CN106706389B - 岩黄连根的石蜡切片方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种岩黄连根的石蜡切片方法，包括样品固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与展片、脱蜡、染色以及封片，在透明步骤之前，将脱水后的岩黄连根放于体积浓度为0.8‑1.2％的番红溶液浸染8‑12h；在染色步骤中，将载有岩黄连根的玻片进行复水，复水后再放于酒精溶液中进行分色，同时向用于分色的酒精溶液中加入体积比为1/(800‑1000)的醋酸，最后放入体积浓度为0.8‑1.2％的固绿溶液中染色20‑30秒。本发明制备的根部切片组织更清晰，轮廓根分明，便于药材的鉴别。
Description
技术领域
本发明涉及组织学领域。更具体地说，本发明涉及一种岩黄连根的石蜡切片方法。
背景技术
岩黄连(Corydalis saxicola Bunting)是罂粟科植物，为多年生草本植物，分布于我国广西、广东、福建、湖南等省。全草入药，全草含脱氢卡维丁(岩黄连碱)等活性成分；具有显著的抗菌、消炎、镇痛和强安定作用，并观察到有抑制肿瘤细胞作用；主治疮疖肿毒、肝炎、肝硬化、肝癌等症，是著名的壮瑶药品种。岩黄连植物分布局限于石灰岩山区，属石山特有种。由于生境条件恶劣，其自然繁殖率很低，种群发展困难，资源蕴藏量十分有限。近年来人们大量采挖和收购，导致了野生资源的供不应求，野生岩黄连资源濒临枯竭，市场供不应求。随着日益攀升的市场价格，混淆品层出不穷，因此急需开发出岩黄连根部切片用以鉴别药材的真伪，供规范药材市场，鉴别真伪的岩黄连切片需要达到的效果为岩黄连根部切片结构清晰，能明确分辨各组织结构等，且需要标本可以长期保存使用，为永久性显微玻片标本。常规切片技术步骤繁杂不统一，且制备出来的岩黄连根部切片达不到要求无法适用于药材的鉴别。
发明内容
本发明的一个目的是解决现有技术制备的岩黄连根部切片不够清晰不能用于药材真伪鉴别的问题，并提供至少后面将说明的优点。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种岩黄连根的石蜡切片方法，包括样品固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与展片、脱蜡、染色以及封片，包括：
在透明步骤之前，将脱水后的岩黄连根放于体积浓度为0.8-1.2％的番红溶液浸染8-12h；
在染色步骤中，将载有岩黄连根的玻片进行复水，复水后再放于酒精溶液中进行分色，同时向用于分色的酒精溶液中加入体积比为1/(800-1000)的醋酸，最后放入体积浓度为0.8-1.2％的固绿溶液中染色20-30秒。
优选的是，所述体积浓度为0.8-1.2％的番红溶液是用2/3体积无水酒精+1/3体积TO型生物透明剂的混合液为溶剂配制而成，所述体积浓度为0.8-1.2％的固绿溶液是用体积浓度为95％的酒精溶液为溶剂配制而成。
优选的是，将载有岩黄连根的玻片依次放入1/2体积型生物透明剂+1/2体积无水酒精混合液、无水酒精、无水酒精、体积浓度为95％酒精、体积浓度为85％酒精、体积浓度为70％酒精中复水，每级3-5秒；再放入体积浓度为50％酒精中分色，3-10秒；之后再依次放入体积浓度为70％酒精、体积浓度为85％酒精中进一步处理，每级3-10秒。
优选的是，固绿溶液染色后将载有岩黄连根的玻片放于放入无水酒精中洗去染色剂，此级停留3-10秒；然后依次放入无水酒精、1/2TO型生物透明剂+1/2无水酒精混合液中，每级停留3-10秒；最后将载有岩黄连茎的玻片放入TO型生物透明剂中停留5-10分钟，此步骤重复三次。
