KR101996722B1

KR101996722B1 - 다채널 박막전극을 이용한 전기적 생체분자 이동방법

Info

Publication number: KR101996722B1
Application number: KR1020170086725A
Authority: KR
Inventors: 장재명; 최영식
Original assignee: 재단법인대구경북과학기술원
Priority date: 2017-07-07
Filing date: 2017-07-07
Publication date: 2019-07-04
Also published as: KR20190005682A

Abstract

본 발명은 생체분자를 전기장을 이용해 이동시키는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 다채널 전극을 통해, 전기장의 방향, 세기 및 패턴을 생체분자의 고유의 전하에 특성에 맞게 제어하여 단백질 또는 핵산 등 생체분자를 원하는 속도와 방향으로 공간 이동시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 전기장 방향을 제어하기 위해서 3개 이상의 다채널 전극을 설치하고, 전기적 스위치를 활용하여 다채널 전극 중에서 임의의 두 개 이상의 전극을 양극 (cathode)과 음극 (anode) 전극으로 선택하여 전원공급 장치와 연결한다. 또한, 본 발명은 다수의 전극을 사용했을 때, 전극을 위치할 수 있는 공간적 한계를 극복하기 위해서 가요성 기판 상에 도전체 예를 들어 금속물질을 얇게 적층한 박막전극을 양면으로 사용하였다. 또한, 본 발명은 전극을 선택하는 전기적 스위치를 컴퓨터로 제어하여 전기장 패턴을 다양하게 구성하고, 현미경 관찰을 통한 되먹임 (feed-back) 알고리즘을 통해 생체분자의 특성에 따라 이동 속도나 위치를 보다 효율적으로 제어한다.

Description

다채널 박막전극을 이용한 전기적 생체분자 이동방법 {A method of electrically moving a biological molecule using multi-channel thin membrane electrodes}

본 발명은 전기장을 이용해 단백질, 핵산등의 생체고분자를 이동시키는 방법에 관한 것이다.

일반적으로 완충용액 속에서 핵산이나 단백질 등의 생체분자들은 전하 (electric charge)를 갖는다. 자연적으로 DNA는 그 구조의 특징상 음전하를 띈다. 단백질의 경우 용액의 pH에 따라서 등전점의 값이 낮으면 음전하를, 높으면 양전하를 갖는 것으로 알려져 있다. 여기서 등전점은 단백질의 순전하 값이 0이 되는 pH이다. 이같이 생체분자를 포함하는 완충용액에 전기장이 인가되면 생체분자는 전기장의 방향과 세기, 그리고 생체분자의 전하와 크기에 따라 이동한다. 구체적으로, 전기장 (E)에 놓인 생체분자의 전하 (q)는 힘

을 받고 이동을 하게 된다. 이 운동에 대한 항력으로 유체의 밀도 (ρ), 입자의 투영면적 (A), 항력계수, 그리고 상대 속도 (V)에 영향을 받으므로 힘

을 받는다. 입자에 대한 레이놀즈수가 1보다 작은 구형입자에서는 운동에 대한 항력을 유체의 점도 (μ)와 입자의 직경 (d_p)의 식

으로 변환할 수 있다. 따라서, 이 두가지 힘이 균형

을 이루게 되면,

가 된다. 즉, 거대분자가 움직이는 속도는 전하의 크기 및 전기장의 세기와 방향에 비례하고, 분자의 크기와 용액의 점도에 반비례 한다.

이처럼 전하를 띠는 물질을 포함하는 용액에 전기장을 인가할 때, 물질이 어느 한방향으로 이동하는 현상을 전기영동이라고 하며, 이러한 원리에 근거하여 물질마다 다른 이동도의 차이를 이용해 단백질이나 핵산 등의 생체분자를 분리, 정제 및 분석 하는 방법을 총칭하여 전기영동법이라고 한다. 전기영동법은 다른 분리, 정제 및 분석 방법과 달리 생체분자에 열성변성을 초래하기 않고, 방법이 매우 단순하며, 재현성이 높다. 또한, 전기영동법을 적용하는 경우 전기장 안에서 전하를 갖는 입자가 이동하는 속도는 입자의 전하량, 크기, 모양, 완충용액의 pH, 및 점성도 등의 여러 가지 요인에 의해 결정되기 때문에 일정한 용액에서 전하를 갖고 있는 입자의 이동속도는 일정한 전기장 안에서 입자 자체의 성질에 따라서 결정된다. 따라서, 전기영동법은 핵산 또는 단백질과 같은 생체분자의 분리, 정제 및 분석에 있어 매우 효과적인 수단이다.

