CN107236709A - 来源于肺转移灶的高转移人卵巢癌细胞系及其建立和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了来源于肺转移灶的高转移人卵巢癌细胞系及其建立和应用，其命名人高转移卵巢癌细胞系A2780‑M，于2017年01月22日保藏在于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201719。本发明的人高转移卵巢癌细胞系A2780‑M来源于人卵巢癌A2780细胞系，且具有较母系更明显的增殖活性、更强的转移功能、侵袭功能和细胞运动能力，可以作为可靠的高转移人卵巢癌细胞系和动物模型，用于研究卵巢癌转移的分子机制，还能为临床诊治、药物筛选及预后判断提供新的靶点。

Description

来源于肺转移灶的高转移人卵巢癌细胞系及其建立和应用
技术领域
本发明属于微生物动物细胞领域，具体涉及人卵巢癌细胞系及其建立和应用。
背景技术
卵巢癌死亡率居妇科肿瘤首位，转移扩散是其预后不良的首要原因。最新统计表明国内外卵巢癌的5年生存率在40％左右，全球每年有超过200,000新增病例。卵巢癌患者在临床被确诊时，往往已处于中晚期，约30％首诊时即有转移发生，还有30～40％的患者在随后几年中将发生转移。卵巢癌一旦发生转移，一般临床常规治疗效果不佳，死亡率极高，严重威胁患者的健康，是人类面临的亟待阐明和解决的重大基础和临床问题。因此，建立可靠的高转移人卵巢癌细胞系和动物模型成为卵巢癌研究的当务之急。它不仅有利于阐明卵巢癌转移的分子机制，还能为临床诊治、药物筛选及预后判断提供新的靶点，具有特殊的重要性和迫切性。
现有研究中，可用于小鼠移植瘤模型转移研究的细胞系包括SKOV-3、CAOV-3、CAOV-4、OVCAR-3、AO、3AO及HO-8910等。其中AO、CAOV-3、CAOV-4和OVCAR-3有相对较高的转移率，研究显示主要是出现在肺转移(60％-90％)(参见：高庆蕾，孟力，王世宣，et al.卵巢癌高频转移细胞模型的建立及其与nm23-H1的相关性研究.现代妇产科进展.2003；12:161-163.)。但是，目前通过肺转移灶建立的卵巢癌高转移细胞株十分有限，高转移人卵巢癌裸鼠模型(NSMO)和高转移人卵巢癌细胞系(HO-8910PM)是目前少有的自发性肺转移人卵巢癌组织模型和细胞模型，其建立时间比较早，为卵巢癌生物学的研究提供了最基本的实验材料。但研究肿瘤的生物学行为，无论是在细胞水平还是在分子生物学水平，都需要有一个良好的参比对照系统，这样可以简化实验程序，最大限度的减少实验结果中的混杂因素，有利于分析总结。尤其是，近年来新的基因标志物不断涌现，这些新的标志物在卵巢癌预后方面有了进一步的研究。因此，建立新的肺转移灶来源的高转移细胞系，以丰富和完备人卵巢癌细胞系库，为研究卵巢癌转移机制提供合适的体外模型，以促进人卵巢癌的基础和临床研究，是非常有必要的。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种人高转移卵巢癌细胞系A2780-M及其建立和应用。该细胞系能够稳定传代、成瘤性好，且在体外能长期培养传代，并可成功建立移植瘤模型。此外，由于该细胞系是自发转移至肺所建立的新细胞，因此对于研究卵巢癌转移特别是血道转移及其机制是一个良好的模型。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种人卵巢癌细胞系，命名为人高转移卵巢癌细胞系A2780-M，于2017年01月22日保藏在于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C201719。
本发明还提供如上所述的人卵巢癌细胞系的子代细胞系。
一种人卵巢癌细胞系的建立方法，包括以下步骤：
采用人卵巢癌细胞A2780为亲本细胞，通过体外Transwell小室筛选出高运动转移性能的细胞，再在裸鼠皮下接种促成肺转移灶形成；分离所述肺转移灶，体外贴壁培养，经连续扩增、传代得到一株稳定生长的人高转移卵巢癌细胞A2780-M。
本发明还提供如上所述的人卵巢癌细胞系或所述子代细胞系在作为卵巢癌发生、卵巢癌发展或卵巢癌转移的细胞模型中的应用。
