CN103695557A - 一种基于茎尖的银杏染色体核型分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于茎尖的银杏染色体核型分析方法；本发明采用新梢上茎尖为试验材料，利用银杏茎尖分生组织细胞分裂旺盛的特点，通过固定、解离、染色、压片等步骤，对嫁接保存的银杏良种资源染色体核型进行分析，结果准确可靠，方法简便，易于操作，对于银杏种质资源的收集、分类、评价和保护具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于茎尖的银杏染色体核型分析方法，属于一种树木细胞学的分析方法。
背景技术
染色体核型分析又称组型分析，是染色体分析中的一个基本方法，是指某一个个体或种的全部染色体的形态结构，包括染色体的数目、大小、形状、主缢痕和副缢痕等特征的总和。它代表了一个个体，一个种甚至一个属或更大类型的特征。不同的物种具有不同的核型，所以核型是区别物种的基本遗传学依据，对于研究生物遗传变异、生物系统的演化、物种之间的亲缘关系、某些生物的起源、远缘杂交及染色体工程等有重要意义。自从细胞分类学萌芽以来，核型的差异被广泛地用作确定植物间分类差别的依据。核型可以解决常规形态分类难以解决的问题，是现代综合分类的重要组成部分，对裸子植物和被子植物的细胞遗传学等具有重要意义。目前，在许多植物类群中，染色体数据如染色体数目、核型分析、染色体带型分析、染色体组分析等已同形态特征一样成为标准分类的基本数据。常规的染色体核型分析是以植物材料的根尖为试材，用压片法对其染色体进行观察分析。
银杏是第四纪冰川的孑遗物种，是历史的遗产和活化石，具有重要的经济、生态和文化价值。从广义上讲，银杏目前有核用品种、观赏品种、叶用品种、雄株品种和材用品种等五大栽培变种。目前，银杏良种繁育和种质保存的主要方法是“本砧嫁接”，即利用银杏种子培育的实生苗，作为砧木，嫁接不同银杏种质。常规的核型分析技术因取材部位为根尖，即从砧木部位进行取材，达不到对所保存的种质资源的核型进行分析的目的。针对常规核型分析技术在银杏嫁接繁育的不同种质、品种上应用的局限性，本发明采用银杏的茎尖作为核型分析的试材，客服了上述局限性。目前还未见到采用茎尖对银杏嫁接繁育的不同品种或种质进行核型分析的报道，本发明是在这样的技术背景下提出的。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种基于茎尖的银杏染色体核型分析方法；本发明的目的是，针对银杏良种繁育和种质保存的主要方法是“本砧嫁接”，常规的染色体核型分析技术因取材部位为根尖，即从砧木部位进行取材，达不到对所保存的种质资源的染色体核型进行分析的目的。为了对嫁接繁育的不同种质、品种进行染色体核型分析，本发明采用了以下
技术方案：
（1）取材
在银杏生长旺盛季节的晴朗天气，上午9：00～11：00，下午14：00～16：00，取植株新梢茎尖；由于在野外操作，注意保持材料的干净；
（2）预处理
预处理的温度，以材料正常生长温度为宜，温度不宜过高。采集的材料立即放入盛有二氯苯的饱和溶液的青霉素小瓶内处理8h；
（3）固定
将材料冲洗3～4次后放入卡诺固定液中，固定液的体积约为材料的10倍。材料不能装太多，处理的温度以室温为宜；一般固定10～24h。固定后的材料可转入70%乙醇中，于4℃冰箱中保存备用；
（4）解离
倒去固定液，用蒸馏水漂洗2～3次。在体式显微镜下剥离幼嫩叶取出分生组织部分，放入预热的1mol/L HCl中，60℃水浴中解离10～12min，然后用蒸馏水漂洗2～3次；
（5）染色