优选的是，将固定后岩黄连根依次经过体积浓度为80％酒精、体积浓度为85％酒精、体积浓度为90％酒精、体积浓度为95％酒精逐级脱水，每个浓度梯度脱水45-60分钟，再放于100％酒精中脱水两次，每次30-45分钟。
优选的是，每个梯度浓度的酒精溶液在对岩黄连根脱水过程中进行真空抽气15-18分钟。
优选的是，所述真空抽气过程包括：将岩黄连根放于每个梯度浓度的酒精溶液中，第1-3分钟，将酒精溶液逐渐升温至35℃，加压50KPa，之后维持2分钟；第6-8分钟，将酒精溶液逐渐升温至40℃，加压100KPa，之后维持2分钟；第11-13分钟，将酒精溶液逐渐升温至45℃，加压150KPa，之后维持2-5分钟，泄压。优选的是，对番红溶液染色后的岩黄连根依次用1/2体积无水酒精+1/2体积TO型生物透明剂混合液以及1/3体积无水酒精+2/3体积TO型生物透明剂混合液进行透明处理，每级透明时间均为60-120分钟；再放于纯TO型生物透明剂中浸泡2次，每次浸泡60-120分钟。
优选的是，在每次透明过程中进行真空抽气10-15分钟。
优选的是，在透明步骤之前用番红溶液染色时，将脱水后的岩黄连根放于0.8-1.2％的番红溶液中进行真空抽滤20分钟，浸染3小时后，用频率为800兆赫的电磁波对岩黄连根进行辐照45秒，在浸染的第7小时，再用频率为850兆赫的电磁波对岩黄连根进行辐照35秒。
本发明至少包括以下有益效果：
(1)本发明公布的岩黄连根切片方法，岩黄连根横切结构清晰，可以在10至12天内切出结构清晰的岩黄连根结构，标本可以长期保存使用，为永久性显微玻片标本，可供岩黄连药材显微鉴别应用，供规范市场；
(2)岩黄连根部脱水后根部几乎透明，本发明在透明前先用番红溶液对样品进行预染色，这样在包埋的时候包埋的位置更准确，本发明的番红溶液是用2/3体积无水酒精+1/3体积TO型生物透明剂的混合液为溶剂配制而成，这样既可以进行透明也可以进行染色，省时省力；
(3)本发明在固绿染色前在50％酒精中加入醋酸进行分色醋酸的加入有利于分色，使得番红固绿染色不同部位效果更明显；
(4)在分色后用体积浓度为70％酒精、体积浓度为85％酒精对样品进一步处理，可以使得岩黄连根部中各组织更立体，在染色后效果更突出，更易于观察对比；
(5)在固绿染色之后，再将片子依次放入无水酒精、1/2TO型生物透明剂+1/2无水酒精混合液中，每级停留3-10秒；最后将载有岩黄连叶片的玻片放入TO型生物透明剂中停留5-10分钟，此步骤重复三次，目的是完全除去残留在叶片和玻片上蜡；
(6)岩黄连根部的组织比较紧密，因此在脱水步骤中的真空抽气时，逐渐升高酒精的温度，并加压，这样可以使得酒精溶液能更容易进入到根部各组织中，从而使得根部脱水的效果更好；
(7)岩黄连根部的组织比较紧密，用电磁波对岩黄连根部短时间照射不会改变根部结构，但是却可以加速根部组织内部分子的高速运动，以使染料在根部内的运输加快，增加弥散、渗透和交换效率，从而使得染色的效果更好，做出来的根部切片组织更清晰，轮廓根分明，便于药材的鉴别。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明的对照组的石蜡切片图；
图2为本发明的实施例1的石蜡切片图；
图3为本发明的实施例4的石蜡切片图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：
(1)固定：新鲜岩黄连根部采下后用自来水冲净表面浮尘，吸干叶片表面水分。然后垂直根部中脉横切，每片长约8mm，宽4mm，放入体积浓度为70％酒精配制的FAA固定液中固定24小时，FAA固定液由体积浓度为70％酒精:冰醋酸:甲醛体积比为90:5:5配制而成。
