CN108267410A - 一种高蛋白质水稻品系的染色体组鉴定方法 - Google Patents

一种高蛋白质水稻品系的染色体组鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种高蛋白质水稻品系的染色体组鉴定方法，包括以下步骤：A.取材；B.预处理；C.前低渗；D.固定；E.酶解；F.后低渗；G.二次固定；H.制片；I.染色体观察。A.取材：上午9点到10点，水稻田中剪取所需材料生长旺盛的根尖0.6‑0.9cm，用清水洗净。B.预处理：把饱和α‑溴萘放入管中，上下摇动，最后吸取下面的澄清作为最后的预处理液体，预处理2～4小时。本发明方法镜检时先在低倍体镜下观察，可见有丝分裂各时期的染色体，然后转换高倍镜观察。

Description

一种高蛋白质水稻品系的染色体组鉴定方法
技术领域
本发明涉及分子生物学遗传育种技术领域，特别涉及一种高蛋白质水 稻品系的染色体组鉴定方法。
背景技术
大米中各种营养素含量虽不是很高，但因人们食用量大，故其也具有 很高营养功效，是补充营养素的基础食物，是人类的主食之一，据现代营 养学分析，大米含有蛋白质，脂肪，维生素B1、A、E及多种矿物质，大 米中含碳水化合物75％左右，蛋白质7％-8％，脂肪1.3％-1.8％，并含有丰 富的B族维生素等。
粳米中的碳水化合物主要是淀粉，所含的蛋白质主要是米谷蛋白，其 次是米胶蛋白和球蛋白，其蛋白质的生物价和氨基酸的构成比例都比小麦、 大麦、小米、玉米等禾谷类作物高，消化率66.8％-83.1％，也是谷类蛋白 质中较高的一种，因此，食用大米有较高的营养价值。
水稻育种包含杂交稻育种和常规稻育种，育种目标从高产逐渐转向优 质，因蛋白质含量高低间接影响大米的营养高低，因此选育高蛋白含量的 水稻品种也是一个重要的研发方向；通过染色体组多倍化之后对同源多倍 体水稻和异源多倍体水稻进行更深入地研究则有可能解决产量问题和固 定稻属植物的杂种优势效应问题，由此将进一步完善稻属植物的科学研究 体系。
从物种倍性水平进化和染色体大小的适宜性的理论看，适当增大水稻 基因组，尤其是异源基因组，提高它的倍性水平，不仅将有可能大大提高 水稻产量，而且有可能大大增加它的遗传变异范围和可适应性，大幅度提 高水稻的质量和抗性，为水稻育种提供一个新途径。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种高蛋白质含量的水稻新品 种选育方法，即通过在原有二倍体高蛋白含量水稻品种的基础上，通过进 行染色体加倍，从而选育出蛋白质含量较高的多倍体水稻品系。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种高蛋白质水稻品系的染色体 组鉴定方法，包括以下步骤：
A.取材；
B.预处理；
C.前低渗；
D.固定；
E.酶解；
F.后低渗；
G.二次固定；
H.制片；
I.染色体观察。
A.取材：上午9点到10点，水稻田中剪取所需材料生长旺盛的根尖 0.6-0.9cm，用清水洗净。
B.预处理：把饱和α-溴萘放入管中，上下摇动，最后吸取下面的澄清 作为最后的预处理液体，预处理2～4小时。
C.前低渗：将经过预处理的根尖用蒸馏水冲洗几次。
D.固定：把预处理好的根尖放入新鲜的甲醇∶冰乙酸＝3∶1固定液中， 然后放4℃冰箱保存。
E.酶解：从固定液中取出根尖放入无菌水中，把根尖上的固定液冲洗 干净，然后用刀片切取根尖前部0.3～0.7mm，用滤纸吸干上面的蒸馏水后 放入酶解液中，每个装有酶解液的管中放1-2个根尖，随后放进28℃的恒 温箱。
所述酶解液为2％纤维素酶+2％果胶酶，酶解时间为4.5-5h。
所述酶解液为4％纤维素酶+3％或4％果胶酶，酶解时间为5h。
F.后低渗：用无菌水把根尖上的酶解液冲洗干净。