将材料转置到载玻片上，加一小滴改良卡宝品红染液，染色约10min。为了使染色体着色加深，可以用吸水纸把载玻片上的染液吸掉，再滴加染液复染一次；
（6）压片
在平整的桌面上，先铺上两层柔软的面巾纸，上放一张吸水纸，将带有染色的材料的载玻片放于吸水纸上。用镊子夹取盖玻片，先一端接触到载玻片，然后慢慢轻放，尽量赶走气泡；用左手手指拿吸水纸的一角压住盖玻片的一角，防止盖玻片的滑动，然后用右手持一解剖针，先用针尖轻敲盖玻片，使材料分散均匀，后用吸水纸把多余的染液吸走，最后用针柄再敲击盖玻片，使细胞分散压平；
（7）镜检
镜检时先用低倍镜如10倍镜进行观察，找到一个好的视野后再转到高倍镜如40倍镜下观察。看到有合适的细胞后，可滴加香柏油，转到100倍的油镜下观察；观察到有分散良好的中期染色体后，用NikonE200显微镜摄影，用DT2000图像分析系统将图像直接保存于电脑中。
本发明的有益效果是：
（1）本发明用银杏茎尖为染色体核型分析材料，使通过嫁接方式保留的良种、种质的核型分析获得成功。
（2）进行核型分析时一般利用体细胞分裂中期的染色体，因为此时染色体已充分缩短而稳定。本发明取材的时间选在上午9：00～11：00，下午14：00～16：00，在这个时间段所取的材料中期分裂相较多，染色体核型分析容易成功。
（3）本发明对试验材料的预处理时间为8h，解离时间为10～12min，此条件能获得最佳观察效果。
利用上述方法对通过“本砧嫁接”保存的优良种质的染色核型进行分析，结果准确可靠，方法简便，易于操作，对于银杏种质资源的收集、分类、评价和保护具有重要意义。
具体实施方式
实施例1
应用本方法对山东农业大学叶籽银杏种质资源基因库中通过嫁接保存的28株树龄5年的来自日本、山东等地的叶籽银杏进行核型分析，均取得准确可靠结果，叶籽银杏染色体核型分析的实施步骤如下：
1.药品的配制
(1)饱和对二氯苯溶液的配制
称取5g结晶放入棕色试剂瓶中，加入100ml已加热到40～45℃的蒸馏水中，振荡5min，静置冷却约1h后即可使用。该溶液在10～20℃条件下存放和处理为宜。溶液用完后，可重新加入温热蒸馏水，如上法配制。
(2)改良卡宝品红染液的配制：
原液A：3克碱性品红溶于100ml体积分数70%酒精中。原液B：取原液A10ml，加入90ml体积分数5%的苯酚水溶液，充分混匀后，置于37℃温箱中2～4h，此液只可保存2周。原液C，即苯酚品红染液：取原液B45ml，加入体积分数37%的甲醛、冰醋酸各6ml充分混匀，此液可长期保存。配好以上溶液后，取原液C10～20ml，加入80～90ml体积分数45﹪冰醋酸和1.8克山梨醇即得改良卡宝品红。该溶液要放置3周以上用效果才好。
（3）卡诺固定液
常规的卡诺固定液为无水酒精：冰醋酸=3：1。为了进一步促进染色体的分散，对固定液进行了改进，加大了酸的用量，采用无水酒精：冰醋酸=2：1的配方，效果较理想。
（4）1N盐酸的配制
取36.5%的浓盐酸83ml定容至1升。
2.染色体制片
（1）取材
在银杏生长旺盛季节的晴朗天气，上午9：00～11：00，下午14：00～16：00，取植株新梢茎尖；由于在野外操作，注意保持材料的干净。
（2）预处理
预处理的温度，以材料正常生长温度为宜，温度不宜过高。采集的材料立即放入盛有二氯苯的饱和溶液的青霉素小瓶内处理8h。
（3）固定
将材料冲洗3～4次后放入卡诺固定液中，固定液的体积约为材料的10倍。材料不能装太多，处理的温度以室温为宜；一般固定10～24h。固定后的材料可转入70%乙醇中，于4℃冰箱中保存备用。
（4）解离
倒去固定液，用蒸馏水漂洗2～3次。在体式显微镜下剥离幼嫩叶取出分生组织部分，放入预热的1mol/L HCl中，60℃水浴中解离10～12min，然后用蒸馏水漂洗2～3次。