(2)脱水：将材料从FAA固定液中取出，滤纸吸干多余FAA固定液，放入带橡胶塞的平底玻璃管内，加入体积浓度为80％酒精中，体积浓度为80％酒精的加入量为材料体积的20倍以上，真空抽气15分钟，停留45分钟；倒出体积浓度为80％酒精，加入体积浓度为85％酒精，真空抽气15分钟，放置45分钟；倒出体积浓度为85％酒精，加入体积浓度为90％酒精，真空抽气15分钟，放置60分钟；倒出体积浓度为90％酒精，加入体积浓度为95％酒精，真空抽气18分钟，放置60分钟；倒出体积浓度为95％酒精，加入100％酒精，真空抽气18分钟，放置30分钟；更换一次100％酒精，真空抽气15分钟，放置45分钟。
(4)透明：倒出无水酒精，在透明之前，将脱水后的岩黄连根放于体积浓度为1％的番红溶液浸染10h，其中体积浓度为1％的番红溶液是用2/3体积无水酒精+1/3体积TO型生物透明剂的混合液为溶剂配制而成；倒出番红溶液，加入1/2体积无水酒精+1/2体积TO型生物透明剂的混合液，真空抽气15分钟，放置60分钟；倒出1/2体积无水酒精+1/2体积TO型生物透明剂的混合液，加入1/3体积无水酒精+2/3体积TO型生物透明剂的混合液，真空抽气15分钟，放置90分钟；倒出1/3体积无水酒精+2/3体积TO型生物透明剂的混合液，加入纯TO型生物透明剂，真空抽气15分钟，放置90分钟；倒出TO型生物透明剂，换一次TO型生物透明剂，真空抽气15分钟，放置120分钟。
(5)浸蜡：第一次浸蜡向装岩黄连根的玻璃管中加入固体小蜡块，加入量为TO型生物透明剂体积的1/3，塞好瓶塞，放入45℃恒温箱中，待蜡融化后再行加入同样数量的蜡块，此步骤共4次，直至蜡不再融化为止，最后一次加蜡打开瓶塞，尽可能让TO透明剂挥发，此过程需要2天。第二次浸蜡将根连同蜡一起倒入坩锅中，再将坩锅移至60℃恒温箱中，凝固的蜡全部溶解后将连同根、TO透明剂一起倒出，换入已融化溶点为56℃的石蜡，在60℃恒温箱中放置4h；然后再次换入已融化溶点为58℃的石蜡，在60℃恒温箱中放置2h后即可包埋。
(6)包埋：从恒温箱拿出盛有岩黄连根的坩锅，将标签夹出放在包埋盒一边，底部蜡稍凝后，解剖针在酒精灯上稍加热划开纸盒表面凝蜡，立即将坩锅中的材料拨入包埋盒，并将材料按照切片方向放好，静置冷却。待表面凝固后放入水盆中，使之沉入水底30分钟后，取出包埋盒，室温晾干，储藏备用。
(7)切片与展片：蜡块的固着与修整：将蜡块按材料大小及切割方向修至适当大小。粘蜡块：将修好的小蜡块粘到木块上。用解剖刀在酒精灯上加热，然后接触一下蜡块底部，使底部蜡软化，迅速将其粘在木块上。蜡块与木块连接的部位，应滴些熔蜡，加强粘接的牢固性。将粘着蜡块的木块固定在切片机上，调好所需厚度(6-12μm)，进行切片，按顺序放置在准备好的大纸盒里或硬纸上。用小拇指涂极少量明胶粘片剂在载玻片上。在玻片上加足够的蒸馏水，将载玻片放置在50±(1-2)℃展温台上。解剖刀将蜡带分割成适当长度的小段，长度小于盖玻片长度的1/5-2/5，用刀尖蘸水，将粘起蜡带，放在在载玻片的水面上使之迅速平展，调整蜡带位置，使之排列整齐。展温台另一端垫上两张纸，待蜡带展平后，立即将其载玻片上的水吸干净，再置温台上；待水完全蒸发，用砖石笔在切片一端刻上记号，放入45℃烘箱中烘烤至少放置1天后才可进行下一步。
(8)脱蜡：将要染色的片子依次放入3瓶TO型生物透明剂中，每级3分钟，脱去石蜡。
(9)染色：将脱蜡后的片子依次放入1/2体积TO型生物透明剂+1/2体积无水酒精的混合液、无水酒精、无水酒精、体积浓度为95％酒精、体积浓度为85％酒精、体积浓度为70％酒精中复水，每级3秒。再将片子放入体积浓度为50％酒精中分色10秒，体积浓度为50％酒精溶液中加入有醋酸，其中，醋酸：50％酒精的体积比为1:1000。然后将片子依次放入体积浓度为70％酒精、体积浓度为85％酒精中进一步处理，每级7秒。最后将片子放入体积浓度为1％的固绿溶液中染色20秒，其中体积浓度为1％的固绿溶液是用体积浓度为95％的酒精溶液为溶剂配制而成。染色完成后，将片子放入无水酒精中，涮去片子上的染色剂，此级停留10秒；再将片子放入无水酒精中，停留10秒；之后将片子放入1/2体积TO型生物透明剂+1/2体积无水酒精的混合液中，停留3秒；最后将片子放入TO型生物透明剂中，停留5分钟，此步骤重复三次。
