CN112067410A - 一种基于幼芽的流苏树染色体核型分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于幼芽的流苏树染色体核型分析方法，包括以下步骤：(1)取流苏树植株的幼芽作为试验材料，放入由对二氯苯和8‑羟基喹啉组成的混合处理液中，在避光条件下进行预处理；(2)将预处理后的试验材料放入卡诺固定液中，固定10‑24h；(3)将固定后的试验材料用蒸馏水冲洗后，转移至0.075mol/L KCl溶液中进行前低渗处理；将前低渗处理后的试验材料进行解离处理；(4)将解离后的材料用蒸馏水冲洗后，采用染色液进行染色；(5)对染色后的材料进行压片和镜检。利用本发明的方法对通过“本砧嫁接”保存的优良种质的流苏树染色体核型进行分析，结果准确可靠，方法简便，易于操作，对于流苏树种质资源的收集、分类、评价和保护具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及林木细胞学分析方法技术领域，具体涉及一种基于幼芽的流苏树染色体核型分析方法。
背景技术
植物染色体是遗传信息的重要载体。核型是依据处于细胞分裂中期浓缩的染色体的形态来建立的。不同的物种具有不同的核型，所以核型是区别物种的基本遗传学依据。核型分析能够有效的对各个染色体的特征进行识别，这对于促进基因定位以及定体方面的研究发挥着其他领域不可替代的作用。在染色体工程、细胞分类学以及植物杂交育种领域，也是一种基础的、不可或缺的方法。自1848年Hofmeister在观察紫鸭趾草的花粉母细胞时发现了染色体，1888年Waldeyer正式提出染色体这一术语，染色体的研究至今已有一百多年的历史。染色体核型又称为染色体组型，是对每种生物染色体的数目、长度、形态、带型以及着丝粒位置等方面的分析研究，它代表了一个个体，一个种甚至一个属或更大类型的特征，对于研究生物遗传变异、生物系统的演化、物种之间的亲缘关系、某些生物的起源、远源杂交等有重要意义。常规的染色体核型分析是以植物材料的根尖为试材，用压片法对其染色体进行观察分析。
流苏树是木犀科流苏树属植物，为我国家二级保护植物。流苏根系发达，适应性强，耐寒，喜中性及微酸性土壤，耐干旱瘠薄，可作荒山绿化树种。成年流苏树形、花型优美，是优良的园林绿化树种及行道树，在生产实践上具有良好的开发利用价值。
目前对于流苏树的研究主要集中在流苏树的组织快繁、扦插、嫁接等方面；近年来在流苏树分子生物学遗传多样性上的研究取得了一些进展(流苏种质资源的收集评价及遗传多样性的分析，山东农业大学)，但有关流苏树细胞遗传学上的研究至今仍旧空白。
染色体核型分析主要通过研究其染色体数目及形态特征，反映不同物种或品种之间存在的染色体细胞学差异。不同物种的染色体核型模式在进化的过程中不受外界环境因素干扰和影响，在一定程度上反映出其进化的基本特征。因此，植物核型的研究不仅能为种间遗传变异、系统演化以及亲缘关系提供证据，还可以为杂交育种选育及杂交后代鉴定等提供理论依据。但由于流苏树的染色体数目较多，且染色体非常小，一般较难观察，所以国内外对于流苏树染色体数目、核型分析的研究的相关报道极少，对于流苏树的染色体核型分析仍然是目前的技术难点所在。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种基于幼芽的流苏树染色体核型分析方法。本发明采用流苏树的幼芽作为试验材料对流苏树嫁接的不同种质进行核型分析，克服了常规核型分析技术在流苏树嫁接繁育的不同种质方面的局限性。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种基于幼芽的流苏树染色体核型分析方法，包括以下步骤：
(1)取流苏树植株的幼芽作为试验材料，放入由对二氯苯和8-羟基喹啉组成的混合处理液中，在避光条件下进行预处理；
