분, 다시 말하면, 생검, 예를 들면, 이식된 조직의 생검이다. 표본은 새로 단리되거나 또는 보존, 예를 들면, 순간 동결될 수 있다. 일부 구체예에서, 표본은 미리 보존된 표본, 예를 들면, 예로서 조직 은행으로부터 보존된 표본, 예를 들면, 조직 수집 프로그램으로부터 획득된 인간 뇌의 보존된 표본일 수 있다. 일부 경우에, 표본은 특정된 질환 또는 장애를 앓는 것으로 알려진 개체로부터 표본, 예를 들면, 예로서 자폐성 인간으로부터 뇌 조직의 시료일 수 있다. 다른 경우에, 시료는 특정한 질환 또는 장애를 앓지 않는 "정상적인" 개체로부터 획득될 수 있다. 일부 경우에, 시료는 유전자도입 개체, 예를 들면, 예로서 유전자도입 생쥐로부터 획득될 수 있다.
표본의 세포가 조직의 초미세구조를 물리적으로 지지하는 하이드로겔에 교차결합되기 때문에, 세포와 조직의 3-차원 체계를 보존하면서, 구조적 지지를 정상적으로 제공하지만 세포이하 단백질과 분자의 가시화를 방해하는 세포 요소, 예를 들면, 지질이 제거될 수 있다. 이러한 제거는 생물학적 표본의 내부가 광 및/또는 거대분자에 대해 실질적으로 투과성이도록 만들고, 표본의 내부, 예를 들면, 세포와 세포이하 구조가 조직의 시간-소모적이고 교란적인 섹션화 없이, 현미경적으로 가시화될 수 있도록 한다. 상기 절차는 또한, 당분야에서 통상적으로 이용되는 절차보다 신속한데, 그 이유는 전형적으로 별개의 단계에서 수행되는 명료화와 투과화가 세포 요소를 제거하는 단일 단계에서 합동될 수 있기 때문이다. 부가적으로, 표본은 포괄적인 분석을 위해 반복적으로 염색되고, 염색이 되지 않고, 그리고 다른 시약으로 재-염색될 수 있다.
대상 방법은 많은 용도를 발견한다. 가령, 대상 방법은 중추신경계의 연결도 (connectivity)를 조사하기 위한 표본을 준비하는데 적용될 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같은 "연결도"는 일반적으로, 뉴론 사이에 연결을 의미하고, 그리고 단일 세포 수준, 예를 들면, 시냅스, 축삭 말단, 수지상 척주 등에서 연결뿐만 아니라 CNS의 뉴론과 영역의 그룹, 예를 들면, 주요 축삭 관, 예를 들면, 뇌량 (CC), 전교련 (AC), 해마 맞교차 (HC), 추체교차, 추체로, 바깥섬유막, 속섬유막 (IC), 대뇌각 (CP) 등 사이에 연결을 포함한다. 전뇌 및/또는 이의 척수 표본 또는 영역 (가령, 대뇌 (즉, 대뇌 피질), 소뇌 (즉, 소뇌 피질), 전뇌의 복측 영역 (가령, 줄무늬체, 미상, 피각, 담창구, 중격의지핵; 중격핵, 시상밑핵); 시상과 시상하부의 영역과 핵; 심부 소뇌의 영역과 핵 (가령, 치상핵, 구상핵, 전상핵, 실정핵) 및 뇌간 (가령, 흑질, 적색핵, 뇌교, 올리브 핵, 뇌신경 핵); 그리고 척주의 영역 (가령, 앞뿔, 가쪽뿔, 뒤뿔))은 대상 방법에 의해 사후에 준비되고, 그리고 그 내부에 뉴론의 연결도는 예로서, 사후에 뇌, 예를 들면, 인간 뇌의 완전한 연결도를 제공하기 위해 현미경적으로 분석될 수 있다, 예를 들면, 획득되고, 보관되고, 렌더링되고, 이용되고, 그리고 작동될 수 있다. 이런 연구는 뇌가 어떻게 발달하고 건강에서 및 질환 동안 어떻게 기능하는 지를 이해하고, 그리고 인식과 인격의 토대를 이해하는데 크게 기여할 것이다.
다른 실례로서, 대상 방법은 질환을 사정하거나, 진단하거나 또는 모니터링하는데 이용될 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같은 "진단"은 일반적으로, 질환 또는 장애에 대한 개체 감수성의 예측, 개체가 현재 질환 또는 장애에 의해 영향을 받는 지에 대한 결정, 질환 또는 장애에 의해 영향을 받는 개체의 예후 (가령, 암성 상태, 암의 단계, 환자가 암으로 사망할 가능성의 식별), 질환 또는 장애를 위한 치료에 대한 개체 반응성의 예측 (가령, 예로서 동종이계 조혈 줄기 세포 이식, 화학요법, 방사선요법, 항체요법, 작은 분자 화합물 요법에 대한 긍정적인 반응, 부정적인 반응, 반응 전혀 없음) 및 테라메트릭스 (therametrics)의 이용 (가령, 치료의 효과 또는 효능에 관한 정보를 제공하기 위한 개체 상태의 모니터링)을 포함한다. 가령, 생검은 암성 조직으로부터 준비되고, 그리고 암의 유형, 암이 발달한 정도, 암이 치료적 개입 (therapeutic intervention)에 반응하는 지의 여부 등을 결정하기 위해 현미경적으로 분석될 수 있다.
다른 실례로서, 생검은 조직의 상태, 질환이 발달한 정도, 치료가 성공적일 가능성 등을 결정하기 위해 병든 조직, 예를 들면, 신장, 췌장, 위 등으로부터 준비될 수 있다. 본원에서 용어 "치료", "치료하는" 등은 일반적으로, 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 획득하는 것을 의미하는데 이용된다. 효과는 질환 또는 이의 증상을 완전하게 또는 부분적으로 예방한다는 관점에서 예방적 및/또는 질환 및/또는 질환에 기인한 부작용에 대한 부분적인 또는 완전한 치유의 관점에서 치료적일 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같은 "치료"는 포유동물에서 질환의 임의의 치료를 포괄하고, 그리고 (a) 질환에 대한 소인이 있지만 이를 앓는 것으로 아직 진단되지 않은 개체에서 질환이 발생하는 것을 예방하거나; (b) 질환을 저해하거나, 다시 말하면, 이의 발생을 중지시키거나; 또는 (c) 질환을 경감하는, 다시 말하면, 질환의 관해를 유발하는 것을 포함한다. 치료적 작용제는 질환 또는 손상의 발생 이전에, 동안 또는 이후에 투여될 수 있다. 치료가 환자의 원치 않는 임상 증상을 안정시키거나 또는 감소시키는 진행성 질환의 치료가 특히 관심된다. 이런 치료는 바람직하게는, 영향을 받은 조직에서 기능의 완전한 상실에 앞서 수행된다. 대상 요법은 바람직하게는, 질환의 증상 단계 동안, 그리고 일부 경우에 질환의 증상 단계 이후에 투여된다. 용어 "개인", "개체", "피험자" 및 "환자"는 본원에서 교체가능하게 이용되고, 그리고 진단, 치료, 또는 요법이 요망되는 임의의 포유류 개체, 특히 인간을 지칭한다. 대상 방법과 시스템을 이용한 사정, 분석, 진단, 예후 및/또는 치료에 적합한 질환의 실례에는 암, 면역계 질환, 신경정신병 질환, 내분비/생식 질환, 심혈관/폐 질환, 근골격 질환, 위장 질환 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
유사하게, 대상 방법은 개체가 이식된 장기/조직, 예를 들면, 심장, 신장, 간, 또는 기타 장기를 얼마나 잘 받아들이는 지를 결정하기 위해 조직 이식편을 모니터링하는데 이용될 수 있다. 이런 경우에, 이식된 장기의 생검은 대상 방법에 의해 준비되고, 그리고 표본은 예를 들면, 조직 일체성, 조직 혈관화, 면역 세포의 침윤 등에 대해 현미경적으로 분석될 수 있다.
대상 방법은 또한, 정상적인 조직, 장기와 세포를 사정하는데, 예를 들면, 정상적인 조직 표본, 예를 들면, 특정한 질환 또는 장애를 앓는 것으로 알려지지 않은 개체로부터 채취된 조직 표본의 세포와 조직 사이에 관계를 사정하는데 이용될 수도 있다. 대상 방법은 예로서, 태아 발생 동안, 예를 들면, 예로서 신경계의 발생과 성숙 동안 세포와 조직 사이에 관계를 조사하고, 그리고 발생이 완결된 후 세포와 조직 사이에 관계, 예를 들면, 완전히 발달된 성체 표본의 신경계의 세포와 조직 사이에 관계를 조사하는데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 대상 방법은 특정한 세포, 조직 및/또는 장기의 발생 및/또는 기능에서 유전학적 변화의 효과를 조사하기 위해 유전자도입 동물로부터 수집된 시료에서 이용될 수 있다.