(10)封片：将片子平放在纸上，擦去下部残留的TO型生物透明剂，上面滴2-3滴加拿大树胶，盖玻片在酒精灯上烘一下，从一侧小心盖下，避免出现气泡，放入45℃烘箱，烘干即可取出，贴好标签，标签上注名材料名称、采集地点、时间等信息。
实施例2：
(1)固定：新鲜岩黄连根部采下后用自来水冲净表面浮尘，吸干叶片表面水分。然后垂直根部中脉横切，每片长约5mm，宽3mm，放入体积浓度为70％酒精配制的FAA固定液中固定24小时，FAA固定液由体积浓度为70％酒精:冰醋酸:甲醛体积比为90:5:5配制而成。
(2)脱水：将材料从FAA固定液中取出，滤纸吸干多余FAA固定液，放入带橡胶塞的平底玻璃管内，加入体积浓度为80％酒精中，体积浓度为80％酒精的加入量为材料体积的20倍以上，真空抽气15分钟，停留55分钟；倒出体积浓度为80％酒精，加入体积浓度为85％酒精，真空抽气16分钟，放置60分钟；倒出体积浓度为85％酒精，加入体积浓度为90％酒精，真空抽气16分钟，放置45分钟；倒出体积浓度为90％酒精，加入体积浓度为95％酒精，真空抽气15分钟，放置45分钟；倒出体积浓度为95％酒精，加入100％酒精，真空抽气18分钟，放置45分钟；更换一次100％酒精，真空抽气15分钟，放置30分钟。
(4)透明：倒出无水酒精，在透明之前，将脱水后的岩黄连根放于体积浓度为1.2％的番红溶液浸染8h，其中体积浓度为1％的番红溶液是用2/3体积无水酒精+1/3体积TO型生物透明剂的混合液为溶剂配制而成；倒出番红溶液，加入1/2体积无水酒精+1/2体积TO型生物透明剂的混合液，真空抽气10分钟，放置90分钟；倒出1/2体积无水酒精+1/2体积TO型生物透明剂的混合液，加入1/3体积无水酒精+2/3体积TO型生物透明剂的混合液，真空抽气10分钟，放置60分钟；倒出1/3体积无水酒精+2/3体积TO型生物透明剂的混合液，加入纯TO型生物透明剂，真空抽气10分钟，放置120分钟；倒出TO型生物透明剂，换一次TO型生物透明剂，真空抽气10分钟，放置60分钟。
(5)浸蜡：第一次浸蜡向装岩黄连根的玻璃管中加入固体小蜡块，加入量为TO型生物透明剂体积的1/3，塞好瓶塞，放入45℃恒温箱中，待蜡融化后再行加入同样数量的蜡块，此步骤共5次，直至蜡不再融化为止，最后一次加蜡打开瓶塞，尽可能让TO透明剂挥发，此过程需要3天。第二次浸蜡将根连同蜡一起倒入坩锅中，再将坩锅移至60℃恒温箱中，凝固的蜡全部溶解后将连同根、TO透明剂一起倒出，换入已融化溶点为56℃的石蜡，在60℃恒温箱中放置4h；然后再次换入已融化溶点为58℃的石蜡，在60℃恒温箱中放置2h后即可包埋。
(6)包埋：从恒温箱拿出盛有岩黄连根的坩锅，将标签夹出放在包埋盒一边，底部蜡稍凝后，解剖针在酒精灯上稍加热划开纸盒表面凝蜡，立即将坩锅中的材料拨入包埋盒，并将材料按照切片方向放好，静置冷却。待表面凝固后放入水盆中，使之沉入水底30分钟后，取出包埋盒，室温晾干，储藏备用。