(2)将预处理后的试验材料用蒸馏水冲洗后放入卡诺固定液中，固定10～24h；
(3)将固定后的试验材料用蒸馏水冲洗后，转移至0.075mol/L KCl溶液中进行前低渗处理；将前低渗处理后的试验材料用蒸馏水冲洗后放入1mol/L HCl中，60℃水浴解离13～15min；
(4)将解离后的试验材料用蒸馏水冲洗后，采用染色液进行染色；
(5)对染色后的试验材料进行压片和镜检。
优选的，步骤(1)中，在5～8月份于晴朗的天气上午9：30～10：30或下午14：30～15：30，取流苏树植株的顶芽和腋芽作为试验材料。
优选的，步骤(1)中，所述混合处理液由饱和对二氯苯溶液和0.002mol/L 8-羟基喹啉溶液按体积比1:1混合配制而成。
优选的，步骤(1)中，所述预处理的时间为4～6h。
优选的，步骤(3)中，前低渗处理时间为20min。
优选的，步骤(4)中，采用改良卡宝品红染色液进行整体预染或滴染。
进一步的，所述整体预染是将试验材料整个放入离心管中滴加染色液，染色时间为6～7h。
所述滴染是试验材料置于载玻片上，加1～2滴染色液，染色时间为5～10min。
本发明的有益效果：
利用本发明的方法对通过“本砧嫁接”保存的优良种质的流苏树染色核型进行分析，结果准确可靠，方法简便，易于操作，对于流苏树种质资源的收集、分类、评价和保护具有重要意义。
附图说明
图1：本发明的流苏树取样材料；图中，A：顶芽幼芽状态；B：腋芽幼芽状态。
图2：不同试剂预处理染色体形态图；图中，A：对二氯苯；B：0.002mol/L 8-羟基喹啉；C：对二氯苯与0.002mol/L 8-羟基喹啉1:1混合溶液。
图3：流苏树染色体核型(A)及核型模式图(B)。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分介绍的，由于流苏树的染色体数目较多，且染色体非常小，一般较难观察，所以国内外对于流苏树染色体数目、核型分析的研究的相关报道极少，对于流苏树的染色体核型分析仍然是目前的技术难点所在。
基于此，本发明的目的在于提供一种流苏树的染色体核型分析方法。对于染色体核型分析而言，其染色体制片一般包括：取材、预处理、固定、解离、染色、压片和镜检的步骤，但这并不意味着通过上述步骤得到的染色体制片都能够用于染色体核型分析，因为植物种类、取材部位、取材时间、预处理液的种类和浓度、预处理时间、解离的时间及方法、染色时间等都会影响制片的成败；若某一或某些条件设置或处理不当，都可能会造成染色体制片的中期分裂相所占比例过小、染色体重叠、染色体扭曲、断裂、染色体背景不清晰、存在过多杂质等问题，导致染色体核型分析失败。
对于不同树种和不同取材部位来说，其染色体制片难易程度也不相同。对于一些染色体较大、染色体数目较少的树种来说，染色体较容易观察，如银杏、黑松、赤松等裸子植物，其染色体制片也相对容易。但是，流苏树的染色体数目较多，染色体较小(最小仅有零点几微米)，其制片技术存在一定的挑战和难度。由于流苏树的染色体数目较多，制片时染色体不容易分散，且易造成染色体堆集重叠，形态难以辨，或出现染色体不在同一平面的情况；同时染色体较小，观察较为困难，因此对于流苏树取材和制片操作都有着较高的要求。
针对流苏树染色体核型分析所存在的技术难点，发明人主要做了如下技术改进和创新：
第一，对于取材，适时取材是流苏树染色体标本制备的一个重要环节，如取材不当(包括取材部位和取材时间)，即使后续工作做的再到位，也很难观察到具有多分裂相的细胞，因此，取材是染色体制片的一个关键步骤。选取具有分生组织的实验材料，往往能够给实验带来事半功倍的效果。原则上可进行细胞分裂的分生组织和单个细胞均可作为染色体制片的材料，一般常用的材料为种子初生根尖、茎尖、幼小花蕾等。其中初生根尖因取材方便，不受季节限制而被广泛采用，但此种取材方式有一定的局限性，原因是种子与其植株的基因型，甚至染色体数目出现不一致，若对己知品种或特定品种进行细胞及分子层面的研究，则利用种子作为供试材料不可取。流苏树花期较短，为一周左右，取用花蕾为供试材料受时间限制较大。