G.二次固定：把根尖放进固定液中再固定12～18分钟。
本发明有益效果包括：在原有二倍体高蛋白含量水稻品种的基础上， 通过染色体加倍技术诱导成对应的四倍体，基因组含量增加一倍，其染色 体数量的变化决定水稻的品质变化，因此蛋白质含量会比对应的二倍体有 大幅提高，进而筛选蛋白质含量明显提高的稳定品系即选育的蛋白质含量 高的多倍体稳定品系。
具体实施方式
下面结合实施例详述本发明。为使本发明的目的、技术方案及优点更 加清楚、明确，以下举实施例对本发明进一步详细说明，但本发明并不局 限于这些实施例。
在本发明的一实施例中，提供了一种高蛋白质多倍体水稻品系的选育 方法，具体实施步骤为：
A选用优质籼稻或粳稻品系杂交(蛋白质含量≥8％、)，每个品系选择 10个，组成10个组合其中粳稻作母本，籼稻作父本；
剪颖去雄杂交方法：根据父本盛花期时间，安排去雄时间，选取露出 叶鞘2/3-4/5的母本稻穗，剪去剑叶，露出全穗，在阳光下检查穗花发育 情况，除去穗上部已经授粉花(颖花基部有一个小黑影点着为已授粉花，颖 花中部有一较大黑影点者为当天不能开的花，颖花顶端全是黑影者为当天 将开的花、)，基部小穗常不能结实或发育不好，留下中部小穗50-100个(水 稻每一小穗只有一朵花)。留下之花，将花颖上部倾斜剪去，外颖部分应剪 去多些，约三分之一，内颖宜少些，因为内颖切除过多会妨碍子房的发育， 然后用小摄子从切口处伸入将六个雄蕊全部除去(切勿损伤雌蕊)，去雄时， 宜由上部小穗依次而下，以防花药落在下部的小穗上，去雄完毕，即套上 透明纸袋，纸袋下方折密，用回形针夹住。同时剪去其他未去雄的穗子。 授粉时把正在开花的父本穗轻轻剪下2-3个，放入纸袋内用手振动，使花 粉均匀落在母本柱头上。授粉后把套袋口折好用回形针别牢，以免非父本 的花粉落入，同时系上杂交挂牌。杂交后10天应把套袋上端口敞开，以 防霉变，收获时只收剪颖粒。
B将杂交种F1代同对应母本做回交，连续回交3-5代；
回交：同剪颖去雄法；
C将回交3-5代后的杂交种通过组织培养的方法加倍形成多倍体水稻 株；
(1)将杂交种子去壳，挑选胚完整的用于接种；
(2)将种子按照如下程序进行消毒：无菌水清洗3-5次，75％的乙醇 消毒1.5min，之后用17％-20％次氯酸钠消毒45min(时间可以适当调整)， 再用无菌水清洗5次，每次3min。然后将水稻种子转移至无菌纸上，吸 干种子表面的水份并在超净工作台中彻底吹干，接种到愈伤诱导培养基上， 每个培养皿接种20-30粒种子；
(3)将接种有水稻种子的培养皿置于恒温箱中光照培养，温度设置 为28℃，光周期为16h光照，8h黑暗，定期观察统计愈伤组织诱导情况； 10-15d左右时，将诱导出的结构疏松、颜色浅而透明的橙黄愈伤组织切下 来，转移到新的培养基上进行继代培养，一个培养皿中放置15-20块，培 养条件同诱导培养；
(4)15d后，将继代出的愈伤组织进行第二次继代培养，继代时间 为7-10d。之后用灭菌的NB液体培养基+秋水仙素浸泡，500mg/L秋水仙 素，在70转/分摇床上浸泡48h。
(5)诱导后的材料从摇床上取出，在无菌环境下无菌钢网滤过，无 菌水冲洗三次，每次大于等于3min，置于无菌纸上吹干1h左右，再次接 种到继代培养基上恢复愈伤活性并淘汰褐化愈伤，7-10天时接到含有分化 培养基的培养瓶中，一个培养瓶中放置3-4块，将接有愈伤组织的分化培 养基置于光照箱中培养，光照时间16h，黑暗8h，温度设置为28℃；。
(6)将分化培养基中已长4-5cm的苗接到生根培养基上；一个培养 瓶中放置2-3颗苗；
(7)将接有苗的生根培养基置于光照箱中培养，光照时间16h，黑 暗8h，温度设置为28℃，定期观察统计苗的生长状况，待苗长根并且有 3叶一心时，进行炼苗、移栽到大田。
D对形成的多倍体水稻株进行育种学特征选择，同时鉴定染色体倍数： 以染色体组鉴定技术确定多倍体新种质的染色体组型(2n＝4x＝48)；