（5）染色
将材料转置到载玻片上，加一小滴改良卡宝品红染液，染色约10min。为了使染色体着色加深，可以用吸水纸把载玻片上的染液吸掉，再滴加染液复染一次。
（6）压片
在平整的桌面上，先铺上两层柔软的面巾纸，上放一张吸水纸，将带有染色的材料的载玻片放于吸水纸上。用镊子夹取盖玻片，先一端接触到载玻片，然后慢慢轻放，尽量赶走气泡；用左手手指拿吸水纸的一角压住盖玻片的一角，防止盖玻片的滑动，然后用右手持一解剖针，先用针尖轻敲盖玻片，使材料分散均匀，后用吸水纸把多余的染液吸走，最后用针柄再敲击盖玻片，使细胞分散压平。
（7）镜检
镜检时先用低如10倍镜下进行观察，找到一个好的视野后再转到高倍镜如40倍镜下观察。看到有合适的细胞后，可滴加香柏油，转到100倍的油镜下观察；观察到有分散良好的中期染色体后，用NikonE200显微镜摄影，用DT2000图像分析系统将图像直接保存于电脑中。
Claims (4)
1.一种基于茎尖的银杏染色体核型分析方法，该方法包括下述顺序的步骤：
（1）取材
在银杏生长旺盛季节的晴朗天气，上午9：00～11：00，下午14：00～16：00，取植株新梢茎尖，由于在野外操作，注意保持材料的干净；
（2）预处理
预处理的温度，以材料正常生长温度为宜，温度不宜过高，采集的材料立即放入盛有二氯苯的饱和溶液的青霉素小瓶内处理8h；
（3）固定
将材料冲洗3～4次后放入卡诺固定液中，固定液的体积约为材料的10倍；材料不能装太多，处理的温度以室温为宜；一般固定10～24h，固定后的材料可转入70%乙醇中，于4℃冰箱中保存备用；
（4）解离
倒去固定液，用蒸馏水漂洗2～3次；在体式显微镜下剥离幼嫩叶取出分生组织部分，放入预热的1mol/L HCl中，60℃水浴中解离10～12min，然后用蒸馏水漂洗2～3次；
（5）染色
将材料转置到载玻片上，加一小滴改良卡宝品红染液，染色约10min；为了使染色体着色加深，可以用吸水纸把载玻片上的染液吸掉，再滴加染液复染一次；
（6）压片
在平整的桌面上，先铺上两层柔软的面巾纸，上放一张吸水纸，将带有染色的材料的载玻片放于吸水纸上；用镊子夹取盖玻片，先一端接触到载玻片，然后慢慢轻放，尽量赶走气泡；用左手手指拿吸水纸的一角压住盖玻片的一角，防止盖玻片的滑动，然后用右手持一解剖针，先用针尖轻敲盖玻片，使材料分散均匀，后用吸水纸把多余的染液吸走，最后用针柄再敲击盖玻片，使细胞分散压平；
（7）镜检
镜检时先用低倍镜如10倍镜下进行观察，找到一个好的视野后再转到高倍镜如40倍镜下观察。看到有合适的细胞后，可滴加香柏油，转到100倍的油镜下观察；观察到有分散良好的中期染色体后，用NikonE200显微镜摄影，用DT2000图像分析系统将图像直接保存于电脑中。
2.根据权利要求1所述的一种基于茎尖的银杏染色体核型分析方法，其特征在于，步骤（1）所描述的所选择的材料及取材时间。
3.根据权利要求1所述的一种基于茎尖的银杏染色体核型分析方法，其特征在于，步骤（2）所描述的预处理时间。
4.根据权利要求1所述的一种基于茎尖的银杏染色体核型分析方法，其特征在于，步骤（4）所描述的解离时间。
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2013
- 2013-12-31 CN CN201310752322.7A patent/CN103695557A/zh active Pending
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