本发明选择流苏树植株的幼芽作为试验材料。芽是尚未发育成长的枝或花的雏体，按芽着生的位置不同可分为顶芽、腋芽和不定芽。着生在枝条顶端的芽是顶芽，每一枝条的顶端都有顶芽；着生在叶腋处的是腋芽，一般每一叶腋只生一个芽，也有的植物可生几个芽；生于其它部位的芽是不定芽。本发明取材的幼芽主要为顶芽和腋芽(图1)。本发明选取芽为试验材料较茎尖取材范围相对较广，且流苏树芽的生长期为4～8月份，取材时间较长受季节限制相对较小，同时相对于愈伤组织，选用芽作为试验材料，中期分裂相较多，较容易观察到合适的染色体细胞。
另外，不同植物细胞染色体的分裂高峰期的时间会有所差异。本发明研究发现，流苏树在晴朗的天气上午9：30～10：30或下午14：30～15：30存在分裂高峰期，有近45％的细胞处于分裂中期，有利于筛选分散良好的流苏树染色体用于核型分析。
第二，对于预处理，在染色体制片中对材料进行预处理主要是阻断纺锤体的形成，使细胞分裂终止在中期阶段，可提高中期分裂相的出现频率。由于植物不同物种之间的差异性，不同植物所适合的预处理液一般不同。预处理所采用的处理液主要有：饱和对二氯苯溶液、0.002mol/L的8-羟基喹啉溶液，其中，对二氯苯是一种化学诱变剂，其可以降低细胞质的粘滞性，使染色体易于分散；8-羟基喹啉的主要作用是使中期的染色体在赤道面上保持其相应的位置，且作用比较缓和，药力稳定。在进行预处理时，对二氯苯和8-羟基喹啉一般是单独使用的，很少见有将对二氯苯和8-羟基喹啉混合使用的报道。本发明在研究单一试剂对试验的影响的同时也探讨了混合处理试剂对染色体制片的影响。结果表明，使用对二氯苯饱和液处理，可使染色体分散较好，尤其适合染色体计数(图2A)；0.002mol/L8-羟基喹啉溶液处理后，染色体显示缢痕清晰，但细胞中期分裂相较少，且染色体过长(图2B)；对二氯苯与8-羟基喹啉1:1混合溶液处理的染色体兼具两种试剂的共同优点，染色体分散良好且缢痕清晰(图2C)。
本研究的主要目的和创新是提供一种基于幼芽的流苏树染色体核型分析方法，对流苏树嫁接的不同种质进行核型分析，以便克服常规核型分析技术在流苏树嫁接繁育的不同种质染色体分析方面的局限性。常见的预处理试剂有秋水仙素、对二氯苯、8-羟基喹啉、放线菌酮、α-溴奈等，现有预处理液的组合搭配使用可以满足大多数植物的染色体预处理，新的预处理试剂或其他对植物染色体预处理具有辅助效果的物质的发现需要进行大量的探索与实验，所消耗的时间和精力也是巨大的，这是一个缓慢探索发现的过程，因此暂时还未筛选出其他预处理效果更好的新试剂，本研究会在后期不断地实验与探索中寻求此方面的突破。
另外，预处理的时间也是关键所在，预处理时间过短，则染色体收缩不好，难以观测；时间太长，则染色体浓缩太大，难以进行核型分析。因此，针对不同的物种的预处理时间，需要进行大量的试验摸索。研究发现，对于流苏树而言，预处理时间为4～6h时，其处理效果较优，染色体形态稳定，便于进行核型分析。
第三，对于解离，植物细胞含细胞壁和果胶等物质影响压片的效果，因此需要解离除去果胶，并软化细胞壁。本发明在直接使用1mol/LHCl溶液60℃解离流苏树幼芽时发现，细胞核膨胀较小，染色体不易分散。针对这种情况，本发明创新性的在解离之前采用0.075mol/L KCl溶液进行前低渗处理，结果发现，0.075mol/L KCl溶液能够使细胞核充分膨胀，便于染色体铺展，减少染色体堆积重叠的现象。
另外，解离时间不宜过短也不宜过长，解离时间过短细胞不易压片，所得细胞不在同一平面；时间过长细胞破碎，染色体丢失。研究发现，对流苏树解离处理13-15min，其解离效果较优。