대상 방법은 또한, 후보 치료 작용제를 조직 또는 질환에 대한 그들의 효과에 대해 스크리닝하는데 유용한 시스템을 제공한다. 가령, 개체, 예를 들면, 생쥐, 쥐, 개 영장류, 인간 등은 후보 작용제와 접촉되고, 장기 또는 이의 생검이 대상 방법에 의해 준비되고, 그리고 준비된 표본은 하나 또는 그 이상의 세포 또는 조직 파라미터에 대해 현미경적으로 분석될 수 있다. 파라미터는 세포 또는 조직의 정량가능한 요소, 특히 가급적 고처리량 시스템에서 정확하게 측정될 수 있는 요소이다. 파라미터는 세포 표면 결정인자, 수용체, 단백질 또는 이의 형태적 또는 번역후 변경, 지질, 탄수화물, 유기 또는 무기 분자, 핵산, 예를 들면, mRNA, DNA 등, 또는 이런 세포 요소 또는 이들의 조합으로부터 유래된 일부분을 비롯한 임의의 세포 요소 또는 세포 산물일 수 있다. 대부분의 파라미터가 정량적 판독을 제공할 것이지만, 일부 경우에 반-정량적 또는 정성적 결과가 허용될 것이다. 판독은 단일 결정된 값을 포함하거나, 또는 평균, 중간 값 또는 분산 등을 포함할 수 있다. 특징적으로, 파라미터 판독 값의 범위는 복수의 동일한 검정으로부터 각 파라미터에 대해 획득될 것이다. 변이성 (variability)이 예상되고, 그리고 각 세트의 검사 파라미터에 대한 값의 범위는 단일 값을 제공하는데 이용된 통상의 통계학적 방법과 함께 표준 통계학적 방법을 이용하여 획득될 것이다. 따라서, 가령, 이와 같은 한 가지 방법은 세포 생존능, 조직 혈관화, 면역 세포 침윤물의 존재, 질환의 진행을 변경하는 효능 등을 검출하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 스크린은 분석된 파라미터(들)를 대조, 또는 참고 시료, 예를 들면, 후보 작용제와 접촉하지 않은 개체로부터 유사하게 준비된 표본으로부터 파라미터에 비교하는 것을 포함한다. 스크리닝을 위한 관심되는 후보 작용제에는 다수의 화학적 부류, 특히 유기금속성 분자를 비롯한 유기 분자, 무기 분자, 유전학적 서열 등을 포괄하는 공지와 미지의 화합물이 포함된다. 스크리닝을 위한 관심되는 후보 작용제에는 또한, 핵산, 예를 들면, siRNA, shRNA, 안티센스 분자, 또는 miRNA를 인코딩하는 핵산, 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산이 포함된다. 본 발명의 중요한 측면은 독성 검사 등을 비롯하여, 후보 약물을 사정하는 것이다. 대상 방법을 이용한 조직 시료의 사정은 예로서, 유전학적, 전사체학적, 유전체학적, 단백질체학적 및/또는 대사체학적 분석을 포함할 수 있다.
대상 방법은 또한, 전체 조직에서 유전학적으로 인코딩된 마커, 예를 들면, 염색체 비정상 (역위, 중복, 전좌 등), 유전적 이형접합성의 상실, 질환 또는 우수한 건강에 대한 소인을 암시하는 유전자 대립형질의 존재, 치료에 대한 가능한 반응성, 가계 등의 분포를 세포이하 해상도에서 가시화하는데 이용될 수 있다. 이런 검출은 예로서, 개인 맞춤형 의료에서 전술한 바와 같은 질환을 진단하고 모니터링하는데, 그리고 부성 (paternity)을 조사하는데 이용될 수 있다.
재료와 방법
하기 재료와 방법이 하기 실시예에서 이용되었다.
생쥐 뇌에 대한 CLARITY 과정:
성체 생쥐 (4-12주령)는 뷰타나시아-D로 마취되고 4 wt% 파라포름알데히드/4% 아크릴아미드 (wt/vol) / 0.025% 비스-아크릴아미드 (wt/vol) / 0.25 % VA044 (wt/vol) / PBS의 혼합물로 경심 관류되었다. 이후, 뇌가 추출되고 4℃에서 3일 동안 동일한 용액에서 배양되었다. 다음 단계에서, 중합화를 개시하기 위해 용액의 온도가 37℃로 증가되었다. 37℃에서 3시간 배양후, 하이드로겔-포매된 뇌는 전기영동 챔버 내에 배치되었다. 4% SDS (wt/vol)를 내포하는 붕산나트륨 완충액 (200mM, pH 8.5)을 챔버를 통해 순환시키면서, 50℃에서 2일 동안 10-40V가 뇌 전역에 가해졌다. 명료화 후, 이들 뇌는 뇌로부터 SDS를 제거하기 위해 37℃에서 2일 동안 PBS 완충액에서 배양되었다. 면역염색을 위한 생쥐 뇌의 1mm-두께 관상 블록을 만들기 위해, 하이드로겔-포매되고 명료화된 뇌는 생쥐 뇌 매트릭스 (카테고리 번호 15003, Ted Pella, inc., Redding, CA)를 이용하여 1mm-두께 블록으로 절단되었다. 이들 블록은 이후, 전술한 바와 같이 1일 동안 전기영동에 의해 명료화되었다.
사후 인간 뇌 조직에 대한 CLARITY 과정:
사후 인간 뇌 조직의 전두엽 (Brodmann's area 10) (자폐증 사례, #AN13961; 연령, 7세; 성별, 남성; 보관, 실온에서 10% 포르말린에서 82개월)은 바이브라톰을 이용하여 500 μm-두께 블록으로 잘라졌다. 이들 블록은 4 wt% 파라포름알데히드/4% 아크릴아미드 (wt/vol) / 0.025% 비스-아크릴아미드 (wt/vol) / 0.25 % VA044 (wt/vol) / PBS의 혼합물에서 4℃에서 1주 동안 배양되었다. 그 다음, 중합화를 개시하기 위해 용액의 온도가 37℃로 증가되었다. 37℃에서 3시간 배양 후, 하이드로겔-포매된 조직은 주문-제작된 전기영동 챔버 내에 배치되었다 (도 2와 도 8 참조). 4% SDS (wt/vol)를 내포하는 붕산나트륨 완충액 (200mM, pH 8.5)을 챔버를 통해 순환시키면서, 50℃에서 1일 동안 10-40V가 조직 전역에 가해졌다. 명료화 후, 명료화된 조직은 SDS를 제거하기 위해 37℃에서 1일 동안 PBS 완충액에서 배양되었다.
CLARITY-처리된 생쥐 뇌 조직의 면역염색:
GFP 염색을 위해, Thy1-EYFP H 라인 생쥐 (2월령) 뇌의 명료화된 1mm-두께 블록은 37℃에서 2일 동안 0.1% Triton X-100 (wt/vol) / Alexa Fluor 594와 접합된 항-GFP 항체 (카테고리 번호 A21312, Invitrogen, Carlsbad, CA, 1:50 희석도) / 1M 붕산나트륨 완충액 (pH 8.5) 용액에서 배양되고, 그 이후에 37℃에서 1일 동안 0.1% Triton X-100 (wt/vol) / 1M 붕산나트륨 완충액 (pH 8.5)으로 세척되었다. 다른 염색을 위해, Thy1-EYFP H 라인 생쥐 (2월령)의 명료화된 1mm-두께 블록은 37℃에서 2일 동안 0.1% Triton X-100 (wt/vol) / 일차 항체 (희석도, 1:50 - 1:100) / 1M 붕산나트륨 완충액 (pH 8.5) 용액에서 배양되고, 그 이후에 37℃에서 1일 동안 0.1% Triton X-100 (wt/vol) / 1M 붕산나트륨 완충액 (pH 8.5)으로 세척되었다. 조직은 이후, 37℃에서 1일 동안 0.1% Triton X-100 (wt/vol) / 이차 항체 (희석도, 1:50 - 1:100) / 1M 붕산나트륨 완충액 (pH 8.5) 용액에서 배양되고, 그 이후에 37℃에서 1일 동안 0.1% Triton X-100 (wt/vol) / 1M 붕산나트륨 완충액 (pH 8.5)으로 세척되었다.
CLARITY-처리된 사후 인간 뇌 조직의 면역염색:
명료화된 500 μm-두께 블록은 37℃에서 1일 동안 0.1% Triton X-100 (wt/vol) / 일차 항체 (희석도, 1:50 - 1:100) / 1M 붕산나트륨 완충액 (pH 8.5) 용액에서 배양되고, 그 이후에 37℃에서 반나절 동안 0.1% Triton X-100 (wt/vol) / 1M 붕산나트륨 완충액 (pH 8.5)으로 세척되었다. 조직은 이후, 37℃에서 1일 동안 0.1% Triton X-100 (wt/vol) / 이차 항체 (희석도, 1:50 - 1:100) / 1M 붕산나트륨 완충액 (pH 8.5) 용액에서 배양되고, 그 이후에 37℃에서 반나절 동안 0.1% Triton X-100 (wt/vol) / 1M 붕산나트륨 완충액 (pH 8.5)으로 세척되었다.
CLARITY 처리된 생쥐 뇌 조직의 영상화:
무손상 Thy1-EYFP H 라인 생쥐 뇌를 영상화하기 위해, 명료화된 뇌 (3월령)는 FocusClearTM, 물-기초된 담금 매체에서 2일 동안 배양되었다. 뇌는 이후, 2개의 커버유리-바닥 페트리 접시 사이에 끼워 넣어졌다. 뇌의 배측 절반은 10x 수침 대물렌즈가 구비된 Leica SP5 시스템 (Leica HCX AOP L, NA=0.30, 작업 거리=3.6) 및 514nm 여기를 이용하여 먼저 영상화되었다 (스택 크기=3.4mm, 단계 크기=10μm). 봉입된 뇌는 이후, 뒤집어지고, 그리고 복측 절반이 동일한 방식으로 영상화되었다.
피질에서부터 시상까지 가시화하는 3.4mm-두께 체적 영상을 획득하기 위해, 무손상 H 라인 생쥐 뇌는 전술한 바와 같이 봉입되고 10x 대물렌즈 및 514nm 여기 (스택 크기=3.4mm, 단계 크기=2μm)를 이용하여 영상화되었다.
면역염색된 1mm-두께 관상 블록은 FocusClearTM에서 1일 동안 배양되고, 그리고 커버유리-바닥 페트리 접시와 슬라이드유리 사이에 끼워 넣어졌다. 봉입된 시료는 10x 대물렌즈 및 1-광자 여기 (514nm, 591nm, 그리고 654nm)를 이용하여 영상화되었다.
CLARITY-처리된 사후 인간 뇌 조직의 영상화:
명료화되고 면역염색된 조직은 FocusClearTM에서 1일 동안 배양되고 전술한 바와 같이 봉입되었다. 조직은 이후, 25x 수침 대물렌즈가 구비된 Leica SP5 시스템 (Leica HCX IRAPO L, NA=0.95, 작업 거리=2.4)을 이용하여 영상화되었다 (스택 크기=500μm, 단계 크기=0.5μm). Alexa Fluor 594는 780nm 레이저로 여기되었다.
단백질 손실 측정:
6개 PFA-고정된 성체 생쥐 (4주령) 뇌 (4% SDS, Scale, 그리고 Triton X-100 처리의 경우) 및 2개 (4주령) PFA-고정된/하이드로겔-포매된 뇌 (CLARITY의 경우)는 1mm-두께 관상 블록으로 절단되었다. 각 PFA-고정된 뇌의 절반은 칭량되고 2.5ml의 4% SDS, ScaleU2 (4M 요소와 30% 글리세롤의 혼합물) 또는 0.1% Triton X-100 용액 내에 배치되었다. 각 PFA-고정된/하이드로겔-포매된 뇌의 절반은 2.5ml의 4% SDS 용액 내에 배치되었다. 이들 조직은 37℃에서 1주 동안 개별 용액에서 명료화되었고, 그리고 용액 내로 확산함으로써 조직으로부터 상실된 단백질의 양이 BCA (바이신코니닉산) 단백질 검정을 이용하여 측정되었다; 생쥐 뇌에서 총 단백질은 10 wt%로 추정됨.