染色体组鉴定技术：
取材：上午9点到10点(此时细胞分裂旺盛，中期分裂相多)，水稻 田中剪取所需材料生长旺盛的根尖(大约0.5-1cm，用清水洗净)。
预处理：根尖经过预处理可以抑制纺锤体形成，使细胞分裂停止在中 期阶段，从而获得较多的中期分裂相，有4种预处理办法：一是把洗净的 根尖放入冰水混合物中，然后在4℃冰箱放置24小时；二是用0.05％-0.2％ 的秋水仙素处理根尖，大约3小时；三是用0.002-0.004的8-羟基喹啉处 理根尖，(0.002低温4℃处理4h)(大约3小时)；四是用饱和α-溴萘预处 理(把饱和α-溴萘放入管中，上下摇动，最后吸取下面的澄清作为最后的 预处理液体)，大约3小时。
前低渗：将经过预处理的根尖用蒸馏水冲洗几次。
固定：把预处理好的根尖放入新鲜的固定液(甲醇∶冰乙酸＝3∶1) 中，然后放4℃冰箱，可以保存半年。
酶解：从固定液中取一定数量的根尖放入无菌水中，把根尖上的固定 液冲洗干净，然后用刀片切取根尖前部大约0.5mm(根尖留取太长，不利 于根尖吸收酶解液，以致影响解离效果，同时也会使后面的涂片杂质较多， 背景不清晰)，用滤纸吸干上面的蒸馏水后放入酶解液中，每个装有酶解 液的管中放1-2个根尖即可，随后放进28℃的恒温箱。针对不同的材料， 酶解液的浓度和酶解时间也不同。2％纤维素酶+2％果胶酶，时间大约 4.5-5h；4％纤维素酶+3％或4％果胶酶，时间大约5h。
后低渗：用无菌水把根尖上的酶解液冲洗干净。
二次固定：把根尖放进固定液中再固定10多分钟。
制片：取2-3个根尖置于预先清洗好的干净载玻片上，滴半滴固定液 用镊子夹住根尖迅速敲打，若根尖酶解完全，则一敲即碎，且没有残余的 表皮。分散敲打，使染色体散开，玻片的两个边缘再分别滴一滴固定液， 迅速在酒精灯火焰上烤两下，然后甩掉玻片上的残余液体。
染色体观察
用相差显微镜观察玻片，20倍目镜即可观察到染色体。若用普通显微 镜观察，可以提前用扣染法进行染色，染液可选用卡宝品红。少量玻片扣 染法：将做好的玻片倒扣(有染色体的一面朝下)于一个干净的培养皿中， 从玻片的两边滴卡宝品红染液，大约15min后取出玻片，然后用细微的水 流稍加冲洗，在火焰上烤一下即成，此时应注意接触火焰的一面为无染色 体的一面。
将处理好的材料置于载玻片的中央，用滤纸吸去多余的溶液，加1滴 卡宝品红染色液，用解剖针将材料压碎并染色4-5min，盖上盖玻片，并在 盖玻片上盖一层滤纸，左手固定载玻片，右手用铅笔的橡皮头轻敲盖玻片， 然后用拇指在滤纸上方对材料进行施压，使材料尽量分散；以两指夹持载 玻片的2个长边，在酒精灯外焰上烤，但不能沸腾。镜检时先在低倍体镜 下观察，可见有丝分裂各时期的染色体，然后转换高倍镜观察。
E筛选鉴定为四倍体的植株自交形成稳定的品系，即大田种质约3-5 代至形成稳定的品系；
F对稳定的多倍体水稻品系种子进行蛋白质含量初评；蛋白质含量测 定方法如下：
1.标准曲线的制作：
取6只10ml刻度试管，编号，按下表数据配制牛血清白蛋白标准溶 液。准确吸取上述各管溶液0.1ml，对应放于另外6支10ml刻度试管中， 加入5ml考马斯亮兰G-250溶液，盖塞，将试管中溶液给向倒转混合，放 置2分钟后，用10mm光径的比色杯在595nm波长下比色。以光密度值为 纵坐标，以蛋白质浓度值为横坐标，制作出标准曲线。
2.样品中蛋白质提取：
(1)准确称取稻米粉0.5克，放入研钵中，加2ml0.1mol/LNaOH， 研磨成匀浆，转入到10ml离心管中，再用6ml 0.1mol/LNaOH分三次洗涤 研钵，洗液一并转入10ml离心管中，
用玻棒搅拌，放置30分钟，放置过程间断搅动数次。3500rpm离心 15分钟，上清液转入50ml容量瓶中，用蒸馏水定容到刻度，摇匀，得碱 溶性蛋白。
(2)将上述沉淀用70％乙醇重复提取，操作步骤同上，得醇溶性蛋 白。
