CN106769350B - 一种用于富含脂滴组织快速完全透明化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于富含脂滴组织快速完全透明化的方法，具体地，本发明的方法包括以下步骤：提供一水凝胶固定处理后的富含脂滴的组织样品；对所述的组织样品进行透明化预处理，得到预处理样品；对所述的预处理样品进行透明化处理，得到透明化样品；以及对所述的透明化样品进行透明化后处理，得到透明化终样品。本发明的方法不会对生物组织的精细结构造成破坏，并且可以显著提高生物组织的光学成像的深度。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及一种用于富含脂滴组织快速完全透明化的方法，所述的方法可以实现对所有器官和组织，包括整个动物身体的完整透明化，从而获得三维高分辨率结构信息。
背景技术
研究生物医学组织在细胞和亚细胞尺度的三维空间结构，是理解其正常功能机制的基础，也能为掌握器官疾病的发生和发展过程提供基础依据。以前对人和其它动物组织的研究主要为解剖学尺度的研究，而在细胞和亚细胞尺度的研究则受限于解析能力的限制，通常只能研究组织切片的二维结构信息。基于组织连续切片的三维重构技术研究组织则非常耗时和费力。近年来组织透明化技术的迅猛发展使人们获得完整生物组织和器官的高分辨率三维结构成为可能。斯坦福大学Deisseroth教授实验室发明的CLARITY技术最早应用于脑组织的透明化和三维结构研究，并逐步拓展到其它主要器官，如肾脏，小肠等，展示了这种技术在获取生物组织完整三维高分辨率结构信息方面的巨大潜在价值。
然而，将CLARITY技术拓展到所有器官的透明化时，发现有些器官即使用表面活性剂进行很长的时间的处理，也很难被完全的透明化，从而大大限制了三维结构研究所能到达的组织深度。这些很难被完全透明的组织主要包括脂肪组织，肝脏组织和肌肉组织等。这些组织的一个共同特点是它们的组织中都富含脂滴。由于这些脂滴的高度疏水性和致密性，CLARITY技术中用来去脂的方法很难将其从组织中去除。这些致密的脂滴的折射率通常高于周围的其它分子，折射率的不匹配会引起光子的散射增加，从而降低组织的透明度和光学成像的深度。
因此，本领域迫切需要一种快速、有效的用于富含脂滴组织透明化的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速有效地使富含脂滴组织透明化的处理方法和相应的试剂盒。
本发明的第一方面提供了一种用于富含脂滴组织快速完全透明化的方法，所述的方法包括以下步骤：
(i)提供一水凝胶固定处理后的富含脂滴的组织样品；
(ii)对所述的组织样品进行透明化预处理，得到预处理样品；
(iii)对所述的预处理样品进行透明化处理，得到透明化样品；和
(iv)对所述的透明化样品进行透明化后处理，得到透明化终样品。
在另一优选例中，还包括步骤：
(v)对所述的透明化终样品进行染色和封片处理，得到测试样品。
在另一优选例中，所述的富含脂滴的组织包括：肝脏组织、脂肪组织和骨骼肌组织。
在另一优选例中，所述的富含脂滴的组织为切片形式。
在另一优选例中，所述的富含脂滴的组织为厚度0.5-1mm的切片。
在另一优选例中，所述的透明化预处理为使用表面活性剂溶液清洗所述的富含脂滴的组织样品。
在另一优选例中，所述的表面活性剂选自下组：十二烷基硫酸钠(SDS)、Triton X-100、或其组合，较佳地，所述的表面活性剂为SDS。
在另一优选例中，所述的SDS浓度为4％-8％。
在另一优选例中，所述的表面活性剂清洗所述的富含脂滴的组织样品的时间为7-11天。
在另一优选例中，所述的透明化处理为使用脂肪酶混合液消化所述的预处理样品。
在另一优选例中，所述的脂肪酶混合液为含有脂肪酶、胆酸和氯盐的混合液，其中，所述的胆酸选自下组：牛黄胆酸、牛磺脱氧胆酸、或其组合。
在另一优选例中，所述的胆酸还包括牛黄胆酸和牛磺脱氧胆酸的盐，或盐水合物。
在另一优选例中，所述的脂肪酶混合液中脂肪酶浓度为2000unit/mL-6000unit/mL。
在另一优选例中，所述的脂肪酶混合液中胆酸浓度为3mM-11mM。
在另一优选例中，所述的脂肪酶混合液中包括选自下组的氯盐：
300-500mM的NaCl，和/或
2-10mM的CaCl2。
在另一优选例中，所述的脂肪酶混合液消化预处理样品的时间为3天-7天。
在另一优选例中，所述的透明化后处理为使用表面活性剂溶液清洗所述的透明化样品。
