CN104350372A - 用于制备供显微镜分析的生物样本的方法和组合物 - Google Patents

用于制备供显微镜分析的生物样本的方法和组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN104350372A
CN104350372A CN201380028711.3A CN201380028711A CN104350372A CN 104350372 A CN104350372 A CN 104350372A CN 201380028711 A CN201380028711 A CN 201380028711A CN 104350372 A CN104350372 A CN 104350372A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sample
hydrogel
tissue
electrophoresis
methods according
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201380028711.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104350372B (zh
Inventor
K·A·狄塞罗斯
K·崇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Leland Stanford Junior University
Original Assignee
Leland Stanford Junior University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Leland Stanford Junior University filed Critical Leland Stanford Junior University
Publication of CN104350372A publication Critical patent/CN104350372A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104350372B publication Critical patent/CN104350372B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
    • G01N1/31—Apparatus therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704—Details; Accessories
    • G01N27/44743—Introducing samples
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704—Details; Accessories
    • G01N27/44747—Composition of gel or of carrier mixture
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
    • G01N33/549—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic with antigen or antibody entrapped within the carrier
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/34—Microscope slides, e.g. mounting specimens on microscope slides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N2001/4038—Concentrating samples electric methods, e.g. electromigration, electrophoresis, ionisation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/4833—Physical analysis of biological material of solid biological material, e.g. tissue samples, cell cultures

Abstract

提供了用于制备供显微镜分析的生物样本的方法和组合物。这些方法在例如医学和研究中有许多用途，例如，诊断或监控疾病或移植物移植、研究健康或患病组织、针对在疾病修饰中的毒性和功效筛选候选剂。还提供了用于实施本方法的试剂、设备、试剂盒和其系统。