현재까지 개발된 전기영동법은 대표적으로 아가로즈 겔 전기영동, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, SDS-PAGE 전기영동, 간헐 전기장 전기영동법 등이 있다. 지난 수년 동안에 전기영동법은 핵산, 단백질의 분리, 정제 및 분석 등에서 확장되어 생체분자를 이동시키는 관점으로 변화하고 있다. 최근 조직투명화 방법의 하나로 제시된 클래러티 (Clarity^TM) 기법은 전기영동을 이용하는 것으로서, 10 ∼ 60 V 전기장을 인가하여 뇌조직으로부터 지질을 분리하고 투명화 한다. 분자탐색자 (molecular probe)를 전기장 내에 두고 회전체의 의해 순환되는 완충용액으로 이동시켜 뇌조직 염색을 보다 더 효과적으로 수행하는 방법이 보고된 바 있다. 전기영동법을 이용하는 것은, 큰 크기와 복잡한 구조를 갖는 생체조직 내에서 조직 샘플에 대한 손상 없이 보다 더 빠른 속도로 생체분자를 이동시킬 수 있는 장점을 갖는다. 이와 같이, 전기영동을 이용한 조직 염색은 조직의 구조를 그대로 유지하면서 조직 내 항원에 분자탐색자를 결합시킬 수 있어 유리하다.

그러나, 종래기술의 전기영동법은 주로 분리 또는 정제를 목적으로 하는 것으로서, 생체분자를 다양한 공간으로 이동시키는데 한계가 있다. 즉, 기존의 방법은 평행직선형 형태의 젤 안에서 단일방향의 전기장만을 사용하므로, 생체분자를 자유롭게 이동시킬 수 없다. 또한, 종래기술에 따른 전기영동은 일반적으로 일정한 전압을 지속적으로 인가하는 방법을 이용한다. 그 밖에 일부 종래기술이 생체분자가 갖는 특성에 따라 완충용액의 점도를 수정하거나 전기장 세기를 변화시키는 것을 제시하고는 있으나, 전기장의 방향 또는 패턴을 변화시키는 것을 구체적으로 기술하거나 시사한 바 없다. 종래기술의 다른 예로서, 간헐 전기장 (pulsed electric field)을 이용하는 전기영동법의 경우, 변조전파 조절 장치를 이용해 거의 수직 관계의 두 전기장을 바꾸어가면서 간헐적으로 전기장을 인가한다. 그러나 이러한 방법은 예를 들어, 2 Mb 이상의 큰 크기를 갖는 DNA 분자를 분리하는 것이 목적으로서, 생체분자를 공간적으로 자유롭게 이동하여 위치시키는 것은 불가능하다. 마찬가지로, 이차원 전기영동법은 단백질 혼합물을 각 단백질의 등전점에 따라 일차적으로 분리하고, 전개된 시료가 분리된 방향에 대해 수직방향으로 전기장을 가하여 분리하는 방법으로 등전초점조절 (isoelectric focusing)과 SDS-PAGE가 결합된 기술이다. 그러나 이 방법 또한 평행직선형 형태의 전기장을 이용하고 있으며, 이를 생체분자의 자유로운 위치 조정에 활용함에 있어서는 한계가 있다. 특히, 단백질을 이용한 세포 또는 조직 염색 방법에서 기존의 전기영동법을 이용한 염색방법은 생체분자를 일 방향으로 움직이면서 결합시키는 방식을 채택하기 때문에 시간과 비용 등 측면에서 효율성이 떨어진다.

이에 본 발명자들은 상기 종래기술의 문제점을 극복하기 위해 부단히 노력한 결과, 전기영동에 다채널 전극을 이용하고, 전자제어 기술을 접목 하여, 전기장의 방향, 세기 및 패턴을 생체분자 고유의 특성에 맞게 제어함으로써, 단백질 또는 핵산 등의 생체분자를 원하는 속도와 방향으로 전기적으로 공간적으로 이동시킬 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

WO 2003058229 2003.07.17. WO 1998059092A1 1998.12.30.