신경돌기 추적:
개별 뉴론의 수동 추적은 Imaris 소프트웨어 (Bitplane, Inc)를 이용하여 수행되었다. 세포체가 z-스택의 중간 150 μm 내에 위치하는 뉴론은 무작위로 시료추출되고 추적을 위해 선택되었다. 세포체는 가능한 많은 세포체, 하지만 5 μm 미만의 수상돌기만을 포함하는 사용자-규정된 역치를 통해 반-자동으로 재건되었다. 세포체로부터 기원하는 모든 신경돌기는 짧은 분절에서 "Surpass" 양식으로 수동으로 추적되고, 그리고 각 분절은 연결되기 이전에, 자동적으로 중심되었다 (사용자 수정을 위한 기회를 가짐). 동일한 세포의 사상체 사이에 상호연결의 숫자 및 추적된 세포로부터 사상체와 임의의 다른 세포의 사상체 사이에 상호연결의 숫자는 수동으로 계산되었다. 흥미로운 구조를 보이는 뉴론은 비-무작위로 선택되고 전술한 동일한 방법을 이용하여 추적되었다.
하이드로겔 용액 준비:
1. 온도와 안전 수칙에 특히 유의하면서 다음을 합치고 혼합한다. 중합화를 예방하기 위해 모든 요소를 항상 얼음 위에 유지시킨다.
주의: 파라포름알데히드 (PFA)는 자극물, 민감제, 발암물질원 및 독소이다. 아크릴아미드는 강력한 신경독소, 호흡기와 피부 민감제, 발암물질원, 자극물, 돌연변이원, 기형원 및 생식 위험물이다. CLARITY를 위해 이용될 수 있는 하이드로겔의 화학적 구성물 중에서 다수가 이들 범주 중에서 하나 또는 그 이상에 속할 것이다. 이런 이유로, 단위체 및/또는 교차결합제 (가령, 아크릴아미드 또는 PFA)의 피부 접촉 또는 흡입을 피하기 위해, 하이드로겔 용액과 중합체의 용액 준비와 모든 차후 취급은 안면 가리개, 실험실 가운, 장갑, 그리고 앞이 막힌 신발을 비롯한 개인용 보호구 (PPE)를 갖춘 가스배출 후드에서 수행되어야 한다.
400mL의 하이드로겔 단위체 용액의 경우:
Figure pct00002
사포닌은 전통적인 면역조직화학에서 세포 막을 투과하는데 종종 폭넓게 이용되는 온화한 비-이온성 계면활성제이다. CLARITY에서, 사포닌은 특히, 심장 관류가 실행가능하지 않은 시료, 예를 들면, 사후 인간 조직과 제브라피시 뇌의 경우에, 하이드로겔 단위체와 개시자의 조직 내로의 확산을 조장하기 위해 하이드로겔 단위체 주입 과정에서 이용될 수 있다. 사포닌은 하이드로겔 단위체 주입 과정에서 요구되는 배양 시간을 단축한다. 하지만, 사포닌 이용과 연관될 수 있는 거품이 형성될 수도 있기 때문에, 일과적인 사포닌은 권장되지 않는다.
2. 40 mL 분취량을 얼음 위에서 50 mL 원뿔형 튜브 내로 분배한다. 각 조직 시료는 1개의 40mL 튜브의 이용을 필요로 할 것이다: 관류를 위한 20 mL 및 시료 포매를 위한 나머지 20 mL.
3. 튜브를 빈틈없이 밀폐하고, 그리고 이들을 후드로부터 이전하기에 앞서, 이차 격납용기 (얼음 위에서)에서 유지한다. 분취량을 얼음으로부터 -20℃로 이동한다. 이들 용액은 이용을 위해 준비될 때까지 -20℃에서 보관한다. 이들은 준비 과정 동안 모든 요소가 충분히 차게 유지된다면, -20℃에서 무기한으로 보관될 수 있다.
명료화 용액 준비:
1. 피부 접촉 또는 흡입을 피하기 위해, 용액을 가스배출 후드 내에 적절한 PPE에서 준비한다. 안전에 특히 유의하면서, 물, 붕산, 그리고 황산도데실나트륨 (SDS)을 교반하면서 합친다. pH가 8.5에 도달할 때까지 NaOH를 첨가한다. 이러한 용액은 실온에서 만들어지고, 보관되고, 그리고 이용될 수 있다. 경고: SDS는 피부와 호흡기계에 대한 독소와 자극물이다.
10L의 명료화 용액의 경우:
Figure pct00003
하이드로겔 용액으로 경심 관류:
1. 관류에 앞서, 동결된 하이드로겔 단위체 용액을 냉장 장치 또는 얼음 위에서 해동한다.
2. 용액이 완전하게 해동되고 투명할 때 (하지만, 여전히 얼음같이 차가움), 부드럽게 뒤집어 혼합한다. 침전물이 없도록 확인하고, 그리고 거품이 용액 내로 들어가는 것을 피한다.
3. 관류 재료를 가스배출 후드 내에서 준비한다.
4. 성체 생쥐를 뷰타나시아-D로 깊게 마취시킨다.
5. 동물을 먼저, 20 mL의 얼음같이 차가운 1X PBS, 이후 20 mL의 얼음같이 차가운 하이드로겔 용액으로 경심 관류한다. 관류의 느린 속도 (20 mL의 각 용액에 대해 약 2분)를 유지한다.
6. 조직 (가령, 뇌)을 50 mL 원뿔형 튜브 내에 20 mL의 차가운 하이드로겔 용액에 즉시 배치한다. 시료는 4℃ 냉장 장치로 이동될 때까지, 얼음 위에서 용해하여 유지한다.
7. 시료가 형광단을 내포하면, 시료를 알루미늄 호일로 씌우고, 그리고 4℃에서 2-3일 동안 배양하여 하이드로겔 용액이 조직 내로 더욱 확산될 수 있도록 한다.
하이드로겔 조직 포매:
1. 시료를 내포하는 50 mL 원뿔형 튜브를 건조 챔버에서 (가스배출 후드에서) 탈기하여 튜브 내에 모든 가스를 다음과 같이 질소로 교체한다 (그 이유는 산소가 하이드로겔 형성을 방해하기 때문이다):
a. 50 mL 원뿔형 튜브를 건조 챔버 내에 선반 위에 배치한다.
b. 50 mL 원뿔형 튜브를 비틀어 가스 교환이 가능할 만큼 충분히 개방한다.
c. 질소 탱크를 켜고, 그리고 건조 챔버의 입구가 질소 가스로 채워지도록 제어 밸브를 조정한다.
d. 건조 챔버 밸브를 질소 가스 흐름에서 진공으로 전환한다.
e. 진공 펌프를 켠다. 챔버 뚜껑을 검사함으로써 챔버가 완전 진공 하에 있도록 확인한다. 진공을 10분 동안 유지한다.
f. 진공을 끄고, 그리고 챔버를 질소 가스로 채우기 위해 밸브를 천천히 돌린다.
g. 질소 가스로 배기하면서, 튜브에 도달할 수 있을 만큼 챔버를 조심스럽게 개방한다. 공기에 대한 노출을 최소화하기 위해 주의하면서, 시료 튜브를 신속하고 빈틈없이 닫는다.
2. 튜브를 37℃ 방 또는 배양기 내에 회전 장치 상에서 37℃ 수조에 담근다. 3시간 동안 또는 용액이 중합화될 때까지 배양한다.
3. 가스배출 후드에서, 포매된 시료를 겔로부터 추출한다 (시료를 조심스럽게 끄집어내고 여분의 겔 조각을 장갑낀 손가락으로 제거한다). 하이드로겔 폐기물 처분은 하이드로겔 단위체와 교차결합제 (가령, 아크릴아미드와 PFA)에 대한 모든 기관, 국가와 지역 규정에 따라서 수행되어야 한다.
4. 시료를 실온에서 24시간 동안 50mL의 명료화 용액으로 세척하여 여분의 PFA, 개시자, 그리고 단위체를 투석한다. 시료를 각각 37℃에서 24시간 동안 50ml로 2회 더 세척하여 잔여 PFA, 개시자, 그리고 단위체를 더욱 감소시킨다. 이러한 폐기물 용액을 생물학적 위험으로서 조심스럽게 처분하도록 주의한다.
전기영동 조직 명료화 (ETC):
1. ETC 챔버를 조립한다.
a. 시료를 챔버 내에 배치한다.
b. 명료화 용액을 온도 제어된 순환기를 이용하여 챔버를 통해 순환시키는데, 시료를 명료화하기 위해 10-60V가 37-50℃에서 수일 동안 조직 (가령, 뇌) 전역에 가해진다. 명료화 과정은 더욱 높은 전압과 온도에서 더욱 빠르긴 하지만, 더욱 많은 전력을 필요로 하고, 1개의 전원 공급장치 (전형적인 출력 최대, 300W)에 의해 동시에 작동가능한 명료화 셋업의 숫자를 제한한다. 가령, 37℃와 30V에서 4개의 셋업이 동시에 작동될 수 있는 반면, 50℃와 60V에서 단지 2개의 셋업만 작동될 수 있고, 따라서 순환기 온도와 전압은 현실적인 고려사항을 충족하도록 선택되어야 한다.
2. 수일 후, 시료를 각각 24시간 동안 PBST (1X PBS에서 0.1% TritonX)로 2회 세척한다.
영상화를 위한 시료 준비:
1. 시료를 영상화에 앞서 2일 동안, FocusClearTM 또는 80% 글리세롤 용액에서 배양한다. 이들 용액은 CLARITY-처리된 조직에 필적하는 굴절률을 갖는다. 시료를 둘러싸는 충분한 용액이 있고, 그리고 증발 손실이 일어나지 않도록 담보한다. 시료를 광으로부터 보호한다.
2. 깨끗한 유리 슬라이드를 손에 잡고 이를 먼지-없는 표면 위에 부드럽게 배치한다.
