CN105954082A - 一种小麦根尖染色体制片的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种小麦根尖染色体制片的方法，其具体步骤为：在种子发芽后，取其幼根，经8‑羟基喹啉预处理后，用卡诺固定液固定、蒸馏水前低渗处理、纤维素酶和果胶酶酶解、蒸馏水后低渗处理，将处理后的根尖生长点用涂片法制片，最后在相差显微镜下镜检。本发明的染色体制片方法操作方便简单，染色体分散良好且背景较浅，易于计数，分裂相不易丢失。

Description

一种小麦根尖染色体制片的方法

技术领域

本发明涉及植物遗传学领域，特别是一种小麦根尖染色体制片的方法。

背景技术

小麦是世界上重要的粮食作物，小麦属中有20多个种，普通小麦属于禾本科小麦族、小麦亚族、小麦属的一个种，其栽培面积约占小麦总面积的90%。小麦簇内各属和小麦属内除普通小麦外的各物种，一般都称为普通小麦的近缘植物（吴兆苏，小麦育种学，农业出版社，1990）。普通小麦的近缘植物中蕴藏着多种多样的、普通小麦本身所不具备的、可为品种改良所需要的性状基因，通过远缘杂交、染色体工程技术，可将这些基因转育到普通小麦中，从而丰富普通小麦的遗传基础。在小麦的起源进化研究、外源染色体的鉴定、基因的染色体定位、物理图谱构建、减数分裂机理等研究中，都涉及到染色体的研究。

小麦染色体制片的准备，是开展小麦细胞遗传学、小麦分子细胞遗传学以及基于染色体等相关研究的基础。目前，国内外小麦染色体制片的主要方法为压片法（Gill等，TheGiemsa C-banded karyotype of rye，PNAS，1974，71（4）：1247-1249；陈瑞阳等，植物染色体Giemsa分带技术的研究，植物学报，1979，21（1）：11-18；陈佩度等，用分子原位杂交（GISH）鉴定小麦-簇毛麦双倍体、附加系、代换系和易位系，遗传学报，1995，22（5）：380-386；任正隆等，一个改良的染色体C带技术，四川农业大学学报，1995，13（1）：1-5），一些学者应用去壁低渗悬浮液滴片法（陈瑞阳等，植物有丝分裂染色体标本制作的新方法，植物学报，1979，21（3）：297-298；Fu等，Molecular cytogenetic characterization of wheat–Thinopyrum elongatum addition, substitution and translocation lines with anovel source of resistance to wheat Fusarium head blight，2012，39：103-110）进行小麦染色体制片。这两种方法在操作过程存在以下一些问题：压片法在去除盖玻片时，载玻片上的分裂相易丢失；压片法有时会造成染色体断裂；背景相对较深。滴片法染色体制片，染色体在载玻片上附着不牢固，在后续的实验过程中，易造成染色体的丢失；有时背景较深；有时需要用特殊的设备对材料进行预处理等等，均不能满足普通实验室染色体镜检制片的需要。

发明内容

针对上述小麦染色体制片技术的不足，本发明提供一种操作简单方便、不需要特殊设备的根尖染色体制片方法，以获得清晰的分裂相，其染色体分散良好，细胞质较少、背景浅，易于进行核型分析，也可以用于染色体分带或荧光原位杂交实验，本发明是这样实现的：

一种小麦根尖染色体制片的方法，其具体步骤为：

A)种子发根：将小麦种子放在垫有滤纸的培养皿中，加足量蒸馏水，使种子充分浸泡于蒸馏水中，室温、遮光条件下，培养至种子露白（约20-24h），吸去多余水分后，移至4℃冰箱，遮光处理20-24小时；再将培养皿放至在22℃培养箱中避光生长。