本发明还提供如上所述的人卵巢癌细胞系或所述子代细胞系在建立卵巢癌动物模型中的应用，尤其是在建立高转移卵巢癌动物模型中的应用。
在本发明的一些实施例中，如上所述的人卵巢癌细胞系或所述子代细胞系用于在裸鼠中产生皮下移植瘤并出现肺转移灶。
所述的裸鼠优选为Balb/c裸鼠。
本发明还提供如上所述的人卵巢癌细胞系或所述子代细胞系在研究卵巢癌发生、发展、转移机理或筛选治疗卵巢癌药物中的应用。
一种筛选治疗卵巢癌药物的方法，包括以下步骤：
测试组中，在含所述人卵巢癌细胞系A2780-M或所述子代细胞系的培养体系中添加不同浓度测试化合物，并观察卵巢癌细胞系A2780-M的数量和/或生长情况；
在对照组中，在所述人卵巢癌细胞系A2780-M或所述子代细胞系的培养体系中不添加测试化合物，并观察卵巢癌细胞系A2780-M的数量和/或生长情况；
其中，如果测试组中卵巢癌细胞系A2780-M的数量或生长速度小于对照组，就表明该测试化合物是对卵巢癌细胞的生长或增殖有抑制作用的治疗卵巢癌的候选药物。
一种筛选治疗具有高运动、高转移倾向的卵巢癌药物的方法，包括以下步骤：
测试组中，在含所述人卵巢癌细胞系A2780-M或所述子代细胞系的培养体系中添加不同浓度测试化合物，并观察卵巢癌细胞系A2780-M的数量和/或生长情况；
对照组中，在母系卵巢癌细胞系A2780的培养体系中添加与之对应的测试化合物，并观察卵巢癌细胞系A2780的数量和/或生长情况；
其中，如果测试组中卵巢癌细胞系A2780-M的数量或生长速度小于对照组中卵巢癌细胞系A2780的数量或生长速度，就表明该测试化合物是对具有高运动、高侵袭卵巢癌细胞的生长或增殖具有更强的敏感性，是治疗具有高运动、高转移倾向的卵巢癌的候选药物。
本发明中，采用人卵巢癌细胞A2780为亲本细胞筛选出高运动转移性能的人卵巢癌细胞，裸鼠皮下接种促成肺转移灶形成，并从所述肺转移灶分离和建立了一种稳定生长的人高转移卵巢癌细胞系A2780-M。
本发明通过光学形态观察发现体外生长的A2780-M细胞贴壁生长，遗传物质STR鉴定该细胞为单一细胞株，证实符合来源于人卵巢癌A2780细胞系。细胞动力学实验显示A2780-M细胞来源于A2780母系，且A2780-M细胞生长更活跃。免疫表型显示A2780-M细胞较A2780母系细胞具有更多原始幼稚细胞的膜抗原以及粘附功能的抗原表达，有利于快速分化增殖和促进细胞运动侵袭。细胞免疫组化实验显示A2780-M细胞膜蛋白、胞浆蛋白、核蛋白都有β-catenin的表达，而母系A2780细胞均在细胞膜表达，且表达量不如A2780-M。同样WB实验也证实β-catenin在A2780-M细胞中的表达较A2780细胞明显增强。细胞穿膜实验显示A2780-M的侵袭功能较A2780母系细胞强。细胞划痕实验显示A2780-M的细胞运动能力明显强于母系A2780细胞。
综合可见，本发明人高转移卵巢癌细胞系A2780-M，作为来源于人卵巢癌A2780细胞系的单一细胞株，具有较母系更明显的增殖活性、更强的转移功能、侵袭功能和细胞运动能力，并且其中β-catenin表达表现出与其性能的相关性，因此，该卵巢癌细胞系A2780-M可以作为可靠的高转移人卵巢癌细胞模型和动物模型，用于研究卵巢癌转移的分子机制，还能为临床诊治、药物筛选及预后判断提供新的靶点，可以为研究体外、体内和临床抗癌药物敏感性及耐药性的相关性，以及人卵巢癌的发生、发展、转移和生物标志物提供新的试验材料。药物敏感实验结果也为临床用药提供了基础。
相比于现有技术，本发明的有益效果如下：
(1)本发明的人高转移卵巢癌细胞系A2780-M具有较好的贴壁性。
(2)本发明的人高转移卵巢癌细胞系A2780-M为单一细胞株，并证实符合来源于人卵巢癌A2780细胞系。
(3)本发明的人高转移卵巢癌细胞系A2780-M，具有较母系更明显的增殖活性、更强的转移功能、侵袭功能和细胞运动能力，可以作为可靠的高转移人卵巢癌细胞系和动物模型，用于研究卵巢癌转移的分子机制，还能为临床诊治、药物筛选及预后判断提供新的靶点。
生物材料的保藏
本发明的人卵巢癌细胞系，命名为人高转移卵巢癌细胞系A2780-M，于2017年01月22日保藏在于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：C201719。
