CN109387509A - 一种郁金香染色体及核型研究技术 - Google Patents

一种郁金香染色体及核型研究技术 Download PDF

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Abstract

本发明涉及了一种郁金香染色体核型研究方法。具体利用郁金香鳞茎种球萌发的根尖为实验材料,利用根尖分生区中分生组织细胞具有旺盛分裂特点,进行染色体形态观察研究。本发明还公开了郁金香染色体核型研究技术,包括材料选取、预处理、固定、染色、制片、镜检。本发明对郁金香染色体进行核型研究分析,方法简便可靠、结果准确具有可重复性、易于操作。此发明将对郁金香染色体核型研究、种质资源分类及保护等相关研究具有重要意义并提供一定技术支持。

Description

一种郁金香染色体及核型研究技术
技术领域
本发明涉及一种郁金香染色体及核型研究技术,属于植物细胞学及细胞遗传学领域研究。
背景技术
植物染色体是植物细胞中包含重要遗传信息的聚合体,其在显微镜下观察呈棒状或圆柱状。由于其在细胞分裂时期易于被碱性染料染色,因此得名,并被广泛用于染色观察研究。染色体核型分析就是通过对染色体数量、形态特征、着丝点的位置、端粒有无等染色体特征信息进行观察研究,对染色体信息进行分析的方法。
到目前为止,园林植物方面有关核型分析的研究已覆盖到百合(瞿素萍.百合部分栽培品种的核型研究与分析[D].中国农业科学院,2014.)、兰花(敖素燕.国兰表型性状与核型分析[D].浙江农林大学,2014.)、菊花(朱明丽.大菊品种的细胞分类学研究[D].北京林业大学,2010.)、梅花(陈晶鑫.梅花染色体制片技术优化及基于荧光原位杂交的核型分析[D].北京林业大学,2013.)等。
郁金香(Tulipa gesneriana L.)是百合科(Liliaceae)郁金香属(Tulipa L.)的球根花卉。郁金香属植物的染色体基数是12,并且大多数品种都属于二倍体(2n=24),同时也存在少部分的三倍体、四倍体和极少数的五倍体(Marasek A,Okazaki K.Analysis ofintrogression of the Tulipa fosteriana genome into Tulipa gesneriana usingGISH and FISH[J].Euphytica,2008(160):217-230)。郁金香在染色体相关的研究还处于初步阶段,核型分析研究报道也很少。徐萍(徐萍.郁金香品种倍性及杂交研究[D].浙江大学,2014)对郁金香部分品种进行了染色体倍性观察,但对于核型研究方法步骤并没有相对具体的解释。植物染色体制片所涉及的影响因素众多,因此找到一套适合郁金香染色体核型研究的方法将对染色体观察、种质资源保护分类鉴定及育种工作提供重要参考价值及依据。
发明内容
为了上述问题,本发明的目的在于提供一种郁金香染色体核型研究技术,使得在显微镜下可以清晰观察出各条染色体形态并进行核型研究。
为达到以上所述目的,本发明提供技术方法如下:
(1)材料选取:选择健壮完整、无机械损伤、无病害的的鳞茎种植于草炭∶蛭石∶珍珠岩=1∶1∶1的湿润基质中,进行室温下的生根培养。每隔一天进行观察一次,待根长度长至1.5cm-2.5cm之间时,选择生长分裂旺盛的根尖,作为预处理材料。于晴天上午9:00-11:00进行取材。
(2)预处理:取材时,用剪子剪下粗壮的根尖,存入2ml离心管中,标注品种编号,并加入适量的0.07mmol/L放线菌酮溶液,放入冰盒中临时保存,取材结束带回实验室,避光保存于4℃冰箱内,预处理12个小时。
(3)固定:配置卡诺固定液(无水乙醇∶冰醋酸=3∶1),并保证随用随配。将预处理结束的根尖转入固定液中,4℃冰箱内处理22-24个小时。固定结束后如若不能及时进行压片使用,则将根尖用90%的酒精漂洗两次后,保存在70%的酒精中。
