CN111537531A - 一种快速的细胞超薄切片电镜检测逆转录病毒的方法 - Google Patents
一种快速的细胞超薄切片电镜检测逆转录病毒的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111537531A CN111537531A CN202010396557.7A CN202010396557A CN111537531A CN 111537531 A CN111537531 A CN 111537531A CN 202010396557 A CN202010396557 A CN 202010396557A CN 111537531 A CN111537531 A CN 111537531A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ultrathin section
- cell
- retrovirus
- sample
- electron microscopy
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 54
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 title claims abstract description 19
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 claims abstract description 8
- ABUBSBSOTTXVPV-UHFFFAOYSA-H [U+6].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O Chemical compound [U+6].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O ABUBSBSOTTXVPV-UHFFFAOYSA-H 0.000 claims abstract description 6
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 claims abstract description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 claims description 13
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 11
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 11
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 5
- 239000003822 epoxy resin Substances 0.000 claims description 4
- 229920000647 polyepoxide Polymers 0.000 claims description 4
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 claims description 4
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 claims description 3
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000010949 copper Substances 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 2
- 229910052762 osmium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- SYQBFIAQOQZEGI-UHFFFAOYSA-N osmium atom Chemical compound [Os] SYQBFIAQOQZEGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- JNLCUVJKTXKKSG-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;lead Chemical compound [Pb].OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O JNLCUVJKTXKKSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 claims 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 27
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 12
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 9
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 9
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 9
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 7
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 6
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 5
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 4
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 4