附图说明
图1A和图1B分别为A2780细胞和A2780-M细胞的光学形态图片，放大倍数为100倍。
图2为A2780细胞和A2780-M细胞的细胞增殖曲线比较图，其中，横坐标为时间(小时)，纵坐标为细胞指数(cell index)。
图3为A2780细胞和A2780-M细胞的免疫表型表达结果，具体为：图3-1A和图3-1B分别为A2780细胞和A2780-M细胞的免疫分型CD34-PE表达结果；图3-2A和图3-2B分别为A2780细胞和A2780-M细胞的免疫分型CD24-PE表达结果；图3-3A和图3-3B分别为A2780细胞和A2780-M细胞的免疫分型CD133-PE表达结果；图3-4A和图3-4B分别为A2780细胞和A2780-M细胞的免疫分型CD117-PE表达结果；图3-5A和图3-5B分别为A2780细胞和A2780-M细胞的免疫分型CD44-FITC表达结果。
图4A和图4B分别为A2780细胞和A2780-M细胞中β-catenin蛋白表达的免疫组化结果。
图5为A2780细胞和A2780-M细胞中β-catenin蛋白表达的免疫印迹检测结果。
图6为A2780细胞和A2780-M细胞分别通过基质胶穿膜至下层被艾森实时无标记细胞功能分析仪电极检测到的细胞生长差异图。
图7A为A2780细胞穿过基质胶在其背层贴壁生长的细胞染色图，放大倍数为100倍；图7B为A2780-M细胞穿过基质胶在其背层贴壁生长的细胞染色图，放大倍数为100倍。
图8为细胞划痕实验中A2780细胞和A2780-M细胞的迁移运动能力比较。
图9A为加入顺铂(DDP)后的细胞杀伤抑制曲线。
图9B为加入羟基喜树碱(SN-38)后的细胞杀伤抑制曲线。
图9C为加入多烯他赛(DX)后的细胞杀伤抑制曲线。
图9D为加入吡柔比星(THP)后的细胞杀伤抑制曲线。
图10为分别接种A2780细胞和A2780-M细胞的裸鼠体外成瘤第40天后，解剖所得裸鼠肺照片，左边对应的是接种A2780细胞后的肺，右边对应的是接种A2780-M细胞后的肺。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)或按照供应商所建议的条件。
下列实施例中未特别说明的各种仪器、原料和试剂均为本领域熟知的市售产品，可通过商业途径获得。
例如，RPMI-1640培养基及胎牛血清购自美国GIBCO公司；细胞消化液购自美国GIBCO公司(货号1694300)；Transwell小室(购自Corning公司；货号3422)，Matrigel胶(购自Corning公司；货号356234)，细胞周期ABC试剂盒为美国BD公司(Becton,Dickinson andCompany)产品(货号340242)，Annexin V FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒为BD公司产品。
A2780细胞，购自南京科佰生物科技有限公司。也可直接向欧洲细胞库(ECACC)或美国典型培养物收藏中心(ATCC)购得。
在下列实施例中列出的所使用的具体材料及其来源，仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下组织、细胞、试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。
细胞培养
将细胞置于含10％(v/v)胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基中，同时培养基中还含有100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素双抗，在培养温度37℃、气体环境为5％CO2/95％空气(v/v)、湿度为饱和湿度的孵育箱中培养，GIBCO公司消化液(其组成是体积比为1:1的0.25％(w/v)胰蛋白酶和0.02％(w/v)二乙烯四乙酸二钠的混合)消化传代，取对数生长期细胞作为后续实验用细胞。
实施例1：高转移人卵巢癌细胞系的建立
一、高转移人卵巢癌细胞的首次筛选和建立