Chung K et al., Nature, 497: 332-337 (2013) Kim SY et al., PNAS, 112(46): E6274-E6283 (2015)

이와 같이, 본 발명은 전기장 내에서 핵산 또는 단백질과 같은 생체분자의 전기장 내 이동 방향과 속도를 생체분자의 특성과 이를 수용하는 완충용액의 점도 (viscosity)에 따라 자동제어 하는 전기영동방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 전기장 내 생체분자 이동을 위한 전기영동장치 또는 시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 생체분자 예를 들어, 단백질 또는 핵산 등에 대한 전기영동을 수행함에 있어서, 전기장의 세기 및 방향을 조절하고, 인가하는 전기장의 패턴을 제어하는 방법을 제공한다. 본 발명의 일 예에서, i) 내부가 빈 원기둥, 다각기둥 또는 비정형기둥을 형성하는 가요성 기판의 내측면 상에 구비된 3쌍 이상의 전극을 포함하는 다채널 전극에 의해 둘러싸인 공간에 생체분자를 포함하고 유체가 이동할 수 있는 전도성물질을 제공하고; 및 ii) 상기 다채널 전극으로부터 연속 또는 불연속적으로 변경되는 임의의 한 쌍의 전극을 선택하고 이에 전기를 공급하여 상기 전도성물질에 전기장을 인가하는 것을 포함하는, 다채널 전극을 이용하여 유체가 이동할 수 있는 전도성물질 내에서 생체분자를 이동시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 일예에서, 상기 생체분자를 이동시키는 방법은, 상기 ii)에서 전기장을 인가한 후, 상기 생체분자의 이동을 측정하고 모니터링 하는 것을 추가로 포함하며, 컴퓨터와 연계된 되먹임 알고리즘 (feedback algorithm)으로 상기 모니터링 결과와 함께 생체분자 및 전도성물질의 특성에 따라 전기장의 세기, 방향 및 패턴을 제어하는 것인, 다채널 전극을 이용하여 유체가 이동할 수 있는 전도성물질 내에서 생체분자를 이동시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 내부가 빈 원기둥, 다각기둥 또는 비정형기둥을 형성하는 가요성 기판과 상기 기판의 내측면 또는 외측면 상에 구비되고 3쌍 이상의 전극을 포함하는 다채널 전극으로 구성된 전극모듈; 상기 기판의 내측면 또는 외측면에 의해 규정되고, 유체가 이동 할 수 있는 전도성물질 및 셍체분자를 포함하는 전기장인가부; 및 상기 전극에 전기를 공급하는 전원공급부로 구성된 다채널 전극 전기영동장치를 제공한다. 상기 전극모듈과 전기장인가부는 다양한 형태의 용기에 수용될 수 있다. 본 발명의 일 예에서, 상기 다채널 전극은, 복수 개의 전극 배치와 이들의 배선으로 인한 공간적 제한을 극복하기 위해, 상기 기판 상에 금속성 도전체를 얇게 적층한 박막전극으로 제작될 수 있으며, 상기 각 전극은 이웃하는 다른 전극과 이격하도록 배치된다. 이와 같이, 본 발명은 유연한 가요성 기판을 사용하므로, 상기 다채널을 구성하는 전극은 기판이 형성하는 원형기둥 또는 다른 형태의 기둥의 내측면에 배치될 수 있다. 또한, 상기 기판 내측면 상에 구비된 전극의 수와 이들이 배치된 구조에 따라, 360° 모든 방향으로 다양한 방향성을 제공하는 전기장이 생성 될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 전극과 상기 전도성물질 또는 전도성물질 내의 생체분자가 직접 접촉하여 발생할 수 있는 전기화학반응과 이에 따른 부작용을 방지하기 위해, 상기 전극을 구성하는 금속성 도전체와 상기 전도성물질을 물리적으로 분리하고 구획하는 하이드로젤 내벽 (hydrogel inner wall)을 상기 기판의 내측면 (또는 외측면)에 추가로 구비하는 전기영동장치를 제공한다. 상기 하이드로젤 내벽은 예를 들어, 상기 전도성물질 내의 생체분자가 전극과 직접 접촉하지 않도록 함으로써, 생체분자의 변성을 방지할 수 있다.

또한, 본 발명은 전기장 인가 시에 전극으로부터 발생하는 전기화학반응의 부산물이 상기 전도성물질 예를 들어, 완충용액 내로 유입되는 것과 이에 따라 상기 완충용액이 기화되는 것을 방지하기 위해 전기장인가부 상부에 착탈가능 한 캡부재 (cap member)를 더 포함할 수 있다. 전기영동 수행 시 캡부재를 전기장인가부 상부에 체결함으로써, 전기화학반응 시 전극에서 발생하는 부산물이 완충용액에 유입되지 않도록 제어하여 완충용액의 물성 (pH, 조성물질 등)이 변하는 것을 방지하고, 생체분자의 이동에 영향을 주는 전기장 이외의 다른 변수를 최소화 할 수 있다.