(7)切片与展片：蜡块的固着与修整：将蜡块按材料大小及切割方向修至适当大小。粘蜡块：将修好的小蜡块粘到木块上。用解剖刀在酒精灯上加热，然后接触一下蜡块底部，使底部蜡软化，迅速将其粘在木块上。蜡块与木块连接的部位，应滴些熔蜡，加强粘接的牢固性。将粘着蜡块的木块固定在切片机上，调好所需厚度(6-12μm)，进行切片，按顺序放置在准备好的大纸盒里或硬纸上。用小拇指涂极少量明胶粘片剂在载玻片上。在玻片上加足够的蒸馏水，将载玻片放置在50±(1-2)℃展温台上。解剖刀将蜡带分割成适当长度的小段，长度小于盖玻片长度的1/5-2/5，用刀尖蘸水，将粘起蜡带，放在在载玻片的水面上使之迅速平展，调整蜡带位置，使之排列整齐。展温台另一端垫上两张纸，待蜡带展平后，立即将其载玻片上的水吸干净，再置温台上；待水完全蒸发，用砖石笔在切片一端刻上记号，放入45℃烘箱中烘烤至少放置1天后才可进行下一步。
(8)脱蜡：将要染色的片子依次放入3瓶TO型生物透明剂中，每级5分钟，脱去石蜡。
(9)染色：将脱蜡后的片子依次放入1/2体积TO型生物透明剂+1/2体积无水酒精的混合液、无水酒精、无水酒精、体积浓度为95％酒精、体积浓度为85％酒精、体积浓度为70％酒精中复水，每级5秒。再将片子放入体积浓度为50％酒精中分色3秒，体积浓度为50％酒精溶液中加入有醋酸，其中，醋酸：50％酒精的体积比为1:800。然后将片子依次放入体积浓度为70％酒精、体积浓度为85％酒精中，每级10秒。最后将片子放入体积浓度为1.2％的固绿溶液中染色26秒，其中体积浓度为1.2％的固绿溶液是用体积浓度为95％的酒精溶液为溶剂配制而成。染色完成后，将片子放入无水酒精中，涮去片子上的染色剂，此级停留8秒；再将片子放入无水酒精中，停留3秒；之后将片子放入1/2体积TO型生物透明剂+1/2体积无水酒精的混合液中，停留10秒；最后将片子放入TO型生物透明剂中，停留10分钟，此步骤重复三次。
(10)封片：将片子平放在纸上，擦去下部残留的TO型生物透明剂，上面滴2-3滴加拿大树胶，盖玻片在酒精灯上烘一下，从一侧小心盖下，避免出现气泡，放入45℃烘箱，烘干即可取出，贴好标签，标签上注名材料名称、采集地点、时间等信息。
实施例3：
(1)固定：新鲜岩黄连根采下后用自来水冲净表面浮尘，吸干叶片表面水分。然后垂直根部中脉横切，每片长约10mm，宽5mm，放入体积浓度为70％酒精配制的FAA固定液中固定24小时，FAA固定液由体积浓度为70％酒精:冰醋酸:甲醛体积比为90:5:5配制而成。
(2)脱水：将材料从FAA固定液中取出，滤纸吸干多余FAA固定液，放入带橡胶塞的平底玻璃管内，加入体积浓度为80％酒精中，体积浓度为80％酒精的加入量为材料体积的20倍以上，真空抽气18分钟，停留60分钟；倒出体积浓度为80％酒精，加入体积浓度为85％酒精，真空抽气18分钟，放置50分钟；倒出体积浓度为85％酒精，加入体积浓度为90％酒精，真空抽气15分钟，放置55分钟；倒出体积浓度为90％酒精，加入体积浓度为95％酒精，真空抽气15分钟，放置55分钟；倒出体积浓度为95％酒精，加入100％酒精，真空抽气15分钟，放置40分钟；更换一次100％酒精，真空抽气15分钟，放置40分钟。
(4)透明：倒出无水酒精，在透明之前，将脱水后的岩黄连根部放于体积浓度为0.8％的番红溶液浸染12h，其中体积浓度为0.8％的番红溶液是用2/3体积无水酒精+1/3体积TO型生物透明剂的混合液为溶剂配制而成；倒出番红溶液，加入1/2体积无水酒精+1/2体积TO型生物透明剂的混合液，真空抽气10分钟，放置120分钟；倒出1/2体积无水酒精+1/2体积TO型生物透明剂的混合液，加入1/3体积无水酒精+2/3体积TO型生物透明剂的混合液，真空抽气15分钟，放置120钟；倒出1/3体积无水酒精+2/3体积TO型生物透明剂的混合液，加入纯TO型生物透明剂，真空抽气15分钟，放置60分钟；倒出TO型生物透明剂，换一次TO型生物透明剂，真空抽气15分钟，放置90分钟。