在另一优选例中，使用表面活性剂溶液清洗所述的透明化样品的时间为1-3天。
在另一优选例中，所述的步骤(i)和(ii)之间，和/或步骤(ii)和(iii)之间，和/或步骤(iii)和(iv)之间，和/或步骤(iv)和(v)之间，还包括使用缓冲液进行清洗。
在另一优选例中，所述的缓冲液选自下组：PBS缓冲液、PBST缓冲液、硼酸缓冲液、或其组合。
在另一优选例中，使用选自下组的组织染液对所述的透明化终样品进行染色：Hoechst染液、DAPI染液、Tomato-Lectin染液。
本发明的第二方面提供了一种试剂盒，所述的试剂盒用于富含脂滴组织的透明化，并且，所述的试剂盒包括：
(1)第一容器，以及位于所述容器内的第一试剂组合物，所述的第一试剂组合物含有表面活性剂；
(2)第二容器，以及位于所述容器内的第二试剂组合物，所述的第二试剂组合物含有胆酸和脂肪酶；
(3)任选的第三容器，以及位于所述容器内的第三试剂组合物，所述的第三试剂组合物含有氯盐溶液、缓冲液，和/或组织染液；
以及(4)任选的使用说明书。
本发明的第三方面提供了一种透明化组织的测试样品，包括：
(a)通过如本发明第一方面所述的方法制备得到的透明化终样品；
(b)组织染液；
(c)载玻片；
(d)盖玻片；和
(e)粘合剂。
在另一优选例中，所述的粘合剂为蓝丁胶。
在另一优选例中，所述的透明化终样品的脂滴含量≤10％。
在另一优选例中，所述的透明化组织的测试样品的衰减深度为0.5-1mm。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1本发明的用于富含脂滴组织透明化的方法的基本原理示意图
11：未透明组织
12：脂滴
21：脂肪酶
22：表面活性剂
31：透明化后的组织
图2样品的封装
图3(a)实验组肝片封片
图3(b)对照组肝片封片
图4 4％SDS处理后小鼠肝片(1mm厚)的透明效果
图5脂肪酶消化液处理后小鼠肝片(1mm厚)的透明效果
图6不同去脂方式后组织的成像深度比较
图7荧光信号随成像深度增加的衰减比较
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现了一种用于富含脂滴组织的透明化试剂组合以及透明化方法。实验表明，采用脂肪酶消化高度疏水和致密脂滴，并与表面活性剂(如SDS)结合使用，可以将高度疏水和致密的脂滴完全从组织中清除出去，从而大幅度减少组织中高度散光的物质，并获得完全透明化的完整组织。所述方法可以大幅增加富含脂滴组织的光学成像深度，使得完整组织的三维光学成像和在细胞和亚细胞尺度的结构解析成为可能。在此基础上完成了本发明。
术语
透明化
如本文所用，术语“透明化”是指通过化学或者物理的方法对组织样品进行必要的处理，使得不透明的组织转变成完全透明的组织，其核心是减少了光线在组织中传播时的散射。透明化后的组织可以用光学仪器，比如光学显微镜，直接观察其内部结构。
脂滴(lipid droplets)
如本文所用，术语“脂滴”是重要的能量存储细胞器，在大多数真核生物细胞中存在，其尺寸分布从非脂肪细胞中的几十纳米到脂肪细胞中的100微米不等。脂滴的结构由两部分组成，包括一个极度疏水和致密的内核，内核外面由单层磷脂膜包裹。疏水内核的主要化学成分是甘油三脂(triacylglycerol)和甾醇酯(sterol ester)。
脂肪酶(lipase)
如本文所用，术语“脂肪酶”也叫甘油脂水解酶，是一类具有催化脂肪分解反应的酶，能够催化甘油三脂的水解反应，将甘油三脂分解成甘油和脂肪酸。
衰减深度
如本文所用，术语“衰减深度”定义为荧光信号衰减到起始信号的一半时的深度定义为衰减深度。
本发明的用于富含脂滴组织透明化的方法
对于用水凝胶固定好的富含脂滴组织，此处采用的水凝胶固定处理方法为本领域技术人员所熟知的常规技术手段。在本发明的方法中，首先用表面活性剂进行初步的透明化，然后加入脂肪酶(如猪胰脂肪酶)水解掉组织中富含的脂滴。脂肪酶是一种催化脂肪水解的酶，它可以将三链的甘油三酯上的一条甚至两条脂肪酸链消化下来。消化后的产物(如脂质小分子)进一步通过结合表面活性剂(如SDS)，以SDS微囊的形式离开组织，进而实现对富含脂滴样品的快速和完全透明化。图1为本发明的用于富含脂滴组织透明化的方法的基本原理示意图。
衰减深度测试方法
本发明用荧光标记的样品作为测试衰减深度的标准样品，测量荧光信号随着成像深度的增加而减少的衰减曲线，基于归一化后衰减曲线，荧光信号从原始信号强度衰减到一半信号强度时的成像深度即为衰减深度。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1：富含脂滴的肝脏组织的完全透明化(以肝脏组织的透明化为例)
