CN101482515A

CN101482515A - 一种刺槐属茎尖染色体的压片方法

Info

Publication number: CN101482515A
Application number: CNA2009100677694A
Authority: CN
Inventors: 黄建全; 张娜; 朱延林; 田淑芬; 刘建华; 苗博瑛
Original assignee: Tianjin Forestry and Fruit Tree Institute
Current assignee: Tianjin Forestry and Fruit Tree Institute
Priority date: 2009-01-22
Filing date: 2009-01-22
Publication date: 2009-07-15

Abstract

本发明提供了一种刺槐属茎尖染色体的压片方法，包括取材、预处理、固定、解离、压片、染色、敲打、镜检等步骤，其特点是在培养室温度22－25℃时，于下午3－4时采取长势旺盛的刺槐组培苗的茎尖，这时的细胞处于分裂旺盛期；预处理采用8－羟基喹啉0.002－0.004M处理3－5小时；用十字压片法压片；卡宝品红染色；用铅笔头敲打材料，使细胞尽量分散均匀。本发明的压片方法，操作容易，制片效率高，节省药物消耗，染色体分散均匀，易计数，很容易观察到染色体的中期分裂相，染色均匀清晰，特别适用于材质坚韧的林木材料的染色体压片。

Description

一种刺槐属茎尖染色体的压片方法

技术领域

本发明属于植物鉴定技术领域，涉及林木茎尖染色体压片的方法。特别适用于像刺槐属等材质坚韧、分生组织细胞质和细胞间的果胶质含量丰富的林木茎尖染色体的压片。

背景技术

生物的许多性状都是由基因控制的，而基因主要是在细胞核内的染色体上。因此，染色体发生形态结构或数量上的变化，都必然会引起生物的性状发生变异。远缘杂交、辐射育种，单倍体育种、多倍体育种等是作物育种的重要途径之一，而鉴别其后代是否真正的远缘杂种，属何种变异类型等，通过对染色体的遗传行为的分析，又是较为准确和普遍的重要方法。因此，对植物细胞进行制片来观察染色体，是研究、识别生物遗传及变异类型的重要手段和技术。研究表明染色体压片法是观察植物染色体最常用的方法，也是研究染色体组型、染色体分带、染色体畸变和姊妹染色单体交换的基础。

有丝分裂期在整个细胞周期中所占的时间相对较短，有丝分裂制片的主要目的是进行染色体鉴定，希望观察到更多分裂相，尤其是分裂中期相，通常要对材料进行不同的预处理。预处理主要通过抑制和破坏纺锤丝的形成来获得更多的中期分裂相；同时，预处理还可改变细胞质的粘度，促使染色体缩短和分散，便于压片和观察。常用的预处理有物理法、化学法、混合处理法等。

植物细胞的细胞壁对细胞形态和结构起支撑和保护作用，分生组织的细胞壁结构将分生细胞结合成一个整体，因此在压片之前需要采用适当方法软化或部分分解细胞壁、除去细胞之间的果胶层使细胞间易于分离，这一操作称为解离。同时，解离也可适当清除部分细胞质，使细胞质背景趋于透明化，便于观察染色体。

植物细胞分裂周期的长短不尽相同，通常在十到几十小时之间，温度明显地影响细胞分裂周期，同时不同植物有丝分裂高峰时间不尽相同。要经多次试验才能掌握某一植物有丝分裂高峰期，以便得到更多的处于分裂中期的细胞。

根尖与茎尖是有丝分裂的高发部位，根尖由于取材方便，是观察植物染色体最常用的材料。由于茎尖不好获得，且茎尖组织不易解离，较难制片。材质坚韧的林木茎尖更难被解离，解离时间短，细胞不能很好的分散开；解离时间长，染色体会受到破坏。目前根尖是制作染色体压片的常用材料，应用于刺槐属的茎尖制作染色体压片的方法很少有文献报道。