Description

用于制备供显微镜分析的生物样本的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年8月9日提交的美国临时专利申请序列号61/681,551的申请日的优先权权益，该申请的公开内容以其整体并入本文。
发明领域
本发明涉及制备供显微镜分析的生物样本。
发明背景
为了研究复杂器官和组织，例如脑和肿瘤，有必要理解其完整的3-D结构和整个组织内的精细分子细节。由阵列断层成像术或串行块面扫描电子显微术示例的目前方法可以提供亚细胞精细细节，但是涉及过分的低效且损伤性的机械切片和重构。已经开发了与组织清洁方法组合的光学切片技术，其中减少光散射以增加组织可以成像的深度。虽然这些方法可以避开费力的机械切片和重构过程，但它们与免疫染色/分子表型分析不相容。需要用于制备供显微镜分析的生物组织的技术，其保持组织和其中亚细胞结构的3-D完整性，同时还使组织内的生物分子例如蛋白质、脂质、类固醇、核酸和小分子可在组织中更深区域用分子探针标记。本发明解决了这些和其他问题。
发明概述
提供了用于制备供显微镜分析的生物样本的方法和组合物。这些方法在例如医学和研究中有许多用途，例如，诊断或监控疾病或移植物移植、研究健康或患病组织以及针对在疾病修饰中的毒性和功效筛选候选剂。还提供了用于实施本方法的试剂、设备、试剂盒及其系统。
在一些实施方案中，本公开提供了制备供显微镜分析的生物样本的方法，所述方法包括用多个水凝胶亚基固定所述样本，使所述水凝胶亚基聚合以形成水凝胶包埋的样本，并清洁所述水凝胶包埋的样本。在一些实施方案中，清洁所述水凝胶包埋的样本包括从所述样本基本上去除多种细胞组分。在一些实施方案中，所述细胞组分包括脂质。
在一些实施方案中，清洁所述水凝胶包埋的样本包括对所述样本进行电泳。在一些实施方案中，使用包含离子型表面活性剂的缓冲溶液对所述样本进行电泳。在一些实施方案中，所述离子型表面活性剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。在一些实施方案中，使用范围从约10至约60伏特的电压对所述样本进行电泳。在一些实施方案中，持续范围从约15分钟多至约10天的时段对所述样本进行电泳。在一些实施方案中，所述方法还包括在封固剂中孵育所述经清洁的样本，所述封固剂具有与所述清洁组织相匹配的折射率。在一些实施方案中，所述封固剂增加所述样本的光学透明度。在一些实施方案中，所述封固剂包括甘油。
在一些实施方案中，显微镜分析是光学显微术、激光显微术、电子显微术和扫描探针显微术。在一些实施方案中，固定所述样本包括使所述样本与多聚甲醛接触。在一些实施方案中，所述水凝胶亚基包括丙烯酰胺。在一些实施方案中，使所述样本聚合包括热交联。
在一些实施方案中，所述方法还包括使所述样本与多肽、核酸或小分子接触。在一些实施方案中，所述接触包括电泳、流体压力、超声振动、溶质对比(solute contrast)、微波辐射或血管循环。在一些实施方案中，所述多肽、核酸或小分子包括当对所述样本通过显微镜进行分析时使之可见的组分。在一些实施方案中，所述组织是中枢神经系统(CNS)组织。在一些实施方案中，所述CNS组织是全脑。
在一些实施方案中，本公开提供了通过显微术使生物样本成像的方法，所述方法包括如上所述制备生物样本，和用显微镜使所述生物样本成像。在一些实施方案中，所述显微镜是光学显微镜、激光显微镜、电子显微镜或扫描探针显微镜。在一些实施方案中，所述样本的细胞或亚细胞方面用运输进入所述制备的组织的一个或多个小分子、核酸或蛋白质标记。在一些实施方案中，所述方法还包括去除之前运输进入所述制备的组织的一个或多个小分子、核酸或蛋白质。
在一些实施方案中，本公开提供了对神经系统组织的连通性进行绘图的方法，所述方法包括如上所述制备神经系统组织样本，和用显微镜使所述样本中的一个或多个神经元成像。在一些实施方案中，本方法还包括用当对所述样本通过显微镜分析时使之可见的组分标记所述样本中的一个或多个神经元。在一些实施方案中，所述神经元在固定所述组织之前被标记。在一些实施方案中，所述神经元在使所述水凝胶聚合之后被标记。
在一些实施方案中，本公开提供了用于制备供显微镜分析的组织的试剂盒，所述试剂盒包括固定剂和多个水凝胶亚基。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括用于对三维水凝胶包埋的样本进行电泳以从所述样本基本上去除多个细胞组分的装置。在一些实施方案中，所述细胞组分包括脂质。
在一些实施方案中，本公开提供了用于制备供成像的生物样本的系统，所述系统包括用于对三维水凝胶包埋的样本进行电泳以从所述样本基本上去除多个细胞组分的装置、电源和温度控制的缓冲液循环器。在一些实施方案中，所述细胞组分包括脂质。
在一些实施方案中，本公开提供了电泳组织清洁设备，所述设备包括用于容纳三维水凝胶包埋的样本的电泳室、多个电极、电源和温度控制的缓冲液循环器。在一些实施方案中，本设备还包括缓冲液过滤组件。在一些实施方案中，本设备还包括多个流体入口和/或出口孔。在一些实施方案中，本设备还包括被配置成支持所述水凝胶包埋的样本的组件。在一些实施方案中，所述组件被配置成支持所述水凝胶包埋的样本处于基本上在两个或多个所述电极之间产生的电场内的位置。在一些实施方案中，一个或多个所述电极包括用于增加由所述电极产生的电场的大小的放大组件。在一些实施方案中，所述放大组件包括一个或多个S形弯曲。在某些实施方案中，一个或多个电极的长度和宽度大致相等。在一些实施方案中，本设备还包括与所述电泳室形成流体密封和/或空气密封的盖子。
在一些实施方案中，本公开提供了保存生物样本的方法，所述方法包括用多个水凝胶亚基固定所述样本，使所述水凝胶亚基聚合以形成水凝胶包埋的样本，和清洁所述水凝胶包埋的样本。在一些实施方案中，本方法还包括将经清洁的水凝胶包埋的样本储存在封固剂中。在一些实施方案中，本方法还包括分析经清洁的水凝胶包埋的样本以供病理状态的评价、诊断或预后。在一些实施方案中，所述样本是活检样本或尸检样本。在一些实施方案中，所述病理状态是癌症、免疫系统功能障碍、神经精神疾病、内分泌/生殖疾病、心血管/肺部疾病、肌肉骨骼疾病或胃肠疾病。
在一些实施方案中，所述样本包括正常组织，并且所述方法还包括分析所述样本以评价细胞、组织、器官或系统功能和/或细胞和组织之间的关系，包括发育期间。在一些实施方案中，本方法还包括对所述样本进行遗传学、转录组学、基因组学、蛋白质组学、代谢物组学和/或药物筛选分析。在一些实施方案中，本方法还包括储存所述样本供未来分析、评估或功能化。
在一些实施方案中，本公开提供用于将水凝胶单体注入生物组织并随后引发所述单体形成具有希望硬度、透明度、孔径、电导率或通透性性质的聚合物、凝胶、网孔或网络的系统，该系统包括生物样本和多个水凝胶亚基。在一些实施方案中，所述系统还包括纳米级硬件设备、蛋白质、寡核苷酸和/或荧光染色试剂。在一些实施方案中，所述系统的组分被诸如热、光、化学引发剂和/或加速剂的能量或外部信号活化或功能化。
附图简述
结合附图阅读以下详述时得到本发明的最好理解。本专利或申请文件包含至少一个用颜色绘制的附图。带有具有颜色附图的本专利或专利申请公布的副本根据要求并支付必要费用后由专利局提供。要强调的是，根据常规实践，附图的各个特征不是按比例绘制的。相反，各个特征的尺寸为了清晰而随意放大或缩小。附图包括以下图。
图1是显示在没有组织切片的情况下利于组织成像的称为“CLARITY”的方法的概述的图解。
图2是电泳组织清洁(ETC)设备和相关仪器的图解。
图3是使用CLARITY方法成像的完整成年小鼠脑样本的图像集合。
图4是显示使用CLARITY处理的完整组织体积中分子表型分析结果的图像和数据的集合。
图5是显示使用CLARITY的完整组织的多轮分子表型分析的图像集合。
图6是显示使用CLARITY的人脑结构定位和分子表型分析的结果的图像和数据集合。
图7是显示使用CLARITY成像的小鼠脑组织的结果的图像集合。
图8是显示ETC室设计实例的图的集合。所示尺寸以毫米计。
图9是显示使用FocusClearTM和甘油的完整成年小鼠脑的光学组织清洁的图像的集合。
图10是显示CLARITY处理的小鼠脑组织的电子显微镜(EM)成像结果的图像集合。图像展示CLARITY方法的EM相容性。
图11是显示整个小鼠脑分子表型分析的结果的图像集合。
图12是使用CLARITY方法成像的小鼠脑的前额皮质中TH阳性神经元的轴突纤维的图像集合。
图13是显示使用CLARITY方法成像的小鼠脑的伏核和纹状体中TH阳性神经元的轴突纤维的图像集合。
图14是显示使用CLARITY方法成像的小鼠脑的杏仁核中TH阳性神经元的轴突纤维的图像集合。
图15是显示不同深度(0-200μm，20μm间隔)PSD-95斑点的平均免疫荧光横截面的一系列图。
图16是显示不同深度(0-200μm，20μm间隔)的平均PSD-95斑点的一系列图像。
图17是显示微管相关蛋白2(MAP2)染色的图像集合，所述染色显示了使用CLARITY方法成像的遍及1mm厚的小鼠脑组织样本中致密树状纤维和神经元细胞体的均一标记。
图18是显示整个成年斑马鱼脑分子表型分析结果的图像。
图19是显示来自孤独症受试者的脑组织样本的新皮质中示踪的PV阳性神经元结果的图像集合。
图20是显示来自正常对照受试者的脑组织样本的新皮质中示踪的PV阳性神经元结果的图像集合。
发明详述
提供了用于制备供显微镜分析的生物样本的方法和组合物。这些方法在例如医学和研究中有许多用途，例如，诊断或监控疾病或移植物移植、研究健康或患病组织、针对在疾病修饰中的毒性和功效筛选候选剂。还提供了用于实施本方法的试剂、设备、试剂盒及其系统。在阅读了以下更全面描述的组合物和方法的细节后，本发明的这些和其他目的、优势和特征对于本领域技术人员将变得显而易见。
在描述本方法和组合物之前，要理解，本发明不限于所描述的特定方法或组合物，因为这些当然可以变化。还要理解，本文使用的术语只用于描述特定实施方案，而不旨在限制，因为本发明范围仅由所附权利要求限制。
当提供值的范围时，要理解，介于该范围上限和下限之间的每个中间值(除非上下文明确另外指示，至下限单位的十分之一)也被明确公开。所述范围内任何所述值或中间值与该所述范围内任何其他所述值或中间值之间的每个较小范围涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括于该范围或排除在该范围外，并且其中任一个限值或两个限值包括在较小范围内或任一个限值都不包括在较小范围内的每个范围也涵盖在本发明内，这取决于所述范围内任何具体排除的限值。当所述范围包括限值的一个或两个时，排除那些包括的限值的任一个或两个的范围也包括在本发明内。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文描述的那些相似或等同的任何方法和材料可用于实施或测试本发明，但现在描述一些潜在且优选的方法和材料。本文提到的所有出版物通过引用并入本文以公开和描述所述出版物引用与之相关的方法和/或材料。要理解，存在矛盾时，本公开替代并入的出版物的任何公开。
如阅读本公开后对本领域技术人员而言显然的是，本文描述和示例说明的个别实施方案的每一个具有离散的组件和特征，其可以容易地与其他几个实施方案的任何一个的特征分开或组合，而不背离本发明的范围或精神。可以所述事件顺序或者以任何逻辑上可能的任何其他顺序进行任何描述的方法。方法的任何步骤可以与该方法的另一步骤间隔任选的储存步骤，即，在室温、在16℃、在4℃、在-12℃、在-20℃、在-70℃或在-130℃储存。
必须注意，除非上下文另外明确指出，如本文和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物。因此，例如，对“一种细胞”的提及包括多个此类细胞，并且对“该肽”的提及包括对一种或多种肽及其等同物的提及，例如本领域技术人员已知的多肽，以此类推。
本文讨论的出版物仅为在本申请的申请日之前的其公开内容而提供。本文没有任何被解释为承认本发明没有权利借助在先发明而先于此类出版物。而且，提供的出版日期可能不同于实际出版日期，实际出版日期可能需要独立确认。
方法
在本发明的各方面，提供了用于制备供显微镜分析的生物样本的方法。所谓“显微镜分析”意指使用提供样本各方面的显现的技术分析样本，所述样本的各方面不能用肉眼看到，即，不在正常眼的分辨范围内。此类技术可以包括但不限于光学显微术(例如，明视野、斜面照明、暗视野、相差、微分干涉差、干涉反射、落射荧光、共聚焦等显微术)、激光显微术、电子显微术和扫描探针显微术。所谓“制备供显微镜分析的生物样本”一般意指使样本适合在样本内无限深度的显微镜分析。
在实施本方法时，在水凝胶亚基存在下固定生物样本。所谓“固定”样本意指使样本(即样本细胞)暴露于固定剂，使得细胞组分变得相互交联。所谓“水凝胶”或“水凝胶网络”意指水不溶性聚合物链的网络，有时以胶态凝胶存在，其中水是分散介质。换言之，水凝胶是可以吸收大量水而不溶解的一类聚合物材料。水凝胶可以含有超过99％的水，并且可以包含天然或合成的聚合物或其组合。水凝胶还具有非常类似于天然组织的柔韧度，这归因于其显著的水含量。适合的水凝胶的详细描述可以参见公开的美国专利申请20100055733，其明确通过引用并入本文。所谓“水凝胶亚基”或“水凝胶前体”意指可以交联或“聚合”形成三维(3D)水凝胶网络的亲水单体、预聚物或聚合物。不受科学理论束缚，认为生物样本在水凝胶亚基存在下的这种固定使样本组分与水凝胶亚基交联，从而使分子组分固定在合适的位置，保持组织构造和细胞形态。
任何常规固定剂(fixation agent)或“固定剂(fixative)”可用于固定剂/水凝胶组合物中以在水凝胶亚基存在下固定样本，例如甲醛、多聚甲醛、戊二醛、丙酮、乙醇、甲醇等。通常，固定剂将在缓冲液中稀释，例如盐水、磷酸盐缓冲液(PB)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、柠檬酸缓冲液、磷酸钾缓冲液等，通常以如下浓度稀释：约1-10％，例如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％或10％，例如4％多聚甲醛/0.1M磷酸盐缓冲液；2％多聚甲醛/0.2％苦味酸/0.1M磷酸盐缓冲液；4％多聚甲醛/0.2％高碘酸盐/1.2％赖氨酸于0.1M磷酸盐缓冲液中；4％多聚甲醛/0.05％戊二醛于磷酸盐缓冲液中；等。使用的固定剂类型和暴露于固定剂的持续时间将取决于样本中感兴趣分子对由固定剂引起的变性的敏感性，并且将是普通技术人员已知的或者可以使用常规组织化学或免疫组织化学技术容易确定的，例如如Buchwalow和Immunohistochemistry：Basics and Methods.Springer-VerlagBerlin Heidelberg 2010所述。
固定剂/水凝胶组合物可以包含任何常规的水凝胶亚基，例如但不限于聚(乙二醇)及其衍生物(例如PEG-二丙烯酸酯(PEG-DA)、PEG-RGD)、聚脂肪族聚氨酯、聚醚聚氨酯、聚酯聚氨酯、聚乙烯共聚物、聚酰胺、聚乙烯醇、聚丙二醇、聚氧化四亚甲基、聚乙烯比咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚(羟基丙烯酸乙酯)和聚(羟基甲基丙烯酸乙酯)、胶原、透明质酸、脱乙酰壳多糖、右旋糖酐、琼脂糖、明胶、藻酸盐、蛋白质聚合物、甲基纤维素等。在一些情况下，可以修饰水凝胶亚基以增加水凝胶的特定性质；例如，可以并入肽序列以诱导降解(参见例如，West和Hubbell，1999，Macromolecules，32：241)或修饰细胞粘附(参见例如Hem和Hubbell，1998，J.Biomed.Mater.Res.，39：266)。诸如亲水纳米粒子的试剂，例如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PLG)、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚苯乙烯、聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)等，可用于改善水凝胶的通透性，同时维持可图案性(参见例如，美国专利申请号13/065,030；Lee W.等人2010Proc.Natl.Acad.Sci.107，20709-20714)。诸如PEG、可降解PEO、聚(乳酸)(PLA)的嵌段共聚物的材料和其他类似材料可用于增加水凝胶的特定性质(参见例如，Huh和Bae，1999，Polymer，40：6147)。可以纳入交联剂(例如双-丙烯酰胺、双氮丙啶等)和引发剂(例如偶氮二异丁腈(AIBN)、核黄素、L-精氨酸等)以促进之后聚合步骤中相互作用的大分子之间的共价结合。
通常，水凝胶亚基和修饰剂的浓度和分子量取决于选定的聚合物和它们聚合成的水凝胶网络的所需特性，例如孔径、膨胀性质、电导率、弹性/刚性(杨氏模量)、生物降解指数等。例如，可能希望水凝胶包含足够尺寸的孔以允许大分子例如蛋白质、核酸或如下文更详细描述的小分子通过进入样本。普通技术人员会知道孔径一般随递增的水凝胶亚基浓度而减少并且一般随递增的水凝胶亚基与交联剂比率而增加，并且会制备包含允许此类大分子通过的一定浓度水凝胶亚基的固定剂/水凝胶组合物。作为另一实例，可能希望水凝胶具有特定硬度，例如，以在操作包埋的样本时提供稳定性，例如约2-70kN/m2，例如约2kN/m2、约4kN/m2、约7kN/m2、约10kN/m2、约15kN/m2、约20kN/m2、约40kN/m2，但通常不超过约70kN/m2的杨氏模量。普通技术人员会知道水凝胶网络的弹性可能受到许多因素影响，包括聚合物的分支、水凝胶亚基的浓度和交联的程度，并且会制备包含一定浓度水凝胶亚基以提供此类希望弹性的固定剂/水凝胶组合物。因此，例如，固定剂/水凝胶组合物可以包含浓度约1％w/v至约20％w/v，例如约2％至约15％、约3％至约10％、约4％至约8％的丙烯酰胺单体，和浓度范围约0.01％至约0.075％，例如0.01％、0.02％、0.025％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％或0.075％的双-丙烯酰胺交联剂；或者，例如，固定剂/水凝胶组合物可以包含浓度范围约1％w/w至约50％w/w、例如1％或更大、5％或更大、7.5％或更大、10％或更大、15％或更大、20％或更大、30％或更大、40％或更大且通常不超过约50％的具有范围至少约2.5K至约50K、例如2.5K或更大、3.5K或更大、5K或更大、7.5K或更大、10K或更大、15K或更大、20K或更大但通常不超过约50K的分子量的PEG预聚物。提供希望的水凝胶特性的水凝胶亚基和修饰剂的浓度可以通过本领域方法或者如以下工作实施例中描述的容易地确定。
可以通过任何常规方法将固定剂/水凝胶溶液递送至样本，所述方法例如灌注、注射、滴注、吸收、涂布、浸入/浸没等。样本通常在水凝胶存在下固定15分钟或更久，例如30分钟或更久，1小时或更久、2小时或更久、4小时或更久、6小时或更久、12小时或更久、在一些情况下16小时或更久、20小时或更久或24小时或更久。
样本固定之后，使水凝胶亚基聚合(即，共价或物理交联)以形成水凝胶网络。聚合可以通过任何方法，包括但不限于热交联、化学交联、物理交联、离子交联、光交联、辐射交联(例如，x射线，电子束)等，并且可以基于使用的水凝胶类型和本领域知识来选择。例如，未聚合或部分聚合的树脂与特定交联化学品的混合导致形成交联的化学反应。可以通过暴露于辐射源例如电子束暴露、γ-辐射或UV光而在正常是热塑性的材料中纳入交联；例如使用电子束处理来使C型交联聚乙烯聚合。通过在挤压过程中添加过氧化物(A型)或者通过在挤压过程中添加交联剂(例如乙烯基硅烷)和催化剂并然后进行挤压后固化来制备其他类型的交联聚乙烯。许多聚合物通常在暴露于大气氧时经历氧化性交联。在一些情况下，反应比预期的更快，并且因此聚合反应可以包括使用抗氧化剂来减缓氧化性交联的形成。在其他情况下，例如，当希望通过氧化更快形成交联时，可以使用氧化剂例如过氧化氢来加速该过程。聚合的时间长度取决于使用的水凝胶亚基的类型和选择的聚合方法，但是通常是约15分钟至约48小时，例如15分钟或更久、1小时或更久、2小时或更久、3小时或更久、4小时或更久、6小时或更久、12小时或更久、16小时或更久、24小时或更久，或者在一些情况下是48小时。最佳的时间和试剂组合将是普通技术人员已知的，或者可以凭经验或者通过任何数目的公开可获得的资源(例如，在万维网上piercenet.com；还参见Macroporous Polymers:Production Properties and Biotechnological/Biomedical Applications.由Bo Mattiasson，Ashok Kumar，和IgorYu编辑.Galeaev.CRC Press 2010；和Crosslinking Reagents Technical Handbook，Pierce Biotechnology,Inc.，2006)来确定。
一经聚合，水凝胶包埋的(即，水凝胶杂交的)样本可以被清洁。所谓“清洁”样本意指使得样本基本上可透光，即，透明的。换言之，约70％或更多的用于照明样本的可见(即，白色)光、紫外光或红外光会穿过样本并只照明其中选定的细胞成分，例如，75％或更多的光、80％或更多的光、85％或更多的光、在一些情况下90％或更多的光、95％或更多的光、98％或更多的光，例如100％的光会穿过样本。样本光学性质的这种变化提供了组织内部细胞和亚细胞结构的显现。
从样本压迫细胞组分例如脂质，从样本抽取细胞组分例如脂质，或者引起样本内细胞组分例如脂质降解(即，溶解)的任何处理可用于清洁样本，包括但不限于暴露于有机溶剂例如二甲苯、乙醇或甲醇；暴露于去污剂例如皂角苷、Triton X-100和Tween-20；暴露于离子型表面活性剂例如十二烷基硫酸钠(SDS)；电泳；流体压力；超声振动；溶质对比；微波辐射；血管循环等。在一些情况下，使用不猝灭荧光蛋白的溶剂进行清洁。已知猝灭荧光蛋白的有机溶剂的实例包括四氢呋喃、己烷、苄醇/苯甲酸苄酯(BABB)和二苄基醚。因此，为了保存各种蛋白质的荧光，在一些实施方案中，使用不同于上列那些溶剂进行清洁，例如使用非有机溶剂进行清洁。
在一些情况下，使用离子型表面活性剂例如SDS进行清洁，以通过积极地使带电离子胶束从待清洁的样本运出而加快清洁过程。清洁可以在与选定的清洁方法相容的任何便利缓冲液中进行，例如如本领域已知的盐水、磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、硼酸钠缓冲液、硼酸缓冲液、柠檬酸缓冲液等，并且每厘米厚度样本通常将花费约1-10天，即，每立方厘米通常约1天，在一些情况下2天，有时5天，并且通常不超过10天。最佳时间可以通过视觉检测样本透明度来容易地确定。
清洁之后，样本将一般基本不含脂质。所谓“基本不含脂质”意指在清洁之前样本中存在的最初脂质量被减少大约70％或更多，例如75％或更多，例如80％或更多，例如85％或更多，例如90％或更多，例如95％或更多，例如99％或更多，例如100％。
适合用于本文描述的方法和系统的组织样本一般包括从活或死的受试者收集的任何类型的组织样本，例如活检样本和尸检样本。可以使用本文描述的方法和系统收集和处理组织样本，并在处理之后立即进行显微镜分析，或者可以保存并在未来时间，例如在储存较长时段之后进行显微镜分析。在一些实施方案中，本文描述的方法可用于保持组织样本处于稳定、可及且完全完整的形式以供未来分析。例如，组织样本例如人脑组织样本可以如上所述处理并清洁以去除多种细胞组分，例如脂质，然后储存供未来分析。在一些实施方案中，本文描述的方法和系统可用于分析之前保存或储存的组织样本。例如，在一些实施方案中，还未经受CLARITY方法的之前保存的组织样本可以如本文描述的进行处理和分析。
在一些情况下，不需要进一步操作样本供显微镜分析。例如，样本可以包括可通过显微术直接显现的生物分子。所谓“生物分子”一般意指组织或细胞内的蛋白质、脂质、类固醇、核酸等。这种情况的一个实例是如果作为样本来源的生物体表达具有发荧光的能力的蛋白质，即，“荧光蛋白”或“FP”。所谓“发荧光”意指在一种波长吸收能量并在另一种波长发射能量。例如，绿色荧光蛋白(GFP)指在在发射光谱中在510nm或约510nm处具有峰的多肽。许多在不同波长处发射的FP是本领域已知的。感兴趣的FP包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、橙色荧光蛋白(OFP)、青色荧光蛋白(CFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、红色荧光蛋白(RFP)、远红外荧光蛋白或近红外荧光蛋白。如本文使用的，水母GFP指来自水母属的GFP并且指其突变体或变体。此类变体和来自其他物种(例如，珊瑚礁(Anthozoa reef coral)、沟迎风海葵(Anemonia sea anemone)、海肾(Renilla sea pansy)、丛生棘杯珊瑚(Galaxea coral)、鹿角褐色珊瑚(Acropora brown coral)、蜿蜒曲纹珊瑚(Trachyphyllia)和海贝石珊瑚(Pectimidae stony coral)和其他物种)的GFP是公知的，并且是本领域技术人员可获得且已知的。示例性GFP变体包括但不限于BFP、CFP、YFP和OFP。荧光蛋白及其变体的实例包括GFP蛋白质，例如Emerald(Invitrogen，Carlsbad，Calif.)、EGFP(Clontech，Palo Al to，Calif)、Azami-Green(MBL International，Woburn，Mass.)、Kaede(MBL International，Woburn，Mass.)、ZsGreen1(Clontech，Palo Al to，Calif.)和CopGFP(Evrogen/Axxora，LLC，San Diego，Calif.)；CFP蛋白质，例如Cerulean(Rizzo，NatBiotechnol.22(4)：445-9(2004))、mCFP(Wang等人，PNAS USA.101(48)：16745-9(2004))、AmCyanl(Clontech，Palo Al to，Calif)、MiCy(MBL International，Woburn，Mass.)和CyPet(Nguyen和Daugherty，Nat Biotechnol.23(3)：355-60(2005))；BFP蛋白质，例如EBFP(Clontech，Palo Al to，Calif.)；YFP蛋白质，例如EYFP(Clontech，Palo Al to，Calif.)、YPet(Nguyen和Daugherty，Nat Biotechnol.23(3)：355-60(2005))、Venus(Nagai等人，Nat.Biotechnol.20(1)：87-90(2002))、ZsYellow(Clontech，Palo Al to，Calif)和mCitrine(Wang等人，PNAS USA.101(48)：16745-9(2004))；OFP蛋白质，例如cOFP(Strategene，La Jolla，Calif.)、mKO(MBL International，Woburn，Mass.)和mOrange；和其他(Shaner N C，Steinbach P A，和Tsien R Y.，Nat Methods.2(12)：905-9(2005))。另一类荧光蛋白是已经从corallimorphDiscosoma分离的红色荧光蛋白Discosoma RFP(DsRed)(Matz等人，Nature Biotechnology 17：969-973(1999))和来自任何其他物种(例如Heteractis reef coral和红海葵(Actinia)或Entacmaea海葵)的红色或远红外荧光蛋白质及其变体RFP包括例如Discosoma变体，例如单体红色荧光蛋白1(mRFP1)、mCherry、tdTomato、mStrawberry、mTangerine(Wang等人，PNAS U S A.101(48)：16745-9(2004))、DsRed2(Clontech，Palo Al to，Calif.)和DsRed-T1(Bevis和Glick，Nat.Biotechnol.，20：83-87(2002))、Anthomedusa J-Red(Evrogen)和Anemonia AsRed2(Clontech，Palo Alto，Calif.)。远红外荧光蛋白包括例如Actinia AQ143(Shkrob等人，Biochem J.392(Pt 3):649-54(2005))、Entacmaea eqFP611(Wiedenmann等人Proc Natl Acad Sci USA.99(18):11646-51(2002))、Discosoma变体例如mPlum和mRasberry(Wang等人，PNAS U S A.101(48)：16745-9(2004))以及Heteractis HcRed1和t-HcRed(Clontech，Palo Alto，Calif.)。
另外或可选地，可能希望在显微镜分析之前使样本的细胞和细胞内结构与一种或多种大分子接触。例如，可以提供促进特定细胞生物分子例如蛋白质、脂质、类固醇、核酸等以及亚细胞结构显现的大分子。在一些实施方案中，大分子是诊断性的。在一些实施方案中，大分子是预后的。在一些实施方案中，大分子是预测对疗法的响应。在一些实施方案中，大分子是筛选中的候选剂，例如在疾病治疗等中筛选辅助疾病诊断和/或预后的试剂。
例如，样本可以与核酸染色剂如DAPI和Hoechst接触，核酸染色剂结合DNA小沟，从而标记细胞的核。可以采用结合特定细胞结构并且已经用荧光报告分子衍生化的药物或毒素，例如用于染色哺乳动物细胞中肌动蛋白纤维的荧光标记的毒伞素。有许多荧光报告的分子，称为荧光团或荧光物，例如荧光素、Alexa Fluors或DyLight 488，其可以化学连接至结合样本中感兴趣的靶生物分子的分子。
作为另一实例，样本可以与一种或多种特异性针对特定细胞生物分子并与之结合的多肽(例如抗体、标记的肽等)接触，以通过颜色或免疫荧光直接或间接标记。所谓免疫荧光意指利用抗体与其抗原或结合配偶体的高特异性结合以标记细胞内的特定蛋白质或其他分子的技术。样本用特异性针对感兴趣生物分子的一抗处理。荧光团可以直接偶联至一抗或肽。可选地，可以使用与一抗特异性结合的与检测部分或荧光团偶联的二抗。参见例如，Buchwalow和Bocker.Immunohistochemistry:Basics and Methods，Springer-Verlag，Berlin Heidelberg 2010，和Hayat,M.A.Microscopy,Immunohistochemistry,and Antigen Retrieval Methods for Light and Electron Microscopy.Kluwar Academic Publishers，New York 2002，可以遵循方案的实例。可以采用特异性针对靶细胞生物分子并且与荧光体或其他检测部分偶联的肽。
可以作为大分子提供的一类物质的另一实例是核酸。例如，样本可以与反义RNA接触，所述反义RNA与感兴趣的基因的转录物互补并且特异性杂交，例如，以研究样本细胞中的基因表达。作为另一实例，样本可以与DNA接触，所述DNA与感兴趣的基因组材料互补并且特异性杂交，例如，以研究基因突变，例如杂合性丢失、基因复制、染色体倒位等。杂交RNA或DNA与检测部分偶联，所述检测部分即可以直接或间接显微镜可视的物质。原位杂交技术的实例可以参见例如Harris和Wilkinson.In situ hybridization:Application todevelopmental biology and medicine，Cambridge University Press1990；和Fluorescence In Situ Hybridization(FISH)ApplicationGuide.Liehr，T编辑，Springer-Verlag，Berlin Heidelberg 1990。
作为另一实例，样本可以与小分子接触。例如，如果样本包含β-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶，可能希望显现表达这些蛋白质的组织的细胞和区域。为此目的，样本可以与β-半乳糖苷酶的底物(例如X-gal、4-三氟甲基伞形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷(TFMU-Gal)、试卤灵β-D-吡喃半乳糖苷(Res-gal)、4-甲基伞形酮基β-D-吡喃半乳糖苷(MUG)、二-β-D-吡喃半乳糖苷(FDG)、羧基伞形酮基β-D-吡喃半乳糖苷(CUG))或碱性磷酸酶的底物(例如(NBT)/5-溴-4-氯-3'-吲哚基磷酸氮蓝四唑(BCIP))以及允许β-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶活性显现的其他试剂接触。作为另一实例，可能希望在例如CNS样本中显现神经元的树突棘。为此，样本可以暴露于Golgi-Cox浸渍中使用的化学品，例如3％重铬酸钾，随后2％硝酸银溶液。