3.测定：
吸取提取液0.1ml，放入10ml具塞刻度试管中，加5ml考马斯亮兰 G-250试剂，混匀，放置2分钟，用10mm光径的比色杯在595nm波长下 比色(比色空白用0.1ml蒸馏水代替提取液与5ml考马斯亮兰G-250试剂 混合)，记录OD值。然后根据所测OD595nm在标准曲线上查出所对应的 蛋白质浓度(C)。
4.结果计算：
蛋白质含量(％)＝查表所得蛋白质浓度(ug/ml)×提取液总体积(ml) /样品重(g)×106
G选取蛋白质含量高于10％的优质水稻品系种植，即为高蛋白多倍体 稳定品系新品种。
在本发明另一实施例中，提供了一种高蛋白质水稻品系的选育方法， 通过在原有二倍体高蛋白含量水稻品种的基础上，通过染色体加倍技术诱 导成对应的四倍体，进而筛选蛋白质含量明显提高的稳定品系。
所述高蛋白质水稻品系的选育方法，优选包括以下步骤：
A选用蛋白质含量≥8％的籼稻或粳稻品系杂交，其中粳稻作母本， 籼稻作父本；
B将杂交种F1代同对应母本做回交，连续回交3-5代；
C将回交3-5代后的杂交种通过组织培养的方法加倍形成多倍体水稻 株；
D对形成的多倍体水稻株进行育种学特征选择，同时鉴定染色体倍数： 以染色体组鉴定技术确定多倍体新种质的染色体组型；
E筛选鉴定为四倍体的植株自交形成稳定的品系：大田种植3-5代至 形成稳定的品系。
所述步骤A或步骤B可以进一步包括：根据父本盛花期时间，安排 去雄时间，选取露出叶鞘2/3-4/5的母本稻穗，剪去剑叶，露出全穗，在 阳光下检查穗花发育情况，除去穗上部已经授粉花。
判断穗上部已经授粉花的方法可以为：颖花基部有一个小黑影点者为 已授粉花；颖花中部有一较大黑影点者为当天不能开的花；颖花顶端全是 黑影者为当天将开的花。
所述步骤A或步骤B可以进一步包括：留下之花，将花颖上部倾斜 剪去，外颖部分应剪去1/3～2/5，内颖部分应剪去1/4～1/5；然后在不损伤 雌蕊的前提下从切口处伸入将六个雄蕊全部除去。
所述步骤A或步骤B可以进一步包括：去雄时，由上部小穗依次而 下，防止花药落在下部的小穗上；去雄完毕，即套上透明纸袋，纸袋下方 折密，用回形针夹住；同时剪去其它未去雄的穗子。
所述步骤A或步骤B可以进一步包括：授粉时把正在开花的父本穗 小心剪下2-3个，放入纸袋内用手振动，使花粉均匀落在母本柱头上；授 粉后把套袋口折好用回形针别牢，以免非父本的花粉落入，同时系上杂交 挂牌。
所述步骤A或步骤B可以进一步包括：杂交后9～12天把套袋上端口 敞开，防止霉变，收获时只收剪颖粒。
所述步骤C优选进一步包括：
(1)种子消毒；
(2)光照培养；
(3)继代培养；
(4)分化培养；
(5)生根培养；
(6)炼苗移栽；
(7)多倍体高蛋白质水稻田间鉴定。
在本发明再一实施例中，还提供了一种如前述任一项高蛋白质水稻品 系的选育方法培育的高蛋白质水稻。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种高蛋白质水稻品系的染色体 组鉴定方法，包括以下步骤：
A.取材；
B.预处理；
C.前低渗；
D.固定；
E.酶解；
F.后低渗；
G.二次固定；
H.制片；
I.染色体观察。
A.取材：上午9点到10点，水稻田中剪取所需材料生长旺盛的根尖 0.6-0.9cm，用清水洗净。
B.预处理：把饱和α-溴萘放入管中，上下摇动，最后吸取下面的澄清 作为最后的预处理液体，预处理2～4小时。
C.前低渗：将经过预处理的根尖用蒸馏水冲洗几次。
D.固定：把预处理好的根尖放入新鲜的甲醇∶冰乙酸＝3∶1固定液中， 然后放4℃冰箱保存。
E.酶解：从固定液中取出根尖放入无菌水中，把根尖上的固定液冲洗 干净，然后用刀片切取根尖前部0.3～0.7mm，用滤纸吸干上面的蒸馏水后 放入酶解液中，每个装有酶解液的管中放1-2个根尖，随后放进28℃的恒 温箱。