3. BluTack 퍼티의 작은 조각을 취하고, 그리고 장갑낀 손을 이용하여 일정한 직경 웜 (worm)-형상을 준비한다. 두께를 시료 두께의 약 1.5X로 균일하게 만든다 (가령, 시료가 1 mm이면, 퍼티 튜브 직경을 1.5 mm로 만든다).
4. 퍼티의 2개 튜브를 수직 슬라이드를 교차하여 수평하게 배치하고, 그 사이에 조직 시료를 위한 공간을 남겨둔다. 슬라이드에서 삐져나오는 과잉의 피터를 절단한다.
5. 주걱을 이용하여, 시료를 조심스럽게 채취하고 이를 슬라이드의 중간에서 퍼티 튜브 사이에 배치한다. ~20 μl의 FocusClearTM 매체를 시료의 상부에 피펫팅한다.
6. Willco 접시 (귀때가 달린 면이 위로 향함)를 퍼티 튜브의 상부에 조심스럽게 배치한다. 시료 및 FocusClearTM 매체와 접촉이 이루어질 때까지, 접시의 유리 부분을 조심스럽게 천천히 압박한다 (유리 파괴를 피하기 위해 손가락을 퍼티 위에 유지시킨다). 시료, 매체, 슬라이드, 그리고 접시 사이에 거품이 없도록 담보한다.
7. 그 다음, P200 피펫을 이용하여, 추가의 FocusClearTM을 밀폐된 챔버의 어느 한쪽에 조심스럽게 도입한다 (광학적으로 일치하기 때문에, 배양을 위한 시료를 둘러싸는 액체로부터). 거품이 들어가지 않도록 주의한다.
8. 전체 챔버가 FocusClearTM으로 채워지면, 챔버를 완전히 밀폐하고 증발을 예방하기 위해 퍼티, 접시, 그리고 슬라이드 사이에 양쪽 수직 구멍을 교차하여 PDMS 밀폐제 (Kwik-Sil)를 이용한다.
9. 알루미늄 호일을 챔버의 상부에 배치하고 이를 수평면 (광손상을 최소화하기 위해 광으로부터 보호됨)에 배치한다. 시료를 10-15분 동안 방치하여 PDMS 밀폐제가 완전히 중합화할 수 있도록 한다.
10. 이제, 영상화를 위한 준비가 완성된다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 만들고 이용하는 방법에 관한 완전한 개시와 설명을 당업자에게 제공하기 위하여 진술되고, 그리고 본 발명자들이 그들의 발명으로서 간주하는 것의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않을 뿐만 아니라 하기 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험인 것으로 단언하는 것으로 의도되지 않는다. 이용된 숫자 (가령, 양, 온도 등)에 대하여 정확성을 담보하기 위한 노력이 이루어지긴 했지만 일부 실험 오차와 편차가 고려되어야 한다. 달리 지시되지 않으면, 부 (parts)는 중량부 (parts by weight)이고, 분자량 (molecular weight)은 중량 평균 분자량 (weight average molecular weight)이고, 온도는 섭씨이고, 그리고 압력은 대기압 또는 거의 대기압이다.
실시예 1: 전체 조직을 영상화하기 위한 과정
정확한 3-차원 (3-D) 영상화, 면역조직화학, 임상적 진단, 그리고 기능화를 위해 전체 조직 (전체 장기/생물체)을 영상화하는 과정이 개발되었다. 조직을 조직의 초미세구조를 물리적으로 지지하는 나노-다공성 하이드로겔에서 포매하고, 이후 단지 막 지질만을 전기영동적으로 제거함으로써, 전체 조직은 고도로 투명하고 거대-분자에 투과성이 된다. 이러한 기술은 미세한 하이드로겔 메시에 의해 확보된, 조직 내에 단백질, 작은 펩티드, 작은 분자, 그리고 핵산을 그들의 3-차원 분포에서 보존한다. 조직의 파괴적 섹션화를 우회함으로써, 세포이하 구조가 분석될 수 있다. 이에 더하여, 조직은 포괄적인 분석을 위해 다른 시약으로 반복적으로 염색되고, 염색되지 않고, 그리고 재염색될 수 있다. "CLARITY"로 명명된 과정의 도해는 도 1에서 제공된다. 패널 a: 조직은 하이드로겔 단위체 (청색)의 존재에서 포름알데히드 (적색)을 이용하여 교차결합된다. 이러한 과정에서, 포름알데히드는 단위체를 생체분자, 예를 들면, 단백질, 핵산, 그리고 작은 분자에 공유 연결한다. 패널 b: 그 다음, 생체분자-결합된 단위체가 하이드로겔 메시 내로 중합화된다. 이러한 하이드로겔-조직 혼성화는 조직의 구조를 물리적으로 지지하고 생체분자를 하이드로겔 메시 내로 화학적으로 통합한다. 패널 c: 그 다음, 전기장이 이온성 세정제 용액에 담긴 하이브리드 전역에 가해진다. 패널 d: 이온성 미셀을 하이브리드로 능동 수송하고 조직으로부터 막 지질만을 추출하여, 구조 및 교차결합된 생체분자가 정위하고 영상화와 분자 표현형에 가용하도록 하기 위해 전기영동이 이용된다. 패널 e: 전체 조직 면역염색은 항체를 이용하여 수행될 수 있다. 항체의 세정제-매개된 제거는 동일한 시료에서 멀티 라운드의 면역염색을 수행하는데 이용될 수 있다.
실시예 2: CLARITY 과정을 위한 장치와 시스템
전기영동 조직 명료화 (ETC) 챔버 및 연관된 요소 (온도-제어된 완충액 순환기, 완충액 필터, 그리고 전기영동 전원 공급장치 포함)가 실시예 1에서 설명된 CLARITY 과정의 일부를 수행하기 위해 개발되었다. 장치와 시스템의 도해는 도 2에서 제공된다. 패널 a: ETC 셋업은 맞춤 ETC 챔버, 온도-제어된 완충액 순환기 (RE415, Lauda, Germany), 완충액 필터 (카테고리 번호 4422K61, McMaster, Robbinsville, NJ), 그리고 전원 공급장치 (카테고리 번호 164-5052, Biorad, Hercules, CA)로 구성된다. 시료는 20-60V를 전극에 가함으로써 전기영동된다. 완충액 용액은 명료화 과정 내내 완충액 용액의 온도와 조성을 일정하게 유지하기 위해 챔버를 통해 순환된다. 패널 b-d: ETC 챔버 설계. 패널 b는 실린더형 플라스틱 하우징, 입구 / 출구 포트 (카테고리 번호 5463K245, McMaster, Robbinsville, NJ) 및 2개의 백금 전극 (카테고리 번호 267201, Sigma, St. Louis, MO)을 보여주는 대표적인 장치의 다양한 도면을 도시한다. 완충액 입구와 출구는 챔버를 통한 완충액 흐름이 완충액 용액의 전기분해에 의해 발생된 기포를 효과적으로 제거하도록 위치한다. 패널 c는 어셈블리의 요소를 도시한다. 패널 d는 탑 컷스루 도면 (top cut-through view)을 도시한다. 하이드로겔-포매된 조직은 챔버의 중간에서 두 전극 사이에 위치하는 시료 홀더 (Cell Strainer, BD Biosciences, Durham, NC) 내에 배치된다. 챔버 외부에 노출된 각 전극의 단부는 전원 공급장치에 연결된다. 본 발명의 구체예에 따른 챔버의 공간적 치수의 실례는 도 8에 포함된다.
실시예 3: 무손상 성체 생쥐 뇌 시료의 영상화
무손상 성체 생쥐 뇌 시료는 CLARITY 과정에 종속되고 영상화되었다. 도 3은 결과를 도시한다. 패널 a-d: 배경에서 Ramon y Cajal quote로 전체 생쥐 뇌 (3월령)의 영상. 패널 a: CLARITY 전. 패널 b: CLARITY 후: 하이드로겔-조직 혼성화, ETC, 그리고 FocusClearTM과 굴절률 (RI) 정합 후 Thy1-EYFP H 라인 뇌. 패널 c: 패널 b에서 도시된 동일한 뇌의 형광 영상. 패널 d: 영상화를 위한 전체 명료화된 생쥐 뇌의 봉입. 뇌는 2개의 커버유리 사이에 끼워 넣어진다. 뇌의 배측 절반은 단일 광자 (1P) 여기 현미경검사를 이용하여 먼저 영상화되고, 그리고 이후, 뇌은 뒤집어지고 복측 절반이 영상화된다. 패널 e: 10x 수침 대물렌즈 (개구수 (NA) = 0.3, 작업 거리 = 3.6 mm) 및 514 nm 여기를 이용하여 영상화된 무손상 CLARITY-처리된 생쥐 뇌 (3월령)의 3D 재건. 왼쪽, 배측 절반의 재건 (배측에서 복측으로, 스택 크기 = 3100 μm, 단계 크기 = 20μm). 오른쪽, 복측 절반의 재건 (복측에서 배측으로, 스택 크기 = 3400 μm, 단계 크기 = 20μm). 눈금자, 1 mm. 패널 f: 피질, 해마, 그리고 시상의 모든 층에 걸쳐 가시화를 보여주는 비-절편화된 생쥐 뇌의 3D 재건 (10x 대물렌즈, 스택 크기 = 3400 μm, 단계 크기 = 2 μm, 514 nm 여기). 눈금자, 400 μm. 패널 g-l: 심지어 ~3400 μm의 깊이에서도 미미한 해상도 손실을 보여주는 상이한 깊이에서 패널 f로부터 3개의 광학 섹션. 눈금자, 100 μm. 패널 g: z = 446 μm. 패널 h: z = 1683 μm. 패널 i: z = 3384 μm. 패널 j-l: 각각, 패널 g, h와 i에서 상자모양 영역. 패널 m: CLARITY 과정 후 막-국지적인 ChR2-EYFP를 보여주는 Thy1-ChR2-EYFP 라인의 줄무늬체에서 축삭 다발의 횡단면의 영상. 1 mm-두께 관상 블록은 CLARITY-처리되고 63x 글리세롤 담금 대물렌즈 (NA = 1.3, 작업 거리 = 280μm)를 이용하여 영상화되었다. 눈금자, 5 μm. 패널 n: CLARITY-처리된 Thy1-EYFP H 라인 생쥐의 피질에서 추체골 뉴론의 잘-보존된 수상돌기와 수지상 척주를 보여주는 고해상도 영상. 1 mm-두께 관상 블록은 63x 글리세롤 대물렌즈를 이용하여 영상화되었다. 눈금자, 5 μm.
