CN103630421A

CN103630421A - 一种芍药成熟种胚的石蜡切片制作方法

Info

Publication number: CN103630421A
Application number: CN201310636143.7A
Authority: CN
Inventors: 孙晓梅; 刘广林; 陆秀君; 张丽杰; 杨盼盼; 邢司艺; 杨宏光; 王亚斌
Original assignee: Shenyang Agricultural University
Current assignee: Shenyang Agricultural University
Priority date: 2013-12-03
Filing date: 2013-12-03
Publication date: 2014-03-12
Anticipated expiration: 2033-12-03
Also published as: CN103630421B

Abstract

本发明公开了一种芍药成熟种胚的石蜡切片制作方法，其步骤是取材与固定：剥去种皮，切割种子，将含种胚和部分胚乳的种尖部分浸入FAA固定液中固定24h以上；脱水：浓度70%乙醇中泡洗3～5次后从浓度70%乙醇开始梯度脱水；透明：二甲苯作透明剂进行5级透明；浸蜡与包埋：倒出1/2体积二甲苯，向瓶中加蜡屑至饱和，40℃过夜。之后每隔2h换一次蜡液，每天3次，重复3天后进行常规石蜡包埋；切片；展片及粘片：在50℃恒温水浴锅的铁板上使蜡带展平；脱蜡、复水、番红固绿染色、透明；封片。本发明能够得到组织结构完整、清晰的芍药成熟种胚石蜡切片，从而为研究芍药种子休眠和萌发提供准确的技术支持。

Description

一种芍药成熟种胚的石蜡切片制作方法

技术领域

本发明涉及一种石蜡切片的制作方法，尤其涉及一种芍药成熟种胚的石蜡切片制作方法。

背景技术

芍药（Paeonia lactiflora）为芍药科芍药属多年生宿根花卉，是中国的传统名花，栽培历史悠久，与牡丹并称“花中二绝”，是植物造景和切花的优良材料，观赏价值极高。

在长期的系统演化过程中，芍药种子形成了特殊的休眠萌发特性，即上、下胚轴休眠特性。种子繁殖是获得芍药实生苗的唯一手段，是无性繁殖的基础。自然条件下从播种到出苗需要6～7个月的时间，生长周期长，对芍药的人工栽培生产和种子检验带来很大的困难。探讨这种特殊的双重休眠机理机制，在学术上和解决生产实践中遇到的问题均具有重要意义。胚是种子萌发的主体，而对芍药种子胚萌发的研究少见报道。

石蜡切片是组织学研究中的重要实验技术，其基本步骤包括样品的取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、粘片、脱蜡、染色和封片等一系列特殊处理。整个过程虽然并不复杂，但要制出高质量的切片，每一个步骤的操作都很重要，且具有不同组织结构的植物以及植物不同部位的组织结构所需的处理不同，需要进行摸索和改进。而芍药成熟种胚石蜡切片技术方面的相关研究报道很少。

综上所述，如果能找到芍药成熟种胚石蜡切片的制备方法，能为研究芍药种子休眠和萌发提供准确的技术支持，对揭示芍药种子休眠机理具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于针对芍药种子胚乳多、浸蜡难和种胚小、难操作的问题，找到一种操作简单方便的芍药成熟种胚石蜡切片的制备方法，使制作的切片组织结构完整、清晰，易于观察。

本发明的技术方案如下：

1、取材和固定：

（1）洗种子：用洗洁精清洗10～20min，流水冲洗干净。

（2）种子的筛选：水选，浸种2～3h之后，去除上浮的不充实种子。

（3）用浓度0.5%的高锰酸钾溶液对芍药种子进行40min消毒处理，用蒸馏水冲洗干净。

（4）在恒温箱中，45℃温水浸种48h，使种皮软化，种子吸水。

（5）去除上浮的不充实种子。

（6）用吸水纸吸干种子表面的水分，用手术刀剥去种皮，将芍药种子切割成含有胚的种尖部分（四周含部分胚乳）迅速放入盛FAA固定液（福尔马林、冰醋酸和浓度70%乙醇的体积比为1：1：18）的青霉素药瓶中固定，4℃冰箱放置，固定24h以上。