B）预处理：当根的长度为0.5-1.5cm时，剪取全部幼根放入浓度为2mM 8-羟基喹啉溶液中，在20-25℃、黑暗条件下，预处理2-4h；

C）固定：将预处理的根尖，在装有蒸馏水的培养皿中清洗2次，每次5分钟，然后用吸水纸吸干水分后，室温条件下，用现配置的卡诺氏固定液（乙醇与乙酸按体积比3:1混合后获得）固定48h，然后用于下一步酶解，或放入-20℃冰箱中保存；

D）酶解：将固定好的幼根用蒸馏水清洗2次，每次5分钟，以刀片切取1.5-2.5mm的根尖，用吸水纸吸干水分后，放入装有50µl 酶解液的eppendorf管中（5-6个根尖/50µl酶解液），37℃水浴中酶解45min-1h；然后用移液枪吸去酶液后，加入1ml用蒸馏水处理5min；

所述酶解液配制方法为：将400mg纤维素酶和、200mg果胶酶溶解于10ml浓度为0.01M柠檬酸缓冲液中；

所述0.01M柠檬酸缓冲液配比为：将1.47g柠檬酸三钠和1.05g一水柠檬酸溶解于500ml蒸馏水中。

E）涂片：用平枪头吸取一个根尖置于载玻片上，用吸水纸吸去根尖周围水分，加30µl 35%冰醋酸，用解剖针将根尖分生组织敲碎，用摄子去掉大块组织残渣后，置于40-45℃的电热台面上，用解剖针来回将根尖组织涂匀，在35%冰醋酸挥发完之前，用1ml枪头吸取1-2ml卡诺氏固定液漂洗载玻片，在室温下凉干，即获得所述小麦根尖染色体制片。

将载玻片置于相差显微镜下观察，选择染色体形态良好、不重叠或重叠少、清晰的细胞，可以直接照相进行核型分析，也可以用于染色体分带或荧光原位杂交实验。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

（1）操作简单，不需要特殊设备。

（2）方便易学，没有经过细胞学训练的人员，根据本发明方法，也可以制备出良好的小麦染色体制片。

（3）在涂片过程中，用卡诺氏固定液漂洗载玻片，因而获得的分裂相清晰，细胞质较少，染色体分散良好；染色体制片进行荧光原位杂交实验，背景信号弱。（4）涂片过程在电热台面上进行，有利于细胞附着在载玻片上，分裂相不易丢失。

附图说明

图1为中国春小麦镜检图片。

图2为硬粒小麦镜检图片。

图3为簇毛麦镜检图片。

图4为压片法簇毛麦镜检图片。

具体实施方式

实施例中所涉及的试剂：

0.01M柠檬酸缓冲液配制方法：将1.47g柠檬酸三钠和1.05g一水柠檬酸溶解于500ml蒸馏水中；

酶解液配制方法：将400mg纤维素酶和200mg果胶酶溶解于10ml浓度为0.01M柠檬酸缓冲液中。

卡诺氏固定液配制方法：将乙醇与乙酸按体积比3：1混合，现用现配；

实施例使用的普通小麦中国春（2n=6x=42）、硬粒小麦（2n=4x=28）和簇毛麦（2n=2x=14）均由南京农业大学细胞遗传研究所提供。

实施例1 普通小麦中国春（2n=6x=42）的染色体制片

种子发根：将30粒普通小麦品种中国春种子放在垫有滤纸的培养皿中，加足量蒸馏水，使种子充分浸泡于蒸馏水中，室温、遮光条件下，放置20小时；种子露白后，吸去多余水分后，移至4℃冰箱，遮光处理24小时；再将培养皿放至在22℃培养箱中避光生长。

预处理：当小麦种子根的长至0.5-1.5cm时，将幼根全部剪下，放入装有1ml浓度为2mM 8-羟基喹啉溶液的1.5ml eppendorf管中，在22℃、黑暗条件下，预处理2.5h（在实际操作中，预处理时间可以在2-4h范围内）；

固定：取出预处理的根尖，用吸水纸吸去多余的8-羟基喹啉溶液后，在装有蒸馏水的培养皿中清洗2次，每次5分钟，然后用吸水纸吸干水分后，放入新的eppendorf管中，室温条件下，用现配置的卡诺氏固定液固定48h；