실시예 4: 무손상 조직 체적에서 분자 표현형
무손상 조직 체적은 CLARITY를 이용하여 처리되고 분자 표현형 분석에 종속되었다. 결과는 도 4에 도시된다. 패널 a: 단백질 손실 측정 (방법 참조); 오차 막대, s.e.m.; 각 조건에 대해 n=4. 패널 b: 균일한 면역염색을 보여주는, 무손상 비-절편화된 형태에서 GFP에 대해 면역염색된 Thy1-EYFP 생쥐의 1mm-두께 관상 블록의 체적 렌더링. 무손상 블록은 37℃에서 1일 동안 ETC-명료화되고 3일 동안 면역염색되었다 (Alexa594와 접합된 GFP 항체에서 2일, 그리고 1일 세척). 블록은 이후, 10x 수침 대물렌즈 및 1p 여기 (514nm와 591nm)를 이용하여 영상화되었다. 왼쪽, EYFP (녹색). 중간, 항-GFP 염색 (적색). 오른쪽, 오버레이. 눈금자, 500 μm. 패널 c: EYFP와 항-GFP 염색의 완전한 중첩을 보여주는 피질에서 상자모양 영역의 확대된 3D 렌더링. 패널 d: GFP 염색의 공동-국지화 분석. Manders 중첩 계수 (MOC)는 조직 깊이의 함수로서 플롯팅되었다. 오른쪽, 왼쪽에서 3D 렌더링으로부터 상이한 깊이에서 2개의 광학 섹션. 눈금자, 100 μm. 패널 e-f: 개별 시냅스의 식별. H 라인 생쥐 뇌 (2월령)의 500 μm-두께 관상 블록은 1일 동안 명료화되고 3일 동안 시냅신 I (적색)과 PSD-95 (녹색)에 대해 면역염색되었다: 일차 (1일) - 세척 (0.5일) - 이차 (1일) - 세척 (0.5일). 해마는 이후, 63x 글리세롤 대물렌즈 및 단일 광자 (1P) 여기 (514nm, 591nm, 651nm)를 이용하여 영상화되었다. 패널 e: 왼쪽, 2개의 광학 섹션 (z= 20 μm과 200 μm). 오른쪽, 상자모양 영역의 확대된 영상. 개별 시냅스 부점은 심부까지 영상 분해될 수 있다. 백색에서 EYFP. 패널 f: z=20μm (상부)과 z=200μm (하부)에서 PSD-95 부점의 평균 면역형광 횡단면. 오차 막대는 평균의 95% 신뢰 구간을 지시한다. 패널 g: 영상화 깊이의 함수로서 PSD-95 부점의 평균 면역형광 횡단면의 반 극대 (FWHM)에서 전체 너비. 깊이 전체에서 거의 일정한 FWHM는 해상도 상실이 미미하다는 것을 의미한다. 삽도는 z= 20 μm과 200 μm에서 평균 부점을 도시한다. 패널 h-i: 작은 분자, 단백질, 그리고 핵산은 잘 보존되고, 국지적이고, 그리고 CLARITY-변환된 조직에서 분자 프로브를 이용하여 가시화될 수 있다. 패널 h: 감마-아미노부티르산 (GABA)과 파브알부민 (PV)의 공동-국지화를 보여주는 해마에서 감마-아미노부티르산과 파브알부민 염색. 왼쪽, GABA. 중간, PV. 오른쪽, 오버레이. 야생형 생쥐 뇌 (3월령)의 500 μm-두께 관상 블록은 1일 동안 명료화되고 3일 동안 면역염색되었다: 일차 (1일) - 세척 (0.5일) - 이차 (1일) - 세척 (0.5일). 블록은 이후, 25x 수침 대물렌즈 (NA = 0.95, 작업 거리 = 2.5 mm) 및 단일 광자 여기 (488nm과 591nm)를 이용하여 영상화되었다. 눈금자, 20 μm. 패널 i: 줄무늬체 내에 세포체 주변에서 도파민 수용체 D2 (drd2) mRNA 국지화를 보여주는 CLARITY-변환된 생쥐 뇌 블록에서 in situ 혼성화 (ISH) (AP: -1.7; DV: -2.3; ML: 2.6). LV, 측뇌실. 청색, DAPI. drd2에 대한 50 bp RNA 프로브는 500 μm-두께 CLARITY-처리된 관상 블록과 혼성화되고 FastRed로 가시화되었다. 블록은 25x 수침 대물렌즈, FastRed의 경우에 단일 광자 여기 (555nm), 그리고 DAPI의 경우에 2개 광자 여기 (720nm)를 이용하여 영상화되었다. 눈금자: 왼쪽, 100 μm; 오른쪽, 20 μm. 패널 j-k: 생쥐 뇌의 중격의지핵 (NAc)과 미상-피각 (CPu)에서 TH-양성 뉴론의 축삭 섬유. 패널 j: TH (적색)와 DAPI (녹색)에 대해 염색된 1 mm-두께 생쥐 뇌 블록의 3D 렌더링 (브레그마 1.10 -> 0.10). aca, 전교련; 눈금자 500 μm. 패널 k: 패널 j에서 NAc와 aca의 50 μm 체적의 최대 융기. 눈금자, 50μm.
실시예 5: 무손상 조직의 멀티-라운드 분자 표현형
무손상 조직 시료는 CLARITY를 이용하여 처리되고 멀티-라운드 분자 표현형 분석에 종속되었다. 결과는 도 5에 도시된다. 패널 a: 1차 라운드 염색. 무손상 비-절편화된 형태에서 티로신 수산화효소 (TH)에 대해 면역염색된 Thy1-EYFP 생쥐의 1 mm-두께 관상 블록 (브레그마 -2.5mm)의 체적 렌더링. 블록은 1일 동안 ETC-명료화되고 6일 동안 면역염색되었다: 일차 (2일) - 세척 (1일) - 이차 (2일) - 세척 (1일). 눈금자, 500 μm. 패널 b: 항체 용리. 영상화된 항체는 블록을 60℃에서 0.5일 동안 4% SDS 용액에서 배양함으로써 패널 a에서 보이는 블록으로부터 용리되었다. 주의할 점은 TH 신호는 완전하게 제거되는 반면, EYFP의 형광 신호는 유지된다는 것이다. 패널 c: 2차 라운드 염색. PV (적색)와 GFAP (청색)에 대해 면역염색된 동일한 블록의 3D 렌더링. DAPI (백색)는 핵을 대조염색하는데 이용되었다. 패널 d-f: 각각, 패널 a, b와 c에서 황색-상자모양 영역의 100 μm-체적의 최대 융기. 주의할 점은 EYFP-양성 뉴론의 패턴뿐만 아니라 세포 형태가 매우 유사하다는 것이다; 조직 체계와 세포 구조는 멀티-라운드 염색의 과정 내내 잘 보존된다. SNR, 흑질; cp, 대뇌각; 눈금자, 100 μm. 패널 g: 강한 DAPI 신호를 보여주는 패널 c에서 백색-/점-상자모양 영역의 광학 섹션. DG, 치아이랑; 눈금자, 100 μm. 패널 h-i: 패널 a에서 백색-상자모양 영역의 TH 채널 (패널 h) 및 패널 j에서 백색-상자모양 영역의 TH 채널 (패널 i). TH 염색의 패턴과 신호 강도는 1차 라운드와 3차 라운드 사이에 유사하다; 항원과 항원성은 2번의 연속 항체 용리 과정 후 잘 보존된다. 눈금자, 100 μm. 패널 j: 3차 라운드 염색. 패널 a-c에서 도시된 동일한 블록은 TH (적색)와 ChAT (청색)에 대해 면역염색되었다. 패널 k: EYFP-발현 뉴론 (녹색), PV-양성 뉴론 (적색), 그리고 GFAP (청색)의 분포를 도시하는 패널 c에서 해마의 확대된 3D 도면. Alv, 해마의 백색판; 눈금자, 200 μm.
실시예 6: 인간 뇌 시료의 구조적 맵핑과 분자 표현형
인간 뇌 시료는 CLARITY를 이용하여 처리되고 구조적 맵핑과 분자 표현형 분석에 종속되었다. 결과는 도 6에 도시된다. 패널 a-g, i, k: 사후 인간 뇌 (Autism Tissue Program 사례 #AN13961; 연령, 7세; 성별, 남성; PMI, 25; 보관, 실온에서 10% 포르말린에서 82개월)의 CLARITY-처리된 전두엽 (BA 10)의 면역염색. 500 μm-두께 무손상 블록은 1일 동안 명료화되고 다음과 같이 3일 동안 면역염색되었다: 일차 (1일) - 세척 (0.5일) - 이차 (1일) - 세척 (0.5일). 염색된 블록은 25x 수침 대물렌즈를 이용하여 영상화되었다. 패널 a: 수초 염기성 단백질 (MBP)과 PV 염색을 보여주는 광학 섹션. 백색 화살표는 PV-양성 융기 주변을 둘러싸는 막-국지적인 MBP를 지시한다. 눈금자, 10 μm. 패널 b: TH와 PV 염색. 120 μm-두께 체적 영상의 최대 융기. 단계 크기, 0.5 μm; 눈금자, 50 μm. 패널 c: 신경필라멘트 (NP)와 GFAP 염색을 보여주는 광학 섹션. 눈금자, 20 μm. 패널 d: 소마토스타틴과 PV 염색. 63 μm-두께 체적 영상의 최대 융기. 단계 크기, 0.5 μm; 눈금자, 20 μm. 패널 e: NP-양성 축삭 섬유의 3D 재건. 적색, 체적을 횡단하는 추적된 축삭. 눈금자, 500 μm; 삽도, 상자모양 영역의 확대된 영상 (눈금자, 20 μm). 패널 f: 자폐증 사례의 신피질에서 PV-양성 뉴론의 가시화. 500 μm-두께 무손상 블록은 전술한 바와 같이 명료화되고 염색되고, 그리고 피질하 층이 식별되었다. 눈금자, 500 μm. 패널 g: 층 IV, V와 VI에서 PV-양성 뉴론 세포체와 섬유를 보여주는 패널 f에서 황색-상자모양 영역. 사다리-모양 헤테로- 또는 이소-뉴론 연결을 갖는 층 VI에서 3개의 대표적인 PV-양성 개재뉴론은 추적되었다 (녹색, 진홍색, 청색). 눈금자, 100 μm. 패널 h: 패널 g에서 3개의 비정상적인 뉴론의 3D 재건. 눈금자, 80 μm. 패널 i: 단일 뉴론으로부터 신경돌기에 의해 형성된 사다리-모양 구조의 형태학적 상세를 보여주는 8 μm 체적 영상의 줌인된 최대 융기. 눈금자, 10 μm. 패널 j: 패널 i에서 도시된 구조의 추적. 패널 k: 2개의 상이한 뉴론으로부터 신경돌기에 의해 형성된 사다리-모양 구조를 보여주는 18 μm 체적 영상의 최대 융기. 눈금자, 10 μm. 패널 l: 패널 k에서 도시된 구조의 추적. 패널 m: 뉴론마다 이소- 또는 헤테로-뉴론 수지상 다리를 증명하는 막대그래프. 뉴론은 무작위로 선별되고 소프트웨어에서 추적되었다 (방법 참조); 수지상 다리는 수동으로 계산되었다. **P<0.05; 오차 막대, s.e.m.; 자폐증 사례의 표재 층과 심부 층 둘 모두에 대해 n=6. 대조 사례 (#AN10251; 연령, 10세; 성별, 남성; PMI, 19.83)의 표재 층과 심부 층 둘 모두에 대해 n=4. 패널 n: 자폐증 사례의 층 II (표재성)에서 뉴론의 3D 재건; 이소-수지상 접촉의 전형적인 회피가 관찰되었다.