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- HOQPTLCRWVZIQZ-UHFFFAOYSA-H bis[[2-(5-hydroxy-4,7-dioxo-1,3,2$l^{2}-dioxaplumbepan-5-yl)acetyl]oxy]lead Chemical compound [Pb+2].[Pb+2].[Pb+2].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HOQPTLCRWVZIQZ-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000005464 sample preparation method Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- 206010063659 Aversion Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 208000029433 Herpesviridae infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000032420 Latent Infection Diseases 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010070863 Toxicity to various agents Diseases 0.000 description 1
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 208000022531 anorexia Diseases 0.000 description 1
- 230000001147 anti-toxic effect Effects 0.000 description 1
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 229960001212 bacterial vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012867 bioactive agent Substances 0.000 description 1
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000011258 core-shell material Substances 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061428 decreased appetite Diseases 0.000 description 1
- 239000012502 diagnostic product Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000005061 intracellular organelle Anatomy 0.000 description 1
- 208000021601 lentivirus infection Diseases 0.000 description 1
- 206010025482 malaise Diseases 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012514 monoclonal antibody product Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 1
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 description 1
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N23/00—Investigating or analysing materials by the use of wave or particle radiation, e.g. X-rays or neutrons, not covered by groups G01N3/00 – G01N17/00, G01N21/00 or G01N22/00
- G01N23/02—Investigating or analysing materials by the use of wave or particle radiation, e.g. X-rays or neutrons, not covered by groups G01N3/00 – G01N17/00, G01N21/00 or G01N22/00 by transmitting the radiation through the material
- G01N23/04—Investigating or analysing materials by the use of wave or particle radiation, e.g. X-rays or neutrons, not covered by groups G01N3/00 – G01N17/00, G01N21/00 or G01N22/00 by transmitting the radiation through the material and forming images of the material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
- G01N2001/302—Stain compositions
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2223/00—Investigating materials by wave or particle radiation