在一些情况下，由提供的大分子靶向的生物分子是细胞内源性的。在其他情况下，可以将大分子提供至样本以靶向/显现异位提供至样本细胞的生物分子，例如，在体内或离体引入样本以标记某些细胞群或亚细胞结构的物质。例如，在神经科学领域经常使用立体定位外科手术以提供生物分子例如蛋白质、病毒、化学品至神经组织，其在体内或离体标记或“示踪”神经元亚群的投射和/或连通性。在该技术中，将包含标记大分子的针在精确位置扎入CNS组织，并且标记分子被释放进入组织。所述分子将在注射部位附近填充神经元，并且根据递送的大分子类型而可以跨突触运输以标记其传出神经靶(“顺行示踪”)和/或跨树突以标记它们从其接收信号的传入神经元(“逆行示踪”)。可用于立体定位标记神经元的物质的实例是本领域公知的，包括例如编码荧光蛋白的核酸；病毒示踪剂，例如1型单纯疱疹病毒(HSV)和弹状病毒；麦胚凝集素(WGA)；菜豆白细胞凝集素(PHA-L)；辣根过氧化物酶偶联的凝集素；生物素化的右旋糖酐胺(BDA)；霍乱毒素B；NEUROBIOTIN(Vector labs)。以该方式标记的样本可以与促进这些异位提供的标记物显现的大分子(例如多肽或化学品)接触。
在一些情况下，将用于显现细胞生物分子或亚细胞结构的大分子被动运输进入样本。换言之，大分子扩散进入样本。在其他情况下，大分子主动运输进入样本，例如通过电穿孔、流体压力、超声振动、溶质对比、微波辐射、血管循环等。在一些实施方案中，在清洁样本之后使样本与大分子接触。在其他实施方案中，水凝胶包埋的样本可以在清洁样本之前与大分子接触。在此类实施方案中，可以通过透化样本，即，改变样本性质以提高样本对大分子的通透性，来促进与大分子的接触。所谓“透化的”样本意指应用于样本的约50％或更多大分子会穿至样本的最深区域，例如60％或更多大分子、70％或更多大分子或80％或更多大分子，在一些情况下85％或更多大分子、90％或更多大分子或95％或更多大分子，例如98％或更多大分子，例如100％大分子会穿过样本。样本和其中细胞的透化可以通过以上针对从样本去除细胞组分例如脂质讨论的或者本领域已知用于透化细胞的方案的任何一种来实现。
为了通过显微镜显示通过本方法制备的样本，在一些实施方案中，将样本包埋入封固剂。封固剂通常基于以下选择：其对用于显示细胞生物分子的试剂的适当性、样本的折射率、和要进行的显微镜分析。例如，对于相差工作，封固剂的折射率应该不同于样本的折射率，而对于明视野工作，折射率应该相似。作为另一实例，对于落射荧光工作，应该选择减少显微术或储存期间褪色、光漂白或猝灭的封固剂。在某些实施方案中，可以选择封固剂或封固溶液以增强或增加清洁组织样本的光学透明度。可以使用的适当封固剂的非限制性实例包括甘油、CC/MountTM、FluoromountTMFluoroshieldTM、ImmunHistoMountTM、VectashieldTM、PermountTM、AcrytolTM、CureMountTM、FocusClearTM或其等同物。
在一些情况下，水凝胶包埋的样本被永久封固。换言之，一旦封固于封固剂中，水凝胶包埋的样本不能被去除以供进一步操作。在其他情况下，样本被临时或可逆地封固。换言之，水凝胶包埋的样本可以从封固剂去除并且在显示可选/另外生物分子或亚细胞结构的显微术之后重新染色。在此类情况下，之前添加至样本例如以显示某些生物分子的大分子可以在显微镜分析之后去除，例如通过暴露于有机溶剂，例如二甲苯、乙醇或甲醇；暴露于去污剂，例如十二烷基硫酸钠(SDS)、皂角苷、Triton X-100和Tween-20；电泳；流体压力；超声振动；溶质对比；微波辐射；血管循环等。然后使水凝胶包埋的样本与特异性针对其他生物分子或亚细胞结构的不同大分子接触。这样，可以对相同样本进行反复染色。
可以通过许多不同类型的显微术的任何一种来分析使用本方法制备的样本，所述显微术例如光学显微术(例如明视野、斜面照明、暗视野、相差、微分干涉差、干涉反射、落射荧光、共聚焦等显微术)、激光显微术、电子显微术和扫描探针显微术。
明视野显微镜是所有光学显微术技术中最简单的。样本照明是通过透射的白光，即，从下面照明并且从上面观察的。限制包括大部分生物样本的低对比度和归因于离焦材料的污斑的低表观分辨率。技术的简易性和所要求的最低限度的样本制备是重要的优点。
在斜面照明显微术中，从侧面照明样本。这得到3维外观图像，并且可以其他方式凸显不可见的特征。基于该方法的最近技术是Hoffmann的调制对比，是用于细胞培养基于倒置显微镜的系统。尽管斜面照明受到与明视野显微术相同的限制(许多生物样本的低对比度；归因于离焦目标的低表观分辨率)，其可以其他方式凸显不可见的结构。
暗视野显微术是用于提高未染色的透明样本的对比度的技术。暗视野照明使用小心对准的光源来最小化进入图像平面的直接透射(未散射)光的量，从而只收集样本散射的光。暗视野可以明显提高图像对比度(特别是透明目标)，同时几乎不需要设备设置或样本制备。然而，该技术的缺点是许多生物样本的最终图像中低的光强度，并且继续受到低表观分辨率的影响。
相差是将穿过透明样本的光的相移转换为图像亮度变化的光学显微术照明技术。换言之，相差将折射率差异显示为对比度差异。相移本身对于人眼是不可见的，但是当它们显示为亮度变化时变得可见。
在微分干涉差(DIC)显微术中，光密度差异将显示为浮凸(relief)差异。该系统由聚光器中分裂普通和异常光束中的光的特殊棱镜(Nomarski棱镜、Wollaston棱镜)组成。两个光束之间的空间差异最小(小于物镜的最大分辨率)。在穿过样本之后，通过物镜中的类似棱镜使光束重聚。在同质样本中，两光束之间没有差异，并且没有产生反差。然而，在折射边界附近(例如细胞质内的核)，普通和异常光束之间的差异将产生图像浮凸。微分干涉差需要偏振光源发挥功能；两个偏振滤光片必须在光路中拟合，一个在聚光器之下(偏振器)，另一个在物镜之上(分析器)。
另一种使用干涉的显微镜技术是干涉反射显微术(还称为反射干涉对比或RIC)。其使用窄范围波长的偏振光在具有不同的折射率的两种物质之间存在界面时反射而用于检查细胞与玻璃表面的粘附。当细胞附着于玻璃表面时，来自玻璃的反射光和来自附着细胞的反射光将干涉。如果没有细胞附着于玻璃，则没有干涉。
荧光显微镜是利用荧光和磷光替代或附加反射和吸收来研究有机或无机物质性质的光学显微镜。在荧光显微术中，用在样本中激发荧光的波长的光照明样本。然后通过显微镜物镜对通常比照明更长的波长的荧光成像。该技术中可以使用两个滤光片；确保照明接近单色并且在正确波长的照明(或激发)滤光片，和确保没有激发光源到达检测器的第二发射(或屏障)滤光片。可选地，这些功能都可以通过单个二向色滤光片完成。“荧光显微镜”指利用荧光产生图像的任何显微镜，无论它是较简单装置如落射荧光显微镜，还是较复杂设计例如共聚焦显微镜，其利用光学切片以获得荧光图像的更好分辨率。
共聚焦显微术利用检测器前光学共轭平面中的点照明和针孔来消除离焦信号。由于仅可以检测极靠近焦平面的荧光产生的光，图像的光学分辨率(特别是在样本深度方向)比宽视野显微镜好得多。然而，由于许多来自样本荧光的光在针孔处被阻断，所以该增加的分辨率以降低的信号强度为代价因此经常需要长时间暴露。由于每次仅照明样本中的一个点，所以2D或3D成像需要在样本中规则光栅上扫描(即，平行扫描线的矩形图形)。可获得的焦平面厚度主要由使用的光波长除以物镜的数值孔径来确定，但也由样本的光学性质确定。薄的光学切片可能使这些类型的显微镜在样本的3D成像和表面轮廓方面特别好。
在单平面照明显微术(SPIM)(还称为光片显微术)中，仅检测物镜的焦平面中的荧光团被照明。光片是在一个方向准直并且在另一方向聚焦的光束。因为没有荧光团在检测器的焦平面外发射，所以该方法还提供了内在的光学切片。而且，当与常规显微术比较时，光片方法表现出减少的光漂白和较低的光毒性，并且经常实现每个样本明显更多的扫描。通过旋转样本，该技术可以实际上用从不同角度获得的多个视角对几乎任何平面成像。然而，对于每个角度，仅样本的相对浅部分以高分辨率成像，而较深区域逐渐显得模糊。
超分辨率显微术是光学显微术的一种形式。由于光的衍射，常规光学显微术的分辨率受到限制，如Ernst Abbe(1873)所述。可获的分辨率的好的近似值是点扩展函数的FWHM(半高全宽)，并且具有高数值孔径和可见光的精确宽视野显微镜通常达到约250nm的分辨率。超分辨率技术允许捕获具有比衍射限值更高分辨率的图像。它们属于两个宽类别，捕获渐逝波中含有的信息的“真实”超分辨率技术，和使用实验技术和被成像以重构超分辨率图像的物质的已知限制的“函数”超分辨率技术。
激光显微术利用各种形式显微术的激光照明源。例如，在许多技术中，集中于生物应用的激光显微术利用超短脉冲激光或飞秒激光，所述技术包括非线性显微术、饱和显微术和多光子荧光显微术例如两光子激发显微术(允许活组织成像达极高深度例如1毫米的荧光成像技术)。
在电子显微术(EM)中，使用电子束照明样本并产生放大图像。电子显微镜比光能光学显微镜具有更大的分辨能力，因为电子波长比可见光(光子)短约100,000倍。它们可以实现好于50pm的分辨率和高达约10,000,000x的放大，而普通的非共聚焦光学显微镜受到衍射限制为约200nm分辨率和低于2000x的有用放大。电子显微镜利用静电和电磁“镜片”来控制电子束并使其聚焦以形成图像。这些镜片是类似于但也不同于通过在样本上或透过样本聚焦光而形成放大图像的光学显微镜的玻璃镜片。使用电子显微镜观察宽范围的生物和无机样本，包括微生物、细胞、大分子、活检样本、金属和晶体。工业上，常用电子显微镜来进行质量控制和失败分析。电子显微术的实例包括透射电子显微术(TEM)、扫描电子显微术(SEM)、反射电子显微术(REM)、扫描透射电子显微术(STEM)和低压电子显微术(LVEM)。
扫描探针显微术(SPM)是使用扫描样本的物理探针形成表面的图像的一类显微术。通过在样本的光栅扫描中逐条线地机械移动探针并记录作为位置函数的探针表面相互作用来获得表面的图像。SPM的实例包括原子力显微术(ATM)；弹道电子发射显微术(BEEM)；化学力显微术(CFM)；传导原子力显微术(C-AFM)；电化学扫描隧道显微术(ECSTM)；静电力显微术(EFM)；流体力显微镜(FluidFM)；力调制显微术(FMM)；特征定向扫描探针显微术(FOSPM)；开尔文探针力显微术(KPFM)；磁力显微术(MFM)；磁共振力显微术(MRFM)；近场扫描光学显微术(NSOM)(或SNOM，扫描近场光学显微术(SNOM)；压电响应力显微术(PFM)；PSTM，光子扫描隧道显微术(PSTM)；PTMS，光热显微分光镜术/显微术(PTMS)；SCM，扫描电容显微术(SCM)；SECM，扫描电化学显微术(SECM)；SGM，扫描门控显微术(SGM)；SHPM，扫描霍尔探针显微术(SHPM)；SICM，扫描离子电导显微术(SICM)；SPSM，旋转偏振扫描隧道显微术(SPSM)；SSRM，扫描扩展抗性显微术(SSRM)；SThM，扫描热显微术(SThM)；STM，扫描隧道显微术(STM)；STP，扫描隧道电势测定法(STP)；SVM，扫描电压显微术(SVM)；和同步加速器x射线扫描隧道显微术(SXSTM)。
试剂和试剂盒
还提供了用于实施上述方法的一种或多种的试剂及其试剂盒。试剂和试剂盒可以包括以下的一种或多种：固定剂；水凝胶亚基；清洁试剂；检测大分子，例如，标记的和或未标记的抗体、核酸探针(寡核苷酸、载体等)、化学品等；缓冲液，例如用于固定、洗涤、清洁和/或使样本染色的缓冲液；封固剂；包埋模具；解剖工具；等。本试剂及其试剂盒可以有很大变化。
还提供了已经通过用于例如在细胞和亚细胞水平研究组织中使用的本发明方法制备的样本。例如，提供了用于研究感兴趣的基因的表达、筛选以鉴定靶向感兴趣的细胞和/或亚细胞结构的候选剂等的固定且聚合的样本或已经被固定、聚合并清洁的样本。这种制备的样本还可以作为本文描述的试剂盒或系统之一中的阳性对照而提供。
除了上述组分，本发明试剂盒还可以包括用于实施本发明方法的说明书。这些说明书可以多种形式存在于本发明试剂盒中，其一种或多种可以存在于试剂盒中。其中这些说明书可以存在的一种形式是作为在适当介质或基底上打印的信息，例如上面打印信息的一张或多张纸，试剂盒包装中，包装说明书中，等等。而另一种方式是其上已经记录信息的计算机可读介质，例如磁盘、CD、数字储存介质等。而可以存在的另一种方式是可通过因特网使用以在移动位置访问信息的网址。任何常规工具可以存在于试剂盒中。
设备和系统
还包括用于进行本发明方法的各方面的设备。本发明设备可以包括例如电泳装置、超声、微波、针、管子、灌注泵等，用于固定、清洁和/或使样本染色。
特别感兴趣的一种设备是适合用于从样本去除细胞组分，例如不与水凝胶网络交联的细胞组分的电泳设备。所谓“电泳”意指将电场施加于样本，例如生物样本。电泳最常用于使样本中的生物大分子例如核酸、蛋白质运动以分离和分析那些大分子。已经开发了许多电泳技术，包括毛细管电泳、凝胶电泳、纸电泳和免疫电泳。例如，在凝胶电泳中，使用诸如琼脂糖或聚丙烯酰胺等化合物形成水凝胶。含有所需大分子的混合物被放置(或上样)到凝胶一端，然后使凝胶与液体缓冲液接触。该液体缓冲液含有盐，其溶解时在缓冲液内形成离子。例如当与电泳缓冲液接触时，生物分子通常带电荷。例如，DNA在常用电泳缓冲液中带负电荷，因为其骨架中含有磷酸基团。因此，当电流施加于凝胶末端时，生物分子从一端向另一端移动通过凝胶。凝胶电泳的电泳设备和方法的实例可以参见例如美国专利号3129158、3208929、3346479、3375187、3616454、3616457、3616454、3616457、3563880、3576727、3674678、3865712、4088561、4151065、4292161、4339327、4375401、4415418、4479861和4588491；和Martin，Robin.Gel electrophoresis:nucleic acids.BIOS Scientific，1996；Hames，B.D.Gel Electrophoresis of Proteins:A Practical Approach，Oxford University Press 1998；和Burmeister,M.和Ulanovsky,L.Pulsed-field Gel Electrophoresis，The Humana Press Inc.1992，其公开内容通过引用并入本文。
适合用于本发明方法的电泳设备一般包括在其中可以放置缓冲溶液和水凝胶包埋的样本的电泳室。参见例如图2和图8。电泳室一般可以是任何适当尺寸以容纳水凝胶包埋的感兴趣的样本，并且可以由在室内保持溶液的任何材料构成，例如玻璃和塑料，例如丙烯酸树脂、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯、聚氟乙烯、聚丙烯、聚氨酯、聚乙烯对苯二甲酸酯、聚四氟乙烯等。在一些实施方案中，对于特定应用适当时，室可以由树脂或硬塑料模制或机械加工或以其他方式形成。在某些实施方案中，电泳室还可以包括被配置支持电泳室内的水凝胶包埋的样本的组件，例如平台。
在一些实施方案中，电泳设备可以包括安装在电泳室上以封闭该室的盖子。根据本发明实施方案的盖子可以包括当盖子与室偶联时与电泳室主体形成液体密封和/或空气密封的封条。在一些实施方案中，一个或多个密封组件可以附接至盖子，附接至室，或者附接至盖子和室两者。当盖子偶联至室时，密封组件可以形成液体和/或空气密封。
根据本发明一些实施方案的电泳设备可以包括与电泳室可操作连接的两个或多个相反极性的电极(即，“阳极”(带负电)和至少一个“阴极”(带正电))，可向其施加电流以在室内产生电场。电极可以由在电流施加至电极时导致电场建立的任何材料构成，并且可以促进跨其中放置的样本建立电场的任何方便的方式配置在室内和相对于样本放置的位置，例如核酸或蛋白质电泳领域公知的。参见例如美国专利号3129158、3208929、3346479、3375187、3616454、3616457、3616454、3616457、3563880、3576727、3674678、3865712、4088561、4151065、4292161、4339327、4375401、4415418、4479861和4588491；和Martin,Robin.Gel electrophoresis:nucleic acids.BIOS Scientific，1996；Hames,B.D.Gel Electrophoresis of Proteins:A Practical Approach，Oxford University Press 1998；和Burmeister,M.和Ulanovsky,L.Pulsed-field Gel Electrophoresis.The Humana Press Inc.1992。例如，电极可以配置在室内以便基本上在样本侧面。
在一些实施方案中，一个或多个电极可以包括用于放大电极之间产生的电场大小的扩展组件。例如，在某些实施方案中，电极可以包括电极弯曲部分的形式的扩展组件，所述弯曲部分自身回折形成多个S形弯曲。包括弯曲扩展组件的电极的实例可以参见图2的图c(标号103a和103b)。扩展组件放大当电压施加至电极时产生的电场的大小，使得整个三维组织样本可以置于电场内。可以按需要调整扩展组件的长度和宽度以容纳各种尺寸的组织样本。例如，在某些实施方案中，如图8的图e所示，包括扩展组件的电极的长度和宽度大致相等。
在某些实施方案中，电泳室可以被例如固体分隔物或空气分隔成两个不同区域，其中每个区域包括缓冲液中的一个电极，并且样本置于缓冲液内以使样本横跨或跨过两个区域，使得电极产生的电场通过样本产生。在一些情况下，室可以包括在其上或其内放置水凝胶包埋的样本的平台或支持结构，例如在两个电极之间的平台、横跨包括电极的室的区域的平台，等。
电泳装置可以可操作连接至可以给电极施加电压的电源。在一些情况下，电源可以与电泳装置分开，即，电泳装置可以是与电源分开的模块。在其他情况下，电源可以集成到电泳装置中，即，电泳装置会包括电源。
在一些情况下，可能希望更换或再循环电泳室内的缓冲液。所谓“循环的”或“再循环的”缓冲液意指从室去除缓冲液，然后例如在穿过冷却单元(冷藏单元，冰浴等)、加热单元、过滤器等之后返回室。所谓“更换”意指从室去除缓冲液并在其位置添加新鲜缓冲液。例如，可能希望控制电泳室内缓冲液的温度(例如，以防止室达到可能引起水凝胶解聚或样本内生物分子变性的温度，例如35℃或更高、40℃或更高、或50℃或更高、60℃或更高、70℃或更高、80℃或更高、90℃或更高、或100℃或更高)；以在缓冲液排出样本时去除大分子；以改变缓冲液离子强度；等。为此目的，电泳装置可以任选包括缓冲液可以通过其进入和/或排出室的一个或多个孔。在一些情况下，室可以包括两个或多个孔，例如，缓冲液通过其进入室的第一孔和缓冲液通过其排出室的第二孔。
可以通过使用一个或多个孔和任选的管子、泵、阀或任何其他适当流体操作和/或流体操纵设备，例如与设备的一个或多个组件可去除地附接或永久附接的管子，来添加/去除/再循环/更换缓冲液。例如，具有第一和第二末端的第一管子可以附接至第一孔，并且具有第一和第二末端的第二管子可以附接至第二孔，其中第一管子的第一末端附接至第一孔，并且第一管子的第二末端可操作连接至接收器等，例如冷却单元、加热单元、过滤单元、废物接收器等；并且第二管子的第一末端附接至第二孔，并且第二管子的第二末端可操作连接至接收器，例如冷却单元、冰上烧杯、过滤单元、废物接收器等。
作为另一实例，具有第一和第二末端的一个管子可以可去除地附接至第一和第二孔，即，管子的第一末端与第一孔可去除地附接，并且管子的第二末端与第二孔可去除地附接，其中管子可操作连接至例如冷藏单元(例如，穿过该装置的管子)、过滤器(例如，管子包括过滤器)、缓冲液贮器(例如，管子通过例如分离器从贮器接收更换缓冲液)等。在一些情况下，管子还与泵可操作连接，所述泵例如蠕动泵、电渗透泵、震荡泵、隔膜泵等，其会促进液体通过管子的移动，促进从电泳室添加/去除/再循环缓冲液，等。以此方式，电泳装置可以与冷却单元、加热单元、过滤单元、缓冲液贮器/接收器、泵等可操作连接。在一些实施方案中，冷藏单元、加热单元、过滤单元、缓冲液贮器/接收器、泵等会集成到电泳装置中。换言之，电泳装置可以包括冷藏单元、加热单元、过滤单元、缓冲液贮器/接收器、泵等。在其他实施方案中，冷藏单元、加热单元、过滤单元、缓冲液贮器/接收器、泵等可以是与电泳装置分开的模块。
现在转向图2，显示了代表性的电泳组织清洁设备。示例设备101包括盖子102、第一电极103a、第二电极103b、基底104、出口孔105、入口孔106、第一电极连接头107a和第二电极连接头107b。
本公开还提供了用于进行本发明方法的系统。系统可以包括一个或多个本文描述的模块，例如电泳装置、电源、冷藏单元、加热单元、泵等。系统还可以包括本文描述的任何试剂，例如固定剂；水凝胶亚基；清洁试剂；检测大分子，例如抗体、核酸探针(寡核苷酸、载体等)、化学品等；缓冲液，例如，用于固定、洗涤、清洁和/或使样本染色的缓冲液；封固剂；包埋模具；等。根据某些实施方案的系统还可以包括显微镜和/或相关的成像设备，例如照相机组件、数字成像组件和/或图像捕获设备、配置成收集根据一个或多个用户输入的图像的计算机处理器等。
应用
使用本发明方法、试剂、试剂盒、系统和设备，普通技术人员能够制备供显微镜分析的任何生物组织。可以使用方法、试剂、试剂盒、系统和设备来从任何植物或动物制备样本，所述动物包括但不限于转基因动物，例如脊椎动物或无脊椎动物，例如昆虫、蠕虫、非洲爪蟾、斑马鱼；哺乳动物，例如马、牛、羊、犬、猫、鼠；啮齿类动物；非人灵长类或人。组织样本可以从活受试者收集(例如，活检样本)，或者可以从死受试者收集(例如，验尸或尸检样本)。样本可以是任何组织类型，例如造血、神经(中枢或外周)、神经胶质、间质、皮肤、黏膜、基质、肌肉(骨骼肌、心肌或平滑肌)、脾、网状内皮、上皮、内皮、肝、肾、胰、胃肠、肺、成纤维和其他细胞类型。在一些情况下，样本是整个生物体，例如蠕虫、昆虫、斑马鱼。在其他情况下，样本是完整器官，例如啮齿类动物的全脑。在其他情况下，样本是器官的一部分，即，活检，例如移植组织的活检。样本可以是新鲜分离的或者保存的，例如快速冷冻的。在一些实施方案中，样本可以是之前保存的样本，例如来自组织库的保存样本，例如获自组织收集程序的人脑的保存样本。在一些情况下，样本可以来自已知罹患指定疾病或病症的受试者，例如来自孤独症人的脑组织的样本。在其他情况下，样本可以来自没有罹患特定疾病或病症的“正常”受试者。在一些情况下，样本可以来自转基因受试者，例如转基因小鼠。
因为样本的细胞与物理上支持组织的超微结构的水凝胶交联，所以正常提供结构支持但是阻碍亚细胞蛋白质和分子显现的细胞组分例如脂质可以被去除，同时保持细胞和组织的3维构造。该去除使得生物样本内部基本上可透过光和/或大分子，允许样本内部，例如细胞和亚细胞结构在显微镜下可视，而无需耗费时间且破坏性的组织切片。该程序也比本领域常用的程序更快速，因为通常以单独步骤进行的清洁和透化可以组合在去除细胞成分的单一步骤中。此外，样本可以反复染色、未染色和用其他试剂复染色以供全面分析。
本发明方法有许多用途。例如，本发明方法可用于制备供研究中枢神经系统连通性的样本。如本文使用的“连通性”一般意指神经元之间的连接，并且包括单细胞水平的连接，例如突触、轴突末端、树突棘等，以及神经元组和作为主要轴突束的CNS区域之间的连接，例如胼胝体(CC)、前连合(AC)、海马连合(HC)、锥体交叉、锥体束、外囊、内囊(IC)、大脑脚(CP)等。全脑和/或脊髓样本或其区域(例如大脑(即，大脑皮质)、小脑(即，小脑皮质)、前脑的腹侧区(例如纹状体、尾状核、壳核、苍白球、伏核；隔核、丘脑下核)；丘脑和下丘脑的区域和核；深部小脑的区域和核(例如，齿状核、小脑球状核、栓状核、顶核)和脑干(例如黑质、红核、脑桥、橄榄核、颅神经核)；和棘区域(例如前角、侧角、后角))可以通过本发明方法死后制备，并且其中的神经元连通性通过显微镜分析，例如获得、储存、提供、使用和驱动，例如以提供脑例如人脑在死亡之后的完全连通性。此类研究会极大促进对脑如何发育并在健康时和疾病期间发挥功能，以及认知和个性的基础的理解。
作为另一实例，本发明方法可用于评价、诊断或监控疾病。如本文使用的“诊断”一般包括预测受试者对疾病或病症的易感性，确定受试者目前是否受到疾病或病症影响，预后受疾病或病症影响的受试者(例如，鉴定癌症状态、癌症阶段、患者因癌症死亡的可能性)，预测受试者对疾病或病症治疗的响应性(例如，对例如同种异体造血干细胞移植、化疗、放疗、抗体疗法、小分子化合物疗法的正响应、负响应、完全无响应)和therametric的使用(例如，监控受试者的病状以提供有关疗法的效果或功效的信息)。例如，可以从癌组织制备活检并进行显微镜分析以确定癌症类型，癌症发展程度，癌症是否对治疗性介入响应，等。
作为另一实例，活检可以从患病组织例如肾、胰腺、胃等制备，以确定组织病状，疾病发展程度，治疗成功的可能性等。术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等在本文使用，一般意指获得想要的药理和/或生理效果。效果在完全或部分防止疾病或其症状方面可以是预防性的，和/或在部分或完全治愈疾病和/或归因于疾病的不良反应方面可以是治疗性。如本文使用的“治疗(treatment)”覆盖哺乳动物中疾病的任何治疗，并且包括：(a)防止疾病在易患该疾病但还没有被诊断患有该疾病的受试者中发生；(b)抑制疾病，即，停止其发展；或者(c)减轻疾病，即，引起疾病退化。治疗剂可以在疾病或损伤发生之前、期间或之后施用。正在进行的疾病的治疗是特别受关注的，其中所述治疗稳定或减少患者的不良的临床症状。此类治疗希望在受影响组织中功能完全丧失之前进行。本发明疗法希望在疾病的有症状阶段施用，并且在一些情况下在疾病的有症状阶段之后施用。术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文可互换使用并指希望诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物受试者，特别是人。适合使用本发明方法和系统评价、分析、诊断、预后和/或治疗的疾病的实例包括但不限于癌症、免疫系统病症、神经精神疾病、内分泌/生殖疾病、心血管/肺部疾病、肌肉骨骼疾病、胃肠疾病等。
类似地，本发明方法可用于监控组织移植物以确定受试者接受移植器官/组织，例如心脏、肾、肝或其他器官的情况。在此类情况下，可以通过本发明方法制备移植器官的活检，并且通过显微镜分析样本的例如组织完整性、组织血管化、免疫细胞侵润等。
本发明方法还可以用于评价正常组织、器官和细胞，例如以评价正常组织样本，例如获自不知道罹患特定疾病或病况的组织样本的细胞和组织之间的关系。本发明方法可用于探究例如胎儿发育期间，例如神经系统发育和成熟期间细胞和组织之间的关系，以及探究发育完全之后细胞和组织之间的关系，例如完全发育的成年样本的神经系统的细胞和组织之间的关系。在一些实施方案中，本发明方法可以用于从转基因动物收集的样本，以探究基因变化对特定细胞、组织和/或器官的发育和/或功能的作用。
本发明方法还提供了用于筛选候选治疗剂对组织或疾病的作用的有用系统。例如，受试者例如小鼠、大鼠、狗、灵长类动物、人等可以与候选剂接触，器官或其活检可以通过本发明方法制备，并且制备的样本经显微镜分析一个或多个细胞或组织参数。参数是细胞或组织的可定量的组分，特别是可以希望在高通量系统中准确测量的组分。参数可以是任何细胞组分或细胞产物，包括细胞表面决定子、受体、蛋白质或其构象或翻译后修饰、脂质、碳水化合物、有机或无机分子、核酸(例如mRNA、DNA等)或从此类细胞组分衍生的部分或其组合。虽然大部分参数会提供定量读数，但在一些情况下，半定量或定量结果将是可接受的。读数可以包括单个测定值，或者可以包括平均值、中值或方差等。典型地，可以从相同测定的多次重复获得每个参数的一系列参数读数值。可变性是预期的，并且使用标准统计方法会获得测试参数组的每一个的一系列值，其中常用统计学方法用于提供单个值。因此，例如，一种此类方法可以包括检测细胞活力、组织血管化、免疫细胞侵润物的存在、改变疾病进展的效力，等。在一些实施方案中，筛选包括将分析的参数与来自对照或参照样本的那些对比，所述对照或参照样本例如从未与候选剂接触的受试者类似制备的样本。用于筛选的感兴趣的候选剂包括已知和未知的化合物，其涵盖许多化学类别，主要是有机分子，其可以包括有机金属分子、无机分子、基因序列等。用于筛选的感兴趣的候选剂还包括核酸，例如，编码siRNA、shRNA、反义分子或miRNA的核酸，或者编码多肽的核酸。本发明的一个重要方面是评价候选药物，包括毒性测试；等。使用本发明方法评价组织样本可以包括例如遗传学、转录组学、基因组学、蛋白质组学和/或代谢物组学分析。
本发明方法还可以用于以亚细胞分辨率显示完整组织中基因编码的标志物的分布，例如染色体异常(倒位、复制、易位等)，遗传杂合性缺失、指示疾病或良好健康倾向的等位基因的存在、对疗法响应的可能性、祖先等。例如，此类检测可用于例如上述诊断和监控疾病，个体化用药和研究亲子关系。
材料和方法
以下材料和方法用于以下实施例。
用于小鼠脑的CLARITY方法：
将成年小鼠(4-12周龄)用Beuthenasia-D麻醉，并用4重量％多聚甲醛/4％丙烯酰胺(重量/体积)/0.025％双-丙烯酰胺(重量/体积)/0.25％VA044(重量/体积)/PBS的混合物经心脏灌注。然后，在4℃下相同溶液中提取并孵育脑3天。在接下来的步骤中，使溶液的温度升至37℃以开始聚合。在37℃下3小时孵育之后，将水凝胶包埋的脑放入电泳室。在通过室循环含有4％SDS(重量/体积)的硼酸钠缓冲液(200mM，pH 8.5)的同时，在50℃下跨脑施加10-40V，持续两天。清洁之后，将脑在37℃下PBS缓冲液中孵育两天以从脑去除SDS。为了制备1mm厚的小鼠脑的冠状块供免疫染色，使用小鼠脑基质(目录号15003，Ted Pella,inc.,Redding，CA)将水凝胶包埋且经清洁的脑切成1mm厚的块。然后如上所述，通过电泳清洁块持续一天。
用于死后人脑组织的CLARITY方法：
使用振动切片机将死后人脑组织(孤独症病例，#AN13961；年龄，7岁；性别，男；储存，室温下10％福尔马林中82个月)的额叶(布罗德曼第10区)切成500μm厚的块。将块在4℃下于4重量％多聚甲醛/4％丙烯酰胺(重量/体积)/0.025％双-丙烯酰胺(重量/体积)/0.25％VA044(重量/体积)/PBS的混合物中孵育一周。接下来，使溶液的温度升至37℃以开始聚合。在37℃下三小时孵育之后，将水凝胶包埋的组织放入定制的电泳室(参见图2和图8)。在通过室循环含有4％SDS(重量/体积)的硼酸钠缓冲液(200mM，pH 8.5)的同时，在50℃下跨组织施加10-40V持续一天。清洁之后，将经清洁的组织在37℃下于PBS中孵育一天以去除SDS。
CLARITY处理的小鼠脑组织的免疫染色：
为了GFP染色，将经清洁的Thy1-EYFP H系小鼠(两月龄)脑的1mm厚的块在37℃下于0.1％Triton X-100(重量/体积)/与AlexaFluor 594(目录号A21312，Invitrogen，Carlsbad，CA，1：50稀释)偶联的抗GFP抗体/1M硼酸钠缓冲液(pH 8.5)溶液中孵育两天，随后在37℃下用0.1％Triton X-100(重量/体积)/1M硼酸钠缓冲液(pH 8.5)洗涤一天。为了其他染色，将经清洁的Thy1-EYFP H系小鼠(两月龄)的1mm厚的块在37℃下于0.1％Triton X-100(重量/体积)/一抗(稀释，1：501：100)/1M硼酸钠缓冲液(pH 8.5)溶液中孵育两天，随后在37℃下用0.1％Triton X-100(重量/体积)/1M硼酸钠缓冲液(pH 8.5)洗涤一天。然后将组织在37℃下在0.1％Triton X-100(重量/体积)/二抗(稀释，1：501：100)/1M硼酸钠缓冲液(pH 8.5)溶液中孵育一天，随后在37℃下用0.1％TritonX-100(重量/体积)/1M硼酸钠缓冲液(pH 8.5)洗涤一天。
CLARITY处理的死后人脑组织的免疫染色：
经清洁的500μm厚的块在37℃下于0.1％Triton X-100(重量/体积)/一抗(稀释，1：501：100)/1M硼酸钠缓冲液(pH 8.5)溶液中孵育一天，随后在37℃下用0.1％Triton X-100(重量/体积)/1M硼酸钠缓冲液(pH 8.5)洗涤半天。然后将组织在37℃下于0.1％Triton X-100(重量/体积)/二抗(稀释，1：501：100)/1M硼酸钠缓冲液(pH 8.5)溶液中孵育一天，随后在37℃下用0.1％Triton X-100(重量/体积)/1M硼酸钠缓冲液(pH 8.5)洗涤半天。