실시예 7: GFP와 TdTomato 신호의 보존
유전자도입 생쥐 뇌 시료는 CLARITY를 이용하여 처리되고 영상화 분석에 종속되었다. 결과는 도 7에 도시된다. 패널 a: EGFP-발현 뉴론과 융기의 분포를 보여주는 CLARITY에 의해 처리된 1 mm-두께 Thy1-EGFP M 라인 생쥐 뇌 블록 (브레그마 -1.6 ->-2.6)의 3D 렌더링. 눈금자, 1mm. 패널 b: TdTomato 리포터 라인 (B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J)과 교잡된 PV-Cre 생쥐 라인 (B6; 129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J)의 1 mm-두께 생쥐 관상 블록의 3D 렌더링. 눈금자, 1 mm. 패널 c: EGFP-발현 뉴론과 이들의 신경돌기를 보여주는 패널 a에서 해마의 300 μm 체적의 최대 융기. 눈금자, 50 μm. 패널 d: 피질에서 TdTomato-발현 뉴론을 보여주는 패널 b에서 조직으로부터 고해상도 광학 섹션. 눈금자, 25 μm. 이들 결과는 GFP와 TdTomato 신호가 CLARITY 과정 동안 보존된다는 것을 증명한다.
실시예 8: 전기영동 조직 명료화 (ETC) 장치
CLARITY 과정을 수행하기 위한 ETC 장치가 설계되고 조립되었다. 본 발명의 구체예에 따른 ETC 장치의 실례는 도 8에 도시된다. 패널 a-d: 실린더형 플라스틱 하우징, 입구 / 출구 포트 (카테고리 번호 5463K245, McMaster, Robbinsville, NJ) 및 2개의 백금 전극 (카테고리 번호 267201, Sigma, St. Louis, MO)을 보여주는 대표적인 장치의 다양한 도면. 완충액 입구와 출구는 챔버를 통한 완충액 흐름이 완충액 용액의 전기분해에 의해 발생된 기포를 효과적으로 제거하도록 위치된다. 패널 e-h: 어셈블리의 요소 및 대표적인 장치의 실례 치수. 모든 치수는 밀리미터 (millimeter) 단위이다. 패널 i-j: 패널 i (등척성)와 패널 j (상면도)에서 장치를 관통하는 섹션은 조립된 챔버 내에 요소 위치를 지시한다. 하이드로겔-포매된 조직은 두 전극 사이에서 챔버의 중간에 위치하는 시료 홀더 (Cell Strainer, BD Biosciences, Durham, NC) 내에 배치된다. 챔버 외부에 노출되는 각 전극의 단일 단부는 전원 공급장치에 연결된다.
실시예 9: FocusClear TM 과 글리세롤을 이용한 무손상 성체 생쥐 뇌의 광학 조직 명료화
무손상 성체 생쥐 뇌 시료는 CLARITY 및 FocusClearTM과 글리세롤 용액을 이용하여 처리되었다. 결과는 도 9에 도시된다. 패널 a: 실온에서 2일 동안 FocusClearTM에서 배양된 PFA-고정된 / 하이드로겔-포매된 / 비-ETC 명료화된 생쥐 뇌 (4주령)의 영상. 패널 b: 실온에서 8일 동안 FocusClearTM에서 배양된 패널에 도시된 동일한 생쥐 뇌. 패널 c: 37℃에서 4일 동안 85% 글리세롤에서 배양된 PFA-고정된 / 하이드로겔- 포매된 / 비-ETC 명료화된 생쥐 뇌 (4주령)의 영상. 패널 d: 실온에서 2일 동안 85% 글리세롤에서 배양된 PFA-고정된 / 하이드로겔-포매된 / ETC 명료화된 생쥐 뇌 (4주령)의 영상.
실시예 10: CLARITY-처리된 시료의 전자 현미경 (EM) 영상화
생쥐 뇌 조직 시료는 CLARITY를 이용하여 처리되고, 이후 전자 현미경검사를 이용하여 영상화되었다. 결과는 도 10에 도시되고, 그리고 CLARITY 과정의 EM-적합성을 증명한다. Thy1-EYFP H 라인 생쥐 (4월령)는 2 wt% 파라포름알데히드 / 2 wt% 글루타르알데히드 / 4% 아크릴아미드 (wt/vol) / 0.05% 비스-아크릴아미드 (wt/vol) / 0.25 % VA044 (wt/vol) / PBS의 혼합물로 경심 관류되었다. 하이드로겔-포매된 뇌는 4일 동안 ETC-명료화되었다. 명료화된 조직은 10x 수침 대물렌즈를 이용하여 영상화되었다 (패널 c에서 도시된 3D 렌더링). 영상화 후, 조직은 실온에서 1시간 동안 1% 오스뮴 사산화물 (EMS Cat# 19100)에 첨가되고, 한외-여과된 물로 3X 세척되고, 그리고 이후, 실온에서 2시간 동안 일괄적으로 염색되었다. 시료는 이후, 각 4℃에서 15분 동안 일련의 에탄올 세척에서 탈수되었다 (50% → 70% → 95% (시료가 RT까지 가온된 이후) → 100% (2x) → 15분 동안 아세토니트릴). 시료는 아세토니트릴과 1:1 혼합된 EMbed-812 수지 (EMS Cat#14120)로 2시간 동안 침투되고, 그 이후에 EMbed-812:아세토니트릴의 2:1 혼합물로 2시간 동안 침투되었다. 시료는 이후, 2시간 동안 EMbed-812 내로, 그 이후에 새로운 수지로 채워진 TAAB 캡슐 내로 배치되고, 그 다음 65℃ 오븐 내로 하룻밤 동안 배치되었다. 절편은 Leica Ultracut S (Leica, Wetzlar, Germany)에서 75와 90 nm 사이에 절단되고, 그리고 포름바르/탄소 코팅된 슬롯 격자 (EMS Cat# FCF2010-Cu) 또는 100 메시 Cu 격자 (EMS Cat#FCF100-Cu) 위에 올려졌다. 격자는 3.5% UrAcetate/ 50% 아세톤에서 30초 동안 대비-염색되고, 그 이후에 0.2% 납 구연산염에서 30초 동안 염색되었다. 관찰은 JEOL JEM-1400 TEM에서 120kV에서 이루어졌고, 그리고 Gatan Orius 디지털 카메라를 이용하여 사진이 촬영되었다. 패널 a: 해마에서 수초화된 축삭을 보여주는 TEM 영상. 눈금자, 100 nm. 패널 b: 해마에서 시냅스후 밀도 (황색 화살표)를 보여주는 TEM 영상. 눈금자, 200 nm. 패널 c: EM 시료 준비에 앞서, 명료화된 1 mm-두께 Thy1-EYFP H 라인 생쥐 블록의 3D 렌더링. EM을 위해 2% 글루타르알데히드를 이용하여 고정된 생쥐 뇌 조직은 CLARITY를 이용하여 명료화되고 영상화되었다.
실시예 11: 전체 생쥐 뇌 시료의 분자 표현형
전체 생쥐 뇌 시료는 CLARITY를 이용하여 처리되고 분자 표현형 분석에 종속되었다. 결과는 도 11에 도시된다. 패널 a: 무손상 생쥐 뇌에서 TH-양성 뉴론과 이들의 섬유의 3D 면역조직학적 가시화. 무손상 뇌는 3일 동안 ETC-명료화되고 6주 동안 염색되고: 일차 (2주) - 세척 (1주) - 이차 (2주) - 세척 (1주), 그리고 10x 수침 대물렌즈를 이용하여 복부로부터 2500 μm에서 영상화되었다. 눈금자, 700 μm. 패널 b-d: 상이한 깊이에서 광학 섹션. 주의할 점은 TH-양성 뉴론은 무손상 뇌에서 잘 표지화되고 심지어 2500 μm-심부에서도 분명히 가시적이라는 것이다. CPu, 미상 피각; PO, 시각전핵; VTA, 복측 피개부; SNR, 흑질; RR, 적색뒤핵; DR, 배후 솔기; 눈금자, 100μm.
실시예 12: 생쥐 뇌 시료의 전전두엽 피질에서 축삭 섬유의 영상화
생쥐 뇌 시료는 CLARITY를 이용하여 처리되고 전전두엽 피질에서 TH-양성 뉴론의 축삭 섬유가 영상화되었다. 결과는 도 12에 도시된다. 패널 a: TH (적색)와 DAPI (녹색)에 대해 염색된 1 mm-두께 생쥐 뇌 블록 (브레그마 2.68 -> 1.68)의 3D 렌더링. 블록은 1일 동안 ETC-명료화되고 6일 동안 면역염색되었다: 일차 (2일) - 세척 (1일) - 이차 (2일) - 세척 (1일). PrL, 변연전 피질; IL, 변연계 피질; 눈금자, 500 μm. 패널 b: IL/PrL에서 TH 섬유를 보여주는 줌인 3D 렌더링. 눈금자, 200 μm. 패널 c-e: 패널 a에서 IL/PrL의 50 μm-체적의 최대 융기. 눈금자, 200μm. 패널 c: DAPI; 패널 d: TH; 패널 e: DAPI와 TH; 패널 f: 대량 투하된 세포 (백색 화살표) 및 비-신경분포된 세포 (황색 화살표)를 보여주는 패널 e에서 황색-상자모양 영역. 눈금자, 100μm.