- G01N2223/10—Different kinds of radiation or particles
- G01N2223/102—Different kinds of radiation or particles beta or electrons
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2223/00—Investigating materials by wave or particle radiation
- G01N2223/60—Specific applications or type of materials
- G01N2223/612—Specific applications or type of materials biological material
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种快速的细胞超薄切片电镜检测逆转录病毒的方法，步骤包括：1）样品的收集与固定；2）醋酸铀块染；3）脱水、渗透和聚合；4）切片、染色后透射电镜检测。本发明与传统方法相比，极大的提升了样本制备的效率，使传统的5‑7天制样周期缩短至1天，并使一种快速检测病毒的超薄切片技术成为了可能。优化后的超薄切片电镜技术检测病毒，相比传统的病毒检测方法，大幅提高了病毒检测的特异性、准确性和检测效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域和医疗健康领域，特别是涉及生物制品安全性检测领域和未知病毒形态学快速检测和判断，具体涉及一种快速的细胞超薄切片电镜检测逆转录病毒的方法。
背景技术
生物制品是以微生物、细胞、动物或人源组织和体液等为原料，应用传统技术或现代生物技术制成，用于人类疾病的预防、治疗和诊断的产品。人用生物制品包括：细菌类疫苗（含类毒素）、病毒类疫苗、抗毒素及抗血清、血液制品、细胞因子、生长因子、酶、体内及体外诊断制品，以及其他生物活性制剂，如毒素、抗原、变态反应原、单克隆抗体、抗原抗体复合物、免疫调节及微生态制剂等。
在生物制品的生产和应用过程中会遇到一些诸如安全性的问题。如抗体药物，单克隆抗体中小鼠杂交瘤细胞的使用，容易使单抗制品出现内源性病毒污染的可能；而多克隆抗体主用采用动物血清制备，也同样存在动物血清来源的安全性问题。目前，很多基因制品涉及蛋白表达载体的构建，这种构建的细胞系容易出现病毒感染的隐患。如疱疫病毒(EBV)转染的人成淋巴细胞系与小鼠骨髓瘤细胞融合后，其分泌的单克隆抗体容易出现小鼠逆转录病毒的感染。再者，基因重组蛋白制品所使用的表达细胞系本身含有内源性病毒，如中国仓鼠卵巢细胞自身存在内源性逆转录病毒，这也使得其分泌的蛋白存在安全隐患。作为生物制品的来源，均存在被细菌、病毒等微生物污染的可能性，因此在药品安全性问题上，生物制品与传统药品最大的不同是：生物制品存在内源性病毒污染的可能。因此，WHO、美国FDA、中国CFDA以及欧洲相关部门已经出具相应法规并规定：存在内源性污染的生物制品，在生产工艺中必须具备去除/灭活内源性污染的工艺，而且，必须对此工艺及产品进行生物安全性检测以排除生物制品制备工艺及产品潜在的病毒污染。
另外，医疗健康领域也需要进行病毒检测。病毒性感染可由多种病毒引起，但临床表现均有畏寒、发热、全身倦怠无力、食欲减退等全身中毒症状及受侵组织器官炎症的表现。人体的病毒性感染分为隐性感染、显性感染、慢病毒感染。多数情况下的感染呈隐性感染。少数为显性感染。显性感染中多数病毒性感染表现为急性感染，发病急、病程短，多在1～2周内自愈，少数表现为潜伏性感染（如疱疹病毒感染等）和慢性感染（如乙型肝炎病毒感染等）。
电子显微镜在病毒学研究中发挥着重要作用，尤其是在病毒粒子的鉴定、形态学研究和病毒检测方面，超薄切片透射电镜技术是一种最为直接和有效的方式来检测病毒颗粒的存在。无论是从病毒形态学和病毒发生学上，都能通过超薄切片电镜技术获得清晰和准确的结果。但由于传统的超薄切片样本制备方法复杂，周期较长，需投入大量的人力和时间成本，无法实现超薄切片电镜技术的快速检测，这也使得超薄切片电镜技术无法在竞争剧烈的制药领域内得到更好的应用。因此，根据传统方法的原理进行优化和创新，是解决当前问题的根本所在。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种快速的细胞超薄切片电镜检测逆转录病毒的方法。与传统方法相比，极大的提升了样本制备的效率，使传统的5-7天制样周期缩短至1天，并使一种快速检测病毒的超薄切片技术成为了可能。优化后的超薄切片电镜技术检测病毒，相比传统的病毒检测方法，大幅提高了病毒检测的特异性、准确性和检测效率。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种快速的细胞超薄切片电镜检测逆转录病毒的方法，该方法包括如下步骤：
I.样品采集，清洗后用戊二醛和锇酸双重固定；
II.醋酸铀块染；
III.丙酮脱水后环氧树脂梯度渗透，再将样品纯树脂聚合；
IV.超薄切片、染色后透射电镜检测。
作为本发明优选的技术方案，在步骤I中，所述样品采集为：收集1-2×107个细胞样本；
作为本发明优选的技术方案，在步骤I中，所述清洗具体方法为：用1×PBS清洗3-5遍；
作为本发明优选的技术方案，在步骤I中，所述双重固定具体方法为：5%戊二醛(体积百分比)固定8-12小时左右，再进行1%锇酸(质量体积百分比)固定0.5-1小时左右。
作为本发明优选的技术方案，在步骤II中，所述醋酸铀块染，在2-8℃冰箱放置2-3小时，减少样本的晃动；
作为本发明优选的技术方案，在步骤III中，所述丙酮脱水具体方法为：用70%丙酮、90%丙酮、100%丙酮各脱水5分钟，脱水时放置在摇床上震荡。
作为本发明优选的技术方案，在步骤III中，所述环氧树脂梯度渗透具体方法为：丙酮：环氧树脂=1:1渗透20分钟后纯树脂渗透2小时，渗透时放置在摇床上震荡。
作为本发明优选的技术方案，在步骤III中，所述纯树脂聚合具体方法为：样本在纯树脂60℃聚合处理，不少于10小时。