CLARITY处理的小鼠脑组织的成像：
为了使完整的Thy1-EYFP H系小鼠脑成像，将经清洁的脑(三月龄)在水基浸没介质FocusClearTM中孵育两天。然后将脑包封在两个盖玻片底培养皿之间。首先使用配有10x水浸物镜(Leica HCX AOP L，NA＝0.30，工作距离＝3.6)和514nm激发的Leica SP5系统使脑的背侧半成像(堆栈尺寸＝3.4mm，步长＝10μm)。然后反转固定的脑，并以相同方式成像腹侧半。
为了获得从皮质到丘脑可视的3.4mm厚体积图像，如所述固定完整H系小鼠脑，并使用10x物镜和514nm激发成像(堆栈尺寸＝3.4mm，步长＝2μm)。
将免疫染色的1mm厚冠状块在FocusClearTM中孵育一天，并包封在盖玻片底培养皿和载玻片之间。使用10x物镜和单光子激发(514nm、591nm和654nm)使固定的样本成像。
CLARITY处理的死后人脑组织的成像：
将清洁并免疫染色的组织在FocusClearTM中孵育一天并如上所述固定。然后使用配有25x水浸物镜(Leica HCX IRAPO L，NA＝0.95，工作距离＝2.4)(堆栈尺寸＝500μm，步长＝0.5μm)的Leica SP5系统使组织成像。使用780nm激光激发Alexa Fluor 594。
蛋白质损失测量：
将六个PFA固定的成年小鼠(四周龄)脑(供4％SDS、Scale和Triton X-100处理)和两个(四周龄)PFA固定的/水凝胶包埋的脑(供CLARITY)切成1mm厚的冠状块。对每个PFA固定的脑的一半进行称重并放入2.5ml 4％SDS、ScaleU2(4M尿素和30％甘油的混合物)或0.1％TritonX-100溶液。将每个PFA固定的/水凝胶包埋的脑的一半放入2.5ml 4％SDS溶液。允许组织在37℃下于各自溶液中清洁一周，并使用BCA(双辛可宁酸)蛋白质测定测量通过扩散进入溶液而从组织损失的蛋白质的量；估计小鼠脑中的总蛋白质为10重量％。
神经突示踪：
使用Imaris软件(Bitplane,Inc)进行单个神经元的手工示踪。其细胞体定位于z-堆栈中间150μm的神经元被随机取样并选择用于示踪。通过用户定义的阈值半自动重构细胞体，其包括尽可能多的细胞体但小于5μm的任何树突。以“Surpass”模式以短线段手工示踪源于细胞体的所有神经突，并且在连接之前自动集中每个线段(有用户校正的机会)。手动计数相同细胞的纤丝之间互联的数目和来自示踪细胞以及任何其他细胞的纤丝之间互联的数目。非随机选择展现感兴趣结构的神经元并使用上述相同方法示踪。
水凝胶溶液制备：
1.组合并混合以下，特别注意温度和安全性防范。始终保持所有组分在冰上以防止聚合。
警告：多聚甲醛(PFA)是刺激剂、致敏剂、致癌剂和毒素。丙烯酰胺是强力的神经毒素、呼吸和皮肤致敏剂、致癌剂、刺激剂、诱变剂、致畸剂和生殖危害剂。可用于CLARITY的水凝胶的许多化学成分属于这些类别中的一个或多个。因此，为避免单体和/或交联剂(例如丙烯酰胺或PFA)的皮肤接触或吸入，必须在通风橱中使用个人防护装备(PPE)进行溶液制备和水凝胶溶液和聚合物的所有随后操作，所述个人防护装备(PPE)包括面罩、实验服、手套和不露脚趾的鞋。
对于400mL水凝胶单体溶液：
成分 添加： 最终浓度
丙烯酰胺(40％) 40mL 4％
Bis(2％) 10mL 0.025％
VA-044引发剂 1g 0.25％
10X PBS 40mL 1X
16％PFA 100mL 4％
dH2O 210mL 不适用
皂角苷(任选) 200mg 0.05％
总体积 400mL 不适用
皂角苷是广泛使用的温和的非离子型表面活性剂，其常用于以常规的免疫组织化学通透细胞膜。在CLARITY中，皂角苷可用于水凝胶单体输注过程以促进水凝胶单体和引发剂扩散进入组织，特别是对于其中心脏灌注不可行的样本，例如死后人组织和斑马鱼脑。皂角苷缩短了水凝胶单体输注过程所需的孵育时间。然而，可能形成可与皂角苷使用关联的气泡，因此不建议常规的皂角苷。
2.将40mL等份试样分配进入冰上的50mL锥形管。每个组织样本需要使用一个40mL管：20mL用于灌注，其余20mL用于样本包埋。
3.紧密密封管并在从通风橱取出它们之前保持在二级密封系统(secondary containment)(冰上)。将等份试样从冰上转移至-20℃。将这些溶液储存在-20℃，直至它们准备使用。它们可以长期储存在-20℃，只要所有组分在制备期间保持足够冷。
清洁溶液制备：
1.为避免皮肤接触或吸入，在通风橱中以适当PPE制备溶液。特别注意安全性，搅拌下合并水、硼酸和十二烷基硫酸钠(SDS)。添加NaOH，直至pH达到8.5。该溶液可以在室温制备、储存并使用。警告：SDS是毒素并且对皮肤和呼吸系统有刺激性。
对于10L清洁溶液：
成分 添加： 最终浓度
硼酸 123.66g 200mM
十二烷基硫酸钠 400g 4％
dH2O 填至10L 不适用
NaOH 至pH 8.5 不适用
总体积 10L 不适用
用水凝胶溶液经心脏灌注：
1.在灌注之前，将冷藏器中或冰上的冷冻的水凝胶单体溶液解冻。
2.当溶液完全解冻且透明(但依然冰冷)时，小心颠倒混合。保证没有沉淀，并且避免将任何气泡引入溶液。
3.在通风橱中制备灌注材料。
4.用Beuthanasia-D深入麻醉成年小鼠。
5.首先用20mL冰冷1X PBS、然后用20mL冰冷水凝胶溶液经心脏灌注动物。维持缓慢的灌注速率(20mL的每种溶液约2分钟)。
6.立即将组织(例如脑)放入50mL锥形管中20mL冷的水凝胶溶液中。保持溶液中的样本在冰上，直至它可以移至4℃冷藏器。
7.如果样本含有荧光团则将其覆盖在铝箔中，并在4℃孵育2-3天以允许水凝胶溶液进一步扩散进入组织。
水凝胶组织包埋：
1.使在干燥室(通风橱中)中含有你的样本的50mL锥形瓶脱气以用氮气替代管中所有气体(因为氧气阻碍水凝胶形成)，如下：
a.将50mL锥形管放在干燥室中的支架上。
b.将50mL锥形管旋开，足以允许气体更换。
c.打开氮气罐并调节控制阀，使得进入干燥室的入口被氮气填充。
d.将干燥室阀门从氮气流转向真空。
e.打开真空泵。通过测试室盖证实该室处于完全真空下。保持真空10分钟。
f.关闭真空并缓慢打开阀门以用氮气填充室。
g.小心打开室正好足以达到管，同时用氮气吹扫。非常小心地使暴露空气的程度最低，并且快速且紧密地关闭样本管。
2.使管在37℃室或孵育器中于旋转器上浸没入37℃水浴。孵育3小时或者直至溶液聚合。
3.在通风橱中，从凝胶提取包埋的样本(小心取出样本并用带手套的手指取出额外的凝胶条)。应该根据有关水凝胶单体和交联剂(例如丙烯酰胺和PFA)的所有公共机构、州和国家法规来进行水凝胶废物处理。
4.室温下用50mL清洁溶液洗涤样本24小时以透析出额外的PFA、引发剂和单体。在37℃下用50ml洗涤样本另外两次，每次持续24小时，以进一步减少残余的PFA、引发剂和单体。如生物危险物一样小心地处理该废溶液。
电泳组织清洁(ETC)：
1.构建ETC室。
a.将样本放入室内。
b.使用温度控制的循环器使清洁溶液穿过室循环，37-50℃下跨组织(例如脑)施加10-60V几天以清洁样本。清洁过程在较高电压和温度下较快，但是需要更高的功率，从而限制了由一个电源(通常功率输出最大值为300W)可同时操作的清洁装置的数目。例如，在37℃和30V下可以同时运行四个装置，而在50℃和60V下仅可以运行2个装置，因此应该选择循环器温度和电压以符合实际考虑。
2.几天之后，用PBST(1X PBS中0.1％TritonX)洗涤样本两次，每次24小时。
制备供成像的样本：
1.在成像之前在FocusClearTM或80％甘油溶液中孵育样本2天。这些溶液具有匹配CLARITY处理的组织的折射率。确保样本周围存在足够的溶液，并且不出现蒸发损失。使样本避光。
2.取干净的载玻片并将其小心放在无灰尘表面上。
3.使用带手套的手取一小块BluTack油灰并制备恒定直径的蠕虫形状。保持厚度均匀并且是样本厚度的约1.5倍(例如，如果样本是1mm，则使油灰管直径为1.5mm)。
4.水平跨越垂直载玻片放置两管油灰，在其间为组织样本留出空间。切掉突出载玻片的多余油灰。
5.使用刮刀，小心取样本并将其放在载玻片中间油灰管之间。吸取约20μl FocusClearTM介质在样本顶部。
6.将Willco盘小心放置(加盖的一侧向上)在油灰管顶部。小心且缓慢下压盘的玻璃部分(使手指保持在油灰上方以避免玻璃破碎)，直至与样本和FocusClearTM介质形成接触。确保样本、介质、载玻片和盘之间没有气泡。
7.现在使用P200移液管，将更多FocusClearTM小心引入密封室的任一侧(从围绕样本用于孵育的液体，因为其已经光学匹配)。极小心不要引入任何气泡。
8.现在，整个室用FocusClearTM填充，跨油灰、盘和载玻片之间的两个垂直开口使用PDMS密封剂(Kwik-Sil)以完全密封室并防止蒸发。
9.将铝箔放在室顶部并将其放在水平面上(避光以最小化光损害)。静置样本10-15分钟以允许PDMS封闭剂完全聚合。
10.现在准备好用于成像。
实施例
提供给以下实施例以向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开和描述，并且不旨在限制本发明人认为其发明的范围，也不旨在表示以下实验是进行的所有或唯一实验。已经努力确保有关所使用的数字(例如量、温度等)的准确性，但是应该考虑一些实验误差和偏差。除非另外指明，份是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，并且压力是或接近大气压。
实施例1：使完整组织成像的方法
开发了一种方法以使完整组织(包括完整器官/生物体)成像，供准确的三维(3-D)成像、免疫组织学、临床诊断和功能化。通过将组织包埋进物理支持组织的超微结构的纳米多孔水凝胶，然后电泳去除仅膜脂质，完整组织变得高度透明并且可透过大分子。该技术保持组织中的蛋白质、小肽、小分子和核酸处于其三维分布，由精细水凝胶网固定。通过避免破坏性的组织切片，可以分析亚细胞结构。此外，组织可以被反复染色、未染色和用其他试剂复染色以供全面分析。图1提供了称为“CLARITY”的方法的图解。图a：使用甲醛(红色)在水凝胶单体(蓝色)存在下使组织交联。在该方法中，甲醛使单体与生物分子共价连接，所述生物分子例如蛋白质、核酸和小分子。图b：接下来，将生物分子结合的单体聚合成水凝胶网。该水凝胶-组织杂交物理支持组织的结构并将生物分子化学并入进入水凝胶网。图c：接下来，跨浸入离子去污剂溶液的杂交体施加电场。图d：使用电泳以主动转运离子胶束进入杂交体并将仅膜脂质从组织提取出来，使得结构和交联的生物分子在适当的位置并可用于成像和分子表型分析。图e：可以使用抗体进行完整组织免疫染色。可以使用去污剂介导的抗体去除来对相同样本进行多轮免疫染色。
实施例2：用于CLARITY方法的设备和系统
开发了电泳组织清洁(ETC)室和相关组件(包括温度控制的缓冲液循环器、缓冲液过滤器和电泳电源)以进行实施例1中描述的CLARITY方法的部分。图2提供了设备和系统的图解。图a：ETC装置由常规ETC室、温度控制的缓冲液循环器(RE415，Lauda，Germany)、缓冲液过滤器(目录号4422K61，McMaster，Robbinsville，NJ)和电源(目录号164-5052，Biorad，Hercules，CA)组成。通过向电极施加20-60V对样本进行电泳。使缓冲溶液循环通过室以维持缓冲溶液的温度和组成在整个清洁过程中恒定。图b-d：ETC室设计。图b显示了代表性设备的各种视图，显示了圆柱形塑料外壳、入口/出口孔(目录号5463K245，McMaster，Robbinsville，NJ)和两个铂电极(目录号267201，Sigma，St.Louis，MO)。定位缓冲液入口和出口，使得通过室的缓冲液流有效去除由缓冲溶液的电泳产生的空气气泡。图c显示了该装配的组件。图d显示了顶部洞穿视图。将水凝胶包埋的组织放入位于两个电极之间的室中间的样本容器(CellStrainer，BD Biosciences，Durham，NC)。室外暴露的每个电极末端与电源连接。图8包括根据本发明实施方案的室的空间尺寸的实例。
实施例3：完整成年小鼠脑样本的成像
使完整成年小鼠脑样本经受CLARITY方法并成像。图3显示结果。图a-d：完整小鼠脑(三月龄)的图像，其中背景中有Ramony Cajal引用。图a：CLARITY之前。图b：CLARITY之后：水凝胶-组织杂交之后的Thy1-EYFP H系脑，ETC，和与FocusClearTM匹配的折射率(RI)。图c：图b中显示的相同脑的荧光图像。图d：固定完整经清洁的小鼠脑供成像。将脑包封在两个盖玻片之间。首先使用单光子(1P)激发显微术使脑的背侧半成像，然后将脑倒置并使腹侧半成像。图e：完整CLARITY处理的小鼠脑(三月龄)的3D重构，其使用10x水浸物镜(数值孔径(NA)＝0.3，工作距离＝3.6mm)和514nm激发成像。左，背侧半的重构(背侧至腹侧，堆栈尺寸＝3100μm，步长＝20μm)。右，腹侧半的重构(腹侧至背侧，堆栈尺寸＝3400μm，步长＝20μm)。比例尺，1mm。图f：非切片小鼠脑的3D重构，显示了通过所有皮质、海马和丘脑层的显现(10x物镜，堆栈尺寸＝3400μm，步长＝2μm，514nm激发)。比例尺，400μm。图g-l：来自图f不同深度的三个光学切片，显示甚至在约3400μm深度的可忽略的分辨率损失。比例尺，100μm。图g：z＝446μm。图h：z＝1683μm。图i：z＝3384μm。图j-l：分别是图g、h和i中的加框区域。图m：Thy1-ChR2-EYFP系的纹状体中轴突束的横截面图像，显示了CLARITY方法之后膜定位的ChR2-EYFP。1mm厚的冠状块经CLARITY处理并使用63x甘油浸物镜(NA＝1.3，工作距离＝280μm)成像。比例尺，5μm。图n：显示良好保存的CLARITY处理的Thy1-EYFP H系小鼠的皮质中锥体神经元的树突和树突棘的高分辨率图像。1mm厚的冠状块使用63x甘油物镜成像。比例尺，5μm。
实施例4：完整组织体积中的分子表型分析
使用CLARITY处理完整组织体积并使其经受分子表型分析。结果显示于图4。图a：蛋白质损失测量(参见方法)；误差线，标准误差；每种情况n＝4。图b：以完整非切片形式对GFP免疫染色的Thy1-EYFP小鼠的1mm厚的冠状块的体绘图，显示均匀的免疫染色。完整的块经ETC清洁一天并在37℃进行免疫染色三天(GFP抗体与Alexa594偶联两天，洗涤一天)。然后使用10x水浸物镜和1p激发(514nm和591nm)使块成像。左，EYFP(绿色)。中，抗GFP染色(红色)。右，重叠。比例尺，500μm。图c：皮质中加框区域的放大3D透视图，显示EYFP和抗GFP染色的完全重叠。图d：GFP染色的共定位分析。绘制Manders重叠系数(MOC)为组织深度的函数。右，来自左侧3D透视图的不同深度的两个光学切片。比例尺，100μm。图e-f：单个突触的鉴定。H系小鼠脑(两月龄)的500μm厚的冠状块被清洁一天并对突触蛋白I(红色)和PSD-95(绿色)免疫染色3天：一抗(1天)洗涤(0.5天)二抗(1天)洗涤(0.5天)。然后使用63x甘油物镜和单光子(1P)激发(514nm、591nm、651nm)使海马成像。图e：左，两个光学切片(z＝20μm和200μm)。右，加框区域的放大图像。可以在整个深度分辨个体突触斑点。EYFP为白色。图f：PSD-95斑点在z＝20μm(顶部)和z＝200μm(底部)的平均免疫荧光横截面。误差线指示平均值的95％的置信区间。图g：作为成像深度的函数的PSD-95斑点的平均免疫荧光横截面的半高全宽(FWHM)。接近恒定的跨深度FWHM表明分辨率损失是可忽略的。插图显示在z＝20μm和200μm的平均斑点。图h-i：小分子、蛋白质和核酸被良好保存、定位并且可以使用CLARITY转化组织中的分子探针来显现。图h：海马中的γ-氨基丁酸(GABA)和小白蛋白(PV)染色，显示GABA和PV的共定位。左，GABA。中，PV。右，重叠。野生型小鼠脑(三月龄)的500μm厚的冠状块被清洁一天并进行免疫染色三天：一抗(1天)洗涤(0.5天)二抗(1天)洗涤(0.5天)。然后使用25x水浸物镜(NA＝0.95，工作距离＝2.5mm)和单光子激发(488nm和591nm)使块成像。比例尺，20μm。图i：CLARITY转化小鼠脑块上的原位杂交(ISH)，显示纹状体中细胞体周围的多巴胺受体D2(drd2)mRNA定位(AP：-1.7；DV：-2.3；ML：2.6)。LV，侧脑室。蓝色，DAPI。drd2的50bp RNA探针与500μm厚的CLARITY处理的冠状块杂交并用FastRed显现。使用25x水浸物镜使块成像，对于FastRed使用单光子激发(555nm)，并且对于DAPI使用双光子激发(720nm)。比例尺：左，100μm；右，20μm。图j-k：小鼠脑的伏核(NAc)和尾状壳核(CPu)中的TH阳性神经元的轴突纤维。图j：1mm厚的小鼠脑块的3D透视图(前卤1.10->0.10)，针对TH(红色)和DAPI(绿色)染色。aca，前连合；比例尺500μm。图k：图j中NAc和aca的50μm体积的最大透射。比例尺，50μm。
实施例5：完整组织的多轮分子表型分析
使用CLARITY处理完整组织样本并经受多轮分子表型分析。结果显示于图5。图a：第一轮染色。以完整的非切片形式针对酪氨酸羟化酶(TH)免疫染色的Thy1-EYFP小鼠的1mm厚的冠状块(前卤-2.5mm)的体绘图。块被ETC清洁1天并进行免疫染色六天；一抗(2天)洗涤(1天)二抗(2天)洗涤(1天)。比例尺，500μm。图b：抗体洗脱。通过在60℃下于4％SDS溶液中孵育块0.5天而从图a所示的块洗脱成像的抗体。注意，TH信号被完全去除，同时保留EYFP的荧光信号。图c：第2轮染色。针对PV(红色)和GFAP(蓝色)免疫染色的相同块的3D透视图。使用DAPI(白色)复染细胞核。图d-f：分别在图a、b和c中的黄色加框区的100μm体积的最大投射。注意，EYFP阳性神经元以及细胞形态的模式是非常相似的；组织构造和细胞结构在多轮染色过程中良好保存。SNR，黑质；cp，大脑脚；比例尺，100μm。图g：图c中白色/点框区域的光学切片，显示强的DAPI信号。DG，齿状回；比例尺，100μm。图h-i：图a(图h)和图j(图i)中白色加框区域的TH通道。TH染色的模式和信号强度在第1轮和第3轮之间是相似的；抗原和抗原性在两个连续抗体洗脱过程之后被良好保存。比例尺，100μm。图j：第3轮染色。对图a-c中显示的相同块针对TH(红色)和ChAT(蓝色)进行免疫染色。图k：图c中海马的放大的3D视图，显示EYFP表达神经元(绿色)、PV阳性神经元(红色)和GFAP(蓝色)的分布。Alv，海马白质；比例尺，200μm。
实施例6：人脑样本的结构定位和分子表型分析
使用CLARITY处理人脑样本并经受结构定位和分子表型分析。结果显示于图6。图a-g、i、k：死后人脑(孤独症组织程序病例#AN13961；年龄，7岁；性别，男；PMI，25；储存，室温下10％福尔马林中82个月)的CLARITY处理的额叶(BA10)的免疫染色。500μm厚的完整块被清洁一天并进行免疫染色3天，如下：一抗(1天)洗涤(0.5天)二抗(1天)洗涤(0.5天)。使用25x水浸物镜使染色的块成像。图a：显示髓磷脂碱蛋白(MBP)和PV染色的光学切片。白色箭头指示围绕PV阳性投射的膜定位的MBP。比例尺，10μm。图b：TH和PV染色。120μm厚的体积图像的最大投射。步长，0.5μm；比例尺，50μm。图c：显示神经丝(NP)和GFAP染色的光学切片。比例尺，20μm。图d：促生长素抑制素和PV染色。63μm厚体积图像的最大投射。步长，0.5μm；比例尺，20μm。图e：NP-阳性轴突纤维的3D重构。红色，跨体积走行的示踪的轴突。比例尺，500μm；插图，加框区域的放大图像(比例尺，20μm)。图f：孤独症病例的新皮质中PV阳性神经元的显现。500μm厚的完整块如上所述被清洁并染色，并鉴别皮质下层。比例尺，500μm。图g：图f中黄色加框区域，显示层IV、V和VI中PV-阳性神经元细胞体和纤维。示踪了具有梯形异-或同-神经元连接的VI层中三个代表性的PV阳性中间神经元(绿色、紫色、蓝色)。比例尺，100μm。图h：图g中三个异常神经元的3D重构。比例尺，80μm。图i：8μm体积图像的放大的最大投射，显示了由单个神经元的神经突形成的梯形结构的形态细节。比例尺，10μm。图j：图i所示结构的示踪。图k：18μm体积图像的最大投射，显示了由两个不同神经元的神经突形成的梯形结构。比例尺，10μm。图l：图k所示结构的示踪。图m：显示每个神经元的同或异-神经元树突桥的条形图。随机选择神经元并以软件示踪(参见方法)；手工计数树突桥。**P<0.05；误差线，标准误差；对于孤独症病例的表面和深层都是n＝6。对于对照病例的表面和深层都是n＝4(#AN10251；年龄10岁；性别，男；PMI，19.83)。图n：孤独症病例的II层(表面)中神经元的3D重构；观察到异-树突接触的典型回避。
实施例7：GFP和TdTomato信号的保存
使用CLARITY处理转基因小鼠脑样本，并经受成像分析。结果显示于图7。图a：CLARITY处理的1mm厚的Thy1-EGFP M系小鼠脑块的3D透视图(前卤-1.6->-2.6)，显示了表达EGFP的神经元和投射的分布。比例尺，1mm。图b：与TdTomato报告系(B6；129S6-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J)杂交的PV-Cre小鼠系(B6；129P2-Pvalbtm1 (cre)Arbr/J)的1mm厚的小鼠冠状块的3D透视图。比例尺，1mm。图c：图a中300μm体积海马的最大投射，显示表达EGFP的神经元及其神经突。比例尺，50μm。图d：图b中组织的高分辨率光学切片，显示了皮质中表达TdTomato的神经元。比例尺，25μm。结果证明，GFP和TdTomato信号在CLARITY方法中被保存。
实施例8：电泳组织清洁(ETC)设备
设计并构建ETC设备以进行CLARITY方法。根据本发明的实施方案的ETC设备的一个实施例显示于图8。图a-d：代表性设备的各个视图，显示了圆柱形塑料外壳、入口/出口孔(目录号5463K245，McMaster，Robbinsville，NJ)和两个铂电极(目录号267201，Sigma，St.Louis，MO)。定位缓冲液入口和出口，使得通过室的缓冲液流有效去除由缓冲溶液的电泳产生的空气气泡。图e-h：该装配的组件和代表性设备的示例尺寸。所有尺寸以毫米计。图i-j：经图i(等角)和图j(顶视图)中设备的切片指示组装室中组件位置。将水凝胶包埋的组织放入位于两个电极之间室中间的样本容器(Cell Strainer，BD Biosciences，Durham，NC)中。室外暴露的每个电极的单个末端与电源连接。
实施例9：使用FocusClearTM和甘油的完整成年小鼠脑的光学组织清洁
使用CLARITY和FocusClearTM和甘油溶液处理完整成年小鼠脑样本。结果显示于图9。图a：室温下FocusClearTM中孵育两天的PFA固定的/水凝胶包埋的/非ETC清洁的小鼠脑(四周龄)的图像。图b：室温下FocusClearTM中孵育八天的图a所示的相同小鼠脑。图c：37℃下85％甘油中孵育四天的PFA固定的/水凝胶包埋的/非ETC清洁的小鼠脑(四周龄)的图像。图d：室温下85％甘油中孵育两天的PFA固定的/水凝胶包埋的/ETC清洁的小鼠脑(四周龄)的图像。
实施例10：CLARITY处理的样本的电子显微镜(EM)成像
使用CLARITY处理小鼠脑组织样本，然后使用电子显微术成像。结果显示于图10，并且说明CLARITY方法的EM相容性。用2重量％多聚甲醛/2重量％戊二醛/4％丙烯酰胺(重量/体积)/0.05％双-丙烯酰胺(重量/体积)/0.25％VA044(重量/体积)/PBS的混合物经心脏灌注Thy1-EYFP H系小鼠(4月龄)。水凝胶包埋的脑被ETC清洁四天。使用10x水浸物镜使经清洁的组织成像(图c显示3D透视图)。成像之后，将组织在室温下于1％四氧化锇(EMS目录号19100)中后固定1小时，用超滤水洗涤3次，然后在室温整体染色2小时。然后使样本在一系列乙醇洗涤中脱水，每次洗涤在4℃下持续15分钟(50％→70％→95％(因此允许样本温至室温)→100％(2次)→乙腈持续15分钟)。用与乙腈1：1混合的EMbed-812树脂(EMS目录号14120)侵润样本2小时，随后用2:1的EMbed-812:乙腈混合物浸润2小时。然后将样本放入EMbed-812中持续2小时，随后用新鲜树脂填充TAAB胶囊，然后放入65℃烘箱中过夜。切片在Leica Ultracut S(Leica，Wetzlar，Germany)上切割成介于75和90nm之间，并且在聚乙烯醇缩甲醛(formvar)/碳涂布的夹缝载网(EMS目录号FCF2010-Cu)或100目Cu载网(EMS目录号FCF100-Cu)上挑选。载网在3.5％UrAcetate/50％丙酮中对比染色30秒钟，随后在0.2％柠檬酸铅中染色30秒钟。在120kV下JEOL JEM-1400TEM中观察并且使用GatanOrius数字照相机拍照。图a：显示海马中有髓鞘的轴突的TEM图像。比例尺，100nm。图b：显示海马中的突触后密度(黄色箭头)的TEM图像。比例尺，200nm。图c：在EM样本制备之前经清洁的1mm厚Thy1-EYFP H系小鼠块的3D透视图。针对EM使用2％戊二醛固定的小鼠脑组织使用CLARITY清洁并成像。
实施例11：完整小鼠脑样本的分子表型分析
使用CLARITY处理完整小鼠脑样本并经受分子表型分析。结果显示于图11。图a：完整小鼠脑中TH阳性神经元及其纤维的3D免疫组织显现。完整脑被ETC清洁三天并染色六周：一抗(2周)洗涤(1周)一抗(2周)洗涤(1周)，并使用10x水浸物镜从腹侧在2500μm成像。比例尺，700μm。图b-d：不同深度的光学切片。注意，TH阳性神经元被良好标记，并且甚至在完整脑中2500μm深度清晰可见。CPu，尾状壳核；PO，视前核；VTA，腹侧被盖区；SNR，黑质；RR，retrorubral核；DR，中缝背核；比例尺，100μm。
实施例12：小鼠脑样本的前额皮质中轴突纤维的成像
使用CLARITY处理小鼠脑样本，并且使前额皮质中TH阳性神经元的轴突纤维成像。结果显示于图12。图a：针对TH(红色)和DAPI(绿色)染色的1mm厚小鼠脑块(前卤2.68->1.68)的3D透视图。块被ETC清洁1天并进行免疫染色六天：一抗(2天)洗涤(1天)二抗(2天)洗涤(1天)。PrL，缘前皮质；IL，下边缘皮质；比例尺，500μm。图b：缩小的3D透视图，显示IL/PrL中的TH纤维。比例尺，200μm。图c-e：图a中IL/PrL的50μm体积的最大投射。比例尺，200μm。图c：DAPI；图d：TH；图e：DAPI和TH；图f：图e中黄色加框区域，显示重度包被的细胞(白色箭头)和非神经支配的细胞(黄色箭头)。比例尺，100μm。
实施例13：小鼠脑样本的伏核和纹状体中轴突纤维的成像
使用CLARITY处理小鼠脑样本，并且使伏核和纹状体中TH阳性神经元的轴突纤维成像。结果显示于图13。图a：图4、图j中20μm体积CPu的最大投射。1mm厚的小鼠脑块(前卤1.10->0.10)被ETC清洁1天并进行免疫染色六天：一抗(2天)洗涤(1天)一抗(2天)洗涤(1天)。CPu，尾状壳核；aca，前连合；NAc，伏核；比例尺，50μm。TH(红色)和DAPI(绿色)。图b：图a中CPu的光学切片，显示被TH纤维重度包被的细胞。比例尺，50μm。
实施例14：小鼠脑样本的杏仁核中轴突纤维的成像
使用CLARITY处理小鼠脑样本并使杏仁核中TH阳性神经元的轴突纤维成像。结果显示于图14。图a-d：1mm厚的小鼠脑块(前卤-1.46.->-2.46)被ETC清洁1天并免疫染色六天：一抗(2天)洗涤(1天)二抗(2天)洗涤(1天)。图a-b：针对TH(红色)和DAPI(蓝色)染色的组织的3D透视图。BLA，基底外侧杏仁核；CeA，中杏仁体；Pir，梨状皮质；比例尺，300μm。图b：仅TH。图c-d：图a中100μm体积的最大投射。比例尺，200μm。图d：仅TH。
实施例15：使用CLARITY处理的组织体积中不同深度的PSD-95斑点的平均免疫荧光横截面的测量
使用CLARITY处理完整组织体积并在不同深度(0-200μm，20μm间隔)测量突触后密度(PSD)-95斑点的平均免疫荧光横截面。结果显示于图15。通过将圆霍夫变换应用于PSD-95图像的梯度场(定制Matlab软件)而评估PSD-95斑点在每个深度的平均荧光强度。这定位所有斑点的中心，半径范围从114nm至684nm(N在31和108之间)。对准中心以计算每个深度的平均斑点并计算横截面和半高全宽(参见图4，图g所示图形)。
实施例16：使用CLARITY处理的组织体积中不同深度的平均PSD-95斑点的测量
使用CLARITY处理完整组织体积并在不同深度(0-200μm，20μm间隔)测量平均突触后密度(PSD)-95斑点。结果显示于图16。比例尺，200μm。使用了实施例14描述的方法。
实施例17：小鼠脑组织中树突纤维和神经元细胞体的MAP2染色
使用CLARITY处理小鼠脑组织样本，并针对微管相关蛋白2(MAP2)染色。结果显示于图17，并且证明在1mm厚的小鼠脑组织中密集树突纤维和神经元细胞体的均匀标记。图a：针对MAP2染色的1mm厚的小鼠脑组织的3D透视图，其在神经元细胞体及其树突投射中表达。块被ETC清洁1天并进行免疫染色六天：一抗(2天)洗涤(1天)二抗(2天)洗涤(1天)。hf，海马沟；DG，齿状回；比例尺，300μm。图b：来自3D透视图的光学切片。比例尺，250μm。图c-d：DG中两个不同深度的高分辨率光学切片，显示了标记纤维的横截面。注意，树突纤维和弱标记的神经元细胞体的个体横截面(黄色箭头)可以在整个成像深度清楚鉴别。使用63x甘油浸物镜获取图像。比例尺，25μm。
实施例18：完整成年斑马鱼脑的分子成像
使用CLARITY处理完整成年斑马鱼脑，并经受分子表型分析。结果显示于图18。从213dpf(受精后天数)鱼提取成年斑马鱼脑，水凝胶杂交，并通过在4％SDS溶液中孵育15天而清洁。经清洁的脑用抗酪氨酸羟化酶(TH)一抗染色四天，然后用Alexafluor 594二抗染色三天。然后用25x水浸物镜使脑成像。3D体积数据(3,406×2,589×1,108μm；步长＝5μm)。红色，TH；蓝色，自发荧光；比例尺，100μm。
实施例19：来自孤独症患者的脑样本中PV阳性神经元的示踪
使用CLARITY处理来自孤独症患者的脑样本，并示踪新皮质中的PV阳性神经元。结果显示于图19。死后人脑(孤独症病例，#AN13961；年龄，7岁；性别，男；PMI，25；储存，室温下10％福尔马林中82个月)的前额叶(BA 10)的500μm厚的完整块被ETC清洁一天并针对小白蛋白(PV)进行免疫染色三天：一抗(1天)洗涤(0.5天)二抗(1天)洗涤(0.5天)。使用25x水浸物镜使染色的块成像。随机选择神经元，规定细胞体位于块的中间125μm，并且在Imaris软件中示踪。图a：显示皮质分层结构和示踪的PV阳性神经元的顶视图。PV，红色；比例尺，200μm。图b：仅示踪的神经元(顶视图)，显示皮质层中神经元(1-13)的相对位置。每个神经元的同-或异-神经元树突桥的数目可以参见下表1。图c：侧视图。图d：侧视图，仅示踪的神经元。
表1：图6、图f和图19中所示孤独症脑组织中14个PV阳性神经元的原始定量数据。
实施例20：来自正常受试者的脑样本中PV阳性神经元的示踪
使用CLARITY处理正常受试者的脑样本，并示踪新皮质中的PV阳性神经元。结果显示于图20。死后人脑(图19所示#AN13961的正常对照病例，#AN10251；年龄，10岁；性别，男；PMI，19.83)的前额叶(BA 10)的500μm厚的完整块被ETC清洁一天并针对小白蛋白(PV)进行免疫染色三天：一抗(1天)洗涤(0.5天)二抗(1天)洗涤(0.5天)。使用25x水浸物镜使染色的块成像。随机选择神经元，规定细胞体位于块的中间125μm，并且在Imaris软件中示踪。图a：显示皮质分层结构和示踪的PV阳性神经元的顶视图。PV，红色；比例尺，200μm。图b：仅示踪的神经元(顶视图)，显示皮质层中神经元(1-8)的相对位置。每个神经元的同-或异-神经元树突桥的数目可以参见下表2。图c：侧视图。图d：侧视图，仅示踪的神经元。
表2：图20所示正常对照人脑组织中八个PV阳性神经元的原始定量数据

