CN116465702A - 一种鹅掌楸属材料染色体的制片方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鹅掌楸属材料染色体的制片方法，属于植物细胞遗传学技术领域。本发明公开的鹅掌楸染色体的制片方法，将鹅掌楸属植物胚性愈伤或球形胚或心形胚或鱼雷胚或子叶胚或黄化苗根尖为染色体制片材料置于饱和对二氯苯溶液中进行预处理2‑4h；将预处理后的材料置于卡诺固定液中进行固定12‑24h；将固定后的材料转至1mol/L的HCl溶液中进行解离2‑8min；将解离后的材料使用改良卡宝品红染液进行染色2‑6h；将染色后的材料置于载玻片上用解剖针将其迅速碾碎，滴加染液后覆盖一张盖玻片，将材料压散后即得到鹅掌楸的染色体制片，为鹅掌楸属植物细胞遗传学和倍性育种等研究方向提供了重要的技术手段。
Description
技术领域
本发明属于植物细胞遗传学技术领域，更具体地说，涉及一种鹅掌楸属材料染色体的制片方法。
背景技术
鹅掌楸属，属于古老的木兰科，现仅存两个种：鹅掌楸和北美鹅掌楸。两种的杂交种树形美观、生长迅速、材性优良、抗逆性强，表现出明显的杂种优势，是重要的用材树种和园林景观树种，具有显著的经济价值和生态价值。2003年，陈金慧教授等成功诱导杂交鹅掌楸未成熟胚脱分化产生胚性愈伤组织，建立了稳定高效的杂交鹅掌楸体胚发生与植株再生技术体系，实现了杂交鹅掌楸优种苗木的规模化供应。迄今为止，该团队已成功创制了数百个胚性愈伤基因型，极大地丰富了鹅掌楸属种质资源。
染色体制片技术是开展细胞遗传学、倍性育种研究的重要手段，被广泛应用于植物有丝分裂、减数分裂染色体行为的观察，核型分析及倍性鉴定等工作中。为获得较多清晰分散的中期分裂相，传统的以根尖、茎尖为材料的染色体制片方法需严格考虑天气状况、取材时间等制约因素，制片效果不易稳定，且鹅掌楸属植物染色体体积较小、数量较多，更为增加了制片难度。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种鹅掌楸属材料染色体的制片方法，用于获得可靠的鹅掌楸染色体制片。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种鹅掌楸属材料染色体的制片方法，包括：
将鹅掌楸属材料置于饱和对二氯苯溶液中进行预处理2-4h；将预处理后的材料置于卡诺固定液中进行固定12-24h；将固定后的材料转至1mol/L的HCl溶液中进行解离2-8min；将解离后的材料使用改良卡宝品红染液进行染色2-6h；将染色后的材料置于载玻片上用解剖针将其迅速碾碎，滴加染液后覆盖一张盖玻片，将材料压散后即得到鹅掌楸的染色体制片。
进一步地，所述的鹅掌楸属材料为鹅掌楸属植物胚性愈伤、各发育阶段的体胚和黄化苗根尖中的一种或几种。
进一步地，所述的各发育阶段的体胚的制备方法为将直径为3-5mm的继代培养18-20d的鹅掌楸胚性愈伤接种至固体体胚诱导培养基上，23℃暗培养，获得球形胚、心形胚、鱼雷胚、子叶胚。
进一步地，所述的饱和对二氯苯溶液的体积大于鹅掌楸胚性愈伤体积的三倍。
进一步地，所述的卡诺固定液的体积大于预处理后的材料体积的三倍。
进一步地，所述的卡诺固定液由体积比为3：1的95％乙醇与冰醋酸组成。
进一步地，所述的HCl溶液的体积大于固定后的材料体积的三倍。
进一步地，所述的预处理时间优选为4-6小时。
进一步地，所述的解离时间优选为2-8min。
进一步地，所述的改良卡宝品红染液配方为染色液母液10mL，45％醋酸90mL，山梨醇1g；所述的染色液母液配方为45mL乙液，6mL 37％甲醛，6mL冰醋酸；所述的乙液配方为甲液10mL，加入90mL 5％石炭酸水溶液；所述的甲液配方为3g碱性品红溶于100mL 70％乙醇。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