1.1制备Transwell小室：在膜孔径为8μm、直径为6.5mm的小室上，预铺用RPMI-1640培养基3倍稀释过的Matrigel胶(即，Matrigel与RPMI-1640培养基的体积比为1:3)，37℃培养箱放置1小时，凝固后移入冰箱保存。
1.2用含0.1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)的无血清培养基水化Matrigel胶，37℃，30min后使用。
1.3将按前述细胞培养方法培养的处于对数生长期的A2780细胞，用前述的GIBCO公司消化液消化成单细胞，以含0.1％(w/v)BSA的无血清培养基重悬细胞得到细胞悬液，细胞计数，调整细胞浓度为5×105个/mL。将Transwell小室放入24孔培养板中，在小室的下层添加600μL的含10％(v/v)FBS的RPMI-1640培养基，上层中加入100μL(含5×104个细胞)细胞悬液。将24孔培养板静置于培养箱中，在培养温度37℃、气体环境为5％CO2/95％空气(v/v)、湿度为饱和湿度的条件下，培养3天。
1.4用前述的GIBCO公司消化液消化穿过基质胶贴在小室底面的细胞，移入新的孔中，按照前述的细胞培养的方法添加培养液继续培养。此时细胞称为穿膜后第一代。
1.5扩大培养孔中穿膜后第一代细胞，再重复上述4个步骤(1.1～1.4)，一共穿膜10次，建成第10代穿膜细胞。暂命名为A2780-M10。
二、裸鼠移植瘤及肺转移实验
2.1将A2780-M10细胞以75×105/0.2mL皮下接种Balb/c裸小鼠(4周龄)。该裸鼠购于上海斯莱克实验动物有限公司，实验动物许可证号：SCXK(沪)2007-0005，实验动物均置于SPF级无菌层流室饲养。
2.2隔天观察裸鼠生长情况和移植瘤生长。
三、肺转移灶培养和细胞系的建立
3.1裸鼠生长40天后，断颈处死裸鼠后，解剖脏器，用眼科剪剪取部分肺转移灶，将其剪碎。移至25平方厘米大小的培养瓶中，按照前述细胞培养方法添加新鲜培养液(即前述的含10％(v/v)FBS的RPMI-1640培养基+100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素双抗)培养。
3.2待细胞贴壁后，用消化排除法(体积比为1:1的0.5％(w/v)胰蛋白酶和0.02％(w/v)EDTA混合液)消化到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化；用此法处理后，成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落，从而去除成纤维细胞。
3.3继续体外扩大培养，直至未见成纤维细胞的生长，肿瘤细胞稳定传代生长(目前稳定传代20代以上)。命名为A2780-M。
将上述高转移人卵巢癌细胞系命名为人高转移卵巢癌细胞系A2780-M。人高转移卵巢癌细胞系A2780-M已于2017年01月22日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：C201719。
实施例2：A2780-M细胞系的生物学特性及应用
(一)A2780-M细胞系的形态学观察
取传代培养的细胞，在光学显微镜下(日本Olympus IMT-2倒置显微镜)观察活细胞生长情况，如图1B所示(放大倍数为100倍)。为了与A2780细胞进行比较，同时还提供了A2780细胞的光学形态图片，如图1A所示(放大倍数为100倍)。由图1A和图1B可见细胞贴壁生长，生长旺盛，大多数细胞呈多边形、卵圆形。2天传代一次。A2780-M细胞较A2780母系细胞形态学上稍有不同，更趋向于短梭状、纤维样。
(二)A2780-M细胞系的遗传物质STR分析
短串联重复序列(short tandem repeat，STR)又称为微卫星DNA，是指染色体上，由数个碱基对作为核心单位(2-6个碱基对)，串联重复形成的一类DNA序列(重复次数为10～60多次，基因片段在400碱基对以下)；每个核心单位重复的次数会出现个体差异，从而形成片段长度不同的等位基因。因此，一组STR序列的重复次数在不同个体中几乎是唯一的，是个体的基因身份特征，也是细胞生物学对细胞身份和来源进行鉴定的主要方法。委托南京科佰生物科技有限公司检测。
