CN104359734B - 一种杜鹃花授粉后胚珠的荧光显微压片制作方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种杜鹃花授粉后胚珠的荧光显微压片制作方法。其制作方法包括对授粉后的杜鹃花雌蕊进行采样与固定、软化、染色、子房壁剥离、制片。采样与固定：摘下授粉后的杜鹃花花朵，剥离花瓣，仅留下包括花柱和子房在内的雌蕊部分，将其置于FAA固定液中固定，24小时后转入70％乙醇溶液中保存；软化：将固定后的材料放于烘箱内加温软化；染色：软化后的材料用0.1％水溶性苯胺蓝染液中避光染色，过夜；子房壁剥离：对染色后的材料进行子房壁剥离处理；制片：对完成剥离的材料进行压片制片。本发明方法能够得到染色清晰、组织结构完整的杜鹃花授粉后的胚珠压片并能观察到全面的受精信息。

Description

一种杜鹃花授粉后胚珠的荧光显微压片制作方法

技术领域

本发明涉及一种荧光显微制片方法，尤其涉及一种杜鹃花授粉后胚珠的荧光显微压片制作方法。

背景技术

杜鹃花属植物在世界园林中占有重要的位置，在欧洲甚有“无杜鹃不成园”的说法。与欧美发达国家杜鹃花品种繁多、应用广泛的现状相比，我国在园林绿化栽培及应用的杜鹃花品种较单一，且主要以引进国外品种为主。我国是世界杜鹃花植物的主要分布中心之一，其野生种中不乏花色、花形、香味上具有独特性的种类，因此在自然界中选育质优、高抗的种类与栽培种进行杂交是加快培育具有我国自主知识产权杜鹃花新品种的一个突破口。

我国的杜鹃花资源丰富，资源隶属于不同亚属(组)。以云南为例，云南拥有杜鹃花资源374种，隶属于7个亚属和4个组以及23个亚组。对我国杜鹃花资源进行育种开发，不可避免要进行亚组间乃至亚属间的远缘杂交工作，而杂交亲和与否是决定远缘杂交成功与否的一个重要因素。为此，杂交亲和性的鉴定对于杂交育种而言至关重要。

亲和指数法是常规育种中鉴定杂交亲和性较常用的方法，但该种方法存在田间工作量大、测定周期长和测定效率不高等缺点。利用苯胺蓝与花粉管壁中的胼胝质结合，在紫外光下呈现明亮黄绿色荧光的授粉花柱荧光显微观察方法因具有取样方便，结果准确、清晰可见，并能对大量材料同时进行处理等优点而被广泛应用于植物亲和状况的判断中。

目前，授粉花柱荧光显微观察技术也已被应用于杜鹃花杂交亲和性检测中。但由于杜鹃花属于木本植物，其子房壁的木质化程度较高，加之大多数杜鹃花种类的子房外部都有附着物着生等等原因而致使目前常用的两种授粉后胚珠的压片方法都各存缺点：其一是整体子房压片法，即将整个雌蕊部分进行压片。该方法的缺点在于压片制片时会出现盖玻片破裂，或是镜检时无法看清胚珠及其受精信息，从而影响试验结果的准确获取。其二是纵切雌蕊压片法，即纵向剖取1/2雌蕊及子房后进行压片。该方法虽能获得较整体子房压片法要好的实验结果，但破坏了子房内胚珠的完整组织结构从而无法获得全面的受精信息。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有授粉花柱荧光显微制片方法中杜鹃花子房难压片、胚珠无法看清或胚珠结构被破坏从而无法获得全面的受精信息的缺点，其目的是提供一种压片效果好、胚珠清晰可见、受精过程清楚可视的杜鹃花授粉胚珠荧光显微压片方法。

本发明提供的一种杜鹃花授粉后胚珠的荧光显微压片制作方法由对授粉后的杜鹃花雌蕊的采样与固定、软化、染色、子房壁剥离、制片五步骤组成，各步骤具体操作如下：

(1)采样与固定：摘下已授粉的杜鹃花花朵，剥离花瓣，仅留下包括花柱和子房在内的雌蕊部分作为待检材料置于FAA固定液中固定，24小时后转入体积分数为70％的乙醇溶液中保存；

(2)加温软化处理：将保存在所述70％的乙醇溶液中的待检材料水洗1次后置于10ml离心管中，将离心管放于56～58℃烘箱内进行加温软化处理，当待检材料的雌蕊花柱部分卷曲成圈状时停止加温，取出待检材料用水洗3-4次后即完成材料软化；

(3)染色：将完成软化的待检材料置于质量分数为0.1％水溶性苯胺蓝染液中避光染色，过夜；

(4)子房壁剥离：用镊子捏出经过夜染色的待检材料，在解剖镜下用解剖针将子房壁剥除；

(5)制片：将剥除子房壁后的雌蕊用镊子捏至载玻片后用盖玻片进行压片，压片过程中用解剖针将花柱部分拉直，并轻撵盖玻片表面使整个雌蕊组织平展摊开，即完成制片。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明针对杜鹃花子房壁的木质化程度较高，大多数杜鹃花种类的子房外部都有附着物着生等生物特征，采用将子房壁剥除措施，有效地克服了现有授粉花柱荧光显微制片方法中杜鹃花子房压片难看见清晰胚珠及受精过程或胚珠结构被破坏从而无法获得全面的受精信息的缺点。实验压片效果图证明，采用本发明方法，胚珠清晰可见、可观察到全面的受精信息，因而能为杜鹃花杂交育种亲和性的鉴定提供可靠的数据和技术支撑，对我国杜鹃花资源开发育种具有重要作用。