1)本发明预处理时间对染色体制片效果影响较大：以子叶胚的染色体制片为例，当预处理时间为2h时，染色体缢缩不足，容易相互交织聚拢，不利于对其进行计数和形态分析；当预处理时间为4h时，染色体缢缩充分，形态标致，可以清晰观察到染色体长臂、短臂和主缢痕；当预处理时间为6h时，染色体缢缩至短粗状，此效果利于染色体计数。
2)本发明解离时间对染色体制片效果影响较大：当解离时间为4min时，细胞间联系紧密，不易压散，影响中期分裂相的寻找和观察；当解离时间为8min时，细胞间的联系被充分破坏，细胞和染色体易被压散，制片效果良好；当解离时间为12min时，染色体被轻度破坏，形态不佳。
3)本发明区别于传统利用植物根尖或茎尖进行染色体制片的取材方法，改善了季节、天气、取材时间等因素对染色体制片产生的负面效果，为鹅掌楸属植物细胞遗传学和倍性育种等研究方向提供了重要的技术手段。
附图说明
图1为本发明的技术路线图；
图2为实施例1中使用的杂交鹅掌楸胚性愈伤图(a)、不同发育阶段的体胚图(d-g)及用于获取根尖的黄化苗图(h)；
图3为各类型材料的染色体制片效果图；
图4为不同预处理时间的子叶胚染色体制片效果图；
图5为不同解离时间的子叶胚染色体制片效果图；
图6为实施例2秋水仙素处理后胚性细胞的染色体制片结果图；
图7为实施例3杂交鹅掌楸四倍体品种“司金香”及其二倍体的根尖染色体制片结果图；
图8为实施例4北美鹅掌楸子叶胚的染色体制片效果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中如无特殊说明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明的整体技术路线如图1所示。
固体体胚诱导培养基：3/4MS+5mg/L抗坏血酸+40g/L蔗糖+0.2g/L水解乳蛋白+2g/L活性炭+2.5g/L洋菜。
实施例1
1、使用的染色体制片材料为杂交鹅掌楸胚性愈伤以及经固体培养诱导获得的各发育阶段的体胚和黄化苗根尖。
2、将继代培养18-20d的胚性愈伤(图2a)接种至固体体胚诱导培养基上，愈伤块的接种直径为3-5mm，培养环境为23℃暗培养。
15d后愈伤表面出现球形胚(图2b、d)，随后依次经历心形胚(图2e)、鱼雷胚(图2f)、子叶胚(图2g)，约25d左右，部分成熟胚(子叶胚)下胚轴和胚根伸长、子叶舒展，形成黄化苗(图2h)。由于愈伤块中胚性细胞发育的不同步性，在体胚诱导25d后的愈伤块表面(图2c)可同时收获以上所有5个发育阶段的材料，用于染色体制片。
3、预处理
收取步骤2中继代培养18-20d的胚性愈伤、经诱导获得的四个发育阶段的体胚和黄化苗根尖，将其置于饱和对二氯苯溶液中进行预处理，预处理液的体积大于材料体积的3倍，预处理时间如表1所示。此步骤的目的是抑制细胞分裂，使更多细胞停留在分裂中期，同时促使染色体缢缩、分散，便于后续观察和计数。
4、固定
将经过预处理的材料用水清洗至可自然沉淀，随后将其置于卡诺固定液(V95％乙醇：V冰醋酸＝3：1)中进行固定，固定液体积大于材料体积的3倍，固定时间如表1所示。此步骤的目的是利用固定液极强的渗透性对细胞进行快速固定，并维持染色体结构的完整性、增强染色体的嗜碱性，以保证良好的染色效果。
5、解离
将经过固定的材料用清水漂洗3-5遍，随后转移至1mol/L的HCl溶液中，60℃水浴解离，解离液体积大于材料体积的3倍，解离时间如表1所示。此步骤目的是使组织中的细胞相互分离，便于压片时细胞及染色体的分散。
6、染色
将经过解离的材料迅速转入冷水中，轻轻漂洗(解离后的材料质地柔软、易损坏)3-5遍，然后使用改良卡宝品红染液(1.甲液：称取3g碱性品红，溶于100mL70％乙醇；2.乙液：取甲液10mL，加入90mL 5％石炭酸水溶液；3.染色液母液：取45mL乙液，6mL 37％甲醛，6mL冰醋酸混溶；4.改良卡宝品红染液：取染色液母液10mL，45％醋酸90mL，称取山梨醇1g，溶解后即得最终染液。)浸没材料，室温下“整染”2-6h，染色过程需在密闭容器中进行，以防止染液挥发。此步骤的目的是使染色体充分着色，便于观察。