(4)染色:将保存的根尖从离心管中取出,用蒸馏水进行漂洗3-4次,加入预热到60℃的1mol/L盐酸中,进行解离7min。完成后再次用蒸馏水漂洗3-4次,将根尖上残留的盐酸洗净。将冲洗干净的根尖置于载玻片上,切取1-2mm的茎尖,用解剖针尽量撕碎,并用卡宝品红进行染色2min。
(5)制片:染色结束后,盖上盖玻片压片,并用滤纸吸去多余的液体。压片的过程中先用手指将片子压实,再用带有橡皮的铅笔轻轻敲击盖玻片,使得根尖组织和细胞可以均匀的分散在载玻片上。
(6)镜检:使用光显微镜进行观察,先用低倍镜(10x)进行观察,找到合适的视野及分裂相后,转到高倍镜(60x)进行观察拍照。
本发明的有益效果:
(1)本实验选取的取材时间确定为晴天上午9:00-11:00,更优选为晴天上午9:00-10:00。在这个时间段进行郁金香根尖取材,镜检结果发现染色体中期分裂相所占总细胞总数比例最高,染色体核型分析成功率也最高。
(2)本发明确定染色体预处理时间为12个小时,处理温度为4℃处理。预处理的目的在于抑制分裂中的细胞中纺锤丝的形成从而得到更多中期分裂相。同时,预处理还具有诱导染色体聚缩变直的作用。郁金香染色体为细长型,因此适当延长染色体预处理时间有利于观察中期形态。本发明结果显示为4℃下预处理12小时效果为最佳。
(3)本发明对染色体解离时间定为7min,染色时间定为2min,通过此途径可以得到最清晰的染色体染色及分散效果。解离的目的在于将聚集的染色体分散。时间过短会导致染色体集中从而不利于观察;时间过长又会导致染色体过于分散准确性下降。染色的目的是利于观察染色体形态。时间长短会影响染色体染色深浅及周边细胞质的微量染色状态。
附图说明
图1为实施例1优化过程中部分方法染色体观察图。由于压片过程优化程度高低,展示出不同的染色体效果。
图2为实施例2中已经过方法优化后所观察到的部分品种染色体观察图。分别展示的品种为:‘纯金’、‘小汤姆’、‘西内德阿莫’。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
实施例1郁金香染色体核型研究方法优化
1.选取4个具有代表性的郁金香品种‘金色检阅’、‘领袖’、‘普瑞斯玛’、‘紫旗’,通过将选取的品种种球根盘浸泡在清水中来获得茎生根。待根长到1-3cm左右时,分别于晴天上午(9:00-11:00)、下午(14:00-16:00),取长度相等的4个品种的郁金香种球根尖作为实验材料准备备用。
2.将刚取下的根尖放入0.07mmol/L的放线菌酮中进行预处理,然后用卡诺固定液(冰醋酸∶乙醇=1∶3)常温下固定24小时。从固定液中取出后,用蒸馏水将根洗净,如不能立即压片,则将根尖放置在70%的乙醇中,4℃保存。
3.制片时,将储存好的材料取出,用蒸馏水漂洗3次,吸干水分后,放入1mol/L的盐酸中,60℃水浴解离。而后用蒸馏水3-4次反复漂洗,将盐酸漂洗净后,切取1-2mm的根尖,用解剖针尽量撕碎,并用卡宝品红进行染色。
4.染色结束后,盖上盖玻片压片,并用滤纸吸去多余的液体。压片的过程中先用手指将片子压实,再用带有橡皮的铅笔轻轻敲击盖玻片,使得根尖组织和细胞可以均匀的分散在载玻片上。使用光显微镜进行观察,先用低倍镜(10x)进行观察,找到合适的视野及分裂相后,转到高倍镜(60x)进行观察拍照。
5.本试验分别考察取材时间、预处理温度、预处理时间、解离时间、染色时间这五个重要因素对染色体压片的影响。(表1)
6.结果表明取材时间定在上午9:00-11:00,预处理时间12小时,预处理避光保存于4℃冰箱内,解离时间7min,染色时间2min可以取得最佳效果。
表1.影响因素
实施例2郁金香染色体核型研究
应用本发明方法,对北京植物园中所种植43个品种的郁金香根尖进行染色体核型观察研究,均取得了较好的结果。
1.材料选取:选择健壮完整、无机械损伤、无病害的的鳞茎种植于草炭∶蛭石∶珍珠岩=1∶1∶1的湿润基质中,进行室温下的生根培养。每隔一天进行观察一次,待根长度长至1.5cm-2.5cm之间时,选择生长分裂旺盛的根尖,作为预处理材料。于晴天上午9:00-11:00进行取材。