酶解：取出固定好的幼根，在培养皿中用蒸馏水清洗2次，每次5分钟，用刀片切取2mm根尖部分（实际操作中，可根据需要切取1.5-2.5mm根尖部分），吸水纸吸干水分后，用镊子将根尖放入装入50µl 酶解液的1.5ml eppendorf管中（每50µl混合液可以酶解5-6个根尖），37℃水浴中酶解1h；酶解后，用移液枪吸去酶解液后，加入1ml蒸馏水处理5min；

涂片：用平枪头小心吸取一个根尖置于干净的载玻片上，用吸水纸吸去根尖周围水分，加30µl 质量分数为35%的冰醋酸，用解剖针将根尖分生组织敲碎，用摄子去掉大块组织残渣后，置于45℃的电热台面上，用解剖针来回将根尖分生组织涂匀，在35%冰醋酸挥发完之前，用1ml枪头吸取2ml卡诺氏固定液漂洗载玻片，室温下凉干，即获得小麦根尖染色体制片；

镜检：将载玻片置于相差显微镜10倍物镜下观察，选择染色体形态良好、重叠少，细胞质少。DAPI染色后，在荧光显微镜60倍油镜下照相，染色结果如图1（图中比例尺为10µm）所示，由图1可见，该小麦根尖细胞染色体数目为42，染色体分散良好、重叠少。

实施例2 硬粒小麦（2n=4x=28）和簇毛麦（2n=2x=14）的染色体制片和荧光原位杂交

种子发根：将硬粒小麦品种中引1286和簇毛麦（陈佩度等，普通小麦与簇毛麦杂种后的细胞遗传学研究，南京农学院学报，1982，4：1-15）种子放在垫有滤纸的培养皿中，加足量蒸馏水，使种子充分浸泡于蒸馏水中，室温、遮光条件下，放置20小时；种子露白后，吸去多余水分后，移至4℃冰箱，遮光处理24小时；再将培养皿放至在22℃培养箱中避光生长。

预处理：将剪取的新鲜幼根放入装有1ml浓度为2mM 8-羟基喹啉溶液的1.5mleppendorf管中，在22℃、黑暗条件下，预处理3h；

固定：取出预处理的根尖，用吸水纸吸去多余的8-羟基喹啉溶液后，在装有蒸馏水的培养皿中清洗2次，每次5分钟，然后用吸水纸吸干水分后，放入新的eppendorf管中，室温条件下，用现配置的卡诺氏固定液固定48h；

酶解：取出固定好的幼根，在培养皿中用蒸馏水清洗2次，每次5分钟，用刀片切取2.5mm根尖部分，吸水纸吸干水分后，用镊子将根尖放入装有50µl 酶解液的1.5ml eppendorf管中（每50µl混合液可以酶解5-6个根尖），37℃水浴中酶解45min；酶解后，用移液枪吸去酶液后，加入1ml蒸馏水处理5min；

涂片：用平枪头小心吸取一个根尖置于干净的载玻片上，用吸水纸吸去根尖周围水分，加30µl 35%冰醋酸，用解剖针将根尖分生组织敲碎，用摄子去掉大块组织残渣后，置于40℃的电热台面上，用解剖针来回将根尖分生组织涂匀，在35%冰醋酸挥发完之前，用1ml枪头吸取2ml卡诺氏固定液漂洗载玻片，室温下凉干，获得小麦根尖染色体制片；