또한, 본 발명은 내부가 빈 원기둥, 다각기둥 또는 비정형기둥을 형성하는 가요성 기판과 상기 기판의 내측면 상에 구비되고 3쌍 이상의 전극을 포함하는 다채널 전극으로 구성된 전극모듈; 상기 기판의 내측면에 의해 규정되고 유체가 이동 할 수 있는 전도성물질 및 생체분자를 포함하는 전기장인가부; 및 상기 전극에 전기를 공급하는 전원공급부로 구성된 다채널 전극 전기영동장치에 더하여, 모니터링부 및 제어부를 추가로 포함하는 전기영동시스템을 제공한다. 본 발명의 일 예에서, 상기 모니터링부는 생체분자의 이동을 측정 및 관찰하기 위한 관찰수단 (예를 들어, 현미경) 및 이미징수단 (예를 들어, 카메라)을 포함한다. 또한, 상기 제어부는 무선데이터통신과 무선인터넷 등을 포함하는 유무선 통신수단을 이용한 양방향 통신이 가능한 컴퓨터 및 정보입/출력장치 (I/O모듈)로 구성되며, 상기 컴퓨터는 모니터링부에서 제공된 정보를 저장하고,생체분자 및 전도성물질의 특성과 함께 상기 제공된 정보를 분석하며, 상기 입/출력장치를 통해 전원공급부에 전기장의 세기, 방향 및 패턴을 제어하기 위한 명령을 제공한다. 이와 같이, 본 발명의 전기영동시스템은 컴퓨터를 이용해 전기적 스위치를 제어할 뿐만 아니라, 전기장의 세기를 조절하고 생체분자의 이동을 현미경의 카메라로부터 관찰할 수 있는 되먹임 회로시스템으로 구성할 수 있다.

본 발명은 다채널 (박막) 전극을 이용하여 전기장의 세기, 방향 및 패턴을 제어하는 방법 및 이를 이용한 전기영동장치에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 전기장 내 생체분자의 이동성을 조절할 수 있으므로, 생체 조직 (tissue)과 같은 복잡한 구조를 갖는 큰 규모의 샘플의 내부나 외부로 생체분자를 보다 더 용이하게 이동시킬 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면, 전기장 하에서 생체조직 내 또는 완충용액과 같이 유체 내를 이동하는 생체분자를 측정수단 예를 들어, 현미경을 통해 모니터링 하고 컴퓨터와 연계된 되먹임 알고리즘 (feedback algorithm)을 통해 제어함으로써, 생체분자의 특성과 완충용액의 점도 등 물성에 따라 생체분자의 이동속도 및/또는 방향을 용이하게 제어할 수 있다. 또한, 종래기술과 비교하여 시간 및 비용 면에서 효율적이고 안정적으로 생체 조직 염색을 수행할 수 있다. 예를 들어, 본 발명과 종래기술의 방법에서 같은 세기의 전기장을 인가하기 위해 본 발명은 30 V 이하의 전압을 이용하는 반면에 종래기술은 100 V 이상의 직류 전압을 사용하며, 이는 부주의에 의한 감전 및 이로 인한 화상 등의 위험과, 염색하고자 하는 조직에 대한 손상을 초래 할 수 있다. 또한, 생체분자를 완충용액 내의 유체 흐름을 통해 이동시키는 경우, 완충용액의 흐름과 생체조직 표면에서 생성되는 마찰력에 의해서 유체 속도에 따라 조직의 손상이 증가할 수 있는 문제가 있는 반면에, 본 발명에서 생체분자는 유체 흐름 없이 이동되므로 조직 손상이 없다. 또한, 본 발명에 따르면, 박막 전극과 박막 전극을 둘러싸는 젤을 이용할 수 있으며, 완충용액과 전극으로만 이루어지는 조직염색방법 보다 사용되는 완충용액의 양이 1/2 정도 덜 들어간다. 따라서, 같은 농도로 같은 크기의 조직을 염색할 때 사용되는 생체분자의 양이 감소되므로 경제적이다. 뿐만 아니라, 같은 크기와 같은 조성을 갖는 원통형 고체 하이드로젤을 염색한 결과, 종래방법과 비교하여 약 1/4의 시간으로 염색이 가능한 것으로 확인하였다.