2.预处理:取材时,用剪子剪下粗壮的根尖,存入2ml离心管中,标注品种编号,并加入适量的0.07mmol/L放线菌酮溶液,放入冰盒中临时保存,取材结束带回实验室,避光保存于4℃冰箱内,预处理12个小时。
3.固定:配置卡诺固定液(无水乙醇∶冰醋酸=3∶1),并保证随用随配。将预处理结束的根尖转入固定液中,4℃冰箱内处理22-24个小时。固定结束后如若不能及时进行压片使用,则将根尖用90%的酒精漂洗两次后,保存在70%的酒精中。
4.染色:将保存的根尖从离心管中取出,用蒸馏水进行漂洗3-4次,加入预热到60℃的1mol/L盐酸中,进行解离7min。完成后再次用蒸馏水漂洗3-4次,将根尖上残留的盐酸洗净。将冲洗干净的根尖置于载玻片上,切取1-2mm的茎尖,用解剖针尽量撕碎,并用卡宝品红进行染色2min。
5.制片:染色结束后,盖上盖玻片压片,并用滤纸吸去多余的液体。压片的过程中先用手指将片子压实,再用带有橡皮的铅笔轻轻敲击盖玻片,使得根尖组织和细胞可以均匀的分散在载玻片上。
6.镜检:使用光显微镜进行观察,先用低倍镜(10x)进行观察,找到合适的视野及分裂相后,转到高倍镜(60x)进行观察拍照。
以上所述均为本发明的优选实施方式,应当提出的是,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,可以进行相关改进和润饰,这也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种郁金香染色体及核型研究技术,该技术包括以下步骤:
(1)材料选取:选择健壮完整、无机械损伤、无病害的的鳞茎种植于草炭∶蛭石∶珍珠岩=1∶1∶1的湿润基质中,进行室温下的生根培养。每隔一天进行观察一次,待根长度长至1.5cm-2.5cm之间时,选择生长分裂旺盛的根尖,作为预处理材料。于晴天上午9:00-11:00进行取材。
(2)预处理:取材时,用剪子剪下粗壮的根尖,存入2ml离心管中,标注品种编号,并加入适量的0.07mmol/L放线菌酮溶液,放入冰盒中临时保存,取材结束带回实验室,避光保存于4℃冰箱内,预处理12个小时。
(3)固定:配置卡诺固定液(无水乙醇∶冰醋酸=3∶1),并保证随用随配。将预处理结束的根尖转入固定液中,4℃冰箱内处理22-24个小时。固定结束后如若不能及时进行压片使用,则将根尖用90%的酒精漂洗两次后,保存在70%的酒精中,4℃保存。
(4)染色:将保存的根尖从离心管中取出,用蒸馏水进行漂洗3-4次,加入预热到60℃的1mol/L盐酸中,进行解离7min。完成后再次用蒸馏水漂洗3-4次,将根尖上残留的盐酸洗净。将冲洗干净的根尖置于载玻片上,切取1-2mm的茎尖,用解剖针尽量撕碎,并用卡宝品红进行染色2min。
(5)制片:染色结束后,盖上盖玻片压片,并用滤纸吸去多余的液体。压片的过程中先用手指将片子压实,再用带有橡皮的铅笔轻轻敲击盖玻片,使得根尖组织和细胞可以均匀的分散在载玻片上。
(6)镜检:使用光显微镜进行观察,先用低倍镜(10x)进行观察,找到合适的视野及分裂相后,转到高倍镜(60x)进行观察拍照。
2.根据权利要求1中所述材料选取,其特征在于(1)中所描述的材料特点及取材时间。晴天上午9:00-11:00进行取材所观察到的分裂相比例最高。
3.根据权利要求1中所述预处理,其特征在于(2)中所述预处理环境条件及时间。避光保存于4℃冰箱内,预处理12个小时的结果最有利于放线菌酮溶液与材料结合。
4.根据权利要求1中所述染色,其特征在于(4)中所描述的解离时间及染色时间。加入预热到60℃的1mol/L盐酸中,进行解离7min。并染色2min后制片效果最佳。
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