综上，针对流苏树染色体数目多、染色体较小、难以进行染色体核型分析的难题，本发明通过对取材、预处理和解离等步骤的优选和创新，使制备的细胞染色体制片具有较多的中期分裂相，染色体分散而不重叠，染色体不扭曲、断裂，主缢痕、随体清晰。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
实施例1：
(1)取材：
5～8月份，流苏树芽开始生长时，于晴朗的天气上午9：30～10：30或下午14：30～15：30取植株幼芽，剥去芽鳞，野外操作时注意保持材料的干净。
(2)预处理：
将采集的材料立即放入盛有对二氯苯与8-羟基喹啉1：1混合处理液的青霉素小瓶中，避光处理，预处理时间为4～6h，预处理温度不宜过高。
(3)固定：
预处理结束后，将材料用蒸馏水冲洗3～5次，然后转移到卡诺固定液(无水乙醇：冰乙酸＝3：1)中，室温条件下固定10～24h，固定后如不立即使用，可移入4℃冰箱中保存，保存时间不宜过长，一般不超过40d。
(4)解离：
将固定的材料取出，用蒸馏水冲洗干净后，转移至0.075mol/LHCl溶液中前低渗20min，取出后冲洗3～5次，放入预热60℃的1mol/L HCl溶液中解离13～15min。
(5)染色：
解离后的材料用蒸馏水冲洗3～5次后，采用改良卡宝品红染色液染色，可整体预染或滴染。整体预染是将材料整个放入1.5ml离心管中滴加染色液，染色时间为6～7h；滴染时，取材料置于载玻片上，加1～2滴染色液，染色时间为5～10min，材料不宜过多。
(6)压片：
将处理后的材料置于干净的载玻片上，滴加1～2滴改良卡宝品红染色液5～10min，加盖玻片，按住盖玻片对角防止滑动，用解剖针轻轻敲击尽量赶走气泡，并使细胞分散，便于观察。
(7)镜检：
电子显微镜100x油镜下镜检拍照。选取染色体分散良好的中期分裂细胞，统计30个以上清晰细胞进行染色体计数，挑选5个进行核型分析，结果见图3。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种基于幼芽的流苏树染色体核型分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取流苏树植株的幼芽作为试验材料，放入由对二氯苯和8-羟基喹啉组成的混合处理液中，在避光条件下进行预处理；
(2)将预处理后的试验材料用蒸馏水冲洗后放入卡诺固定液中，固定10～24h；
(3)将固定后的试验材料用蒸馏水冲洗后，转移至0.075mol/L KCl溶液中进行前低渗处理；将前低渗处理后的试验材料用蒸馏水冲洗后放入1mol/L HCl中，60℃水浴解离13～15min；
(4)将解离后的试验材料用蒸馏水冲洗后，采用染色液进行染色；
(5)对染色后的试验材料进行压片和镜检。
2.根据权利要求1所述的流苏树染色体核型分析方法，其特征在于，步骤(1)中，在5～8月份于晴朗的天气上午9：30～10：30或下午14：30～15：30，取流苏树植株的顶芽和腋芽作为试验材料。
3.根据权利要求1所述的流苏树染色体核型分析方法，其特征在于，步骤(1)中，所述混合处理液由饱和对二氯苯溶液和0.002mol/L 8-羟基喹啉溶液按体积比1:1混合配制而成。
4.根据权利要求1所述的流苏树染色体核型分析方法，其特征在于，步骤(1)中，所述预处理的时间为4～6h。
5.根据权利要求1所述的流苏树染色体核型分析方法，其特征在于，步骤(3)中，前低渗处理时间为20min。
6.根据权利要求1所述的流苏树染色体核型分析方法，其特征在于，步骤(4)中，采用改良卡宝品红染色液进行整体预染或滴染。
7.根据权利要求6所述的流苏树染色体核型分析方法，其特征在于，所述整体预染是将试验材料整个放入离心管中滴加染色液，染色时间为6～7h。
8.根据权利要求6所述的流苏树染色体核型分析方法，其特征在于，所述滴染是试验材料置于载玻片上，加1～2滴染色液，染色时间为5～10min。
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