发明内容

本发明的目的在于针对上述利用茎尖制作染色体压片的缺点与不足，提供一种刺槐属茎尖染色体的压片方法。用于对不易解离的茎尖制备染色体压片。

本发明的方法特别适用于像刺槐属等材质坚韧、分生组织细胞质和细胞间的果胶质含量丰富的林木茎尖染色体压片。

本发明所述的刺槐属包括：二乔刺槐、8044、8048、83002、3-I、金叶刺槐、韩国四倍体、匈牙利四倍体、长叶刺槐等品种。

本发明的取材使用组织培养苗，通过压片和敲打使材料尽量分散。植物细胞分裂周期的长短不尽相同，通常在十到几十小时之间，温度明显地影响细胞分裂周期，同时不同植物有丝分裂高峰时间也不尽相同。

为实现上述目的本发明提供如下的技术方案：

一种刺槐属茎尖染色体的压片方法，该方法包括如下步骤：

(1)取材：将组织培养的刺槐幼苗茎尖，自茎尖处切取3-5毫米；

(2)预处理：将茎尖放到0.002-0.004M8-羟基喹啉中，处理3-5小时；

(3)固定：用卡诺氏固定液固定24小时；

(4)解离：从固定液中取出刺槐茎尖，用蒸馏水漂洗，再放到1N HCl中，在60℃水浴中解离6-8分钟；解离的目的是使分生组织细胞间的果胶质分解，细胞壁软化或部分分解，使细胞分散开呈单个分布，细胞质呈透明状，使染色体更好的被观察，染色体也容易被分散压平，更好计数。

(5)压片：用蒸馏水漂洗解离后的材料，将材料移至清洁的载玻片上，用刀片自茎尖处切取1毫米左右，以十字压片法覆以载玻片，然后分开两玻片。其中所述的十字压片法指的是两个载玻片呈十字交叉、垂直放置，这样便于将两个载玻片分开，分开后的两个载玻片上都有材料，可以制成两张片子，目的是让材料尽量分散，便于观察。

(6)染色：在两玻片上各滴1-2滴卡宝品红染液进行染色，20-30分钟后加上盖玻片，用吸水纸吸去多余的染液；

(7)敲打：在盖玻片上覆一层吸水纸，然后敲打1-2分钟；

(8)镜检：先在低倍镜下寻找有分裂相的视野，再用高倍镜仔细观察、记数或拍照。

本发明所述的刺槐幼苗为生长旺盛的刺槐组培苗。当培养室温度在22—25℃时，下午3—4时刺槐组培苗的细胞处于分裂旺盛期。

本发明所述的步骤(3)从预处理液转到固定液之前用蒸馏水漂洗3-5次。

本发明所述的步骤(4)中解离前将材料用蒸馏水漂洗3-5次。

本发明所述的步骤(7)中的敲打是指用带橡皮头的铅笔垂直敲打盖玻片。

本发明所述的方法可用于刺槐属等材质坚韧、分生组织细胞质和细胞间的果胶质含量丰富的林木茎尖染色体压片。主要是因为材质坚韧的林木分生组织细胞间的果胶质含量丰富，用HCL解离的时间短，不易将果胶质分解，致使细胞粘连在一起，不易解离，在显微镜下观察不到染色体；用HCL解离的时间长，染色体会受到损坏，导致染色体着色浅、不完整。而刺槐属等材质坚韧的林木需要解离很长时间，细胞才会呈单个分布，这样染色体就遭到严重损坏。

本发明详细的刺槐属茎尖染色体压片方法包括如下步骤：

1.取材：组织培养室温度在22—25℃时，于下午3—4时采取组织培养的刺槐幼苗茎尖，用镊子将茎上的叶片及叶柄去除，自茎尖处切取3-5毫米。

2.预处理：将茎尖放到8-羟基喹啉0.002-0.004M中，处理3-5小时。

3.固定：将从预处理液中取出的茎尖用蒸馏水冲洗3—5次，放入固定液中固定24小时。如不立即进行压片，可将固定材料转入70％酒精中，在4℃冰箱中保存，保存时间最好不超过二个月。所述的固定液为卡诺氏固定液，即用3份无水酒精，加入1份冰醋酸(现配现用)。