检测方法：a、Axygen的基因组抽提试剂盒(来自于Axygen公司)提取细胞基因组DNA；b、采用promega试剂盒扩增样品；c、在ABI3730XL型遗传分析仪上对STR位点和性别基因Amelogenin进行检测；检测结果如下表1所示。
表1：A2780-M细胞系的STR位点和Amelogenin位点的基因分型结果
分析上述数据，并与美国典型培养物保藏中心(ATCC)数据库、德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)数据库和日本JCRB细胞库的数据开展比对，得出以下检测结论：
该细胞DNA进行细胞STR分型结果显示，在各个基因中均未出现四等位基因现象，细胞中没有发现人类细胞交叉污染，表明该细胞株为单一细胞。该株细胞DNA分型在ECACC细胞库中均找到与其细胞分型100％相匹配的细胞，名称为A2780，表明其为A2780的子细胞。
(三)A2780-M细胞系的生长动力学研究
细胞增殖实验：
取对数生长期的A2780-M细胞，以4000个/孔接种至专用孔板中，两复孔。采用实时无标记动态细胞分析技术(RTCA)进行实时动态的细胞增殖检测，获得的细胞增殖曲线为图2中A2780M对应的曲线。
取对数生长期的A2780细胞，用同样的方法进行细胞增殖检测，获得的细胞增殖曲线为图2中A2780对应的曲线。
其中，所用仪器为美国艾森实时无标记细胞功能分析仪。
由图2可知，与A2780母系细胞相比，A2780-M细胞明显提前增殖并进入平台期，说明该A2780-M细胞生长更趋于活跃。
细胞周期实验：
分别收集对数生长期的A2780和A2780-M细胞，用前述的GIBCO消化液消化成单细胞悬液，按10万细胞/孔接种6孔细胞培养板中，共3组，每组3复孔。在37℃、5％CO2饱和湿度的孵箱中继续培养24小时后，收集细胞，PBS(磷酸缓冲盐溶液)清洗后，以4℃、70％酒精(v/v)重悬细胞，过夜待做周期实验。周期实验采用BD公司ABC试剂盒，流式细胞术检测结果。
表2：细胞周期实验结果
细胞 G0-G1(24H/48H) G2-M(24H/48H) S(24H/48H)
A2780 56/58 14.1/12 29.9/30
A2780-M 55/60.5 13/12.5 32/27
细胞周期实验结果如上表2所示，由表2可见：与A2780母系细胞相比较，A2780-M细胞的周期分布和A2780母系细胞基本一致，说明A2780-M细胞来源于A2780母系。
(四)A2780-M细胞系的细胞表型分析
分别收集A2780和A2780-M细胞，经PBS清洗并重悬细胞后，取100μL(含1×104细胞)细胞悬液，加5μL相应CD抗体，避光室温放置30min。再加400μL PBS液，经流式细胞仪(FACS Calibur美国BD公司)上样检测，用cellquest分析软件进行结果分析。分析结果如图3和表3所示。
细胞膜表面分化抗原CD34、CD133、CD117主要表达于原始细胞、幼稚细胞和干细胞，具有分化增殖快速的特性；CD24、CD44属于黏附分子，可以促进细胞运动侵袭，与肿瘤转移侵袭有关。由图3可见，A2870/A2780-M两细胞CD24和CD117全部表达，CD34、CD133、CD44三个抗原的表达量A2780-M明显较母系增高，由此证明A2780-M细胞具有更明显的增殖活性和转移功能。
表3 A2780-M及其母系A2780细胞的免疫表型表达结果
免疫表型 A2780(％) A2780M(％)
CD34-PE 5.6 15.2
CD24-PE 98.3 99.5
CD133-PE 15.9 24.4
CD117-PE 98.8 98.8
CD44-FITC 10.4 27.6
(五)A2780-M细胞的β-catenin蛋白表达
β-catenin(β-链蛋白)最早作为一种黏附因子被发现，后来人们发现β-catenin还是一种多功能的蛋白质。主要位于细胞膜，而在胞浆中游离量较少。β-catenin的功能主要为介导细胞间黏附和参与基因的表达，它是Wnt信号通路中的关键分子，调控细胞生长增殖，与E-cadherin(上皮细胞钙粘蛋白)形成复合体，在维持上皮极性和粘附性方面起着重要作用。但在恶性行为发生过程中，wnt信号发生异常激活，β-catenin会向细胞核积聚，与E-cadherin的复合体发生解离，上皮细胞的粘附功能降低，使细胞获得向远处转移的能力。