7、压片
用镊子夹取单个经过染色的材料(胚性愈伤的取样可借助移液枪或吸管)置于载玻片上；随后，若制片材料为胚性愈伤、球形胚和心形胚，可用解剖针直接将其迅速碾碎；若为鱼雷胚，可用解剖针将胚根部分截下后碾碎；若为子叶胚，可只取子叶尖端或胚根根尖部分碾碎；若为黄化苗根尖，需用解剖针轻轻刮下着色较深的分生区组织后碾碎；材料破碎后，迅速滴加适量染液将其浸没，静置30s；用镊子夹取一张盖玻片，从染液一侧缓缓盖下，防止产生气泡，用一只手食指和中指(佩戴实验手套)分别按紧盖玻片斜对的两角，用另一只手紧握铅笔(平端朝下)竖直敲压材料所在的盖玻片区域。待材料在载玻片上呈云雾状弥散开后，擦净盖玻片表面可能存在的污渍，用于下一步镜检。
8、镜检
将步骤6)中制好的染色体装片置于光学显微镜(蔡司正置显微镜)下镜检。首先，将视野调至5X镜下找到材料所在的位置，然后转20X镜观察细胞中是否存在中期分裂相，若不存在，继续调回5X镜寻找其他区域的材料及中期分裂相；若存在，则将视野继续调至40X镜下，初步观察染色体是否分散良好以及所有染色体是否保持在同一焦平面上，若符合要求，则直接在分裂相所在的装片位置滴加香柏油后转油镜(100X)观察、拍照，用于后续分析，若不符合要求，则需要继续适当敲压装片，以至制片效果能够满足研究需求。按照表1中的操作条件获得的六种材料的染色体制片效果如图3所示，染色体计数结果显示，以上材料皆为二倍体(2n＝2X＝38)。
表1不同鹅掌楸属植物材料的染色体制片条件
表2预处理和解离时间对子叶胚染色体制片效果的影响
本发明使用的染色体制片材料组织幼嫩、细胞分裂旺盛，容易获得丰富的中期分裂相，且这些材料均在暗环境中生长发育，培养温度、湿度等稳定，因而取材时间自由。本发明的操作流程及条件为多轮摸索总结而得，制片效果良好、稳定，表现为染色体易分散、形态清晰。本发明认为预处理和解离时间对染色体制片效果影响较大。以子叶胚为例，预处理和解离时间对其染色体制片效果的影响如表2所示。当预处理时间过短，为2h时，染色体缢缩不足，容易相互交织聚拢，不利于对其进行计数和形态分析(图4a)；当预处理时间适当，为4h时，染色体缢缩充分，形态标致，可以清晰观察到染色体长臂、短臂和主缢痕(图4b)；当预处理时间稍长，为6h时，染色体缢缩至短粗状，此效果利于染色体计数(图4c)；当解离时间过短，为4min时，细胞间联系紧密，不易压散，影响中期分裂相的寻找和观察(图5a)；当解离时间合适，为8min时，细胞间的联系被充分破坏，细胞和染色体易被压散，制片效果良好(图5b)；当解离时间过长，为12min时，染色体被轻度破坏，形态不佳(图5c)。综上，本发明提供了一套鹅掌楸属植物材料的染色体制片技术方案，操作流程规范，实用性强，具有十分广阔的应用前景。
实施例2
对杂交鹅掌楸胚性愈伤组织建立液体培养悬浮系，悬浮系建立方法参考[陈婷婷，王鹏凯，张稼霁，等.脱落酸和玉米素结合使用对杂交鹅掌楸体胚分化及发育的影响[J].林业科学,2019,55(3)：8.]，在悬浮系中添加2g/L的秋水仙素，连续培养3周。取经过秋水仙素处理的细胞(含大颗粒愈伤、单细胞和细胞团)，按实施例1中的胚性愈伤染色体制片方法，进行压片镜检，观察细胞及染色体变异情况。染色体观察结果(图6)显示，所有中期分裂相包含两种染色体数量，即二倍体(黄色箭头指示的中期细胞及白圈外细胞，2n＝2X＝38条)和四倍体(红色箭头指示的中期细胞及白圈内的细胞，2n＝4X＝76条)，四倍体细胞较二倍体细胞体积更大。本实施例可为杂交鹅掌楸多倍体诱导研究提供倍性检测方法。
实施例3