2、脱水：将固定好的材料放入浓度70%的乙醇中泡洗3～5次，先后转入浓度70%乙醇、浓度80%乙醇、浓度90%乙醇、浓度95%乙醇进行梯度脱水，各梯度间隔时间为1.5h。之后无水乙醇浸泡1h，然后更换无水乙醇再浸泡1h，对材料彻底脱水。

3、透明：脱水后的芍药成熟种胚依次放入体积比为2:1的无水乙醇和二甲苯混合液、体积比为1:1的无水乙醇和二甲苯混合液、体积比为1:2的无水乙醇和二甲苯混合液浸泡，各级浸泡透明2h，然后更换纯二甲苯浸泡1h，再次更换纯二甲苯浸泡30min。

4、浸蜡和包埋：透明处理后将青霉素瓶中的二甲苯倒出1/2，向瓶中添加蜡屑（熔点为52～54℃和62～64℃的混合蜡屑，两者体积比1:1）直到饱和，放回恒温箱中，40℃过夜，青霉素瓶盖儿漏缝盖，让二甲苯慢慢蒸发。第二天早上，再向小瓶中加1/5药瓶体积的蜡屑，敞口放置于60℃恒温箱中，2h后把原溶液倾去，换熔融石蜡（熔点为52～54℃和62～64℃的混合蜡屑，两者体积比1:1），之后每2h换一次蜡液，每天3次，重复5天后进行常规石蜡包埋。

5、切片：根据材料在蜡块中的位置和方向，将蜡块修成梯形，然后粘到切片机的蜡台上进行切片，采用旋转式手动切片机，切片厚度7～10μm。

6、展片及粘片：粘片剂采用明胶粘片剂（1g明胶溶于100ml蒸馏水中）。在洁净的载玻片上均匀涂上少许明胶，将蜡带光面小心地放在载玻片上，以水作漂浮剂，在50℃恒温水浴锅的铁板上使蜡带展平，之后自然干燥。

7、脱蜡、复水、番红固绿染色、透明：将充分干燥的切片放入二甲苯中浸泡30min，之后换新的二甲苯再浸泡20min进行脱蜡。脱蜡后的切片依次放入体积比为1:1的无水乙醇和二甲苯混合液、无水乙醇及浓度为95％、80％、70％、50％乙醇中各5min，于蒸馏水中浸洗2次。之后用浓度为1%的番红进行过夜染色。番红染色后的切片经蒸馏水浸洗2遍后依次入浓度为50％、70％、80％和95％乙醇中各5min进行脱水处理。之后用浓度为0.5%的固绿染色30s。经两次无水乙醇透明，每次5min。切片依次入体积比为1:1的无水乙醇和二甲苯混合液5min，二甲苯5min，二甲苯5min进行透明处理。

8、封片：切片从二甲苯中取出，待二甲苯未挥发完全之前，在材料中央滴1滴中性加拿大树胶，将盖玻片一侧放置在滴有树胶的组织切片上，慢慢放下盖玻片并将空气完全排除。封好的切片放入40℃恒温箱中干燥过夜，制成永久切片。

本发明的积极效果是：找到了一种适宜芍药成熟种胚石蜡切片的制作方法，使制作的切片组织结构完整、清晰，易于观察。

附图说明

图1是沙藏0d芍药种胚的形态图片。

图2是沙藏30d芍药种胚的形态图片。

图3是沙藏60d芍药种胚的形态图片。

具体实施方式

成功制备了混收芍药种子沙藏0d、沙藏30d、沙藏60d的种胚石蜡切片。

结合附图1-3，说明具体实施如下：

1、取材：2012年8月下旬收获芍药混收种子。

2、种子的预处理

（1）洗种子：用洗洁精清洗10～20min，流水冲洗干净。

（5）去除上浮的不充实种子。

（6）15℃沙藏，取沙藏0d、沙藏30d、沙藏60d的芍药种子，洗干净，用吸水纸吸干种子表面的水分，用手术刀剥去种皮，将芍药种子切割成含有胚的种尖部分（四周含部分胚乳）迅速放入盛FAA固定液（福尔马林、冰醋酸和浓度70%乙醇的体积比为1：1：18）的青霉素药瓶中固定，4℃冰箱放置，固定24h以上。