(5)浸蜡：第一次浸蜡向装岩黄连根的玻璃管中加入固体小蜡块，加入量为TO型生物透明剂体积的1/3，塞好瓶塞，放入45℃恒温箱中，待蜡融化后再行加入同样数量的蜡块，此步骤共3次，直至蜡不再融化为止，最后一次加蜡打开瓶塞，尽可能让TO透明剂挥发，此过程需要2天。第二次浸蜡将根连同蜡一起倒入坩锅中，再将坩锅移至60℃恒温箱中，凝固的蜡全部溶解后将连同根、TO透明剂一起倒出，换入已融化溶点为56℃的石蜡，在60℃恒温箱中放置4h；然后再次换入已融化溶点为58℃的石蜡，在60℃恒温箱中放置2h后即可包埋。
(6)包埋：从恒温箱拿出盛有岩黄连根的坩锅，将标签夹出放在包埋盒一边，底部蜡稍凝后，解剖针在酒精灯上稍加热划开纸盒表面凝蜡，立即将坩锅中的材料拨入包埋盒，并将材料按照切片方向放好，静置冷却。待表面凝固后放入水盆中，使之沉入水底30分钟后，取出包埋盒，室温晾干，储藏备用。
(7)切片与展片：蜡块的固着与修整：将蜡块按材料大小及切割方向修至适当大小。粘蜡块：将修好的小蜡块粘到木块上。用解剖刀在酒精灯上加热，然后接触一下蜡块底部，使底部蜡软化，迅速将其粘在木块上。蜡块与木块连接的部位，应滴些熔蜡，加强粘接的牢固性。将粘着蜡块的木块固定在切片机上，调好所需厚度(6-12μm)，进行切片，按顺序放置在准备好的大纸盒里或硬纸上。用小拇指涂极少量明胶粘片剂在载玻片上。在玻片上加足够的蒸馏水，将载玻片放置在50±(1-2)℃展温台上。解剖刀将蜡带分割成适当长度的小段，长度小于盖玻片长度的1/5-2/5，用刀尖蘸水，将粘起蜡带，放在在载玻片的水面上使之迅速平展，调整蜡带位置，使之排列整齐。展温台另一端垫上两张纸，待蜡带展平后，立即将其载玻片上的水吸干净，再置温台上；待水完全蒸发，用砖石笔在切片一端刻上记号，放入45℃烘箱中烘烤至少放置2天后才可进行下一步。
(8)脱蜡：将要染色的片子依次放入3瓶TO型生物透明剂中，每级2-5分钟，脱去石蜡。
(9)染色：将脱蜡后的片子依次放入1/2体积TO型生物透明剂+1/2体积无水酒精的混合液、无水酒精、无水酒精、体积浓度为95％酒精、体积浓度为85％酒精、体积浓度为70％酒精中复水，每级4秒。再将片子放入体积浓度为50％酒精中分色6秒，体积浓度为50％酒精溶液中加入有醋酸，其中，醋酸：50％酒精的体积比为1:900。然后将片子依次放入体积浓度为70％酒精、体积浓度为85％酒精中，每级3秒。最后将片子放入体积浓度为0.8％的固绿溶液中染色30秒，其中体积浓度为0.8％的固绿溶液是用体积浓度为95％的酒精溶液为溶剂配制而成。染色完成后，将片子放入无水酒精中，涮去片子上的染色剂，此级停留3秒；再将片子放入无水酒精中，停留7秒；之后将片子放入1/2体积TO型生物透明剂+1/2体积无水酒精的混合液中，停留7秒；最后将片子放入TO型生物透明剂中，停留6分钟，此步骤重复三次。
(10)封片：将片子平放在纸上，擦去下部残留的TO型生物透明剂，上面滴2-3滴加拿大树胶，盖玻片在酒精灯上烘一下，从一侧小心盖下，避免出现气泡，放入45℃烘箱，烘干即可取出，贴好标签，标签上注名材料名称、采集地点、时间等信息。
实施例4：
在实施例1的基础上，在脱水步骤中，每次抽真空的具体操作如下：将岩黄连根放于每个梯度浓度的酒精溶液中，第1-3分钟，将酒精溶液逐渐升温至35℃，加压50KPa，之后维持2分钟；第6-8分钟，将酒精溶液逐渐升温至40℃，加压100KPa，之后维持2分钟；第11-13分钟，将酒精溶液逐渐升温至45℃，加压150KPa，之后维持2-5分钟，泄压。
在透明步骤之前用番红溶液染色时，将脱水后的岩黄连根放于1％的番红溶液中进行真空抽滤20分钟，浸染3小时后，用频率为800兆赫的电磁波对岩黄连根进行辐照45秒，在浸染的第7小时，再用频率为850兆赫的电磁波对岩黄连根进行辐照35秒。