도 1은 본 발명에 사용되는 다채널 박막전극의 일 예를 펼쳐놓은 사진이다.
도 2는 본 발명의 전기영동장치의 (a) 각 구성의 구조도 및 (b) 전기영동장치 사진 을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 (a) 전기영동장치 제어 시스템 및 (b) 알고리즘 순서도 이다.
도 4는 본 발명의 전기영동장치를 이용하여 미세유체소자 내 (0.5 MOhm)에서 이동하는 분자탐색자 (FITC-dextran, Sigma-Aldrich, USA)의 속도를 측정한 결과이다.
도 5는 본 발명의 전기영동장치를 이용하여 십자형태 모형에서 분자탐색자 (Alexa Flour 488, Molecular Probe, USA)를 제어한 것을 나타낸다.
도 6은 본 발명에 사용되는 전기영동장치의 안정성을 나타낸 것으로 pH의 변화가 거의 없고, 생체조직의 변형이 없음을 나타낸다.
도 7은 본 발명의 전기영동장치를 이용하여 생체조직에 분자탐색자에 해당하는 단백질을 결합하여 조직면역화학 염색을 한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에 사용되는 전기영동장치를 이용해 높이 6 mm, 지름 8 mm의 원통형 폴리아크릴아미드 젤에 분자탐색자 (BSA-FITC, Sigma-Aldrich, USA)를 통과시킨 결과 나타낸 것이다.

본 발명을 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명하면 다음과 같다.

도 1은 다채널 박막전극 (112)의 구조도로서, 박막전극은 절연체인 가요성 필름형 기판 (111) (Liquid Crystal Polymer Film (토닥(주)), Durimide 7000 (FujiFilm), Photosensitive polyimide (KUMHO PETROCHEMICAL) 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다) 위에 물이나 공기에 의해 쉽게 산화되지 않는 금속성 도전체 (예를 들어, Au, TiN, IrOx, 및 Pt을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다)을 반도체 공정을 이용해 적층 (상기 예에서, Au의 경우 진공증착 (evaporation), 나머지의 경우 스퍼터링 (sputtering)) 한 후, 전극 부분을 제외하고 다시 필름을 적층하여 전극이 생체분자가 이동할 수 있는 전도성 물질, 대표적으로, 세포조직 또는 완충용액 중에 노출되도록 하고 나머지 다른 부분은 절연시켰다. 본 발명에서 전극을 이루는 금속물질의 그 배치된 패턴을 임의로 변경할 수 있으며 전극의 크기를 적절하게 조절함에 의해 필요한 수의 전극을 갖도록 할 수 있다. 또한, 각 전극은 서로 이격 되도록 배치하고, 상기 필름형 기판의 양면이 접착되도록 할 수 있으며, 상기 전극 간 이격된 부위로 하이드로젤이 유입되어, 전극을 효과적으로 둘러싸도록 할 수 있다. 박막전극을 양면으로 접착하여 내측면과 외측면에 부착하여 사용하면, 상기 전극 간 이격된 부위로 전기장이 흐르는 동시에 전극 간 배선의 복잡성과 공간적인 한계를 극복할 수 있다.

도 2는 본 발명에서 사용되는 전기영동장치 (100)의 일 구현예의 각 구성의 구조도 및 사진이다. 도 1의 기판 (111) 및 박막전극 (112)은 전극모듈을 구성하고, 하이드로젤 내벽 (121)이 전기장인가부 (120) 내에서 전도성물질 (122)과 박막전극 (112) 및 기판 (111)을 구획한다. 캡부재 (123)는 전기장인가부 (120) 내 전도성물질 (122)의 개방된 상부에 착탈가능 하도록 구비된다. 도 2에서 상기 하이드로젤 내벽 (121)과 상기 박막전극 (112)은 바닥부 (110) 예를 들어, 통상의 페트리디쉬 상에 구비된다. 하이드로젤 내벽 (121) 내에 생체분자를 포함하는 전도성물질 (122), 예를 들어, 완충용액 또는 생체조직이 제공된다. 본 발명의 다채널 박막전극은 유연한 가요성 기판 상에 박막전극이 구비되므로, 전극을 고정하는 수단의 형태에 따라 다양하게 변경 될 수 있다.