4.解离：将从固定液中取出的茎尖用蒸馏水冲洗3—5次，再放到1N HCl中，在60℃水浴中解离6-8分钟。

5.压片：用蒸馏水漂洗解离后的材料，移至清洁的载玻片上，用刀片自茎尖处切取1毫米左右，以十字压片法覆以载玻片，用拇指用力下压使细胞充分分散(不要使盖片移动)，分开两玻片。

6.染色：各滴1-2滴染液进行染色。染色20-30分钟后加上盖玻片，注意不要产生气泡，用吸水纸吸去多余的染液。所述的染色液为卡宝品红染色液，其配制方法如下：

1)原液A：称取3g碱性品红(Basic fuchsin)溶于100ml70％乙醇中(可永久保存)；

2)原液B：取10ml原液A加入90ml5％的苯酚水溶液，在37℃条件下温育2-4h(该溶液不稳定，应在2周内使用)；

3)原液C：取55ml原液B加入6ml冰乙酸和6ml甲醛，充分混匀；

4)卡宝品红染液：取10-20ml原液C加入约80ml45％的冰乙酸和1g山梨醇(可永久保存)。

7.敲打：在盖玻片上覆一层吸水纸，用带橡皮头的铅笔垂直敲打(注意勿使玻片搓动)1-2分钟，使材料分散压平，便于观察。

8.镜检：先在低倍镜下寻找有分裂相的视野，再用高倍镜仔细观察、记数或拍照。调节可调节可变光栏与反光镜，使光线明暗合适，视场亮度适中。

本发明方法制作的染色体压片具有如下优点：

1.可操作性好，重复度高。

2.使染色体压片中处于分裂中期的细胞多。

3.可解决材质坚韧林木的茎尖染色体压片中材料的难解离、细胞不呈单个分布的问题。

4.使染色体压片中的染色体分散均匀、容易计数。

5.染色均匀清晰，可解决材质坚韧林木的茎尖染色体压片中染色体染色颜色浅、染色体不完整等问题。

附图说明

图1刺槐组织培养苗茎尖染色体压片，解离6-8分钟，细胞呈单个分布，处于分裂中期的众多细胞中期分裂相。

图2刺槐组织培养苗茎尖染色体压片，处于分裂前期的细胞和处于分裂中期姊妹染色单体成对存在的细胞。

图3刺槐组织培养苗茎尖染色体压片，处于分裂中期姊妹染色单体成对存在的细胞。

图4、图5刺槐组织培养苗茎尖染色体压片，处于分裂中期，姊妹染色单体已经分开，将要被拉向两极的细胞。

图6、图7刺槐大田苗茎尖染色体压片，解离30分钟，细胞连在一起，不呈单个分布，大多处于细胞分裂间期，处于分裂中期的细胞少。由于组织不易解离，解离的时间长，染色体受到破坏。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，实施例仅为解释性的，决不意味着它以任何方式限制本发明的范围。

其中卡宝品红染色液，其配制方法如下：1)原液A：称取3g碱性品红(Basicfuchsin)溶于100ml70％乙醇中(可永久保存)；2)原液B：取10ml原液A加入90ml5％的苯酚水溶液，在37℃条件下温育2-4h(该溶液不稳定，应在2周内使用)；3)原液C：取55ml原液B加入6ml冰乙酸和6ml甲醛，充分混匀；4)卡宝品红染液：取10-20ml原液C加入约80ml45％的冰乙酸和1g山梨醇。

实施例1

二乔刺槐组培苗茎尖染色体压片

本例以二乔刺槐组培苗茎尖为样本来制备茎尖染色体压片，具体包括如下步骤：

1.茎尖的取材：组织培养室温度为25℃，于下午3时采取组织培养的二乔刺槐幼苗茎尖，用镊子将茎上的叶片及叶柄去除，自茎尖处切取3-5毫米。

2.茎尖的预处理：将茎尖放到8-羟基喹啉0.0035M中，处理3小时。

3.茎尖的固定：用镊子将茎尖从预处理液中取出，用蒸馏水冲洗3-5次，将茎尖放入固定液中固定24小时。

4.茎尖的解离：用镊子将茎尖从固定液中取出，用蒸馏水冲洗3-5次，再放到1NHCl中，在60℃水浴中解离6分钟。

5.茎尖的压片：用镊子将茎尖从1NHCl中取出，用蒸馏水冲洗3-5次，用镊子将茎尖移至清洁的载玻片上，用刀片自茎尖处切取1毫米左右，以十字压片法覆以载玻片，用拇指用力下压使细胞充分分散，分开两载玻片。