作为本发明优选的技术方案，在步骤IV中，所述超薄切片为70-100nm，铜网承载。
作为本发明优选的技术方案，在步骤IV中，所述染色具体方法为：柠檬酸铅片染，常温下染色10-15分钟。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1.本发明为细胞库病毒检测提供一种更为直观、形象、快捷的检测方法；
2.本发明使用的样本处理方式，极大的缩短了样本制备的操作时间；传统方法样品制备需要7天，本发明优化的方法制备样品只需要1天，大幅度减少时间成本和人力成本，增加项目安排的灵活性，并增加单位人员产出，并减少干扰因素的影响；
3.本发明使用醋酸双氧铀块染，增加了切片衬度，也减少了染液污染；
4.本发明相对于传统方法，样品树脂块质地硬，便于切片；
5.本发明切片前染色，可消除污染；
6.本发明使用裸网，直接承载，相对于传统方法去除了承载膜的影响，减少了干扰因素；
7.本发明极大的提升细胞衬度，并对细胞亚显微结构提供了更清晰的展示，增加了细胞切片的丰富度，增强了细胞器和其它颗粒物的清晰度，消除了其他干扰物质对观察病毒的影响，增加了各结构的辨别度；
8.本发明对其他可能存在的颗粒内含物的观察，提供了更为有效的检测途径。
附图说明
图1是实施例1中采用SP2/0-H-A3-细胞用传统方法和本发明方法制备的样本图片对比示意图；图1中，A、B是采用SP2/0-H-A3-细胞用传统方法制备的样本图片；a、b是采用SP2/0-H-A3-细胞用本发明优化方法制备后的超薄切片的样本图片；白色箭头标示为高尔基体、黑色箭头标示为线粒体，白色粗箭头标示为内质网。
图2是实施例1中采用SP2/0-H-A3-细胞用传统方法和本发明方法制备的电镜图片下内源性病毒颗粒的对比示意图；图2中，C是采用SP2/0-H-A3-细胞用传统方法制备的电镜图片，c是采用SP2/0-H-A3-细胞用本发明优化方法制备后的电镜图片；白色箭头标示处内源性病毒颗粒。
图3是实施例1中采用SP2/0-H-A3-细胞用传统方法和本发明方法制备的电镜图片下分泌性病毒颗粒的对比示意图；图3中，D是采用SP2/0-H-A3-细胞用传统方法制备的电镜图片，d是采用SP2/0-H-A3-细胞用本发明优化方法制备后的电镜图片；白色箭头标示处是分泌性病毒颗粒。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。
实施例1：
一、实验步骤：
本发明提供了一种快速的细胞超薄切片电镜检测逆转录病毒技术，其包括如下步骤：
步骤1：收集1-2×107个细胞样本，1×PBS清洗3遍后，5%戊二醛固定12小时，再进行1%锇酸固定30分钟；
步骤2：醋酸铀块染色，在2-8℃冰箱放置2-3小时，减少样本的晃动；
步骤3：丙酮脱水和过度处理，70%丙酮、90%丙酮、100%丙酮各脱水5分钟，脱水时应放置在摇床上进行；
步骤4：丙酮：环氧树脂=1:1渗透20分钟后纯树脂渗透2小时，此步骤需放置在摇床上进行；
步骤5：样本在纯树脂60℃聚合处理，至少10小时；
步骤6：超薄切片70-100nm，铜网承载；
步骤7：柠檬酸铅片染，常温下染色10-15分钟；
步骤8：透射电镜检测。
传统方法和本发明方法对比如下表1：
表1
二、实验结果：
1.图1中A、B为细胞传统方法制备的样本，经超薄切片在电镜下观察可见：除细胞核和部分线粒体能够被分辨出来外，其他亚显微结构比较模糊，分辨度不佳；而图1中a、b为优化后的超薄切片样本制备在电镜下观察，结构清晰，衬度明显，除细胞核和线粒体外，能够清晰分辨内质网、高尔基体和其它重要泡状结构。优化后的方案不仅能在细胞亚显微结构的清晰度上进行提升，而且还高衬度展示了传统方法无法达到的细胞基质内各细胞器丰度。
2.通过对比传统方法和优化方法电镜样本制备后的电镜图片可以发现（见图2中C和c），传统方案下的内源性病毒颗粒颜色较深，与细胞质背景反差较大，较容易区分病毒与其它干扰颗粒；优化方案下的内源性病毒颗粒，虽然也有较深的着色，但细胞质背景颜色也比较深，整体对比不如传统方案的明显反差。但制备效果没有差异，都能反映出病毒簇的集中分布。除此之外，优化后的方案能显示出病毒簇周围分布的大量内质网和线粒体，这与病毒在胞内组装引起宿主细胞器变化的报道相一致。除此之外，优化方案带来的更为清晰的细胞结构，为观察和发现更多除目标颗粒外的其它结构提供了有利的方法基础。
3.对比传统方法和优化方法下的分泌性病毒颗粒（见图3中D和d，白色箭头标示处），两种情况下的电镜结果差异较小，都能拍摄出胞外病毒颗粒的核壳结构。两者在病毒的辨认度上都有较好的表现，都可以实现分泌型胞外病毒颗粒的检测。
三、结果分析
1.从上述对比试验结果可知，本发明大幅度减少时间成本和人力成本，增加项目安排的灵活性，并增加单位人员产出，并减少干扰因素的影响。本发明方法与传统方法在时间成本和人力成本、以及干扰因素影响上的具体对比见下表2：
表2
2.极大提升图片衬度和细胞器的丰富度。
基于超薄切片电镜技术原理，对传统电镜制样方法进行了改良，可以发现本发明优化的方案能极大的提升细胞衬度，并对细胞亚显微结构提供了更清晰的展示，提升了胞内细胞器丰度，增加了各结构的辨别度，更清晰直观的反映出病毒在宿主细胞内外的整个生理过程。除此之外，从实验操作的角度上，优化的方案更为简洁，省去了大量的等待时间，使样品制备过程由原来的1周缩短至了1天，极大的减少了实验操作的时间成本。另外，从人员成本上，优化方案也为人员的灵活调配带来了很大的优势，优化方案使项目排产更为灵活，为以后的业务增长提前打好了坚实的基础。同时，与传统方案的项目开展相比，预测优化方案后将额外节省出一倍的时间用于项目切片和报告。因此，此次方法工艺的优化，将对工作的开展具有极其高效的推动作用。
Claims (10)
1.一种快速的细胞超薄切片电镜检测逆转录病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
I.样品采集，清洗后用戊二醛和锇酸双重固定；
II.醋酸铀块染色；
III.丙酮脱水后环氧树脂梯度渗透，再将样品纯树脂聚合；
IV.超薄切片、染色后透射电镜检测。
2.根据权利要求1所述的一种快速的细胞超薄切片电镜检测逆转录病毒的方法，其特征在于，在步骤I中，所述样品采集为：收集1-2×107个细胞样本。