镜检：将载玻片置于相差显微镜10倍物镜下观察，选择染色体形态良好、重叠少，细胞质少的制片进行荧光原位杂交实验。

荧光原位杂交：分别以45S rDNA、pAtT4（端粒质粒）为探针，分别对硬粒小麦和簇毛麦染色体制片进行荧光原位杂交（荧光原位杂交方法参照以下文献进行，杨学明等，普通小麦-簇毛麦6V代换系45S rDNA和5S rDNA位点的FISH分析，植物遗传资源学报，2011，12（3）：464-467），在荧光显微镜60倍油镜下照相，结果如图2、图3所示，在硬粒小麦中，有两对45S rDNA位于两对染色体的端部，染色体分散良好，杂交信号清晰（图2，图中比例尺为10µm）；在簇毛麦中，每条染色体的两端均具有杂交信号，染色体分散良好、不重叠（图3，图中比例尺为10µm）。

比较例1 压片法簇毛麦（2n=2x=14）的染色体制片和荧光原位杂交镜检

种子发根：将簇毛麦种子放在垫有滤纸的培养皿中，加足量蒸馏水，使种子充分浸泡于蒸馏水中，室温、遮光条件下，放置20小时；种子露白后，吸去多余水分后，移至4℃冰箱，遮光处理24小时；再将培养皿放至在22℃培养箱中避光生长；

预处理：将剪取的新鲜幼根放入装有蒸馏水的1.5ml eppendorf管中，在冰水中处理24h；

固定：取出预处理的根尖，用吸水纸吸去多余水份后，放入新的eppendorf管中，室温条件下，用现配置的卡诺氏固定液固定48h；

压片：切取根尖分生组织置于载玻片上，滴加适量45%醋酸，盖上盖玻片，盖玻片的一侧垫在刀片的边缘，用解剖针或镊子敲击盖玻片使根尖细胞分散，在火焰上微烤后，将载玻片放在两层滤纸之间，用大拇指按在盖玻片的位置用力压片；

揭去盖玻片：将染色体制片放入液氮中冷冻处理30s，用刀片迅速揭去盖玻片后，在70%、90%和100%乙醇中依次脱水，每次5分钟，室温干燥后，相差显微镜镜检，然后进行荧光原位杂交实验；

荧光原位杂交：以pAtT4（端粒质粒）为探针，对簇毛麦染色体制片进行荧光原位杂交（荧光原位杂交方法参照以下文献进行，杨学明等，普通小麦-簇毛麦6V代换系45S rDNA和5S rDNA位点的FISH分析，植物遗传资源学报，2011，12（3）：464-467），在荧光显微镜60倍油镜下照相，结果如图4（图中比例尺为10µm）所示，在簇毛麦中，在12条染色体的两端均具有杂交信号，在4条染色体片段的一端有杂交信号（箭头所示），说明有2条染色体在制片过程中，发生了染色体断裂。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。

Claims (1)

1.一种小麦根尖染色体制片的方法，其特征在于，具体步骤如下：

A）种子发根：将小麦种子放在垫有滤纸的培养皿中，加足量蒸馏水，于室温、遮光条件下培养；待种子露白后，于4℃、遮光培养20-24小时；然后将培养皿置于22℃、遮光培养；

B）预处理：当小麦种子根的长至0.5-1.5cm时，剪取幼根放入浓度为2mM 8-羟基喹啉溶液中，于20-25℃、黑暗条件下，预处理2-4h；

C）固定：以蒸馏水清洗预处理后的幼根，室温条件下，卡诺氏固定液固定48h；

D）酶解：用蒸馏水清洗将固定后的幼根，以刀片切取1.5-2.5mm的根尖，放入酶解液中，37℃水浴酶解45min-1h后，再以蒸馏水室温处理5min；

所述酶解液配制方法为：将400mg纤维素酶和200mg果胶酶溶解于10ml浓度为0.01M柠檬酸缓冲液中；

E）涂片：吸取一个根尖置于载玻片上，用吸水纸吸去根尖周围水分，加30µl 35%冰醋酸，用解剖针将根尖分生组织敲碎，再去掉大块组织残渣，置于40-45℃的电热台面上，用解剖针将根尖组织涂匀，在35%冰醋酸挥发完之前，用1-2ml卡诺氏固定液漂洗载玻片，于室温下凉干，即获得所述小麦根尖染色体制片。