3、脱水：将固定好的材料放入浓度70%的乙醇中泡洗3～5次，先后转入浓度70%乙醇、浓度80%乙醇、浓度90%乙醇、浓度95%乙醇进行梯度脱水，各梯度间隔时间为1.5h。之后无水乙醇浸泡1h，然后更换无水乙醇再浸泡1h，对材料彻底脱水。

4、透明：脱水后的芍药成熟种胚依次入体积比为2:1的无水乙醇和二甲苯混合液、体积比为1:1的无水乙醇和二甲苯混合液、体积比为1:2的无水乙醇和二甲苯混合液浸泡，各级浸泡透明2h，然后更换纯二甲苯浸泡1h，再次更换纯二甲苯浸泡30min。

5、浸蜡和包埋：透明处理后将青霉素瓶中的二甲苯倒出1/2，向瓶中添加蜡屑（熔点为52～54℃和62～64℃的混合蜡屑，两者体积比1:1）直到饱和，放回恒温箱中，40℃过夜，青霉素瓶盖儿漏缝盖，让二甲苯慢慢蒸发。第二天早上，再向小瓶中加1/5药瓶体积的蜡屑，敞口放置于60℃恒温箱中，2h后把原溶液倾去，换熔融石蜡（熔点为52～54℃和62～64℃的混合蜡屑，两者体积比1:1），之后每2h换一次蜡液，每天3次，重复5天后进行常规石蜡包埋。

6、切片：根据材料在蜡块中的位置和方向，将蜡块修成梯形，然后粘到切片机的蜡台上进行切片，采用旋转式手动切片机，切片厚度7～10μm。

7、展片及粘片：粘片剂采用明胶粘片剂（1g明胶溶于100ml蒸馏水中）。在洁净的载玻片上均匀涂上少许明胶，将蜡带光面小心地放在载玻片上，以水作漂浮剂，在50℃恒温水浴锅的铁板上使蜡带展平，之后自然干燥。

8、脱蜡、复水、番红固绿染色、透明：将充分干燥的切片放入二甲苯中浸泡30min，之后换新的二甲苯再浸泡20min进行脱蜡。脱蜡后的切片依次放入体积比为1:1的无水乙醇和二甲苯混合液、无水乙醇及浓度为95％、80％、70％、50％乙醇中各5min，于蒸馏水中浸洗2次。之后用浓度1%的番红进行过夜染色。番红染色后的切片经蒸馏水浸洗2遍后依次入浓度为50％、70％、80％和95％乙醇中各5min进行脱水处理。之后用浓度0.5%的固绿染色30s。经两次无水乙醇透明，每次5min。切片依次入体积比为1:1的无水乙醇和二甲苯混合液5min，二甲苯5min，二甲苯5min行透明处理。

9、封片：切片从二甲苯中取出，待二甲苯未挥发完全之前，在材料中央滴1滴中性加拿大树胶，将盖玻片一侧放置在滴有树胶的组织切片上，慢慢放下盖玻片并将空气完全排除。封好的切片放入40℃恒温箱中干燥过夜，制成永久切片。