本实施例使用的制片材料为杂交鹅掌楸四倍体品种“司金香”(2n＝4X＝76)及其二倍体(2n＝2X＝38)的根尖，染色体制片流程同实施例1，预处理时间为6h，固定时间为24h，解离时间为10min，染色体制片效果如图7所示，利用本发明方法获得了良好的二倍体及四倍体“司金香”的中期分裂相，染色体清晰、分散，计数容易，便于区分二者倍性。本实施例为杂交鹅掌楸多倍体植株的倍性鉴定提供了可靠的方法支持。
实施例4
本实施例使用的制片材料为北美鹅掌楸子叶胚，体胚诱导方法同实施例1。染色体制片效果如图8所示，利用本发明方法获得了良好的北美鹅掌楸的中期分裂相，染色体数量为38条，分散程度高、形态清晰，便于观测。本实施例为北美鹅掌楸的细胞遗传学研究提供了方法支持。
Claims (10)
1.一种鹅掌楸属材料染色体的制片方法，其特征在于，包括：
将鹅掌楸属材料置于饱和对二氯苯溶液中进行预处理2-4h；将预处理后的材料置于卡诺固定液中进行固定12-24h；将固定后的材料转至1mol/L的HCl溶液中进行解离2-8min；将解离后的材料使用改良卡宝品红染液进行染色2-6h；将染色后的材料置于载玻片上用解剖针将其迅速碾碎，滴加染液后覆盖一张盖玻片，将材料压散后即得到鹅掌楸的染色体制片。
2.根据权利要求1所述的鹅掌楸染色体的制片方法，其特征在于，所述的鹅掌楸属材料为鹅掌楸属植物胚性愈伤、各发育阶段的体胚和黄化苗根尖中的一种或几种。
3.根据权利要求2所述的鹅掌楸染色体的制片方法，其特征在于，所述的各发育阶段的体胚的制备方法为将直径为3-5mm的继代培养18-20d的鹅掌楸胚性愈伤接种至固体体胚诱导培养基上，23℃暗培养，获得球形胚、心形胚、鱼雷胚、子叶胚。
4.根据权利要求1所述的鹅掌楸染色体的制片方法，其特征在于，所述的饱和对二氯苯溶液的体积大于鹅掌楸胚性愈伤体积的三倍。
5.根据权利要求1所述的鹅掌楸染色体的制片方法，其特征在于，所述的卡诺固定液的体积大于预处理后的材料体积的三倍。
6.根据权利要求5所述的鹅掌楸染色体的制片方法，其特征在于，所述的卡诺固定液由体积比为3：1的95％乙醇与冰醋酸组成。
7.根据权利要求1所述的鹅掌楸染色体的制片方法，其特征在于，所述的HCl溶液的体积大于固定后的材料体积的三倍。
8.根据权利要求1所述的鹅掌楸染色体的制片方法，其特征在于，所述的预处理时间优选为4-6小时。
9.根据权利要求1所述的鹅掌楸染色体的制片方法，其特征在于，所述的解离时间优选为8min。
10.根据权利要求1所述的鹅掌楸染色体的制片方法，其特征在于，所述的改良卡宝品红染液配方为染色液母液10mL，45％醋酸90mL，山梨醇1g；所述的染色液母液配方为45mL乙液，6mL 37％甲醛，6mL冰醋酸；所述的乙液配方为甲液10mL，加入90mL 5％石炭酸水溶液；所述的甲液配方为3g碱性品红溶于100mL 70％乙醇。
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| CN202310442720.2A CN116465702A (zh) | 2023-04-23 | 2023-04-23 | 一种鹅掌楸属材料染色体的制片方法 |
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|---|---|
| CN (1) | CN116465702A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117330379A (zh) * | 2023-10-12 | 2024-01-02 | 南京林业大学 | 一种青钱柳染色体制片的方法 |
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2023
- 2023-04-23 CN CN202310442720.2A patent/CN116465702A/zh active Pending
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