采用以下方法和步骤对A2780-M细胞进行免疫组化分析：
细胞蜡块处理程序
(1)将细胞培养标本，用低速自动平衡离心机(LD-Z5-2北京)以每分钟3000转离心10分钟；
(2)取沉淀标本以茶叶滤叶包裹；
(3)取4％(v/v)中性甲醛，固定5分钟(采用上海震康快速组织超声处理仪，水温设置70℃)；
(4)丙酮处理4分钟，2次；
(5)入60℃石蜡，浸蜡30分钟；
(6)采用德国徕卡JUNG包埋机包埋；
(7)采用德国徕卡2135石蜡切片机切片，厚度4μ；
(8)60℃烤箱，烤片1小时；
(9)采用德国徕卡ST5020染色机染色；
(10)采用德国徕卡CV5030封片机封片。
免疫组化步骤为：
(1)细胞蜡块经常规脱蜡并水化。
(2)3％(v/v)H2O2去离子水浸泡10分钟，以阻断内源性过氧化物酶。
(3)抗原修复以高压锅喷汽半分钟，缓冲液为0.01摩尔/升的pH为6.0的枸橼酸缓冲液。
(4)滴加一抗，室温下孵育60分钟，PBS缓冲液冲洗，2分钟×3次。
(5)滴加试剂1：Biotin标记羊抗鼠/兔二抗工作液，室温下孵育20分钟，PBS缓冲液冲洗，2分钟×3次。
(6)滴加试剂2：HRP标记链霉素亲和素，室温下孵育30分钟，PBS缓冲液冲洗，2分钟×3次。
(7)稀释配制二氨基联苯胺(DAB)溶液，显色5～10分钟，镜下观察。
(8)清水冲洗，苏木素复染，常规脱水，透明、封片。
所用检测试剂为通用型P003IH免疫组化试剂盒，购自长沙艾佳生物技术有限公司。
为了进行比较，采用相同方法和步骤对A2780细胞进行免疫组化分析。
免疫组化结果(放大倍数为400倍)如图4A和4B所示，结果显示：
图4A的母系细胞A2780的β-catenin蛋白表达弱阳性，集中在胞膜表达；图4B的A2780-M细胞的β-catenin蛋白表达强阳性，以胞膜、胞浆为主，少量入核表达。
采用以下方法和步骤对A2780-M细胞进行免疫印迹(Western-blot)检测：
(1)细胞裂解并提取总蛋白，用BCA试剂盒(购自长沙艾佳生物技术有限公司，货号P001B-1)测定蛋白浓度，以保证上样量一致。
(2)制备分离胶与沉积胶，加样蛋白(50μg)电泳，分离蛋白。
(3)电转膜：将凝胶上的蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上。
(4)封闭转印膜，防止免疫试剂的非特异性结合。
(5)β-catenin(一抗)1:1000孵育4℃过夜；TBST(TBS+Tween)清洗4遍，二抗1:2000孵育2H，再PBST(PBST是在磷酸缓冲盐溶液中含有Tween-20，Tween-20在整个PBST溶液中的体积百分比为0.1％)清洗4遍。
(6)辣根过氧化物酶-增强化学发光(ECL)法显色。
(7)凝胶成像系统成像。
为了进行比较，采用相同方法和步骤对A2780细胞进行免疫印迹检测。
检测结果如图5所示，结果显示：A2780-M细胞中β-catenin的表达(图5中记为A2780M)较A2780细胞中β-catenin的表达(图5中记为A2780)高。
由免疫组化(IHC)和免疫印迹(WB)测试共同证明：
A2780-M细胞高表达β-catenin蛋白，这与它较母系细胞A2780具有更强侵袭转移的生物学特性具有一定相关性。
(六)A2780-M细胞系的细胞侵袭(穿膜)能力分析
细胞侵袭实验
艾森板制备小室：配制1:30浓度的Matrigel(即用RPMI-1640培养基30倍稀释Matrigel胶，Matrigel胶与RPMI-1640培养基的体积比为1:30),培养箱过夜，水化10min后，下室加165μL含10％(v/v)FBS的RPMI-1640培养基，上室加30μL含0.1％(w/v)BSA的无血清培养基，静置1小时后测基线。分别收集A2780和A2780-M细胞，以3万/孔加至上室，含0.1％(w/v)BSA的无血清培养基补足至100μL，室温静置30min后，上机检测。