도 3을 참조하여 본 발명의 전기영동장치시스템 (300)을 설명한다. 상기 전기영동장치시스템은 상기 전기영동장치 (100)에 더하여, 전원공급장치 (311) 및 릴레이모듈 (312)로 구성된 전원공급부 (310); 입출력 장치 (321) 및 컴퓨터 (322)로 구성된 제어부 (320), 및 관측수단 (331) 및 이미징수단 (332)로 구성된 모니터링부 (330)를 포함한다. 상기 관측수단은 예를 들어, 광학현미경 또는 전자현미경이며, 상기 이미징수단은 예를 들어 카메라를 이용하여 형광이미지를 수득하는 것을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 모니터링부 (330)는 전기장 내에서 이동하는 생체분자를 모니터링하고 이를 이미지 정보와 함께 상기 컴퓨터 (322)에 전달한다. 상기 컴퓨터 (322)는 상기 모니터링부 (330)로부터 수신한 정보를 저장, 분석 및 연산 처리하고, 그 결과에 따라 또는 작업자가 미리 입력한 값에 따라, 다채널 전극의 양극 및 음극 정보, 전기장의 세기, 방향 및/또는 패턴을 제어하기 위해 상기 I/O모듈 및/또는 릴레이모듈을 통해 신호를 전달한다. 본 발명의 일 예에서, 상기 모니터링부 (330)에 의해 제공되는 생체분자의 위치와 속도에 따라 전기장의 방향과 패턴을 제어하는 되먹임 알고리즘 (feedback algorithm)이 구성된다.

본 발명에서 “생체분자”는 생물체를 구성하거나 생물체에서 기능을 갖는 분자 (molecule)로서, 핵산, 단백질, 지질, 및 고분자다당류를 포함하여 생명체에서 생성되는 유기화합물을 의미한다.

본 발명에서 “채널”은 한 쌍의 양극과 음극에 의해 형성되는 전하 이동경로를 의미한다. 다수의 전극은 그 개수에 상관없이 한 쌍으로 이루어질 때, 채널의 단위로 구분될 수 있다.

본 발명에서 “전도성물질”은 완충용액, 생체 조직을 포함하며, 상기 전도성물질 중에 포함된 생체분자는 전기장 인가에 따라 특정 방향으로 이동할 수 있다.

본 발명에서 “내부가 빈”은 공동 (cavity)가 형성된 것을 의미한다.

이하 실시 예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 생체분자 확산속도의 비교

본 발명에 따른 8개의 채널을 지닌 다채널 박막전극 전기영동장치를 이용하여 전기장을 인가하고, 분자탐색자의 확산속도를 전기장을 인가하지 않은 경우와 비교하였다. 분자탐색자로서 FITC-dextran ((Fluorescein isothiocyanatedextran, Sigma-Aldrich, USA)를 전도성물질로서 완충용액 (Phosphate buffered saline with Tween-20, Sigma-Aldrich, USA)을 사용하였다. FITC-dextran을 완충용액에 1:100 (v/v)이 되도록 혼합하였고, 이것은 미세유체 채널의 주입구(reservoir)에 넣었다. 분자탐색자의 이동속도는 현미경 (TS100, Nikon, Japan)에 설치된 카메라 (TCH-1.4CHICE, Tucsen, China)를 사용하였다. 높이가 100 ㎛ 이고, 2.5 ㎜ (너비) × 6.0 mm (길이)의 미세유체채널 (0.5 MOhm의 저항값)을 통과시키고, 전기장의 세기 (각각 1,000 V/m, 1,500 V/m 및 2,000 V/m)에 따른 생체분자 이동속도를 측정하였다. 그 결과를 도 4에 나타냈다.

실시예 2: 생체분자의 이동방향 분석

본 발명의 전기영동장치를 이용하여 분자탐색자의 이동방향을 분석하였다. 십자형 구조물 (높이 2mm, 간격 2mm, 길이 10mm) 내에 상기 실시예 1에서와 마찬가지로 1:100 (v/v)로 완충용액 내에 포함시킨 분자탐색자에 대해, 90°간격으로 1,000 V/m 전기장을 인가한 후, 0, 39, 51 및 90초에 분자탐색자의 이동방향을 현미경 (TS100, Nikon, Japan)에 설치된 카메라 (TCH-1.4CHICE, Tucsen, China)를 이용하여 관찰하였다. 도 5는 그 결과를 나타낸 것이다.