10、镜检和照相：将切片置于Motic显微镜下观察并照相，将合格的切片贴上标签，以便再次观察和照相。结果见图1、图2和图3。

Claims

1.一种芍药成熟种胚的石蜡切片制作方法，其特征是：包括如下步骤：

（1）取材和固定：

a. 洗种子：用洗洁精清洗10～20min，流水冲洗干净；

b. 种子的筛选：水选，浸种2～3h之后，去除上浮的不充实种子；

c. 用浓度0.5%的高锰酸钾溶液对芍药种子进行40min消毒处理，用蒸馏水冲洗干净；

d. 在恒温箱中，45℃温水浸种48h，使种皮软化，种子吸水；

e. 去除上浮的不充实种子；

f. 用吸水纸吸干种子表面的水分，用手术刀剥去种皮，将芍药种子切割成含有胚的种尖部分，迅速放入盛FAA固定液的青霉素药瓶中固定，4℃冰箱放置，固定24h以上；

（2）脱水：将固定好的材料放入浓度70%的乙醇中泡洗3～5次，先后转入浓度70%乙醇、浓度80%乙醇、浓度90%乙醇、浓度95%乙醇进行梯度脱水，各梯度间隔时间为1.5h。之后无水乙醇浸泡1h，然后更换无水乙醇再浸泡1h，对材料彻底脱水；

（3）透明：脱水后的芍药成熟种胚依次入体积比为2:1的无水乙醇和二甲苯混合液、体积比为1:1的无水乙醇和二甲苯混合液、体积比为1:2的无水乙醇和二甲苯混合液浸泡，各级浸泡透明2h，然后更换纯二甲苯浸泡1h，再次更换纯二甲苯浸泡30min；

（4）浸蜡和包埋：透明处理后将青霉素瓶中的二甲苯倒出1/2，向瓶中添加蜡屑，直到饱和，放回恒温箱中，40℃过夜，青霉素瓶盖儿漏缝盖，让二甲苯慢慢蒸发；第二天早上，再向小瓶中加1/5药瓶体积的蜡屑，敞口放置于60℃恒温箱中，2h后把原溶液倾去，换熔融石蜡，熔点为52～54℃和62～64℃的混合蜡液，两者体积比1:1之后每2h换一次蜡液，每天3次，重复5天后进行常规石蜡包埋；

（5）切片：根据材料在蜡块中的位置和方向，将蜡块修成梯形，然后粘到切片机的蜡台上进行切片，采用旋转式手动切片机，切片厚度7～10μm；

（6）展片及粘片：在洁净的载玻片上均匀涂上明胶，将蜡带光面小心地放在载玻片上，以水作漂浮剂，在50℃恒温水浴锅的铁板上使蜡带展平，之后自然干燥；

（7）脱蜡、复水、番红固绿染色、透明：将充分干燥的切片放入二甲苯中浸泡30min，之后换新的二甲苯再浸泡20min进行脱蜡；脱蜡后的切片依次放入体积比为1:1的无水乙醇和二甲苯混合液、无水乙醇及浓度95％、80％、70％、50％乙醇中各5min，于蒸馏水中浸洗2次；之后用浓度1%的番红进行过夜染色。番红染色后的切片经蒸馏水浸洗2遍后依次入浓度50％、70％、80％和95％乙醇中各5min进行脱水处理；之后用浓度0.5%的固绿染色30s，经两次无水乙醇透明，每次5min；切片依次入体积比为1:1的无水乙醇和二甲苯混合液5min，二甲苯5min，二甲苯5min进行透明处理；

（8）封片：切片从二甲苯中取出，待二甲苯未挥发完全之前，在材料中央滴1滴中性加拿大树胶，将盖玻片一侧放置在滴有树胶的组织切片上，慢慢放下盖玻片并将空气完全排除；封好的切片放入40℃恒温箱中干燥过夜，制成永久切片。

2.根据权利要求1中所述的芍药成熟种胚的石蜡切片制作方法，其特征在于：在固定之前对种子进行切割，保留含胚的种尖，胚周围有胚乳包裹成块状体。

3.根据权利要求1中所述的芍药成熟种胚的石蜡切片制作方法，其特征在于：步骤（4）所用到的蜡屑和蜡液均为熔点为52～54℃和62～64℃的混合蜡，两者体积比1:1。