图6记录了A2780细胞与A2780-M细胞分别通过基质胶穿膜至下层被艾森实时无标记细胞功能分析仪电极检测到的细胞生长差异，图7A为A2780细胞穿过基质胶在其背层贴壁生长的细胞染色图(×100)，图7B为A2780-M细胞穿过基质胶在其背层贴壁生长的细胞染色图(×100)。由图6、图7A、7B可见，A2780-M细胞较早发生基底膜的穿透，从而贴在小室底层生长，且具备该功能的细胞数较多，说明A2780-M细胞的侵袭功能较A2780母系细胞强。
(七)A2780-M细胞系的细胞体外运动能力分析
采用Wound Healing culture inserts划痕实验板(德国ibidi公司，货号81176)，进行细胞体外划痕实验(在单层细胞中划痕，通过显微镜下观察划痕修复进程从而衡量细胞迁移能力)。
分别收集对数生长期的A2780和A2780-M细胞，以6万/mL浓度接种70μL细胞至ibidi-Culture-Inser(易必迪公司的划痕试验/伤口愈合实验专用培养插件)提供的两个独立小室中，小室置于直径5cm的平皿中，待贴壁生长24小时后，移除小室，添加800μL无血清RPMI-1640培养液。显微镜下观察有一明显宽度一致的间隙，拍摄记录0小时细胞生长状态，24、48小时后分别再次观察记录细胞生长状态。
结果如图8所示。图8中，上面3张图片分别为A2780细胞在0小时、24小时、48小时的细胞生长状态，放大倍数为100倍(相差×100)，下面3张图片分别为A2780-M细胞在0小时、24小时、48小时的细胞生长状态，放大倍数为100倍(相差×100)。由图8可见，A2780-M的细胞运动能力明显强于母系A2780细胞，24小时A2780-M细胞就出现运动迁移能力强的细胞向中间划痕间隙区生长，48小时后划痕间隙基本消失。
(八)药物敏感实验
分别收集对数生长期的A2780和A2780-M细胞，以4000/孔/100ul接种96孔板，24小时后分别加药。
药物：顺铂(DDP)、羟基喜树碱(SN-38)、多烯他赛(DX)、吡柔比星(THP)；最高浓度分别为：DDP 50μg/ml、SN-38 4μg/ml、THP 10μg/ml、DX20μg/ml，除DDP浓度梯度三倍稀释，其余均倍比稀释。
48小时后加Cell Counting Kit-8(采用同仁化学研究所(Dojindo)的CCK-8试剂盒)检测OD值，绘制细胞杀伤抑制曲线，如图9A～图9D所示。
在上述药物敏感实验中，选取了临床常用的针对卵巢癌治疗的4种化疗药物，观察它们对A2780和A2780-M细胞生长的抑制功能，从而比较两株不同运动与转移倾向的卵巢癌细胞分别对于这4种药物的敏感性差异，进而筛选相应的候选药物。根据图9A～图9D的结果：A2780-M与其母系细胞A2780相比，DDP和THP两药的药物敏感性没有明显差异，SN-38与DX两药对于A2780和A2780-M细胞具有不同的敏感性，细胞A2780-M对SN-38与DX两药更为敏感。
(九)A2780-M细胞系的细胞体内实验
收集A2780和A2780-M细胞，以120万/0.2mL分别皮下接种4周龄SPF级BALB/c雌性裸鼠(购于上海斯莱克实验动物有限公司，实验动物许可证号SCXK2012-0002)，观察。实验动物均置于SPF级无菌层流室饲养。
10天后，明显发现2组裸鼠皮下绿豆大小移植瘤生长。随着时间推移，接种A2780-M细胞的裸鼠移植瘤生长速度较接种母系A2780细胞的裸鼠移植瘤生长速度稍慢，且接种A2780-M细胞的裸鼠移植瘤表皮可见新生血管。接种A2780细胞的裸鼠移植瘤容易溃破。
40天后，2组裸鼠的移植瘤生长至1.5×2cm大小，解剖脏器，肉眼发现接种A2780-M细胞的裸鼠有肺转移结节。病理证实为肺转移。接种母系细胞A2780细胞的裸鼠未发现转移灶。
图10是分别接种A2780和A2780-M细胞的移植瘤裸鼠经过40天生长后，解剖观察到的肺组织样本。其中左侧为接种A2780细胞组裸鼠的肺，未见明显转移灶；右侧为接种A2780-M细胞组裸鼠肺，可见明显肺转移灶。