3.根据权利要求1所述的一种快速的细胞超薄切片电镜检测逆转录病毒的方法，其特征在于，在步骤I中，所述清洗具体方法为：用1×PBS清洗3-5遍。
4.根据权利要求1所述的一种快速的细胞超薄切片电镜检测逆转录病毒的方法，其特征在于，在步骤I中，所述双重固定具体方法为：5%戊二醛固定8-12小时，再进行1%锇酸固定0.5-1小时。
5.根据权利要求1所述的一种快速的细胞超薄切片电镜检测逆转录病毒的方法，其特征在于，在步骤II中，所述醋酸铀块染色，在2-8℃冰箱放置2-3小时，减少样本的晃动。
6.根据权利要求1所述的一种快速的细胞超薄切片电镜检测逆转录病毒的方法，其特征在于，在步骤III中，所述丙酮脱水具体方法为：用70%丙酮、90%丙酮、100%丙酮各脱水5分钟，脱水时放置在摇床上震荡。
7.根据权利要求1所述的一种快速的细胞超薄切片电镜检测逆转录病毒的方法，其特征在于，在步骤III中，所述环氧树脂梯度渗透具体方法为：丙酮：环氧树脂=1:1渗透20分钟后纯树脂渗透2小时，渗透时放置在摇床上震荡。
8.根据权利要求1所述的一种快速的细胞超薄切片电镜检测逆转录病毒的方法，其特征在于，在步骤III中，所述将样品纯树脂聚合具体方法为：样品在纯树脂60℃聚合处理，不少于10小时。
9.根据权利要求1所述的一种快速的细胞超薄切片电镜检测逆转录病毒的方法，其特征在于，在步骤IV中，所述超薄切片为70-100nm，铜网承载。
10.根据权利要求1所述的一种快速的细胞超薄切片电镜检测逆转录病毒的方法，其特征在于，在步骤IV中，所述染色具体方法为：柠檬酸铅片染色，常温下染色10-15分钟。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010396557.7A CN111537531A (zh) | 2020-05-12 | 2020-05-12 | 一种快速的细胞超薄切片电镜检测逆转录病毒的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010396557.7A CN111537531A (zh) | 2020-05-12 | 2020-05-12 | 一种快速的细胞超薄切片电镜检测逆转录病毒的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111537531A true CN111537531A (zh) | 2020-08-14 |
Family
ID=71967878
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010396557.7A Pending CN111537531A (zh) | 2020-05-12 | 2020-05-12 | 一种快速的细胞超薄切片电镜检测逆转录病毒的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111537531A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114459851A (zh) * | 2021-12-28 | 2022-05-10 | 苏州药明检测检验有限责任公司 | 一种使用超薄切片电镜技术检测upb中病毒的方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102841006A (zh) * | 2012-09-28 | 2012-12-26 | 北京林业大学 | 一种植物组织透射电镜样品的制备方法 |
| CN103558055A (zh) * | 2013-09-29 | 2014-02-05 | 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 | 一种针对感染病毒的病变细胞的定位超薄切片方法 |
| CN105067413A (zh) * | 2015-09-21 | 2015-11-18 | 河南中医学院 | 一种用于观察植物细胞中单宁类物质分布的超薄切片的染色方法 |
| CN105258999A (zh) * | 2015-11-06 | 2016-01-20 | 中南大学湘雅医院 | 一种单细胞透射电镜制样方法 |
| CN109270103A (zh) * | 2018-10-10 | 2019-01-25 | 中国热带农业科学院橡胶研究所 | 针对海南橡胶树叶片组织的超薄切片的制备方法 |
| CN109900536A (zh) * | 2017-12-07 | 2019-06-18 | 浙江大学 | 光镜-透射电镜联用样品处理试剂及clem检测方法 |
| CN110455595A (zh) * | 2019-07-17 | 2019-11-15 | 北京林业大学 | 一种用于超薄切片的植物组织整体染色法 |
-
2020
- 2020-05-12 CN CN202010396557.7A patent/CN111537531A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102841006A (zh) * | 2012-09-28 | 2012-12-26 | 北京林业大学 | 一种植物组织透射电镜样品的制备方法 |
| CN103558055A (zh) * | 2013-09-29 | 2014-02-05 | 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 | 一种针对感染病毒的病变细胞的定位超薄切片方法 |
| CN105067413A (zh) * | 2015-09-21 | 2015-11-18 | 河南中医学院 | 一种用于观察植物细胞中单宁类物质分布的超薄切片的染色方法 |
| CN105258999A (zh) * | 2015-11-06 | 2016-01-20 | 中南大学湘雅医院 | 一种单细胞透射电镜制样方法 |