Claims (53)

1.一种制备供显微镜分析的生物样本的方法，所述方法包括：
用多个水凝胶亚基固定所述样本；
使所述水凝胶亚基聚合以形成水凝胶包埋的样本；和
清洁所述水凝胶包埋的样本。
2.根据权利要求1所述的方法，其中清洁所述水凝胶包埋的样本包括从所述样本基本上去除多种细胞成分。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述细胞组分包括脂质。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中清洁所述水凝胶包埋的样本包括对所述样本进行电泳。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中使用包含离子型表面活性剂的缓冲溶液对所述样本进行电泳。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述离子型表面活性剂是十二烷基硫酸钠。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中使用范围从约10至约60伏特的电压对所述样本进行电泳。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中持续范围从约15分钟多至约10天的时段对所述样本进行电泳。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，还包括在封固剂中孵育所述经清洁的样本，所述封固剂具有与所述清洁组织相匹配的折射率。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述封固剂增加所述样本的光学透明度。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述封固剂包括甘油。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述显微镜分析选自由以下组成的组：光学显微术、激光显微术、电子显微术和扫描探针显微术。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中固定所述样本包括使所述样本与多聚甲醛接触。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述水凝胶亚基包括丙烯酰胺。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中使所述样本聚合包括热交联。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述样本与多肽、核酸或小分子接触。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述接触包括电泳、流体压力、超声振动、溶质对比、微波辐射或血管循环。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述多肽、核酸或小分子包括当对所述样本通过显微镜进行分析时使之可见的组分。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述组织是中枢神经系统(CNS)组织。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述CNS组织是全脑。
21.一种通过显微术使生物样本成像的方法，所述方法包括：
根据权利要求1-20中任一项所述的方法制备生物样本；和
用显微镜使所述生物样本成像。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述显微镜是光学显微镜、激光显微镜、电子显微镜或扫描探针显微镜。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述样本的细胞或亚细胞方面用运输进入所述制备的组织的一个或多个小分子、核酸或蛋白质标记。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，还包括去除之前运输进入所述制备的组织的一个或多个小分子、核酸或蛋白质。
25.一种对神经系统组织的连通性进行绘图的方法，所述方法包括：
根据权利要求1-24中任一项所述的方法制备神经系统组织样本；和
用显微镜使所述样本中的一个或多个神经元成像。
26.根据权利要求25所述的方法，还包括用当对所述样本通过显微镜进行分析时使之可见的组分标记所述样本中的所述一个或多个神经元。
27.根据权利要求25-26中任一项所述的方法，其中所述神经元在固定所述组织之前被标记。
28.根据权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述神经元在使所述水凝胶聚合之后被标记。
29.一种用于制备供显微镜分析的组织的试剂盒，所述试剂盒包括：
固定剂；和
多个水凝胶亚基。
30.根据权利要求29所述的试剂盒，还包括用于对三维水凝胶包埋的样本进行电泳以从所述样本基本上去除多个细胞组分的装置。
31.根据权利要求29-30中任一项所述的试剂盒，其中所述细胞组分包括脂质。
32.一种用于制备供成像的生物样本的系统，所述系统包括：
用于对三维水凝胶包埋的样本进行电泳以从所述样本基本上去除多个细胞组分的装置；
电源；和
温度控制的缓冲液循环器。
33.根据权利要求32所述的系统，其中所述细胞组分包括脂质。
34.一种电泳组织清洁设备，所述设备包括：
用于容纳三维水凝胶包埋的样本的电泳室；
多个电极；
电源；和
温度控制的缓冲液循环器。
35.根据权利要求34所述的电泳组织清洁设备，还包括缓冲液过滤组件。
36.根据权利要求34-35中任一项所述的电泳组织清洁设备，还包括多个流体入口和/或出口孔。
37.根据权利要求34-36中任一项所述的电泳组织清洁设备，还包括被配置成支持所述水凝胶包埋的样本的组件。
38.根据权利要求34-37中任一项所述的电泳组织清洁设备，其中所述组件被配置成支持所述水凝胶包埋的样本处于基本上在两个或多个所述电极之间产生的电场内的位置。
39.根据权利要求34-38中任一项所述的电泳组织清洁设备，其中一个或多个所述电极包括用于增加由所述电极产生的电场的大小的放大组件。
40.根据权利要求34-39中任一项所述的电泳组织清洁设备，其中所述放大组件包括一个或多个S形弯曲。
41.根据权利要求34-40中任一项所述的电泳组织清洁设备，其中所述一个或多个电极的长度和宽度大致相等。
42.根据权利要求34-41中任一项所述的电泳组织清洁设备，还包括与所述电泳室形成流体密封和/或空气密封的盖子。
43.一种保存生物样本的方法，所述方法包括：
用多个水凝胶亚基固定所述样本；
使所述水凝胶亚基聚合以形成水凝胶包埋的样本；和
清洁所述水凝胶包埋的样本。
44.根据权利要求43所述的方法，还包括将所述经清洁的水凝胶包埋的样本储存在封固剂中。
45.根据权利要求43-44中任一项所述的方法，还包括分析所述经清洁的水凝胶包埋的样本以供病理状态的评价、诊断或预后。
46.根据权利要求43-45中任一项所述的方法，其中所述样本是活检样本或尸检样本。
47.根据权利要求45-46中任一项所述的方法，其中所述病理状态是癌症、免疫系统功能障碍、神经精神疾病、内分泌/生殖疾病、心血管/肺部疾病、肌肉骨骼疾病或胃肠疾病。
48.根据权利要求43-47中任一项所述的方法，其中所述样本包括正常组织，并且其中所述方法还包括分析所述样本以评价细胞、组织、器官或系统功能和/或细胞和组织之间的关系，包括发育期间。
49.根据权利要求43-48中任一项所述的方法，还包括对所述样本进行遗传学、转录组学、基因组学、蛋白质组学、代谢物组学和/或药物筛选分析。
50.根据权利要求43-49中任一项所述的方法，还包括储存所述样本供未来分析、评估或功能化。
51.一种用于将水凝胶单体注入生物组织并随后引发所述单体形成具有希望硬度、透明度、孔径、电导率或通透性性质的聚合物、凝胶、网孔或网络的系统，所述系统包括：
生物样本；和
多个水凝胶亚基。
52.根据权利要求51所述的系统，还包括纳米级硬件设备、蛋白质、寡核苷酸和/或荧光染色试剂。
53.根据权利要求51-52中任一项所述的系统，其中所述系统的组分被诸如热、光、化学引发剂和/或加速剂的能量或外部信号活化或功能化。
CN201380028711.3A 2012-08-09 2013-03-13 用于制备供显微镜分析的生物样本的方法和组合物 Active CN104350372B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261681551P 2012-08-09 2012-08-09
US61/681,551 2012-08-09
PCT/US2013/031066 WO2014025392A1 (en) 2012-08-09 2013-03-13 Methods and compositions for preparing biological specimens for microscopic analysis