综合以上实验观察与验证，体外生长的A2780-M细胞贴壁生长，遗传物质STR鉴定该细胞为单一细胞株，证实符合来源于人卵巢癌A2780细胞系，细胞动力学实验显示A2780-M细胞来源于A2780母系，且A2780-M细胞生长更活跃。免疫表型显示A2780-M细胞较A2780母系细胞具有更多原始幼稚细胞的膜抗原以及粘附功能的抗原表达，有利于快速分化增殖和促进细胞运动侵袭。细胞免疫组化实验显示A2780-M细胞膜蛋白、胞浆蛋白、核蛋白都有β-catenin的表达，而母系A2780细胞均在细胞膜表达，且表达量不如A2780-M。同样WB实验也证实β-catenin在A2780-M细胞中的表达较A2780细胞明显增强。细胞穿膜实验显示A2780-M的侵袭功能较A2780母系细胞强。细胞划痕实验显示A2780-M的细胞运动能力明显强于母系A2780细胞。由此说明：该卵巢癌细胞系A2780-M，作为来源于人卵巢癌A2780细胞系的单一细胞株，具有较母系更明显的增殖活性、更强的转移功能、侵袭功能和细胞运动能力，并且其中β-catenin表达表现出与其性能的相关性，因此，该卵巢癌细胞系A2780-M可以作为可靠的高转移人卵巢癌细胞模型和动物模型，为体内外研究卵巢癌转移的分子机制、药物筛选及预后判断提供新的靶点，同时为研究人卵巢癌的发生、发展、转移和生物标志物等提供新的试验材料。
由此可见，本发明的目的已经完整并有效的予以实现。本发明的方法以及原理已在实施例中予以展示和说明，在不背离所述原理的情况下，实施方式可作任意修改。所以，本发明包括了基于权利要求精神及权利要求范围的所有变形实施方式。

Claims (10)

1.人卵巢癌细胞系，其特征在于，命名为人高转移卵巢癌细胞系A2780-M，保藏编号为CCTCC NO：C201719。
2.如权利要求1所述的人卵巢癌细胞系的子代细胞系。
3.如权利要求1所述的人卵巢癌细胞系的建立方法，包括以下步骤：
采用人卵巢癌细胞A2780为亲本细胞，通过体外Transwell小室筛选出高运动转移性能的细胞，再在裸鼠皮下接种促成肺转移灶形成；分离所述肺转移灶，体外贴壁培养，经连续扩增、传代得到一株稳定生长的人高转移卵巢癌细胞A2780-M。
4.如权利要求1所述人卵巢癌细胞系或如权利要求2所述的子代细胞系在作为卵巢癌发生、卵巢癌发展或卵巢癌转移的细胞模型中的应用。
5.如权利要求1所述人卵巢癌细胞系或如权利要求2所述的子代细胞系在建立卵巢癌动物模型中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，如权利要求1所述的人卵巢癌细胞系或如权利要求2所述的子代细胞系用于在裸鼠中产生皮下移植瘤并出现肺转移灶。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的裸鼠为Balb/c裸鼠。
8.如权利要求1所述人卵巢癌细胞系或如权利要求2所述的子代细胞系在研究卵巢癌发生、发展、转移机理或筛选治疗卵巢癌药物中的应用。
9.如权利要求8所述的筛选治疗卵巢癌药物的方法，包括以下步骤：
测试组中，在含权利要求1所述人卵巢癌细胞系A2780-M或如权利要求2所述的子代细胞系的培养体系中添加不同浓度测试化合物，并观察卵巢癌细胞系A2780-M的数量和/或生长情况；
在对照组中，在权利要求1所述人卵巢癌细胞系A2780-M或如权利要求2所述的子代细胞系的培养体系中不添加测试化合物，并观察卵巢癌细胞系A2780-M的数量和/或生长情况；
其中，如果测试组中卵巢癌细胞系A2780-M的数量或生长速度小于对照组，就表明该测试化合物是对卵巢癌细胞的生长或增殖有抑制作用的治疗卵巢癌的候选药物。
10.如权利要求8所述的筛选治疗卵巢癌药物的方法，所述卵巢癌为具有高运动、高转移倾向的卵巢癌，包括以下步骤：
测试组中，在含权利要求1所述人卵巢癌细胞系A2780-M或如权利要求2所述的子代细胞系的培养体系中添加不同浓度测试化合物，并观察卵巢癌细胞系A2780-M的数量和/或生长情况；
对照组中，在母系卵巢癌细胞系A2780的培养体系中添加相应的测试化合物，并观察卵巢癌细胞系A2780的数量和/或生长情况；
其中，如果测试组中卵巢癌细胞系A2780-M的数量或生长速度小于对照组中卵巢癌细胞系A2780的数量或生长速度，就表明该测试化合物是治疗具有高运动、高转移倾向的卵巢癌的候选药物。
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