所述酶解液为2％纤维素酶+2％果胶酶，酶解时间为4.5-5h。
所述酶解液为4％纤维素酶+3％或4％果胶酶，酶解时间为5h。
F.后低渗：用无菌水把根尖上的酶解液冲洗干净。
G.二次固定：把根尖放进固定液中再固定12～18分钟。
选取本身蛋白含量高的优质粳稻和籼稻杂交，利用杂种优势和多倍体 效应，从而选取蛋白含量高的多倍体品系，这为优质多倍体水稻品种选育 提供了一个新的途径，并且经过这种方法培育的多倍体品系蛋白质含量平 均提高30％左右，达到蛋白含量高品种标准(大于10％)。
杂交水稻具有杂种优势效应，这种优势效应不仅表现在产量上，也体 现在稻米品质上，因此杂交种本身就具有父母本二者的优势，再通过与母 本的回交3-5代可形成稳定二倍体品系，之后通过染色体加倍技术诱导成 对应的四倍体，基因组含量增加一倍，其染色体数量的变化决定水稻的品 质变化，因此蛋白质含量会比对应的二倍体有大幅提高，进而筛选蛋白质 含量明显提高的稳定品系即选育的蛋白质含量高的多倍体稳定品系。
以上所述，仅是本发明的几个实施例，并非对本发明做任何形式的限 制，虽然本发明以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本发明，任何 熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，利用上述揭 示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于本发 明技术方案保护范围内。

Claims (10)

1.一种高蛋白质水稻品系的染色体组鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.取材；
B.预处理；
C.前低渗；
D.固定；
E.酶解；
F.后低渗；
G.二次固定；
H.制片；
I.染色体观察。
2.根据权利要求1所述高蛋白质水稻品系的染色体组鉴定方法，其特征在于，进一步包括以下步骤：A.取材：上午9点到10点，水稻田中剪取所需材料生长旺盛的根尖0.6-0.9cm，用清水洗净。
3.根据权利要求1所述高蛋白质水稻品系的染色体组鉴定方法，其特征在于，进一步包括以下步骤：B.预处理：把饱和α-溴萘放入管中，上下摇动，最后吸取下面的澄清作为最后的预处理液体，预处理2～4小时。
4.根据权利要求1所述高蛋白质水稻品系的染色体组鉴定方法，其特征在于，进一步包括以下步骤：C.前低渗：将经过预处理的根尖用蒸馏水冲洗几次。
5.根据权利要求1所述高蛋白质水稻品系的染色体组鉴定方法，其特征在于，进一步包括以下步骤：D.固定：把预处理好的根尖放入新鲜的甲醇∶冰乙酸＝3∶1固定液中，然后放4℃冰箱保存。
6.根据权利要求1所述高蛋白质水稻品系的染色体组鉴定方法，其特征在于，进一步包括以下步骤：E.酶解：从固定液中取出根尖放入无菌水中，把根尖上的固定液冲洗干净，然后用刀片切取根尖前部0.3～0.7mm，用滤纸吸干上面的蒸馏水后放入酶解液中，每个装有酶解液的管中放1-2个根尖，随后放进28℃的恒温箱。
7.根据权利要求6所述高蛋白质水稻品系的染色体组鉴定方法，其特征在于，所述酶解液为2％纤维素酶+2％果胶酶，酶解时间为4.5-5h。
8.根据权利要求1所述高蛋白质水稻品系的染色体组鉴定方法，其特征在于，进一步包括以下步骤：所述酶解液为4％纤维素酶+3％或4％果胶酶，酶解时间为5h。
9.根据权利要求1所述高蛋白质水稻品系的染色体组鉴定方法，其特征在于，进一步包括以下步骤：F.后低渗：用无菌水把根尖上的酶解液冲洗干净。
10.根据权利要求1所述高蛋白质水稻品系的染色体组鉴定方法，其特征在于，进一步包括以下步骤：G.二次固定：把根尖放进固定液中再固定12～18分钟。
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