附图说明

图1是现有技术整体子房压片法制作的授粉胚珠压片。图1中圈内所示部分即为胚珠所在位置，箭头1所示颗粒为胚珠。

图2是本专利方法制作的授粉胚珠压片。图2中圈内所示部分为胚珠所在位置；箭头1所示白色细线为花粉管，箭头2所示颗粒为胚珠，箭头3所示胚珠即为花粉管进入发生受精的胚珠。

具体实施方式

本发明提供的一种杜鹃花授粉后胚珠的荧光显微压片制作方法由对授粉后的杜鹃花雌蕊的采样与固定、软化、染色、子房壁剥离、制片五步骤组成，各步骤具体操作如下：

(1)采样与固定：摘下已授粉的杜鹃花花朵，剥离花瓣，仅留下包括花柱和子房在内的雌蕊部分作为待检材料置于FAA固定液中固定，24小时后转入体积分数为70％的乙醇溶液中保存，所述FAA固定液使用体积分数为70％乙醇、体积分数为38％甲醛和冰醋酸混合而成，且所述70％乙醇：冰醋酸：38％甲醛的体积比为8:1:1；

(2)加温软化处理：将保存在所述70％的乙醇溶液中的待检材料水洗1次后置于10ml离心管中，将离心管放于56～58℃烘箱内进行加温软化处理，当待检材料的雌蕊花柱部分卷曲成圈状时停止加温，用水洗3-4次后即完成材料软化；

(3)染色：将完成软化的待检材料置于质量分数为0.1％水溶性苯胺蓝染液中避光染色，过夜；所述0.1％水溶性苯胺蓝染液的配制为：先配制摩尔浓度为1.0mol/L的磷酸二氢钾溶液作为缓冲液，再将该缓冲液作为溶剂加入苯胺蓝(溶质)配制成溶质浓度为0.1％的水溶性苯胺蓝染液，所述百分数为质量分数；

(4)子房壁剥离：用镊子捏出经过夜染色的待检材料，在解剖镜下用解剖针将子房壁剥除；

(5)制片：将剥除子房壁后的雌蕊用镊子捏至载玻片后用盖玻片进行压片，压片过程中用解剖针将花柱部分拉直，并轻撵盖玻片表面使整个雌蕊组织平展摊开，即完成制片。

如图2所示，用本发明方法完成制片后在荧光显微镜下观察，即能看到各心皮中排列整齐的胚珠(见图2箭头2)，能清楚看到花粉管进入胚珠内的情况，即授粉后花粉管进入子房的数量及其途径(见图2前箭头1、箭头3)，受精发生的位置(即花粉管在胚珠的位置)及其受精胚珠(发亮的胚珠)数量等受精信息。如图1所示，现有技术的压片，以整体子房压片法为例，由于子房壁遮挡而无法看胚珠皮全貌，制片时需用力压片造成胚珠排列顺序的破坏、及花粉管的断裂，以及子房壁的遮挡影响了花粉管进入子房数量等受精信息的准确收集，且其受精发生的位置不易观察等。

实验压片效果图证明，采用本发明方法，胚珠清晰可见、可观察到全面的受精信息，因而能为杜鹃花杂交育种亲和性的鉴定提供可靠的数据和技术支撑，对我国杜鹃花资源开发育种具有重要作用。

Claims (1)

1.一种杜鹃花授粉后胚珠的荧光显微压片制作方法，该方法由对授粉后的杜鹃花雌蕊进行采样与固定、软化、染色、子房壁剥离、制片五步骤组成，各步骤操作如下：

(1)采样与固定：摘下已授粉的杜鹃花花朵，剥离花瓣，仅留下包括花柱和子房在内的雌蕊部分作为待检材料置于FAA固定液中固定，24小时后转入体积分数为70％的乙醇溶液中保存；

(2)加温软化处理：将保存在所述70％的乙醇溶液中的待检材料水洗1次后置于10ml离心管中，将离心管放于56～58℃烘箱内进行加温软化处理，当待检材料的雌蕊花柱部分卷曲成圈状时停止加温，取出待检材料用水洗3-4次后即完成材料软化；

(3)染色：将完成软化的待检材料置于质量分数为0.1％水溶性苯胺蓝染液中避光染色，过夜；

(4)子房壁剥离：用镊子捏出经过夜染色的待检材料，在解剖镜下用解剖针将子房壁剥除；

(5)制片：将剥除子房壁后的雌蕊用镊子捏至载玻片后用盖玻片进行压片，压片过程中用解剖针将花柱部分拉直，并撵盖玻片表面使整个雌蕊组织平展摊开，即完成制片。