1.1溶液的制备
1)SDS清洗液的制备
5L浓度为4％的SDS(十二烷基硫酸钠)清洗液的配方如下：
2)脂肪酶消化液的制备
1)先分别配置3M氯化钠(NaCl)，1.5％(w/v)牛黄胆酸(Taurocholic)，75mM氯化钙(CaCl2)。
2)配置15mL的混合液的配方如下：
3)再调节pH到7.7左右。将60000unit的脂肪酶lipase溶于该混合液中。
1.2脂质的去除
1)去除肝脏样品表面多余凝胶后，用振荡切片机(VT1200s，Leica)将样品切成1mm厚的肝片。
2)将第一步中切好的肝片孵育在50mL 4％SDS清洗液中，在37℃下清洗7天，期间每天换一次液。
3)将处理好的肝片随机分成实验组和对照组，拍照记录此时肝片的透明程度。
4)将实验组肝片从SDS清洗液中取出，用1×PBS洗去SDS清洗液后，将肝片放入配好的脂肪酶消化液中，在37℃条件下孵育4天；对照组中的肝片则继续在4％SDS清洗液中清洗4天。拍照，记录实验组和对照组中肝片的透明程度。
5)将实验组的肝片从脂肪酶消化液中取出，用1×PBS洗去脂肪酶消化液后，再次放入50mL的4％SDS清洗液中清洗1天；对照组继续在4％SDS清洗液中清洗1天。拍照，记录实验组和对照组中肝片的透明程度。
1.3Hoechst染色及成像
1)将Hoechst33342以1:1000稀释，配成Hoechst染液。
2)将实验组和对照组肝片室温静置孵育在Hoechst染液中12小时。
3)再将实验组和对照组肝片分别转入15mL PBST中，清洗Hoechst33342染料，室温，静置，12小时(每隔6小时换一次PBST)，避光。
4)将实验组和对照组中的肝片从染液中取出，放入折射率匹配液FocusClear中匹配折射率12小时后。
5)如图2所示，用蓝丁胶作为粘合剂将肝片连同折射率均匀化液体(如FocusClear，RIMS)一起水平地封在载玻片和盖玻片之间。实验组肝片封片后如图3(a)所示，对照组肝片封片后如图3(b)所示。
6)用激光扫描共聚焦显微镜(Nikon A1Si Confocal microscope),CFI Plan Apo10×Objective(NA＝0.45,W.D.＝4.0mm))拍摄3D荧光图像。
1.4图像的处理与分析
使用NIS-Elements(Nikon Instruments)图像获取软件，获得3D图像中垂直于拍摄面的切面(XZ or YZ)荧光图像。荧光图像在减去背景后，将位于同一成像深度处的像素值相加并归一化。用归一化后不同深度处的像素值和的变化展示肝片中的荧光信号随着成像深度的增加而衰减的趋势。所有图像和数据处理在MATLAB中完成。
结果分析
2.1SDS去脂效果及其局限性
图4(B)为4％SDS清洗液处理7天后的肝片，与处理前(图4(A))相比，肝片的颜色变浅，表明肝片中的一部分脂质确实被SDS带走了。但是比较SDS处理7天(图4(B))和11天(图4(C))的效果，可以看出，单纯的延长SDS处理肝片的时间，并不能达到明显的完全除去脂质，使得肝片完全透明化的效果。
2.2脂肪酶的去脂效果
图5(A)为未处理样品，将已在SDS中清洗了7天的肝片(图5(B))放入脂肪酶消化液中孵育4天后(图5(C))，比较肝片在脂肪酶消化液处理前后的照片，发现肝片的透明度有了明显的提高。而将脂肪酶处理好的肝片放回4％SDS清洗液中的处理1天，发现整个肝片几近透明(图5(D))，同仅仅孵育在4％SDS中11天的肝片(图4(C))相比，脂肪酶处理的肝片的去脂效果更彻底。
2.3不同处理方式的Hoechst染色成像结果比较
使用脂肪酶去脂法得到的小鼠肝片Hoechst染色结果如图6(B)所示，脂肪酶实验组中肝片内不同深度处的细胞核均得到了良好的标记及成像。而SDS对照组(图6(A))中，在同样的折射率匹配条件下，随着成像深度的增加，荧光信号发生了迅速的衰减(图7)。如果以荧光信号降低到峰值一半的时的厚度计算，脂肪酶去脂法的成像深度为475μm，是SDS去脂法成像深度95μm的5倍。说明脂肪酶的处理确实能够帮助提高肝脏样品透明化程度，实现肝脏样品的深度成像。需要说明的是，由于使用空气镜头成像，空气(折射率为1)和透明化样品的折射率(约为1.45)会造成获得图像的厚度小于样品厚度的情况。此处，成像深度475μm相当于样品的厚度为679μm。