실시예 3: 생체조직 염색 및 안정성 분석

먼저, 전기영동에서 통상적으로 사용되는 완충용액 (Phosphate buffered saline with Tween-20, Sigma-Aldrich, USA)을 본 발명의 전기영동장치의 전기장인가부에 넣고, 1:100의 비율로 분자탐색자 (beta tubulin conjugated Alexa Flour 488, Molecular Probe, USA)를 가하였다. 48시간 동안 1,000 V/m의 전기장을 1초 간격으로 연속하여 인가한 후, 시간별 pH 변화를 관찰하였다. 전기장은 인가하지 않은 것을 대조군으로 하였다. 하이드로젤 내벽 두께가 9 ㎜인 것과 비교하여 3 ㎜에서 완충용액의 pH가 시간 경과에 따라 다소 감소한 것으로 나타났다. 그러나, 3 ㎜ 두께의 얇은 하이드로젤 내벽을 사용한 경우에도, 본 발명의 전기영동장치를 사용하여 전기장을 인가한 것과 대조군의 pH가 큰 차이를 보이지 않았다.

본 발명에 따른 전기영동시스템을 이용하여 생체조직을 염색하였다. 이를 위해, 상기 준비한 생체조직 (8.2 mm x 12.5 mm x 6.0 mm, mouse brain (P1), 한국뇌연구원)을 완충용액 (Phosphate buffered saline with Tween-20, Sigma-Aldrich, USA)에 가한 후 캡부재를 체결하고, 전기장을 인가한 후 현미경 (UltraMicroscope II, Lavision BioTec, Germany)으로 관찰하였다. 현미경은 제조자의 지시에 따라 암실에서 사용하였다. 시스템상의 컴퓨터를 이용하여 다채널 박막전극에서 대향되는 위치의 서로 다른 두 개의 채널이 자동으로 선택되도록 하였다. 구체적으로, 전극 간의 거리를 입력하여 전기장의 세기가 1000 V/m이 되도록 조정하였으며, 전기장 인가 시간을 1초로 설정하고, 전기장 인가 후 채널을 변경하는 시간을 2초로 설정하였다. 다음 본 발명의 전기영동시스템을 작동시키고, 생체분자의 이동을 관찰하였다. 생체조직에 분자탐색자 (beta tubulin conjugated Alexa Flour 488, Molecular Probe, USA)를 1:100의 비율로 가하여 도입시킨 후, 5시간 후에 현미경으로 생체조직을 관찰하였다. 그 결과, 생체조직에 분자탐색자에 해당하는 단백질이 결합되어 있음을 확인하였다 (도 7).

실시예 4: 생체분자 확산 속도 비교

분자탐색자로서 BSA-FITC (Fluorescein isothiocyanate labelled bovine serum albumin, Sigma-Aldrich, USA)를 1:100 (v/v)의 비율로 완충용액 (Phosphate buffered saline with Tween-20, Sigma-Aldrich, USA)에 넣어 사용하였다. 높이 6 ㎜, 지름 8 ㎜의 원통형 폴리아크릴아미드 젤에 상기 분자탐색자를 통과시키고 이를 관찰하였다. BSA-FITC를 12시간 동안 확산 (diffusion) 시킨 경우에는 상기 원통형 젤을 거의 통과하지 못했으나, 본 발명의 전기영동장치를 이용하여 1,000 V/m 세기의 전기장을 인가 한 경우 12 시간동안 처리에서 원통형 젤을 골고루 통과한 것이 관찰되었다. 그 결과를 도 8에 나타냈다.

본 발명은 생체분자를 전기장을 이용해 이동시키는 방법에 관한 것으로서, 핵산 또는 단백질과 같은 생체분자의 분리, 정제 및 분석이 필요한 생명공학실험실이나, 임상에 효과적으로 이용될 수 있다.