실시예 13: 생쥐 뇌 시료의 중격의지핵과 줄무늬체에서 축삭 섬유의 영상화
생쥐 뇌 시료는 CLARITY를 이용하여 처리되고 중격의지핵과 줄무늬체에서 TH-양성 뉴론의 축삭 섬유가 영상화되었다. 결과는 도 13에 도시된다. 패널 a: 도 4, 패널 j에서 CPu의 20 μm-체적의 최대 융기. 1 mm-두께 생쥐 뇌 블록 (브레그마 1.10 -> 0.10)은 1일 동안 ETC-명료화되고 6일 동안 면역-염색되었다: 일차 (2일) - 세척 (1일) - 이차 (2일) - 세척 (1일). CPu, 미상 피각; aca, 전교련; NAc, 중격의지핵; 눈금자, 50μm. TH (적색)와 DAPI (녹색). 패널 b: TH 섬유가 대량 투하된 세포를 보여주는 패널 a에서 CPu의 광학 섹션. 눈금자, 50μm.
실시예 14: 생쥐 뇌 시료의 편도체에서 축삭 섬유의 영상화
생쥐 뇌 시료는 CLARITY를 이용하여 처리되고 편도체에서 TH-양성 뉴론의 축삭 섬유가 영상화되었다. 결과는 도 14에 도시된다. 패널 a-d: 1 mm-두께 생쥐 뇌 블록 (브레그마 -1.46. -> -2.46)은 1일 동안 ETC-명료화되고 6일 동안 면역-염색되었다: 일차 (2일) - 세척 (1일) - 이차 (2일) - 세척 (1일). 패널 a-b: TH (적색)와 DAPI (청색)에 대해 염색된 조직의 3D 렌더링. BLA, 기저측 편도핵; CeA, 중심 편도체; Pir, 조롱박피질; 눈금자, 300 μm. 패널 b: TH 단독. 패널 c-d: 패널 a에서 100 μm-체적의 최대 융기. 눈금자, 200 μm. 패널 d: TH 단독.
실시예 15: CLARITY를 이용하여 처리된 조직 체적에서 변하는 깊이에서 PSD-95 부점의 평균 면역형광 횡단면의 측정
무손상 조직 체적은 CLARITY를 이용하여 처리되고 시냅스후 밀도 (PSD)-95 부점의 평균 면역형광 횡단면이 상이한 깊이 (0-200 μm, 20 μm 간격)에서 측정되었다. 결과는 도 15에 도시된다. PSD-95 부점의 평균 형광 강도는 순환 후프 변환 (circular Hough transform)을 PSD-95 영상의 기울기 장 (gradient field)에 적용함으로써 각 깊이에서 추정되었다 (맞춤 Matlab 소프트웨어). 이것은 114 nm 내지 684 nm의 범위 (31과 108 사이에 N)에서 변하는 반경을 갖는 모든 부점의 중심을 찾아냈다. 이들 중심은 각 깊이와 횡단면에서 평균 부점을 산정하기 위해 정렬되고, 그리고 반 극대에서 전체 너비가 계산되었다 (도 4, 패널 g에 도시된 그래프 참조).
실시예 16: CLARITY를 이용하여 처리된 조직 체적에서 다양한 깊이에서 평균 PSD-95 부점의 측정
무손상 조직 체적은 CLARITY를 이용하여 처리되고 평균 시냅스후 밀도 (PSD)-95 부점이 상이한 깊이 (0-200 μm, 20 μm 간격)에서 측정되었다. 결과는 도 16에 도시된다. 눈금자, 200 μm. 실시예 14에서 설명된 방법이 이용되었다.
실시예 17: 생쥐 뇌 조직에서 수지상 섬유와 뉴론 세포체의 MAP2 염색
생쥐 뇌 조직 시료는 CLARITY를 이용하여 처리되고 미세관-결합된 단백질 2 (MAP2)에 대해 염색되었다. 결과는 도 17에 도시되고, 그리고 1 mm-두께 생쥐 뇌 조직 전역에서 치밀한 수지상 섬유와 뉴론 세포체의 균일한 표지화를 증명한다. 패널 a: 뉴론 세포체 및 이들의 수지상 융기에서 발현되는 MAP2에 대해 염색된 1 mm-두께 생쥐 뇌 조직의 3D 렌더링. 블록은 1일 동안 ETC-명료화되고 6일 동안 면역-염색되었다: 일차 (2일) - 세척 (1일) - 이차 (2일) - 세척 (1일). hf, 해마열구; DG, 치아이랑; 눈금자, 300μm. 패널 b: 3D 렌더링으로부터 광학 섹션. 눈금자, 250μm. 패널 c-d: 표지화된 섬유의 횡단면을 보여주는 DG에서 2가지 상이한 깊이에서 고해상도 광학 섹션. 주의할 점은 수지상 섬유 및 약하게-표지화된 뉴론 세포체 (황색 화살표)의 개별 횡단면은 영상화 심부 전역에서 분명하게 식별될 수 있다는 것이다. 영상은 63x 글리세롤-담금 대물렌즈를 이용하여 촬영되었다. 눈금자, 25μm.
실시예 18: 완전 성체 제브라피시 뇌의 분자 영상화
완전 성체 제브라피시 뇌는 CLARITY를 이용하여 처리되고 분자 표현형 분석에 종속되었다. 결과는 도 18에 도시된다. 성체 제브라피시 뇌는 213 dpf (수정후 일자) 물고기로부터 추출되고, 하이드로겔-혼성화되고, 그리고 4% SDS 용액에서 15일 동안 배양함으로써 명료화되었다. 명료화된 뇌는 4일 동안 항-티로신 수산화효소 (TH)로 일차 염색되고 3일 동안 Alexa fluor 594로 이차 염색되었다. 뇌는 이후, 25x 수침 대물렌즈로 영상화되었다. 3D 체적 데이터 (3,406 x 2,589 x 1,108 μm; 단계 크기=5 μm). 적색, TH; 청색, 자가형광; 눈금자, 100 μm.
실시예 19: 자폐성 개체로부터 뇌 시료에서 PV -양성 뉴론의 추적
한 자폐성 개체로부터 뇌 시료는 CLARITY를 이용하여 처리되고 신피질에서 PV-양성 뉴론이 추적되었다. 결과는 도 19에 도시된다. 사후 인간 뇌 (자폐증 사례, #AN13961; 연령, 7세; 성별, 남성; PMI, 25; 보관, 실온에서 10% 포르말린에서 82개월)의 전두엽 (BA 10)의 500 μm-두께 무손상 블록은 1일 동안 ETC 명료화되고 3일 동안 파브알부민 (PV)에 대해 면역-염색되었다: 일차 (1일) - 세척 (0.5일) - 이차 (1일) - 세척 (0.5일). 염색된 블록은 25x 수침 대물렌즈를 이용하여 영상화되었다. 뉴론은 세포체가 블록의 중간 125 μm 내에 위치해야 한다는 조건 하에, 무작위로 선별되고, 그리고 Imaris 소프트웨어에서 추적되었다. 패널 a: 피질 층상 구조 및 추적된 PV-양성 뉴론을 보여주는 상면도. PV, 적색; 눈금자, 200 μm. 패널 b: 피질층판에서 뉴론 (1-13)의 상대적인 위치를 보여주는 추적된 뉴론 단독 (상면도). 각 뉴론에 대한 이소- 또는 헤테로-뉴론 수지상 다리의 숫자는 하기 표 1에서 찾아볼 수 있다. 패널 c: 측면도. 패널 d: 측면도, 추적된 뉴론 단독.
도 6, 패널 f 및 도 19에서 도시된 자폐성 뇌 조직에서 14개 PV-양성 뉴론에 대한 미가공 정량 데이터.
뉴론 층 헤테로뉴론 다리의 # 이소뉴론 다리의 #
1 1 / 2 1 0
2 1 / 2 0 0
3 1 / 2 0 0
4 3 3 0
5 3 0 0
6 3 0 0
7 4 2 0
8 4 6 1
9 4 3 4
10 5 / 6 14 0
11 5 / 6 4 4
12 5 / 6 4 2
m* 5 / 6 31 21
n* 5 / 6 4 9
실시예 20: 정상적인 개체로부터 뇌 시료에서 PV-양성 뉴론의 추적
정상적인 개체로부터 뇌 시료는 CLARITY를 이용하여 처리되고 신피질에서 PV-양성 뉴론이 추적되었다. 결과는 도 20에 도시된다. 사후 인간 뇌 (도 19에 도시된 #AN13961에 대한 정상 대조 사례, #AN10251; 연령, 10세; 성별, 남성; PMI, 19.83)의 전두엽 (BA 10)의 500 μm-두께 무손상 블록은 1일 동안 ETC 명료화되고 3일 동안 파브알부민 (PV)에 대해 면역-염색되었다: 일차 (1일) - 세척 (0.5일) - 이차 (1일) - 세척 (0.5일). 염색된 블록은 25x 수침 대물렌즈를 이용하여 영상화되었다. 뉴론은 세포체가 블록의 중간 125 μm 내에 위치해야 한다는 조건 하에, 무작위로 선별되고, 그리고 Imaris 소프트웨어에서 추적되었다. 패널 a: 피질 층상 구조 및 추적된 PV-양성 뉴론을 보여주는 상면도. PV, 적색; 눈금자, 200 μm. 패널 b: 피질층판에서 뉴론 (1-8)의 상대적인 위치를 보여주는 추적된 뉴론 단독 (상면도). 각 뉴론에 대한 이소- 또는 헤테로-뉴론 수지상 다리의 숫자는 하기 표 2에서 찾아볼 수 있다. 패널 c: 측면도. 패널 d: 측면도, 추적된 뉴론 단독.