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104350372A true CN104350372A (zh) 2015-02-11
CN104350372B CN104350372B (zh) 2018-03-02

Family

ID=50068460

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380028711.3A Active CN104350372B (zh) 2012-08-09 2013-03-13 用于制备供显微镜分析的生物样本的方法和组合物

Country Status (9)

Country Link
US (3) US10545075B2 (zh)
EP (2) EP2883030B1 (zh)
JP (1) JP6228205B2 (zh)
KR (1) KR102148747B1 (zh)
CN (1) CN104350372B (zh)
AU (1) AU2013300171B2 (zh)
HK (1) HK1204677A1 (zh)
IN (1) IN2014DN09073A (zh)
WO (1) WO2014025392A1 (zh)

Cited By (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103558055A (zh) * 2013-09-29 2014-02-05 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 一种针对感染病毒的病变细胞的定位超薄切片方法
CN104965016A (zh) * 2015-06-15 2015-10-07 南昌大学 一体化的生物组织透明装置
CN105823807A (zh) * 2016-01-04 2016-08-03 浙江农林大学 抗癌药物羟喜树碱药效检测装置及检测方法
CN106682453A (zh) * 2016-12-28 2017-05-17 长春理工大学 一种dna分子的定点编辑方法
CN106769350A (zh) * 2017-01-20 2017-05-31 上海交通大学 一种用于富含脂滴组织快速完全透明化的方法
CN107621462A (zh) * 2016-07-13 2018-01-23 王志伟 一种组织透明化液sut及其制备和应用
CN107674879A (zh) * 2016-08-01 2018-02-09 深圳先进技术研究院 一种光‑基因质粒及其应用
TWI620927B (zh) * 2017-04-21 2018-04-11 胡宇光 神經組織樣本染色之方法及套組與顯現神經元之方法
CN107966477A (zh) * 2018-01-22 2018-04-27 哈尔滨工业大学 一种生物敏感元件
CN108139408A (zh) * 2015-08-07 2018-06-08 麻省理工学院 蛋白质保持扩展显微法
CN108431664A (zh) * 2015-12-23 2018-08-21 皇家飞利浦有限公司 荧光校准载片
CN108474723A (zh) * 2015-12-02 2018-08-31 克莱尔莱特诊断有限责任公司 制备和分析肿瘤组织样品用于检测和监测癌症的方法
CN109612811A (zh) * 2018-12-26 2019-04-12 华中科技大学苏州脑空间信息研究院 一种保护生物组织结构和荧光的水凝胶包埋方法
CN109781493A (zh) * 2018-12-26 2019-05-21 华中科技大学苏州脑空间信息研究院 一种可长时间连续精细切削成像的生物组织水凝胶包埋方法
CN109996887A (zh) * 2016-11-29 2019-07-09 株式会社百义纳理 用于清除生物组织的组合物和使用其清除生物组织的方法
CN110168346A (zh) * 2016-11-08 2019-08-23 哈佛学院院长及董事 使用merfish、扩展显微术和相关技术进行多重成像
CN111397999A (zh) * 2020-05-09 2020-07-10 中国科学院植物研究所 一种增强显微ct植物样品对比度的简易方法
CN111579769A (zh) * 2015-04-30 2020-08-25 上海交通大学 一种对组织样本进行免疫标记的方法
WO2020199328A1 (zh) * 2019-03-29 2020-10-08 华中科技大学 膨胀切削显微成像方法及适用于该方法的超吸水水凝胶
US10995361B2 (en) 2017-01-23 2021-05-04 Massachusetts Institute Of Technology Multiplexed signal amplified FISH via splinted ligation amplification and sequencing
US11180804B2 (en) 2017-07-25 2021-11-23 Massachusetts Institute Of Technology In situ ATAC sequencing
CN114129780A (zh) * 2020-09-03 2022-03-04 天津大学 一种光控释放一氧化氮的复合水凝胶的制备及应用
US11408890B2 (en) 2015-04-14 2022-08-09 Massachusetts Institute Of Technology Iterative expansion microscopy
WO2022188496A1 (zh) * 2021-03-08 2022-09-15 光华临港工程应用技术研发(上海)有限公司 一种用于膨胀超分辨成像的dna纳米结构染料及其应用
US11788123B2 (en) 2017-05-26 2023-10-17 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for high-throughput image-based screening
US11802822B2 (en) 2019-12-05 2023-10-31 Massachusetts Institute Of Technology Multiplexed expansion (MultiExM) pathology
US11802872B2 (en) 2017-02-24 2023-10-31 Massachusetts Institute Of Technology Methods for examining podocyte foot processes in human renal samples using conventional optical microscopy
US11873374B2 (en) 2018-02-06 2024-01-16 Massachusetts Institute Of Technology Swellable and structurally homogenous hydrogels and methods of use thereof
US11959075B2 (en) 2014-07-30 2024-04-16 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for determining nucleic acids