Claims

내부가 빈 원기둥, 다각기둥 또는 비정형기둥을 형성하는 가요성 기판과 상기 기판의 내측면 상에 구비되고, 각각 한 쌍의 전극이 상호 대향하도록 배치된 세 쌍 이상의 전극을 포함하는 다채널 박막전극을 포함하는 전극모듈;
상기 기판의 내측면에 의해 규정되고, 유체가 이동 할 수 있는 전도성물질 및 생체분자를 포함하는 전기장인가부; 및
상기 다채널 박막전극으로부터 연속적 또는 불연속적으로 채널이 변경되도록 선택되어 임의의 대향하는 한 쌍의 전극에 대해 전기를 공급하는 것인 전원공급부를 포함하여, 360° 모든 방향에서 임의의 방향성을 제공하는 전기장이 전기장인가부에 제공되는 것인,
다채널 박막전극 전기영동장치.
제1항에 있어서, 상기 박막전극은, 상기 기판 상에 금속성 도전체를 적층한 박막전극인 것인, 다채널 박막전극 전기영동장치.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 박막전극 각각은 이웃하는 다른 박막전극과 이격되어 구비된 것인, 다채널 박막전극 전기영동장치.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 전도성물질은 생체조직 또는 완충용액이며, 상기 생체분자는 핵산, 단백질, 지질 및 고분자다당류로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 것인, 다채널 박막전극 전기영동장치.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 박막전극과 상기 전도성물질을 구획하는 하이드로젤 내벽 (hydrogel inner wall)이 상기 기판의 내측면에 추가로 구비된 것인, 다채널 박막전극 전기영동장치.
i) 내부가 빈 원기둥, 다각기둥 또는 비정형기둥을 형성하는 가요성 기판의 내측면 상에 구비되고, 각각 한 쌍의 전극이 상호 대향하도록 배치된 세 쌍 이상의 전극을 포함하는 다채널 박막전극에 의해 둘러싸인 공간에 생체분자를 포함하고 유체가 이동할 수 있는 전도성물질을 제공하고; 및
ii) 상기 다채널 박막전극으로부터 연속적 또는 불연속적으로 채널이 변경되도록 선택되어 임의의 대향하는 한 쌍의 전극을 통해 상기 전도성물질에 360° 모든 방향에서 임의의 방향성을 제공하는 전기장을 인가하는 것을 포함하는,
다채널 박막전극을 이용한 전기적 생체분자 이동방법.
제6항에 있어서, 상기 ii)에서 전기장을 인가한 후, 상기 생체분자의 이동을 측정하고 모니터링 하는 것을 추가로 포함하며, 컴퓨터와 연계된 되먹임 알고리즘 (feedback algorithm)으로 상기 모니터링 결과와 함께 생체분자 및 전도성물질의 특성에 따라 전기장의 세기, 방향 및 패턴을 제어하는 것인,
다채널 박막전극을 이용한 전기적 생체분자 이동방법.
내부가 빈 원기둥, 다각기둥 또는 비정형기둥을 형성하는 가요성 기판과 상기 기판의 내측면 상에 구비되고, 각각 한쌍의 전극이 상호 대향하도록 배치된 세 쌍 이상의 전극을 포함하는 다채널 박막전극을 포함하는 전극모듈;
상기 기판의 내측면에 의해 규정되고 유체가 이동할 수 있는 전도 성물질을 및 생체분자를 포함하는 전기장인가부; 및 상기 다채널 박막전극으로부터 연속적 또는 불연속적으로 채널이 변경되도록 선택되어 임의의 대향하는 한 쌍의 전극에 대해 전기를 공급하는 것인 전원공급부를 포함하여, 360° 모든 방향에서 임의의 방향성을 제공하는 전기장을 전기장인가부에 제공하도록 구성된, 다채널 전극 전기영동장치에 더하여,
생체분자의 이동을 측정 및 관찰하기 위한 관찰수단 및 이미징수단을 포함하는 모니터링부; 및
무선데이터통신과 무선인터넷 등을 포함하는 유무선 통신수단을 이용한 양방 향 통신이 가능한 컴퓨터 및 I/O모듈로 구성되며, 상기 컴퓨터는 모니터링부에서 제공된 정보를 저장하고, 상기 생체분자 및 전도성물질의 특성과 함께 상기 제공된 정보를 분석하며, 상기 I/O모듈을 통해 전원공급부에 전기장의 세기, 방향 및 패턴 을 제어하기 위한 명령을 제공하는 제어부를 추가로 포함하는,
다채널 박막전극 전기영동시스템.
제8항에 있어서, 상기 박막전극과 상기 전도성물질을 구획하는 하이드로젤 내벽 (hydrogel inner wall)이 상기 기판의 내측면에 추가로 구비된 것인, 다채널 박막전극 전기영동시스템.
제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 전도성물질은 생체조직 또는 완충용액이며, 상기 생체분자는 핵산, 단백질, 지질 및 고분자다당류로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 것인, 다채널 박막전극 전기영동시스템.
제1항 또는 제2항의 전기영동장치를 이용하여 생체조직을 염색하는 방법.
제1항 또는 제2항의 전기영동장치를 이용하여 생체조직을 투명화 하는 방법.
제8항 또는 제9항의 전기영동시스템을 이용하여 생체조직을 염색하는 방법.
제8항 또는 제9항의 전기영동시스템을 이용하여 생체조직을 투명화 하는 방법.