도 20에서 도시된 정상적인 대조 인간 뇌 조직에서 8개의 PV-양성 뉴론에 대한 미가공 정량 데이터
뉴론 층 헤테로뉴론 다리의 # 이소뉴론 다리의 #
1 1 / 2 0 0
2 1 / 2 0 0
3 3 0 0
4 3 0 0
5 5 / 6 0 0
6 5 / 6 0 0
7 5 / 6 0 0
8 5 / 6 1 1

Claims (53)

  1. 현미경적 분석을 위한 생물학적 표본을 준비하는 방법에 있어서, 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    표본을 복수의 하이드로겔 아단위로 고정시키고;
    하이드로겔 아단위를 중합화하여 하이드로겔-포매된 표본을 형성하고; 그리고
    하이드로겔-포매된 표본을 명료화한다.
  2. 청구항 1에 있어서, 하이드로겔-포매된 표본을 명료화하는 것은 복수의 세포 요소를 표본으로부터 실질적으로 제거하는 것을 수반하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 청구항 1 내지 2중 어느 한 항에 있어서, 세포 요소는 지질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 청구항 1 내지 3중 어느 한 항에 있어서, 하이드로겔-포매된 표본을 명료화하는 것은 표본을 전기영동하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 청구항 1 내지 4중 어느 한 항에 있어서, 표본은 이온성 계면활성제를 포함하는 완충액 용액을 이용하여 전기영동된 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 청구항 1 내지 5중 어느 한 항에 있어서, 이온성 계면활성제는 황산도데실나트륨인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 청구항 1 내지 6중 어느 한 항에 있어서, 표본은 약 10 내지 약 60 볼트의 범위에서 변하는 전압을 이용하여 전기영동된 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 청구항 1 내지 7중 어느 한 항에 있어서, 표본은 약 15분 내지 약 10일의 범위에서 변하는 기간 동안 전기영동된 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 청구항 1 내지 8중 어느 한 항에 있어서, 명료화된 조직의 굴절률 (refractive index)에 대등한 굴절률을 갖는 봉입제 (mounting medium)에서, 명료화된 표본을 배양하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 청구항 1 내지 9중 어느 한 항에 있어서, 봉입제는 표본의 광학 명료성 (optical clarity)을 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 청구항 1 내지 10중 어느 한 항에 있어서, 봉입제는 글리세롤을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 청구항 1 내지 11중 어느 한 항에 있어서, 현미경적 분석은 광학 현미경검사, 레이저 현미경검사, 전자 현미경검사, 그리고 주사식 탐침 현미경검사로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 청구항 1 내지 12중 어느 한 항에 있어서, 표본을 고정시키는 것은 표본을 파라포름알데히드와 접촉시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 청구항 1 내지 13중 어느 한 항에 있어서, 하이드로겔 아단위는 아크릴아미드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 청구항 1 내지 14중 어느 한 항에 있어서, 표본을 중합화하는 것은 열에 의한 교차결합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 청구항 1 내지 15중 어느 한 항에 있어서, 표본을 폴리펩티드, 핵산, 또는 작은 분자와 접촉시키는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 청구항 1 내지 16중 어느 한 항에 있어서, 접촉시키는 것은 전기영동, 동수압, 초음파 진동, 용질 대비, 극초단파 복사, 또는 혈관 순환을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 청구항 1 내지 17중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드, 핵산, 또는 작은 분자는 표본이 현미경적으로 분석될 때 가시화될 수 있는 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 청구항 1 내지 18중 어느 한 항에 있어서, 조직은 중추신경계 (CNS) 조직인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 청구항 1 내지 19중 어느 한 항에 있어서, CNS 조직은 전뇌인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 생물학적 표본을 현미경검사에 의해 영상화하는 방법에 있어서, 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    청구항 1 내지 20중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 생물학적 표본을 준비하고; 그리고
    생물학적 표본을 현미경으로 영상화한다.
  22. 청구항 1 내지 21중 어느 한 항에 있어서, 현미경은 광학 현미경, 레이저 현미경, 전자 현미경, 또는 주사식 탐침 현미경인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 청구항 1 내지 22중 어느 한 항에 있어서, 표본의 세포 또는 세포이하 측면은 준비된 조직 내로 수송된 하나 또는 그 이상의 작은 분자, 핵산 또는 단백질로 표지화된 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 청구항 1 내지 23중 어느 한 항에 있어서, 준비된 조직 내로 미리 수송된 하나 또는 그 이상의 작은 분자, 핵산, 또는 단백질을 제거하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 신경계 조직의 연결도 (connectivity)를 맵핑하는 방법에 있어서, 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    청구항 1 내지 24중 어느 한 항의 방법에 따라 신경계 조직 표본을 준비하고; 그리고
    표본 내에 하나 또는 그 이상의 뉴론을 현미경으로 영상화한다.
  26. 청구항 25에 있어서, 표본 내에 하나 또는 그 이상의 뉴론을 표본이 현미경적으로 분석될 때 가시화될 수 있는 요소로 표지화하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 청구항 25 내지 26중 어느 한 항에 있어서, 뉴론은 조직을 고정하기에 앞서 표지화된 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 청구항 25 내지 27중 어느 한 항에 있어서, 뉴론은 하이드로겔을 중합화한 이후에 표지화된 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 현미경적 분석을 위한 조직을 준비하기 위한 키트에 있어서, 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트:
    고정제; 그리고
    복수의 하이드로겔 아단위.
  30. 청구항 29에 있어서, 3-차원 하이드로겔-포매된 표본을 전기영동하여 복수의 세포 요소를 표본으로부터 실질적으로 제거하기 위한 기구를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  31. 청구항 29 내지 30중 어느 한 항에 있어서, 세포 요소는 지질을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  32. 영상화를 위한 생물학적 표본을 준비하기 위한 시스템에 있어서, 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템:
    3-차원 하이드로겔-포매된 표본을 전기영동하여 복수의 세포 요소를 표본으로부터 실질적으로 제거하기 위한 기구;
    전원 공급장치; 그리고
    온도-제어된 완충액 순환기.
  33. 청구항 32에 있어서, 세포 요소는 지질을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  34. 전기영동 조직 명료화 장치에 있어서, 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 전기영동 조직 명료화 장치:
    3-차원 하이드로겔-포매된 표본을 내포하기 위한 전기영동 챔버;
    복수의 전극;
    전원 공급장치; 그리고
    온도-제어된 완충액 순환기.
  35. 청구항 34에 있어서, 완충액 여과 요소를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 전기영동 조직 명료화 장치.
  36. 청구항 34 내지 35중 어느 한 항에 있어서, 복수의 유체 입구 및/또는 출구 포트를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 전기영동 조직 명료화 장치.
  37. 청구항 34 내지 36중 어느 한 항에 있어서, 하이드로겔-포매된 표본을 지지하도록 형성된 요소를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 전기영동 조직 명료화 장치.
  38. 청구항 34 내지 37중 어느 한 항에 있어서, 요소는 2개 또는 그 이상의 전극 사이에서 발생된 전기장에 실질적으로 내재하는 위치에서 하이드로겔-포매된 표본을 지지하도록 형성된 것을 특징으로 하는 전기영동 조직 명료화 장치.
  39. 청구항 34 내지 38중 어느 한 항에 있어서, 전극 중에서 하나 또는 그 이상은 이들 전극에 의해 발생된 전기장의 크기를 증가시키기 위한 확장 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 전기영동 조직 명료화 장치.
  40. 청구항 34 내지 39중 어느 한 항에 있어서, 확장 요소는 하나 또는 그 이상의 S-모양 벤드를 포함하는 것을 특징으로 하는 전기영동 조직 명료화 장치.
  41. 청구항 34 내지 40중 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 전극의 길이와 너비는 대략 동등한 것을 특징으로 하는 전기영동 조직 명료화 장치.
  42. 청구항 34 내지 41중 어느 한 항에 있어서, 전기영동 챔버와 유밀한 및/또는 기밀한 밀폐를 형성하는 뚜껑을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 전기영동 조직 명료화 장치.
  43. 생물학적 표본을 보존하는 방법에 있어서, 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    표본을 복수의 하이드로겔 아단위로 고정시키고;
    하이드로겔 아단위를 중합화하여 하이드로겔-포매된 표본을 형성하고; 그리고
    하이드로겔-포매된 표본을 명료화한다.
  44. 청구항 43에 있어서, 명료화된 하이드로겔-포매된 표본을 봉입제 내에 보관하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 청구항 43 내지 44중 어느 한 항에 있어서, 병리학적 상태의 사정, 진단, 또는 예후를 위해, 명료화된 하이드로겔-포매된 표본을 분석하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 청구항 43 내지 45중 어느 한 항에 있어서, 표본은 생검 표본 또는 부검 표본인 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 청구항 45 내지 46중 어느 한 항에 있어서, 병리학적 상태는 암, 면역계 기능장애, 신경정신병 질환, 내분비/생식 질환, 심혈관/폐 질환, 근골격 질환, 또는 위장 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 청구항 43 내지 47중 어느 한 항에 있어서, 표본은 정상적인 조직을 포함하고, 그리고 상기 방법은 발생 동안을 비롯하여, 세포, 조직, 장기 또는 시스템 기능 및/또는 세포와 조직 사이에 관계를 사정하기 위해 표본을 분석하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 청구항 43 내지 48중 어느 한 항에 있어서, 표본 상에서 유전학적, 전사체학적, 유전체학적, 단백질체학적, 대사체학적 및/또는 약물 스크리닝 분석을 수행하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 청구항 43 내지 49중 어느 한 항에 있어서, 장래 분석, 평가, 또는 기능화를 위해 표본을 보관하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 하이드로겔 단위체를 생물학적 조직 내로 주입하고 이들 단위체를 차후에 유발하여 원하는 강성도, 투명도, 공극 크기, 전도도, 또는 투과성 성질을 갖는 중합체, 겔, 메시, 또는 네트워크를 형성하기 위한 시스템에 있어서, 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템:
    생물학적 표본; 그리고
    복수의 하이드로겔 아단위.
  52. 청구항 51에 있어서, 나노규모 하드웨어 장치, 단백질, 올리고뉴클레오티드 및/또는 형광 염색 시약을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  53. 청구항 51 내지 52중 어느 한 항에 있어서, 시스템의 요소는 에너지 또는 외부 신호, 예를 들면, 열, 광선, 화학 트리거 및/또는 촉진제에 의해 활성화되거나 또는 기능화된 것을 특징으로 하는 시스템.
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