为了说明本发明的效果，申请人用常规的石蜡切片方法做出根部的石蜡切片作为对照组，再取实施例1和实施例4制得的根部石蜡切片，将三者分别放于莱卡生物显微镜DM2000观察拍照，分别得到图1、图2以及图3，由图可以看出，图3的石蜡切片脉络最清晰，可以用于鉴别药材的真伪；图2次之；图1的根部组织较不清楚，不能用于鉴别药材。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (7)
1.一种岩黄连根的石蜡切片方法，包括样品固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与展片、脱蜡、染色以及封片，其特征在于，
在透明步骤之前，将脱水后的岩黄连根放于体积浓度为0.8-1.2％的番红溶液浸染8-12h；
在染色步骤中，将载有岩黄连根的玻片进行复水，复水后再放于酒精溶液中进行分色，同时向用于分色的酒精溶液中加入体积比为1/(800-1000)的醋酸，最后放入体积浓度为0.8-1.2％的固绿溶液中染色20-30秒；
将固定后岩黄连根依次经过体积浓度为80％酒精、体积浓度为85％酒精、体积浓度为90％酒精、体积浓度为95％酒精逐级脱水，每个浓度梯度脱水45-60分钟，再放于100％酒精中脱水两次，每次30-45分钟；
每个梯度浓度的酒精溶液在对岩黄连根脱水过程中进行真空抽气15-18分钟；
所述真空抽气过程包括：将岩黄连根放于每个梯度浓度的酒精溶液中，第1-3分钟，将酒精溶液逐渐升温至35℃，加压50KPa，之后维持2分钟；第6-8分钟，将酒精溶液逐渐升温至40℃，加压100KPa，之后维持2分钟；第11-13分钟，将酒精溶液逐渐升温至45℃，加压150KPa，之后维持2-5分钟，泄压。
2.如权利要求1所述的岩黄连根的石蜡切片方法，其特征在于，所述体积浓度为0.8-1.2％的番红溶液是用2/3体积无水酒精+1/3体积TO型生物透明剂的混合液为溶剂配制而成，所述体积浓度为0.8-1.2％的固绿溶液是用体积浓度为95％的酒精溶液为溶剂配制而成。
3.如权利要求1所述的岩黄连根的石蜡切片方法，其特征在于，将载有岩黄连根的玻片依次放入1/2体积型生物透明剂+1/2体积无水酒精混合液、无水酒精、无水酒精、体积浓度为95％酒精、体积浓度为85％酒精、体积浓度为70％酒精中复水，每级3-5秒；再放入体积浓度为50％酒精中分色，3-10秒；之后再依次放入体积浓度为70％酒精、体积浓度为85％酒精中进一步处理，每级3-10秒。
4.如权利要求1所述的岩黄连根的石蜡切片方法，其特征在于，固绿溶液染色后将载有岩黄连根的玻片放于放入无水酒精中洗去染色剂，此级停留3-10秒；然后依次放入无水酒精、1/2TO型生物透明剂+1/2无水酒精混合液中，每级停留3-10秒；最后将载有岩黄连茎的玻片放入TO型生物透明剂中停留5-10分钟，此步骤重复三次。
5.如权利要求1所述的岩黄连根的石蜡切片方法，其特征在于，对番红溶液染色后的岩黄连根依次用1/2体积无水酒精+1/2体积TO型生物透明剂混合液以及1/3体积无水酒精+2/3体积TO型生物透明剂混合液进行透明处理，每级透明时间均为60-120分钟；再放于纯TO型生物透明剂中浸泡2次，每次浸泡60-120分钟。
6.如权利要求5所述的岩黄连根的石蜡切片方法，其特征在于，在每次透明过程中进行真空抽气10-15分钟。
7.如权利要求1所述的岩黄连根的石蜡切片方法，其特征在于，在透明步骤之前用番红溶液染色时，将脱水后的岩黄连根放于0.8-1.2％的番红溶液中进行真空抽滤20分钟，浸染3小时后，用频率为800兆赫的电磁波对岩黄连根进行辐照45秒，在浸染的第7小时，再用频率为850兆赫的电磁波对岩黄连根进行辐照35秒。
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