Families Citing this family (98)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201106254D0 (en) 2011-04-13 2011-05-25 Frisen Jonas Method and product
EP2766498B1 (en) 2011-10-14 2019-06-19 President and Fellows of Harvard College Sequencing by structure assembly
US11021737B2 (en) 2011-12-22 2021-06-01 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for analyte detection
EP4249605A3 (en) 2011-12-22 2023-11-15 President And Fellows Of Harvard College Methods for analyte detection
WO2013184754A2 (en) 2012-06-05 2013-12-12 President And Fellows Of Harvard College Spatial sequencing of nucleic acids using dna origami probes
EP2883030B1 (en) 2012-08-09 2022-08-31 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Methods and compositions for preparing biological specimens for microscopic analysis
US10138509B2 (en) 2013-03-12 2018-11-27 President And Fellows Of Harvard College Method for generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix
DE102013205115A1 (de) * 2013-03-22 2014-09-25 Leica Microsystems Cms Gmbh SPIM-Anordnung
CN111662960B (zh) 2013-06-25 2024-04-12 普罗格诺西斯生物科学公司 采用微流控装置的空间编码生物分析
DE102013216934A1 (de) * 2013-08-26 2015-02-26 Leica Microsystems Cms Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur Erhöhung der optischen Transparenz von Bereichen einer Gewebeprobe
KR20160058900A (ko) * 2013-09-20 2016-05-25 캘리포니아 인스티튜트 오브 테크놀로지 온전한 전체 조직의 표현형분석을 위한 방법
US10794802B2 (en) * 2013-09-20 2020-10-06 California Institute Of Technology Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high resolution intact circuit mapping and phenotyping
EP3108218A4 (en) * 2014-02-21 2017-11-15 Massachusetts Institute Of Technology Expansion microscopy
WO2015154000A1 (en) 2014-04-04 2015-10-08 Massachusetts Institute Of Technology Active transport of charged molecules into, within, and/or from charged matrices
EP3149534A4 (en) 2014-05-30 2018-01-31 The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University Methods and devices for imaging large intact tissue samples
JP6778186B2 (ja) * 2014-07-07 2020-10-28 ロゴス バイオシステムズ， インコーポレイテッド 電気泳動を使用する組織クリアリング装置
US10571371B2 (en) 2014-08-07 2020-02-25 Wake Forest University Health Sciences Compositions and methods for clearing a biological sample
KR101563826B1 (ko) * 2014-12-31 2015-10-28 계명대학교 산학협력단 조직 투명화 방법
AU2016218055B2 (en) * 2015-02-09 2019-05-16 Ventana Medical Systems, Inc. Materials and methods for standardizing diffusion of a fluid into tissues
DK3901281T3 (da) 2015-04-10 2023-01-23 Spatial Transcriptomics Ab Rumligt adskilt, multipleks nukleinsyreanalyse af biologiske prøver
US10526649B2 (en) 2015-04-14 2020-01-07 Massachusetts Institute Of Technology Augmenting in situ nucleic acid sequencing of expanded biological samples with in vitro sequence information
US10059990B2 (en) 2015-04-14 2018-08-28 Massachusetts Institute Of Technology In situ nucleic acid sequencing of expanded biological samples
EP3332029B1 (en) * 2015-08-07 2021-10-06 Massachusetts Institute of Technology Nanoscale imaging of proteins and nucleic acids via expansion microscopy
WO2017031249A1 (en) * 2015-08-17 2017-02-23 California Institute Of Technology Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high resolution intact circuit mapping and phenotyping
WO2017075265A1 (en) * 2015-10-28 2017-05-04 The Broad Institute, Inc. Multiplex analysis of single cell constituents
AU2016349288A1 (en) 2015-11-03 2018-05-31 President And Fellows Of Harvard College Method and apparatus for volumetric imaging of a three-dimensional nucleic acid containing matrix
US11254974B2 (en) * 2016-02-10 2022-02-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University RNA fixation and detection in clarity-based hydrogel tissue
CA3016361C (en) * 2016-03-07 2024-01-02 X-Zell Inc. Compositions and methods for identifying rare cells
JP6721899B2 (ja) * 2016-03-30 2020-07-15 国立大学法人 大分大学 高親水性高分子モノマーを主剤とする電子顕微鏡用包埋方法
WO2017189525A1 (en) 2016-04-25 2017-11-02 President And Fellows Of Harvard College Hybridization chain reaction methods for in situ molecular detection
US11397140B2 (en) * 2016-04-29 2022-07-26 Massachusetts Institute Of Technology Methods for reversible and tunable tissue magnification
US10852290B2 (en) 2016-05-11 2020-12-01 Bonraybio Co., Ltd. Analysis accuracy improvement in automated testing apparatus
US10324022B2 (en) 2016-05-11 2019-06-18 Bonraybio Co., Ltd. Analysis accuracy improvement in automated testing apparatus
US10281386B2 (en) * 2016-05-11 2019-05-07 Bonraybio Co., Ltd. Automated testing apparatus
EP3252452A1 (en) 2016-05-25 2017-12-06 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Method for imaging and analysis of a biological specimen
WO2017205531A1 (en) * 2016-05-25 2017-11-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for visualization and quantification of fiber-like structures
WO2017222453A1 (en) 2016-06-21 2017-12-28 Hauling Thomas Nucleic acid sequencing
WO2018044899A1 (en) 2016-08-29 2018-03-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Method and composition for optical clearing of tissues
CN109923216A (zh) 2016-08-31 2019-06-21 哈佛学院董事及会员团体 将生物分子的检测组合到使用荧光原位测序的单个试验的方法
JP7239465B2 (ja) 2016-08-31 2023-03-14 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 蛍光ｉｎ ｓｉｔｕ配列決定による検出のための核酸配列ライブラリの作製法
US10538632B1 (en) 2016-09-30 2020-01-21 National Technology & Engineering Solutions Of Sandia, Llc Shape-preserving polymeric replication of biological matter
JP6898720B2 (ja) * 2016-10-14 2021-07-07 株式会社ファンケル 皮膚内部構造評価方法
CN110140175A (zh) * 2016-11-08 2019-08-16 哈佛学院院长及董事 基质印迹和清除
DE102016123458B3 (de) 2016-12-05 2018-03-15 Georg-August-Universität Göttingen Stiftung Öffentlichen Rechts, Universitätsmedizin Verfahren zur Herstellung transparenter biologischer Präparate für eine lichtmikroskopische Untersuchung
US10955322B2 (en) 2017-01-18 2021-03-23 California Institute Of Technology Methods and devices for soft and osseous tissue clearing and fluorescent imaging
KR101888782B1 (ko) * 2017-02-07 2018-08-14 고려대학교 산학협력단 피부 조직의 투명화 방법, 이를 이용한 피부 조직의 3차원 영상화 방법 및 평가 및 진단 방법
US11436719B2 (en) 2017-02-16 2022-09-06 Kyoto University Cell evaluation method, cell evaluation device, and recording medium storing cell evaluation program
KR20180099482A (ko) * 2017-02-27 2018-09-05 고려대학교 산학협력단 하이드로겔 중합체를 이용한 탈세포화 조직의 제조방법 및 이로부터 제조된 탈세포화 조직
WO2018155925A2 (ko) * 2017-02-27 2018-08-30 고려대학교 산학협력단 하이드로겔 중합체를 이용한 탈세포화 조직의 제조방법 및 이로부터 제조된 탈세포화 조직
MX2017008919A (es) * 2017-07-05 2018-03-01 Gabriela Reyes Fuchs Carmen Proceso para formar una imagen a color de materiales incinerados mediante tecnicas de microscopia.
JP7160350B2 (ja) * 2017-07-06 2022-10-25 公立大学法人大阪 生体組織透明化法及びその試薬
KR101996722B1 (ko) * 2017-07-07 2019-07-04 재단법인대구경북과학기술원 다채널 박막전극을 이용한 전기적 생체분자 이동방법
WO2019068880A1 (en) 2017-10-06 2019-04-11 Cartana Ab RNA MATRIX LIGATION
KR102200618B1 (ko) * 2018-01-12 2021-01-08 재단법인대구경북과학기술원 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 포함하는 생물학적 분자의 조직침투용 조성물 및 이의 용도
WO2019078655A1 (ko) * 2017-10-19 2019-04-25 재단법인대구경북과학기술원 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 포함하는 생물학적 분자의 조직침투용 조성물 및 이의 용도
US10488307B2 (en) 2017-12-12 2019-11-26 Dignity Health Systems, devices, and methods for improved tissue treatment
KR102050248B1 (ko) * 2017-12-29 2019-11-29 연세대학교 산학협력단 조직 투명도 분석 방법
WO2020011735A2 (en) 2018-07-09 2020-01-16 Universität Zürich Systems, apparatuses, and methods for preparation of tissue samples
EP3836967A4 (en) 2018-07-30 2022-06-15 ReadCoor, LLC METHODS AND SYSTEMS FOR SAMPLE PROCESSING OR ANALYSIS
KR102151128B1 (ko) * 2018-08-24 2020-09-02 주식회사 바이나리 질소 가스 가압식 조직 투명화 및 항체 침투 증진용 장치
EP3845629B1 (en) * 2018-08-29 2023-10-25 National Institute for Materials Science Measurement device and evaluation method
KR102368585B1 (ko) * 2018-09-28 2022-03-03 서울대학교산학협력단 온도에 따라 가역적 팽창/초기화가 가능한 하이드로젤을 이용한 생체조직 이미징
US11435302B2 (en) * 2018-11-13 2022-09-06 The Trustees Of Princeton University X-ray assisted electron microscopy staining procedure
GB201818567D0 (en) * 2018-11-14 2018-12-26 Francis Crick Institute Ltd Composition
CN112740013A (zh) * 2019-05-09 2021-04-30 科来旺科技公司 使用离子导电膜对生物样本进行电泳染色的方法和设备
AU2020282024A1 (en) 2019-05-31 2021-11-11 10X Genomics, Inc. Method of detecting target nucleic acid molecules
WO2021095718A1 (ja) * 2019-11-11 2021-05-20 公立大学法人大阪 生体組織透明化方法及びその試薬
US20210254140A1 (en) 2020-02-17 2021-08-19 10X Genomics, Inc. Situ analysis of chromatin interaction
US20210262018A1 (en) 2020-02-21 2021-08-26 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for integrated in situ spatial assay
CN115551638A (zh) * 2020-03-13 2022-12-30 耶鲁大学 用于生物样品的物理膨胀和成像的方法和系统
US20210348991A1 (en) * 2020-05-05 2021-11-11 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods relating to reversibly compressible tissue-hydrogel hybrids
RU2752751C1 (ru) * 2020-09-28 2021-08-02 Ахмеджан Атаханович Аллаберганов Способ получения цифровых двойников документа в виде бумажного носителя текстовой информации или в виде изображения текстового документа
CN112284861B (zh) * 2020-10-21 2023-02-17 上海市农业科学院 用于真姬菇担孢子显微观察的固定液、制备方法、固定方法及应用
US11333588B1 (en) * 2020-12-07 2022-05-17 Nebulum Technologies Co., Ltd. Matrix-assisted methods and compositions to prepare biological samples for super-resolution imaging
EP4012046A1 (en) 2020-12-11 2022-06-15 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for multimodal in situ analysis
CN112665951B (zh) * 2020-12-22 2022-11-11 中国农业科学院作物科学研究所 一种胚乳组织包埋方法与应用
US20220195498A1 (en) 2020-12-23 2022-06-23 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for analyte detection
US20220228200A1 (en) 2021-01-19 2022-07-21 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for internally controlled in situ assays
WO2022164809A1 (en) 2021-01-26 2022-08-04 10X Genomics, Inc. Nucleic acid analog probes for in situ analysis
US20220282319A1 (en) 2021-03-03 2022-09-08 10X Genomics, Inc. Analyte detection in situ using nucleic acid origami
CN117396613A (zh) 2021-06-01 2024-01-12 10X基因组学有限公司 用于分析物检测和探针解析的方法和组合物
WO2022256422A1 (en) 2021-06-02 2022-12-08 10X Genomics, Inc. Sample analysis using asymmetric circularizable probes
WO2023283442A1 (en) 2021-07-09 2023-01-12 10X Genomics, Inc. Methods for detecting analytes using sparse labelling
CN117651855A (zh) 2021-07-13 2024-03-05 10X基因组学有限公司 用于制备具有可控厚度的聚合基质的方法
US20230057571A1 (en) 2021-08-03 2023-02-23 10X Genomics, Inc. Nucleic acid concatemers and methods for stabilizing and/or compacting the same
US20230061542A1 (en) 2021-08-16 2023-03-02 10X Genomics, Inc. Probes comprising a split barcode region and methods of use
WO2023102118A2 (en) 2021-12-01 2023-06-08 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for improved in situ detection of analytes and spatial analysis
US20230242974A1 (en) 2021-12-27 2023-08-03 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for rolling circle amplification
US20230279475A1 (en) 2022-01-21 2023-09-07 10X Genomics, Inc. Multiple readout signals for analyzing a sample
WO2023192616A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for targeted masking of autofluorescence
WO2023196526A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 10X Genomics, Inc. Methods for multiplex cell analysis
WO2023204581A1 (ko) * 2022-04-20 2023-10-26 동국대학교 산학협력단 암세포 사멸효과를 가지는 3d 하이드로젤 복합체 및 이의 제조방법
US20240002902A1 (en) 2022-05-06 2024-01-04 10X Genomics, Inc. Analysis of antigen and antigen receptor interactions
US20240026427A1 (en) 2022-05-06 2024-01-25 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for in situ analysis of v(d)j sequences
WO2023245190A1 (en) 2022-06-17 2023-12-21 10X Genomics, Inc. Catalytic de-crosslinking of samples for in situ analysis
KR102582110B1 (ko) * 2022-07-18 2023-09-21 (재)씨젠의료재단 3차원 세포 또는 생체 조직의 투명화 및 이미지 분석용 조성물
KR20240042887A (ko) * 2022-09-26 2024-04-02 연세대학교 산학협력단 고배율의 세포 확대 분석을 위한 세포 필름, 이의 제조용 조성물 및 제조 방법
WO2024081869A1 (en) 2022-10-14 2024-04-18 10X Genomics, Inc. Methods for analysis of biological samples

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3989613A (en) * 1973-05-16 1976-11-02 The Dow Chemical Company Continuous balanced flow fixed boundary electrophoresis
CN1172529A (zh) * 1995-02-03 1998-02-04 竹崎悌二 生物检测样品的固定支持方法及其固定支持剂和包埋盒
CN1493001A (zh) * 2001-03-16 2004-04-28 ʩ��ķ����ϵͳ��˾ 基于阵列的生物分子分析方法
EP1438976A1 (en) * 2001-09-28 2004-07-21 Biopharma Development Ltd Polyfunctional biocompatible hydrogel and method for the production thereof
CN1587959A (zh) * 2004-09-23 2005-03-02 上海交通大学 基于原子力显微镜观察的生物样品包埋块的制备方法
WO2007030012A2 (en) * 2005-09-05 2007-03-15 Stichting Voor De Technische Wetenscahappen Extracellular matrix imaging
US20070134798A1 (en) * 2005-12-08 2007-06-14 Mccormick Patric Light curing fixative
CN1987446A (zh) * 2005-12-21 2007-06-27 霍夫曼-拉罗奇有限公司 可比较的二维和三维凝胶电泳系统
CN101371125A (zh) * 2006-01-13 2009-02-18 文塔纳医疗系统公司 生物样品处理组合物与方法
CN102072836A (zh) * 2010-11-12 2011-05-25 深圳华大基因科技有限公司 生物大分子浓缩除盐方法及试剂盒
CN102439398A (zh) * 2009-04-27 2012-05-02 蛋白质发现公司 可编程电泳凹口过滤器系统及方法