6.染色：在两载玻片有材料的地方各滴1-2滴卡宝品红染液进行染色。染色20分钟后加上盖玻片。

7.敲打：在盖玻片上覆一层吸水纸，用带橡皮头的铅笔垂直敲打1分钟；使材料分散压平，便于观察.

8.镜检：先在低倍镜下寻找有分裂相的视野，再用高倍镜仔细观察、记数或拍照。调节可调节可变光栏与反光镜，使光线明暗合适，视场亮度适中，其结果详见图1-4。

实施例2

二乔刺槐组培苗茎尖染色体压片

1.茎尖的取材：组织培养室温度为22℃，于下午4时采取组织培养的二乔刺槐幼苗茎尖，用镊子将茎上的叶片及叶柄去除，自茎尖处切取3-5毫米。

2.茎尖的预处理：将茎尖放到8-羟基喹啉0.0025M中，处理5小时。

4.茎尖的解离：用镊子将茎尖从固定液中取出，用蒸馏水冲洗3-5次，再放到1NHCl中，在60℃水浴中解离8分钟。

5.茎尖的压片：用镊子将茎尖从1N HCl中取出，用蒸馏水冲洗3-5次，用镊子将茎尖移至清洁的载玻片上，用刀片自茎尖处切取1毫米左右，以十字压片法覆以载玻片，用拇指用力下压使细胞充分分散，分开两载玻片。

6.染色：在两载玻片有材料的地方各滴1-2滴卡宝品红染液进行染色。染色30分钟后加上盖玻片，用吸水纸吸去多余的染液。

7.敲打：在盖玻片上覆一层吸水纸，用带橡皮头的铅笔垂直敲打1分钟，使材料分散压平，便于观察。

8.镜检：先在低倍镜下寻找有分裂相的视野，再用高倍镜仔细观察、记数或拍照。调节可调节可变光栏与反光镜，使光线明暗合适，视场亮度适中，其结果详见图5。

在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受说明书中所举实例实施方式的限制。

Claims

1、一种刺槐属茎尖染色体的压片方法，该方法包括如下步骤：

(1)取材：采取组织培养的刺槐幼苗茎尖，自茎尖处切取3-5毫米；

(3)固定：用卡诺氏固定液固定24小时；

(4)解离：从固定液中取出刺槐茎尖，用蒸馏水漂洗，再放到1N HCl中，在60℃水浴中解离6—8分钟；

(5)压片：用蒸馏水漂洗解离后的材料，将材料移至清洁的载玻片上，用刀片自茎尖处切取1毫米左右，以十字压片法覆以载玻片，然后分开两玻片；

(7)敲打：在盖玻片上覆一层吸水纸，然后敲打1-2分钟；

2、如权利要求1所述的压片方法，其中所述的刺槐幼苗为生长旺盛的刺槐组培苗。

3、如权利要求1所述的压片方法，其中所述的取材为当组织培养室的温度为22-25℃时，于下午3—4时取材；

4、如权利要求1所述的压片方法，其中步骤(3)从预处理液转到固定液之前用蒸馏水漂洗3-5次。

5、如权利要求1所述的压片方法，其中步骤(4)中解离前将材料用蒸馏水漂洗3-5次。

6、如权利要求1所述的压片方法，其中步骤(7)所述的敲打是指用带橡皮头的铅笔垂直敲打盖玻片。

7、如权利要求1所述的压片方法可用于材质坚韧、分生组织细胞质和细胞间的果胶质含量丰富的林木刺槐属茎尖染色体的压片。