| CN109900536A (zh) * | 2017-12-07 | 2019-06-18 | 浙江大学 | 光镜-透射电镜联用样品处理试剂及clem检测方法 |
| CN109270103A (zh) * | 2018-10-10 | 2019-01-25 | 中国热带农业科学院橡胶研究所 | 针对海南橡胶树叶片组织的超薄切片的制备方法 |
| CN110455595A (zh) * | 2019-07-17 | 2019-11-15 | 北京林业大学 | 一种用于超薄切片的植物组织整体染色法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 单于乃纯: "兔病毒性出血症肝脏病理超微结构的观察", 《云南畜牧兽医》 * |
| 李配等: "健脾益肺化痰方对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠肺组织病理的影响", 《中华中医药学刊》 * |
| 杨胜辉: "载有hTERT基因逆转录病毒感染日本血吸虫童虫的研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士) 医药卫生科技辑》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114459851A (zh) * | 2021-12-28 | 2022-05-10 | 苏州药明检测检验有限责任公司 | 一种使用超薄切片电镜技术检测upb中病毒的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20110195413A1 (en) | Integrated Method for Enriching and Detecting Rare Cells from Biological Body Fluid Sample | |
| Gonzalez et al. | Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs | |
| US20220018745A1 (en) | A method for preparing lymphocyte sample for flow cytometry analysis | |
| CN106980018B (zh) | 一种应用cd45免疫荧光联合cep17探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒及其应用 | |
| CN106970224B (zh) | 一种应用cd45免疫荧光联合cep探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒及其应用 | |
| Davis et al. | Use of monoclonal antibodies and flow cytometry to cluster and analyze leukocyte differentiation molecules | |
| EP1019546B1 (en) | Methods for measurement of lymphocyte function | |
| CN110361442B (zh) | 一种用于质谱流式细胞仪检测的外泌体及其制备方法与应用 | |
| CN111537531A (zh) | 一种快速的细胞超薄切片电镜检测逆转录病毒的方法 | |
| CN110887967B (zh) | 一种检测抗体结合能力的方法及其应用 | |
| Morales‐Kastresana et al. | Detection and sorting of extracellular vesicles and viruses using nanoFACS | |
| CN111504886B (zh) | 一组分子在制备新冠肺炎辅助诊断试剂或试剂盒中的应用 | |
| US9632086B2 (en) | Method and kit for determining-antibody sensitivity and clone cell strain | |
| CN102313813B (zh) | 从生物体液样本中富集与检测稀有细胞的整合方法 | |
| EP2888591B1 (en) | Method for improved cell identification | |
| CN108982839A (zh) | 基于免疫磁珠和流式细胞仪的循环肿瘤细胞检测方法 | |
| CN109439624A (zh) | 一种用于识别或富集有核红细胞的方法 | |
| Martinez et al. | High‐speed cell sorting of infectious trophic and cystic forms of Pneumocystis carinii | |
| Stirk et al. | Comparative sensitivity of three methods for the diagnosis of cytomegalovirus lung infection | |
| CN107236709A (zh) | 来源于肺转移灶的高转移人卵巢癌细胞系及其建立和应用 | |
| CN110196219B (zh) | 一种基于流式细胞术检测鸡脾脏cd8+t细胞特异性杀伤作用的方法 | |
| CN111172229B (zh) | 脾脏多肽制品的生物活性的测定方法 | |
| Mansi et al. | Automated screening for micrometastases in bone marrow smears | |
| US7169571B2 (en) | Methods for measurement of lymphocyte function | |
| EP2607898B1 (en) | Method for evaluating graft |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200814 |