本发明的主要优点包括：
(1)显著提高富含脂滴组织的透明化程度和光学成像深度。实验结果表明，所述方法与传统单纯依靠表面活性剂的透明化方法相比，可以将光学成像的深度增加5倍。
(2)不对生物组织的结构形成任何破坏。所述方法不会对生物组织的精细结果造成破坏。
(3)将组织透明化技术的应用范围大幅度扩展。采用所述方法并结合已有的组织透明化方法，将能实现对所有器官和组织，包括整个动物身体的完整透明化，从而获得三维高分辨率结构信息。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (16)
1.一种用于富含脂滴组织快速完全透明化的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
(i)提供一水凝胶固定处理后的富含脂滴的组织样品；
(ii)对所述的组织样品进行透明化预处理，得到预处理样品；
(iii)对所述的预处理样品进行透明化处理，得到透明化样品；和
(iv)对所述的透明化样品进行透明化后处理，得到透明化终样品；
其中，所述的透明化处理为使用脂肪酶混合液消化所述的预处理样品；并且所述的富含脂滴的组织为切片形式。
2.如权利要求1中所述的方法，其特征在于，还包括步骤：
(v)对所述的透明化终样品进行染色和封片处理，得到测试样品。
3.如权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述的透明化预处理为使用选自下组的表面活性剂溶液清洗所述的富含脂滴的组织样品：
十二烷基硫酸钠、Triton X-100、或其组合。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠。
5.如权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述的脂肪酶混合液为含有脂肪酶、胆酸和氯盐的混合液，其中，所述的胆酸选自下组：牛黄胆酸、牛磺脱氧胆酸、或其组合。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的脂肪酶混合液中脂肪酶浓度为2000unit/mL-6000unit/mL。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的脂肪酶混合液中胆酸浓度为3mM-11mM。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的脂肪酶混合液中包括选自下组的氯盐：
300-500mM的NaCl，和/或
2-10mM的CaCl2。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(iii)的透明化处理时间为3天-7天。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的富含脂滴的组织为厚度0.5-1mm的切片。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述富含脂滴的组织选自下组：脂肪组织、肝脏组织和肌肉组织。
12.如权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述的透明化后处理为使用表面活性剂溶液清洗所述的透明化样品。
13.一种试剂盒，所述的试剂盒用于富含脂滴组织的透明化，其特征在于，所述的试剂盒包括：
(1)第一容器，以及位于所述容器内的第一试剂组合物，所述的第一试剂组合物含有表面活性剂；
(2)第二容器，以及位于所述容器内的第二试剂组合物，所述的第二试剂组合物含有胆酸和脂肪酶；
(3)任选的第三容器，以及位于所述容器内的第三试剂组合物，所述的第三试剂组合物含有氯盐溶液、缓冲液、和/或组织染液；
以及(4)任选的使用说明书。
14.一种透明化组织的测试样品，其特征在于，包括：
(a)通过如权利要求1中所述的方法制备得到的透明化终样品；
(b)组织染液；
(c)载玻片；
(d)盖玻片；和
(e)粘合剂。
15.如权利要求14中所述的透明化组织的测试样品，其特征在于，所述的透明化终样品的脂滴含量≤10％。
16.如权利要求14中所述的透明化组织的测试样品，其特征在于，所述的透明化组织的测试样品的衰减深度为0.5-1mm。
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