Family Cites Families (75)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3129158A (en) 1961-01-24 1964-04-14 Raymond Samuel Process for gel electrophoresis
US3208929A (en) 1962-09-11 1965-09-28 Robert H Raymond Apparatus for gel electrophoresis
US3346479A (en) 1964-04-09 1967-10-10 Scientific Industries Preparative separation by a combination of gel separation and electrophoresis
US3375187A (en) 1965-05-13 1968-03-26 Buchler Instr Inc Apparatus for temperature controlled preparative and analytical electrophoresis
US3576727A (en) 1968-05-23 1971-04-27 Bruce Lee Evatt Gel electrophoresis process
US3563880A (en) 1968-08-28 1971-02-16 Arthur W Anderson Gel electrophoresis unit
SE328135B (zh) 1968-09-19 1970-09-07 Lkb Produkter Ab
US3616454A (en) 1969-03-13 1971-10-26 Univ New York Method of and apparatus for electrophoretic separation in a gel column
US3674678A (en) 1970-10-28 1972-07-04 Millipore Corp Electrophoretic apparatus
US3865712A (en) 1972-04-13 1975-02-11 Lkb Produkter Ab Electrode arrangement for an electrophoretical separation performed in a gel plate
US4088561A (en) 1977-06-27 1978-05-09 The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy Apparatus for electrophoresis separation
US4151065A (en) 1978-01-30 1979-04-24 The Regents Of The University Of California Horizontal slab gel electrophoresis
US4292161A (en) 1979-01-03 1981-09-29 Hoefer Scientific Instruments Vertical gel slab electrophoresis apparatus
FR2496889A1 (fr) 1980-12-22 1982-06-25 Hours Michel Cuve de migration et de reaction utilisable pour des analyses par electrophorese
US4339327A (en) 1981-04-23 1982-07-13 Tyler Jonathan M Miniature slab gel electrophoresis system
US4375401A (en) 1981-05-20 1983-03-01 Nicholas Catsimpoolas Electrophoresis system
EP0101859B1 (de) 1982-07-23 1987-10-14 Matthias Hediger Einrichtung für präparative Gelelektrophorese, insbesondere zur Gemischtrennung an einer einen Gradienten enthaltenden Polyacrylamid-Gelsäure
US4588491A (en) 1984-02-27 1986-05-13 International Biotechnologies, Inc. Horizontal gel electrophoresis device
DE3580418D1 (de) * 1984-07-31 1990-12-13 Hitachi Ltd Elektrophoretisches trennverfahren mit freier stroemung und apparat dafuer.
US4685025A (en) 1985-03-14 1987-08-04 Raychem Corporation Conductive polymer circuit protection devices having improved electrodes
US5188963A (en) 1989-11-17 1993-02-23 Gene Tec Corporation Device for processing biological specimens for analysis of nucleic acids
JPH03167472A (ja) * 1989-11-27 1991-07-19 Sumitomo Chem Co Ltd 実験動物の胎児骨格染色法
JP3216907B2 (ja) 1992-05-18 2001-10-09 株式会社日立製作所 電子ズーム装置及び撮像装置
WO1999036559A1 (en) 1998-01-13 1999-07-22 Julien Jean Pierre Viral vectors expressing self-polymerizing neuronal intermediate filaments and their use
US6722395B2 (en) 1998-01-13 2004-04-20 James W. Overbeck Depositing fluid specimens on substrates, resulting ordered arrays, techniques for analysis of deposited arrays
WO2000017355A2 (en) 1998-09-18 2000-03-30 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human cytoskeleton associated proteins
US6232092B1 (en) 1998-10-02 2001-05-15 Rogers Imaging Corporation Method for preparing biological specimens for visual analysis
US6219575B1 (en) 1998-10-23 2001-04-17 Babak Nemati Method and apparatus to enhance optical transparency of biological tissues
US6409774B1 (en) 1999-06-11 2002-06-25 Resolution Sciences Corporation Electrophoresis-assisted staining of materials
CA2426871A1 (en) 2000-10-24 2002-05-16 Oncosis Llc Method and device for selectively targeting cells within a three -dimensional specimen
US6472216B1 (en) 2001-07-24 2002-10-29 Ann-Shyn Chiang Aqueous tissue clearing solution
DE10209609A1 (de) 2002-03-05 2003-10-02 Europ Lab Molekularbiolog Verfahren und Vorrichtung zur Parallelanalyse von Bio-Molekülen
CA2491528A1 (en) 2002-06-28 2004-01-08 Cardio, Inc. Decellularized tissue
WO2004034890A2 (en) 2002-10-17 2004-04-29 Vacanti, Joseph, P. Biological scaffolding material
JP4361057B2 (ja) * 2003-04-30 2009-11-11 モイル，ウィリアム，アール 生体分子検出および細胞分類用センサ
US7713923B2 (en) 2003-06-25 2010-05-11 Massachusetts Institute Of Technology Self-assembling peptides incorporating modifications and methods of use thereof
US8226715B2 (en) 2003-06-30 2012-07-24 Depuy Mitek, Inc. Scaffold for connective tissue repair
US7326571B2 (en) 2003-07-17 2008-02-05 Boston Scientific Scimed, Inc. Decellularized bone marrow extracellular matrix
US7660620B2 (en) 2003-09-29 2010-02-09 Medtronic, Inc. Timing techniques for magnetic resonance imaging
US7955788B2 (en) * 2003-10-30 2011-06-07 Medtronic, Inc. Bioprosthetic tissue preparation with synthetic hydrogels
WO2005062938A2 (en) 2003-12-23 2005-07-14 The Regents Of The University Of California Chemical agents and methods for optical clearing of skin and mucous membranes to improve light-based diagnostics and therapeutics
DE602005023426D1 (de) 2004-03-25 2010-10-21 California Inst Of Techn Hybridisierungskettenreaktion
GB0414825D0 (en) * 2004-07-02 2004-08-04 Biostatus Ltd Gel formulations and uses thereof
US7727721B2 (en) 2005-03-08 2010-06-01 California Institute Of Technology Hybridization chain reaction amplification for in situ imaging
CA2696562C (en) 2007-08-14 2016-02-16 Smith & Nephew Plc Formation of a scaffold from multiple smaller scaffold components
DE102007045897A1 (de) 2007-09-26 2009-04-09 Carl Zeiss Microimaging Gmbh Verfahren zur mikroskopischen dreidimensionalen Abbildung einer Probe
WO2010014244A2 (en) 2008-07-30 2010-02-04 The Regents Of The University Of California, San Francisco Multidirectional selective plane illumination microscopy
US20100055733A1 (en) 2008-09-04 2010-03-04 Lutolf Matthias P Manufacture and uses of reactive microcontact printing of biomolecules on soft hydrogels
WO2010030358A1 (en) 2008-09-12 2010-03-18 Quickmbed, Inc. Scaffold for tissue sample orientation
US9671400B2 (en) * 2009-02-19 2017-06-06 Dako Denmark A/S Conjugate molecules
CA2756225A1 (en) 2009-03-25 2010-09-30 Los Alamos National Security, Llc Fiber optical assembly for fluorescence spectrometry
US8852614B2 (en) 2010-03-12 2014-10-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Hydrogels with network defects enhanced by nanoparticle incorporation
CN108061677B (zh) * 2010-03-12 2021-10-29 国立研究开发法人理化学研究所 用于生物材料的澄清试剂和其用途
US8867803B2 (en) 2010-04-20 2014-10-21 Eric J. Seibel Optical projection tomography microscopy (OPTM) for large specimen sizes
US8927624B2 (en) 2010-05-14 2015-01-06 Fujifilm Imaging Colorants Limited Dispersion, process for preparing a dispersion and ink jet printing ink
TWI425201B (zh) 2010-10-01 2014-02-01 Nat Univ Tsing Hua 觀察厚組織三維結構之方法
WO2012103343A1 (en) 2011-01-28 2012-08-02 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Functional targeted brain endoskeletonization
EP2703801B1 (en) 2011-04-28 2020-11-25 Riken Method for making biological material transparent
CN103562702A (zh) 2011-05-20 2014-02-05 独立行政法人理化学研究所 生物材料用透明化试剂、及其利用
WO2013016712A2 (en) 2011-07-27 2013-01-31 The Rockefeller University Methods for fixing and detecting rna
JP5967528B2 (ja) 2012-06-22 2016-08-10 国立研究開発法人理化学研究所 生物材料を透明化する方法および生物材料用透明化処理キット
DE102012211462A1 (de) 2012-07-03 2014-01-23 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Verfahren zur Vorbereitung und Durchführung der Aufnahme von Bildstapeln einer Probe aus verschiedenen Orientierungswinkeln
EP2883030B1 (en) 2012-08-09 2022-08-31 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Methods and compositions for preparing biological specimens for microscopic analysis
DE102012020240A1 (de) 2012-10-12 2014-04-17 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Mikroskop und Verfahren zur SPIM Mikroskopie
KR102368591B1 (ko) 2013-04-30 2022-02-25 캘리포니아 인스티튜트 오브 테크놀로지 순차적 하이브리드화 바코딩에 의한 분자의 멀티플렉스 표지화
US10267714B2 (en) 2013-08-14 2019-04-23 Riken Composition for preparing biomaterial with excellent light-transmitting property, and use thereof
DE102013216934A1 (de) 2013-08-26 2015-02-26 Leica Microsystems Cms Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur Erhöhung der optischen Transparenz von Bereichen einer Gewebeprobe
KR20160058900A (ko) 2013-09-20 2016-05-25 캘리포니아 인스티튜트 오브 테크놀로지 온전한 전체 조직의 표현형분석을 위한 방법
CN103513411B (zh) 2013-09-27 2016-02-03 香港应用科技研究院有限公司 荧光显微镜中聚焦的装置和方法
EP3149534A4 (en) 2014-05-30 2018-01-31 The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University Methods and devices for imaging large intact tissue samples
US10571371B2 (en) 2014-08-07 2020-02-25 Wake Forest University Health Sciences Compositions and methods for clearing a biological sample
WO2016073941A1 (en) 2014-11-07 2016-05-12 California Institute Of Technology Methods for phenotyping of intact bones by tissue clearing and staining
JP6687949B2 (ja) 2015-01-20 2020-04-28 国立研究開発法人理化学研究所 生物材料用透明化試薬、システム及びその利用
WO2016147812A1 (ja) 2015-03-18 2016-09-22 国立研究開発法人理化学研究所 生物材料の観察方法および透明化方法
JP2019507352A (ja) 2015-12-02 2019-03-14 クリアライト ダイアグノスティックス リミテッド ライアビリティ カンパニー 癌の検出およびモニタリングのための腫瘍組織サンプルの調製および分析のための方法

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3989613A (en) * 1973-05-16 1976-11-02 The Dow Chemical Company Continuous balanced flow fixed boundary electrophoresis
CN1172529A (zh) * 1995-02-03 1998-02-04 竹崎悌二 生物检测样品的固定支持方法及其固定支持剂和包埋盒
CN1493001A (zh) * 2001-03-16 2004-04-28 ʩ��ķ����ϵͳ��˾ 基于阵列的生物分子分析方法
EP1438976A1 (en) * 2001-09-28 2004-07-21 Biopharma Development Ltd Polyfunctional biocompatible hydrogel and method for the production thereof
CN1587959A (zh) * 2004-09-23 2005-03-02 上海交通大学 基于原子力显微镜观察的生物样品包埋块的制备方法
WO2007030012A2 (en) * 2005-09-05 2007-03-15 Stichting Voor De Technische Wetenscahappen Extracellular matrix imaging
US20070134798A1 (en) * 2005-12-08 2007-06-14 Mccormick Patric Light curing fixative
CN1987446A (zh) * 2005-12-21 2007-06-27 霍夫曼-拉罗奇有限公司 可比较的二维和三维凝胶电泳系统
CN101371125A (zh) * 2006-01-13 2009-02-18 文塔纳医疗系统公司 生物样品处理组合物与方法
CN102439398A (zh) * 2009-04-27 2012-05-02 蛋白质发现公司 可编程电泳凹口过滤器系统及方法
CN102072836A (zh) * 2010-11-12 2011-05-25 深圳华大基因科技有限公司 生物大分子浓缩除盐方法及试剂盒

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALI ERTÜRK ET AL.: "Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury", 《NATURE MEDICINE》 *
ANEL OOSTHUYSEN ET AL.: "Bioprosthetic tissue preservation by filling with a poly(acrylamide) hydrogel", 《BIOMATERIALS》 *
DIRK R. ALBRECHT ET AL.: "Photo- and electropatterning of hydrogel-encapsulated living cell arrays", 《LAB ON A CHIP》 *

Cited By (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103558055B (zh) * 2013-09-29 2016-01-06 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 一种针对感染病毒的病变细胞的定位超薄切片方法
CN103558055A (zh) * 2013-09-29 2014-02-05 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 一种针对感染病毒的病变细胞的定位超薄切片方法
US11959075B2 (en) 2014-07-30 2024-04-16 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for determining nucleic acids
US11408890B2 (en) 2015-04-14 2022-08-09 Massachusetts Institute Of Technology Iterative expansion microscopy
CN111579769B (zh) * 2015-04-30 2023-10-27 李小卫 一种对组织样本进行免疫标记的方法
CN111579769A (zh) * 2015-04-30 2020-08-25 上海交通大学 一种对组织样本进行免疫标记的方法
CN104965016A (zh) * 2015-06-15 2015-10-07 南昌大学 一体化的生物组织透明装置
CN108139408B (zh) * 2015-08-07 2020-08-28 麻省理工学院 蛋白质保持扩展显微法
CN108139408A (zh) * 2015-08-07 2018-06-08 麻省理工学院 蛋白质保持扩展显微法
CN108474723A (zh) * 2015-12-02 2018-08-31 克莱尔莱特诊断有限责任公司 制备和分析肿瘤组织样品用于检测和监测癌症的方法
CN108431664A (zh) * 2015-12-23 2018-08-21 皇家飞利浦有限公司 荧光校准载片
CN108431664B (zh) * 2015-12-23 2021-11-02 皇家飞利浦有限公司 荧光校准载片
CN105823807A (zh) * 2016-01-04 2016-08-03 浙江农林大学 抗癌药物羟喜树碱药效检测装置及检测方法
CN105823807B (zh) * 2016-01-04 2018-04-20 浙江农林大学 抗癌药物羟喜树碱药效检测装置及检测方法
CN107621462B (zh) * 2016-07-13 2020-03-31 王志伟 一种组织透明化液sut及其制备和应用
CN107621462A (zh) * 2016-07-13 2018-01-23 王志伟 一种组织透明化液sut及其制备和应用
CN107674879A (zh) * 2016-08-01 2018-02-09 深圳先进技术研究院 一种光‑基因质粒及其应用
CN110168346A (zh) * 2016-11-08 2019-08-23 哈佛学院院长及董事 使用merfish、扩展显微术和相关技术进行多重成像
CN110168346B (zh) * 2016-11-08 2023-03-03 哈佛学院院长及董事 使用merfish、扩展显微术和相关技术进行多重成像
CN109996887A (zh) * 2016-11-29 2019-07-09 株式会社百义纳理 用于清除生物组织的组合物和使用其清除生物组织的方法
CN106682453A (zh) * 2016-12-28 2017-05-17 长春理工大学 一种dna分子的定点编辑方法
CN106682453B (zh) * 2016-12-28 2019-03-26 长春理工大学 一种dna分子的定点编辑方法
CN106769350B (zh) * 2017-01-20 2019-11-22 上海交通大学 一种用于富含脂滴组织快速完全透明化的方法
CN106769350A (zh) * 2017-01-20 2017-05-31 上海交通大学 一种用于富含脂滴组织快速完全透明化的方法
US11415494B2 (en) 2017-01-20 2022-08-16 Shanghai Jiaotong University Method of rapidly and completely rendering lipid-droplet-rich tissue transparent
US10995361B2 (en) 2017-01-23 2021-05-04 Massachusetts Institute Of Technology Multiplexed signal amplified FISH via splinted ligation amplification and sequencing
US11802872B2 (en) 2017-02-24 2023-10-31 Massachusetts Institute Of Technology Methods for examining podocyte foot processes in human renal samples using conventional optical microscopy
TWI620927B (zh) * 2017-04-21 2018-04-11 胡宇光 神經組織樣本染色之方法及套組與顯現神經元之方法
US11788123B2 (en) 2017-05-26 2023-10-17 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for high-throughput image-based screening
US11180804B2 (en) 2017-07-25 2021-11-23 Massachusetts Institute Of Technology In situ ATAC sequencing
CN107966477A (zh) * 2018-01-22 2018-04-27 哈尔滨工业大学 一种生物敏感元件
US11873374B2 (en) 2018-02-06 2024-01-16 Massachusetts Institute Of Technology Swellable and structurally homogenous hydrogels and methods of use thereof
CN109612811A (zh) * 2018-12-26 2019-04-12 华中科技大学苏州脑空间信息研究院 一种保护生物组织结构和荧光的水凝胶包埋方法
CN109781493A (zh) * 2018-12-26 2019-05-21 华中科技大学苏州脑空间信息研究院 一种可长时间连续精细切削成像的生物组织水凝胶包埋方法
WO2020199328A1 (zh) * 2019-03-29 2020-10-08 华中科技大学 膨胀切削显微成像方法及适用于该方法的超吸水水凝胶
US11802822B2 (en) 2019-12-05 2023-10-31 Massachusetts Institute Of Technology Multiplexed expansion (MultiExM) pathology
CN111397999A (zh) * 2020-05-09 2020-07-10 中国科学院植物研究所 一种增强显微ct植物样品对比度的简易方法
CN114129780B (zh) * 2020-09-03 2022-06-28 天津大学 一种光控释放一氧化氮的复合水凝胶的制备及应用
CN114129780A (zh) * 2020-09-03 2022-03-04 天津大学 一种光控释放一氧化氮的复合水凝胶的制备及应用
WO2022188496A1 (zh) * 2021-03-08 2022-09-15 光华临港工程应用技术研发(上海)有限公司 一种用于膨胀超分辨成像的dna纳米结构染料及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
JP2015533210A (ja) 2015-11-19
EP2883030A1 (en) 2015-06-17
JP6228205B2 (ja) 2017-11-08
IN2014DN09073A (zh) 2015-05-22
US20150144490A1 (en) 2015-05-28
EP2883030B1 (en) 2022-08-31
AU2013300171A1 (en) 2014-11-06
US20210215581A1 (en) 2021-07-15
KR20150043241A (ko) 2015-04-22
EP4163617A1 (en) 2023-04-12
EP2883030A4 (en) 2016-03-02
AU2013300171B2 (en) 2017-09-14
KR102148747B1 (ko) 2020-08-27
CN104350372B (zh) 2018-03-02
HK1204677A1 (zh) 2015-11-27
US10545075B2 (en) 2020-01-28
WO2014025392A1 (en) 2014-02-13
US20170219465A1 (en) 2017-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104350372B (zh) 用于制备供显微镜分析的生物样本的方法和组合物
US11624685B2 (en) Method and system for imaging and analysis of a biological specimen
Richardson et al. Tissue clearing
CN110139922B (zh) 用于澄清组织的组合物和方法
CN109072285A (zh) 扩展临床组织样本的方法
US20200271556A1 (en) Iterative direct expansion microscopy
CN116718450A (zh) 用于标记、透明化和成像大型组织的方法
Hickey et al. Fluorescence microscopy—an outline of hardware, biological handling, and fluorophore considerations
US20210130882A1 (en) Membrane Probes for Expansion Microscopy
Siegerist et al. Novel microscopic techniques for podocyte research
Zhou et al. Continuous subcellular resolution three-dimensional imaging on intact macaque brain
US11802822B2 (en) Multiplexed expansion (MultiExM) pathology
WO2019129646A1 (en) Tissue sample preparation system
US10641782B2 (en) Methods for visualization and quantification of fiber-like structures
Michalska et al. Imaging brain tissue architecture across millimeter to nanometer scales
Parlanti et al. Microscopes, tools, probes, and protocols: A guide in the route of correlative microscopy for biomedical investigation
Orndorff et al. Quantum dot ex vivo labeling of neuromuscular synapses
Debeir et al. Models of cancer cell migration and cellular imaging and analysis
Kim et al. Molecular Decrowding by Tissue Expansion Allows Precise Determination of the Spatial Distribution of Synaptic Proteins at a Nanometer Scale by exTEM
Siegerist Novel Microscopic Techniques for Podocyte Research. Front. Endocrinol. 9: 379. doi: 10.3389/fendo. 2018.00379 Novel Microscopic Techniques for Podocyte Research Florian Siegerist†, Karlhans Endlich† and Nicole Endlich*
Mao Simple Yet Versatile Fluorescent Labeling Methods for Advanced Microscopy Techniques
Zwettler Expansionsmikroskopie kombiniert mit hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
EXSB Decision made by sipo to initiate substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1204677

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant