CN103558055A - 一种针对感染病毒的病变细胞的定位超薄切片方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种针对感染病毒的病变细胞的定位超薄切片方法，该方法包括以下步骤：（1）以腔室玻片作为包埋模具，以感染病毒的细胞为模型，当细胞出现病变时，用树脂原位包埋细胞，（2）通过修块直接暴露目标细胞，或钻取目标细胞后再通过修块暴露目标细胞，（3）针对目标细胞进行超薄切片，（4）采用透射电子显微镜观察目标细胞的超薄切片。

Description

一种针对感染病毒的病变细胞的定位超薄切片方法

技术领域

本发明涉及一种针对感染病毒的病变细胞的定位超薄切片方法，其属于超薄切片制样领域。

背景技术

透射电子显微镜（Transmission electron microscope，TEM）技术是检测和研究病毒的重要手段，也是未知病原诊断和生物恐怖袭击病原鉴定的首选技术之一（参考文献1,2）。TEM技术在乙型肝炎病毒、轮状病毒、汉坦病毒、SARS-Cov等许多病毒的发现和鉴定过程中发挥过重要作用（参考文献3-6）。

负染技术和超薄切片技术是组成生物TEM技术体系的重要技术。液体标本主要通过负染技术进行检测，组织和培养细胞等固体标本主要通过超薄切片技术进行检测。通常情况下，培养的贴壁细胞的超薄切片制样过程需要以下步骤完成：首先通过胰酶消化使细胞脱离培养界面或直接用细胞刮子刮脱细胞，再将脱壁的细胞进行离心使细胞聚集成团块，继而对细胞团块进行醛类和锇酸双固定、梯度乙醇（或环氧丙烷或丙酮）脱水、树脂浸润、包埋、聚合、修块、和切片等处理程序。上述方法仍然是感染病毒细胞透射电镜检测的主要手段。上述传统方法有如下几个不足之处：（1）由于通过离心使细胞沉淀而形成团块，使得所观察的细胞是随机的，往往需要花费较长时间和精力寻找目标细胞，从而降低了检测效率。（2）在细胞的收获过程中由于对细胞进行酶消化或刮取等操作，对细胞造成了不可避免的人工损伤，从而改变了细胞的自然状态，包括细胞的形状、细胞器的功能形态及细胞超微结构的改变等；（3）当病变细胞的数量比例较小时，电镜检测到目标细胞的几率也较小，所以一般会采用延长培养时间，以使病变细胞数量增多，从而增加超薄切片检测的几率，但是这就会延长电镜检测的周期；（4）与贴壁细胞原位处理相比，细胞团块体积大，固定、脱水、浸润等步骤需要较长的时间。比如对细胞团块进行固定一般需要1小时，而单层细胞固定仅需5-10分钟即可。细胞团块进行脱水需要至少1小时，而贴壁细胞仅需10分钟。对细胞团块进行浸润、洗涤等步骤的时间也远长于贴壁细胞。

为了实现针对目标细胞进行超薄切片，洪涛等建立了钉扣包埋方法（参考文献7,8），以实现对贴壁培养细胞中的目标细胞进行定位取样与超薄切片操作，但该方法对细胞进行钉扣的技术要求高，操作繁琐。为实现针对目标细胞的超薄切片操作，本研究对感染细胞通过修块以直接暴露目标细胞，再进行垂直于目标细胞平面的超薄切片；或用空芯钻头钻取目标细胞，再针对目标细胞进行平行于目标细胞平面的超薄切片，通过上述两种方法实现对目标细胞的定位超薄切片，提高超薄切片电镜检测病变细胞的效率。

[参考文献1]Hazelton P R,Gelderblom H R.Electron microscopy for rapiddiagnosis of infectious agents in emergent situations.Emerg Infect Dis,2003,9(3):294-303.

[参考文献2]Biel S S,Gelderblom H R.Diagnostic electron microscopy isstill a timely and rewarding method.J Clin Virol,1999,13(1-2):105-19.

[参考文献3]Dane D S,Cameron C H,Briggs M.Virus-like particles inserum of patients with Australia-antigen-associated hepatitis.Lancet,1970,1:695–698.

[参考文献4]Bishop R F,Davidson G P,Holmes I H,et al.Virus particles inepithelial cells of duodenal mucosa from children with acute nonbacterialgastroenteritis.Lancet,1973,2:1281–1283.

[参考文献5]Hung T,Xia S M,Zhao T X,et al.Morphological evidence foridentifying the viruses of hemorrhagic fever with renal syndrome as candidatemembers of the Bunyaviridae family.Arch Virol,1983,78(1-2):137-144.

[参考文献6]Drosten C,Gunther S,Preiser W,et al.Identification of anovel coronavirus in patients with severe acute respiratory syndrome.New Engl JMed,2003,348:967–976.

[参考文献7]洪涛.生物医学超微结构与电子显微镜技术[M].北京科学出版社,1984,

[参考文献8]洪涛，方肇寅，周静仪，等.电子显微镜观察病毒感染细胞包埋技术的改进.微生物学报，1973，13：44-50

发明内容

发明要解决的问题

本发明的目的是解决现有细胞样本超薄切片技术中存在的目标细胞分布随机、定位不准确、检测效率低的问题，提供一种针对感染病毒的病变细胞的定位超薄切片方法。所述方法能准确暴露目标细胞，并对其进行定位超薄切片，以提高超薄切片的电镜检测效率。

用于解决问题的方案

本发明提供了一种针对感染病毒的病变细胞的定位超薄切片方法。该方法包括以下步骤：（1）以腔室玻片作为包埋模具，以感染病毒的细胞为模型，当细胞出现病变时，用树脂原位包埋细胞，（2）通过修块直接暴露目标细胞，或钻取目标细胞后再通过修块暴露目标细胞，（3）针对目标细胞进行超薄切片，（4）采用透射电子显微镜观察目标细胞的超薄切片。

本发明所述的方法，其中所述步骤（2）中的修块暴露为通过刀片将目标细胞周围的细胞及树脂切除。

本发明所述的方法，其中所述步骤（2）中的钻取目标细胞为通过空芯钻头钻取树脂块上的目标细胞。

本发明所述的方法，其中所述步骤（3）中的目标细胞的超薄切片操作为垂直于处理细胞平面进行超薄切片。

本发明所述的方法，其中所述步骤（3）中的目标细胞的超薄切片操作为平行于处理细胞平面进行超薄切片。

本发明所述的方法，其中所述方法包括将切片位置定位在目标细胞部位。

本发明所述的方法，其中所述病毒为人腺病毒或流感病毒。

本发明所述的方法，其中所述方法包括对目标细胞进行固定、脱水、浸润、包埋和超薄切片。

本发明所述的方法，其中所述目标细胞的固定、脱水、浸润、和包埋过程均在原位进行。

本发明所述的方法，其中所述超薄切片厚度为70-100nm。

发明的效果

本发明通过定位超薄切片技术成功对目标病变细胞进行超薄切片，可以在目标细胞的切片上容易地观察到病毒颗粒。本发明提供一种针对目标细胞的定位超薄切片方法，该方法具有准确定位、快速检测病变细胞的能力，从而提高电镜检测效率。

本发明的病变细胞定位超薄切片法与传统超薄切片法相比具有以下优点：①定位准确：本发明所述方法将切片位置定位在目标细胞部位，降低了电镜观察时的随机性，缩短了电镜检测时寻找目标细胞的时间。②节约时间：本发明所述方法在细胞刚刚产生病变时即可进行制样，无需等到大量细胞出现病变时再进行制样，因此可以将电镜检测的时间点提前，从而节约了时间。此处本发明所述方法还可以结合微波制样技术，实现一个工作日内即可完成检测，与传统超薄切片制样需要数天相比，大大缩短了电镜检测的时间。本发明所述方法直接对贴壁细胞进行固定，不需进行将细胞从培养平面上脱离下来，以及将脱落下的细胞进行离心操作等操作，简化了操作程序，从而缩短了制样时间。对贴壁细胞的固定、脱水、浸润、洗涤等步骤均比对细胞团块进行操作的时间大大缩短。③尽量保持了细胞的自然状态：本发明所述方法对细胞的固定、脱水、浸润、包埋等操作均可在原位进行，避免了对细胞进行酶消化或刮取、离心等操作过程对细胞造成的损伤。④实验材料消耗少：本发明所述方法检测每个样本仅需要1cm×1cm贴壁细胞量即可，因此所需培养细胞、电镜制样的细胞培养基、固定液、脱水剂、和包埋树脂等试剂、耗材用量较少。

综上，本发明所述的病变细胞定位超薄切片法具有精确定位目标细胞并进行超薄切片及制样时间短等优点，适用于细胞超微结构研究、病毒形态及形态发生学研究及突发疫情、未知病原检测等应急事件。

附图说明

图1为以腔室玻片为模具包埋贴壁培养细胞。其中，A:腔室玻片；B:腔室玻片底座上作为包埋模具的由垫圈形成的凹槽；C:将腔室玻片底座覆盖在腔室垫圈形成的凹槽上，使聚合后的包埋块具有平整的表面；D:聚合后的树脂包埋块正、侧面观；

图2为通过修块暴露目标细胞。其中，A:显微镜下定位目标细胞（虚线框内示病变细胞部位）；B:通过修块暴露的目标细胞（虚线框内示病变细胞部位）及垂直于细胞平面超薄切片的部位（实线所示）。

图3为通过空芯钻头分离目标细胞。其中，A:在显微镜下定位目标细胞（黑框所示）；B:空芯钻头钻取目标细胞后在包埋块上形成的圆孔；C:空芯钻头钻取的含有目标细胞（黑框所示）的树脂块。

图4为Ad5感染HEK293目标细胞的垂直于细胞平面超薄切片电镜检测结果。其中，A:病变细胞超薄切片的低倍观察结果；A1:细胞核内散布的病毒颗粒；A2:细胞核内呈结晶状排列的病毒颗粒。A1和A2中的插图为黑框所示区域的放大图。

图5为H1N1感染MDCK目标细胞的垂直于细胞平面超薄切片电镜检测结果。其中，A:病变细胞超薄切片的低倍观察结果，插图显示细胞表面的杆状的病毒颗粒；B:细胞外大量流感病毒颗粒，箭头指示流感病毒的横切面。

图6为Ad5感染HEK293目标细胞的平行于细胞平面的超薄切片电镜观察。其中，A:光镜下修块后目标细胞超薄切片的切面（虚线范围内）；B:电镜下目标细胞的低倍观察。B1:病变细胞的细胞核内病毒颗粒聚集形成的巨大包涵体（IB）；B2：病变细胞的胞浆内病毒颗粒聚集形成的包涵体（IB）。

图7为H1N1感染MDCK目标细胞的平行于细胞平面的超薄切片电镜观察。其中，A:光镜下修块后目标细胞超薄切片的切面（虚线范围内）；B:电镜下目标细胞的低倍观察。B1:目标细胞的细胞膜表面分布大量杆状的病毒颗粒（箭头所示）；B2：目标细胞外大量横切面的病毒颗粒（星号所示）。

具体实施方式

本发明的一个实施方式涉及一种针对感染病毒的病变细胞的定位超薄切片方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）以腔室玻片作为包埋模具，以感染病毒的细胞为模型，当细胞出现病变时，用树脂原位包埋目标细胞，（2）通过修块直接暴露目标细胞，或钻取目标细胞后再通过修块暴露目标细胞，（3）针对目标细胞进行超薄切片，（4）采用透射电子显微镜观察目标细胞的超薄切片。

在本发明的一个优选实施方式中，其中所述步骤（2）中修块暴露为通过刀片将目标细胞周围细胞及树脂切除。

在本发明的一个优选实施方式中，其中所述步骤（2）中的钻取目标细胞为通过空芯钻头钻取树脂块上的目标细胞。

在本发明的一个优选实施方式中，其中所述步骤（3）中的目标细胞的超薄切片操作为垂直于处理细胞平面进行超薄切片。

在本发明的一个优选实施方式中，其中所述步骤（3）中的目标细胞的超薄切片操作为平行于处理细胞平面进行超薄切片。

在本发明的一个优选实施方式中，其中所述方法包括将切片位置定位在目标细胞部位。

在本发明的一个优选实施方式中，对于病毒没有特别限制，可以使用本领域的能够使细胞出现病变的已知病毒，如呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、EV71病毒、疱疹病毒、辛德比斯病毒等。本发明优选使用人腺病毒和流感病毒分别作为无包膜病毒和包膜病毒模型。

在本发明的一个优选实施方式中，其中所述方法包括对目标细胞进行固定、脱水、浸润、包埋和超薄切片。

在本发明的一个优选实施方式中，其中所述细胞的固定、脱水、浸润、和包埋过程均在原位进行。

在本发明的一个优选实施方式中，对于超薄切片厚度没有特别限制，优选超薄切片厚度设定为70-100nm。

在本发明的一个优选实施方式中，对于加热玻片的条件没有特别限制，优选在60-70℃加热台上加热玻片。

在本发明中，术语“定位”是指在显微镜下选取病毒感染且出现病变的目标细胞。

在本发明中，术语“修块”是指使用锐利的刀片将靶细胞周围的树脂切除。

在本发明中，术语“目标细胞”包括目标病变细胞，即出现病变的目标细胞。

在本发明中，术语“腔室玻片”是指美国Thermo公司腔室玻片系统产品，优选使用Lab-Tek Chamber slide^TM system（177445）。

在本发明中，术语“空芯钻头”是指以60ml注射器针头（型号：1.6×30mm），磨平针尖并分离针梗与针栓，以电动砂轮将针梗一端打磨成锯齿状即成为空芯钻头。

在本发明中，术语“树脂”是指本领域已知的环氧树脂，优选使用SPI-PON812环氧树脂。

本发明的方法，采用腔室玻片作为模具，与传统的包埋管或胶囊包埋模具相比，具有能够保持细胞的原位状态、光学显微镜下可清晰识别细胞并易于分离目标细胞的优点。

本发明的方法，采用腔室玻片作为包埋模具，包埋在模具内的细胞保持原位状态，并且在显微镜下能够对目标细胞进行定位，通过修块或空芯钻头钻可分离目的细胞，并针对目的细胞进行超薄切片。传统的培养细胞的超薄切片制样，需要使细胞脱离培养平面，再离心沉淀聚集成团块，以明胶胶囊或包埋管为模具。该发明与传统培养细胞的超薄切片方法相比具有定位准确、提高检测效率的优点。

在本发明中，对于病毒接种的方法没有特别限制，可以使用本领域已知的常规病毒接种方法。优选在接种病毒后，当细胞产生病变时，原位固定细胞；接着，以梯度浓度乙醇对细胞进行脱水，再分别以1:1和1:4的乙醇:树脂和100%树脂浸润细胞，最后用树脂包埋样本。

以下提供本发明的实施例，其仅用于解释和说明的目的，并不限制本发明。其中，除非另外说明，实施例中“%”表示“%(w/v)”。

使用材料

（1）细胞培养基DMEM与MEM、胎牛血清（FBS）、牛血清白蛋白（BSA）、TPCK胰酶，均为美国Gibico公司产品；

EM级多聚甲醛（Paraformaldehyde，简称PFA）、戊二醛（Glutaraldehyde，简称GA）、四氧化锇（Osmium tetroxide，简称OsO₄）、二甲砷酸钠（Sodiumcacodylate，简称Caco）、醋酸双氧铀（Uranyl acetate，简称UAc）、枸橼酸铅（Lead citrate，简称LC）、环氧树脂SPI-PON812，均为美国SPI公司产品；

腔室玻片Lab-Tek Chamber slide^TM system（177445）为美国Thermo公司产品；

人腺病毒5型（Adenovirus type5，Ad5）、甲型流感病毒（Influenza A virus(H1N1)）、HEK293细胞、MDCK细胞，为美国ATCC产品；

（2）目标细胞的钻取设备：

钻磨机（型号：MICROMOT50/E，德国proxonn公司），钻台架（型号：MICROMOT MB140/S，德国proxonn公司）。

（3）取样钻头的制作：

取60ml注射器针头（型号：1.6×30mm），磨平针尖并分离针梗与针栓，以电动砂轮将针梗一端打磨成锯齿状即可。

实施例

实施例1

1.人腺病毒的接种

当传代于Lab-Tek Chamber slide^TM system（177445）腔室玻片孔中的HEK293细胞生长至约80%丰度时，以细胞维持液（含2%FBS的DMEM）按MOI=0.1接种Ad5于HEK293细胞上。接种病毒24-48h后，当细胞产生病变时，以2%PFA-2.5%GA（0.1M Caco缓冲液，pH7.4）于4℃原位固定细胞10min；然后分别以50%、70%、90%、100%、100%乙醇对细胞进行脱水，每次脱水5min；再分别以乙醇：树脂比例分别为1:1、1:4及100%树脂浸润细胞各1次，每次30分钟。

2.树脂包埋

完成树脂浸润细胞后，去除腔室玻片的塑料支架，保留硅胶垫圈，将树脂加入由垫圈形成的方形凹槽内，使树脂平面与垫圈高度齐平，取腔室玻片底座覆盖在垫圈上，以封闭树脂。使用微波处理仪（PELCO 

Prosystem，美国Ted pella公司）进行树脂聚合，参数设置为第1步:150W30min，第2步:600W60min。树脂聚合完成后，以70℃加热台加热腔室玻片，趁热去除覆盖树脂的载玻片及垫圈，将细胞树脂包埋块从腔室玻片上剥离。

3.目标细胞的暴露

(1)垂直于细胞平面进行超薄切片的目标细胞的暴露

在倒置显微镜下定位方形包埋块上的目标细胞，并以刀片切除病灶周围树脂，从而暴露病变细胞。然后将超薄切片刀与样本树脂块安装在超薄切片机上，使超薄切片刀的刀刃与包埋块平面呈垂直状态，并进行超薄切片，切片厚度设定为80nm。以覆膜椭圆单孔铜网捞取切片，切片经1%UAc染色10分钟，以去离子水洗涤切片3次，每次5分钟。再以LC染色5分钟，以0.02MNaOH洗涤切片30秒，再以去离子水洗涤切片3次，每次5分钟。室温下干燥切片，待电镜检测。

(2)平行于细胞平面进行超薄切片的目标细胞的暴露

在倒置显微镜下定位方形包埋块上的目标细胞，用尖头记号笔标记目标细胞相应位置。将取样钻头安装在钢制筒夹（型号：MICROMOT28940，德国proxonn公司）上，并将其安装于钻磨机上，再将钻磨机安装于钻台架上，调整树脂块位置，使标记点位于取样空芯钻头的中空处并与钻头成垂直状态，打开钻磨机电源，按压钻台架手柄，使钻磨机垂直下移，从而钻取标记部位的细胞。将钻取的圆柱形树脂样本块用502强力胶水粘着在1#BEEM包埋管塑形的树脂块的顶端，注意使细胞面一侧暴露在外。在倒置显微镜下对圆柱形样本细胞面进行修整，以刀片切除目标细胞周围的其它细胞和树脂，并修整切面为方形或等腰梯形。然后将超薄切片刀与样本树脂块安装在超薄切片机上，使超薄切片刀的刀刃与包埋块平面呈垂直状态，并进行超薄切片，切片厚度设定为80nm。以覆膜椭圆单孔铜网捞取切片，切片经1%UAc染色10分钟，以去离子水洗涤切片3次，每次5分钟。再以LC染色5分钟，以0.02MNaOH洗涤切片30秒，再以去离子水洗涤切片3次，每次5分钟。室温干燥切片，待电镜检测。

4.电镜观察

染色后的超薄切片在透射电子显微镜（型号：TECNAI12，美国FEI公司）下观察，加速电压80kV，通过CCD相机（型号：Erlangsheng785，美国Gatan公司）拍照记录。

5.结果

5.1细胞的包埋

Lab-Tek Chamber slide^TM system（Cat.No.177445）（图1A）垫圈隔断形成方形模子（图1B），将树脂灌注其内，并以盖玻片覆盖其上，树脂聚合固化后，可形成8个方形树脂块（图1C），每个树脂块大小为1cm×1cm×1mm，腔室玻片上的所有细胞随树脂一起被剥离下来（图1D）。

5.2目标细胞的暴露

(1)垂直于细胞平面进行超薄切片目标细胞的暴露

在显微镜下定位方形包埋块上的目标细胞（图2A虚线框所示），以刀片切除目标细胞附近的树脂，从而暴露目标细胞（图2B），并对目标细胞进行超薄切片，切片部位如图2B实线所示。

(2)平行于细胞平面进行超薄切片目标细胞的钻取

在显微镜下定位方形包埋块上的目标细胞（图3A黑框所示），以取样钻头从树脂块上钻取目标细胞（图3B），可见靶细胞在钻下的圆柱形树脂块上（图3C黑框所示）。

5.3目标细胞的电镜观察

(1)垂直于细胞平面进行超薄切片目标细胞的电镜观察

电子显微镜下可见超薄切片上目标细胞层的切面，细胞游离面与贴壁面清晰可辨。细胞核、线粒体、内质网、多聚核糖体、微绒毛等细胞结构清晰可辨（结果未显示），在切片上的细胞中可以轻易的找到病毒颗粒。其中，Ad5感染的HEK293细胞的切面呈圆形或椭圆形，核浆比倒置（图4A），几乎每个目标HEK293细胞内均可见到Ad5病毒颗粒。有的细胞内可见Ad5病毒颗粒呈散布状态分布于细胞核内（图4之A1），有的细胞核内病毒颗粒聚呈结晶状排列（图4之A2）。

(2)平行于细胞平面进行超薄切片目标细胞的电镜观察

电镜下低倍放大视野时可见超薄切片目标细胞的形状与轮廓（图6B）与光镜下切面上的细胞形状与轮廓（图6A）一致，并可将电镜与光镜所观察的细胞相对应。在电镜下高倍放大时，可见大部分目标细胞内存在病毒颗粒。在细胞核内可见巨大的病毒颗粒聚集而成的包涵体（IB）（图6之B1），细胞浆内也可见包涵体（IB）（图6之B2）。

实施例2

1.流感病毒的接种

当传代于Lab-Tek Chamber slide^TM system（177445）腔室玻片孔中MDCK细胞生长至约80%丰度时，以细胞维持液（含0.2%BSA，2μg/ml TPCK的MEM）按MOI=0.01接种流感病毒Influenza A virus(H1N1)于MDCK细胞上。接种病毒24-48h后，当细胞产生病变时，以2%PFA-2.5%GA（0.1M Caco缓冲液，pH7.4）于4℃原位固定细胞10min；然后分别以50%、70%、90%、100%乙醇对细胞进行脱水，每次脱水5min；再分别以乙醇：树脂比例分别为1:1、1:4及100%树脂浸润细胞各1次，每次30分钟。

2.树脂包埋

完成树脂浸润细胞后，去除腔室玻片的塑料支架，保留硅胶垫圈，将树脂加入由垫圈形成的方形凹槽内，使树脂平面与垫圈高度齐平，取洁净的载玻片覆盖在垫圈上，以封闭树脂。使用微波处理仪（PELCO 

Prosystem，美国Ted pella公司）进行树脂聚合，参数设置为第1步:150W30min，第2步:600W60min。树脂聚合完成后，以70℃加热台加热玻片，趁热去除覆盖树脂的载玻片及垫圈，将细胞树脂包埋块从玻片上剥离。

3.目标细胞的暴露

(1)垂直于细胞平面进行超薄切片的目标细胞的暴露

在倒置显微镜下定位方形包埋块上的目标细胞，并以刀片切除病灶周围树脂，从而暴露病变细胞。然后将超薄切片刀与样本树脂块安装在超薄切片机上，使超薄切片刀的刀刃与包埋块平面呈垂直状态，并进行超薄切片，切片厚度设定为80nm。以覆膜椭圆单孔铜网捞取切片，切片经1%UAc染色10分钟，以去离子水洗涤切片3次，每次5分钟。再以LC染色5分钟，以0.02MNaOH洗涤切片30秒，再以去离子水洗涤切片3次，每次5分钟。室温干燥切片，待电镜检测。

(2)平行于细胞平面进行超薄切片的目标细胞的暴露

在倒置显微镜下定位方形包埋块上的目标细胞，用尖头记号笔标记目标细胞相应位置。将取样钻头安装在钢制筒夹（型号：MICROMOT28940，德国proxonn公司）上，并将其安装于钻磨机上，再将钻磨机安装于钻台架上，调整树脂块位置，使标记点位于取样空芯钻头的中空处并与钻头成垂直状态，打开钻磨机电源，按压钻台架手柄，使钻磨机垂直下移，从而钻取标记部位的细胞。将钻取的圆柱形树脂样本块用502强力胶水粘着在1#BEEM包埋管塑形的树脂块的顶端，注意使细胞面一侧暴露在外。在倒置显微镜下对圆柱形样本细胞面进行修整，以刀片切除目标细胞周围的其它细胞和树脂，并修整切面为方形或等腰梯形。然后将超薄切片刀与样本树脂块安装在超薄切片机上，使超薄切片刀的刀刃与包埋块平面呈垂直状态，并进行超薄切片，切片厚度设定为80nm。以覆膜椭圆单孔铜网捞取切片，切片经1%UAc染色10分钟，以去离子水洗涤切片3次，每次5分钟。再以LC染色5分钟，以0.02MNaOH洗涤切片30秒，再以去离子水洗涤切片3次，每次5分钟。室温干燥切片，待电镜检测。

4.电镜观察

染色后的超薄切片在透射电子显微镜（型号：TECNAI12，美国FEI公司）下观察，加速电压80kV，通过CCD相机（型号：Erlangsheng785，美国Gatan公司）拍照记录。

5结果

5.1采用与实施例1中5.1-5.2相同的方法，进行细胞的包埋和目标细胞的暴露。

5.2目标细胞的电镜观察

(1)垂直于细胞平面进行超薄切片目标细胞的电镜观察

H1N1感染的MDCK细胞的纵切面呈圆形或椭圆形，在其表面可以轻易找到杆状的流感病毒颗粒（图5A，插图示细胞表面的病毒颗粒）。病毒颗粒除呈长短不一的杆状棒状外，还可见呈圆形的病毒横断面（图5B箭头所示），并且病毒颗粒大量聚集（图5B）。

(2)平行于细胞平面进行超薄切片目标细胞的电镜观察

电镜下低倍放大视野时可见超薄切片目标细胞的形状与轮廓（图7B）与光镜下切面上的细胞形状与轮廓（图7A）一致，并可将电镜与光镜所观察的细胞相对应。在电镜下高倍放大时，可见大部分目标细胞表面存在流感病毒颗粒。可见细胞表面满布棒状的病毒颗粒（图7B1箭头所示），也可见细胞外大量聚集的圆形的病毒横断面（图7B2星号所示）。

如上说明的那样，根据本发明，能够提供一种针对感染病毒的病变细胞的定位超薄切片方法，该方法在超薄切片技术体系及相关产业上具有实用性。

Claims (10)

1.一种针对感染病毒的病变细胞的定位超薄切片方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）以腔室玻片作为包埋模具，以感染病毒的细胞为模型，当细胞出现病变时，用树脂原位包埋细胞，（2）通过修块直接暴露目标细胞，或钻取目标细胞后再通过修块暴露目标细胞，（3）针对目标细胞进行超薄切片，（4）采用透射电子显微镜观察目标细胞的超薄切片。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤（2）中的修块暴露为通过刀片将目标细胞周围的细胞及树脂切除。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述步骤（2）中的钻取目标细胞为通过空芯钻头钻取树脂块上的目标细胞。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述步骤（3）中的目标细胞的超薄切片操作为垂直于处理细胞平面进行超薄切片。

5.根据权利要求1或3所述的方法，其中所述步骤（3）中的目标细胞的超薄切片操作为平行于处理细胞平面进行超薄切片。

6.根据权利要求1或2或3所述的方法，其中所述方法包括将切片位置定位在目标细胞部位。

7.根据权利要求1或2或3所述的方法，其中所述病毒为人腺病毒或流感病毒。

8.根据权利要求1或2或3所述的方法，其中所述方法包括对目标细胞进行固定、脱水、浸润、包埋和超薄切片。

9.根据权利要求1或2或3所述的方法，其中所述目标细胞的固定、脱水、浸润、和包埋过程均在原位进行。

10.根据权利要求1或2或3所述的方法，其中所述超薄切片厚度为70-100nm。

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