CN110220904A - 一种基于根尖的尖叶牛樟染色体核型的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于根尖的尖叶牛樟染色体核型分析方法，包括以下步骤：在晴朗的上午采集牛樟组培苗健壮、白嫩的根尖为试验材料，预处理，固定与保存，采用酶解去壁低渗法，经固定、前低渗、酶解、后低渗、涂片获得较佳的染色体标本，其中酶解采用4％纤维素酶和5％果胶酶混合物酶解，吉姆萨染色，镜检；该方法简单易操作，适用于原位PCR、FISH操作的尖叶牛樟染色体核型分析方法，为牛樟细胞学研究提供技术基础。本发明首次报道了尖叶牛樟的染色体核型分析方法和核型，表明牛樟有24条染色体，核型公式为2n＝2x＝24＝22m+2sm，核型不对称系数55.81％，属于2B类型，属于较原始物种。为尖叶牛樟的起源，演化及遗传育种提供一定理论依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种染色体核型分析方法，具体涉及一种基于根尖的尖叶牛樟染色体核型分析方法，属于树木细胞学研究技术的领域。
背景技术
牛樟(CinnamomumKanehirae Hay)隶属于樟科樟属，又名黑樟，为中国台湾本土特有常绿阔叶树种。牛樟具有很高的经济价值，根、茎、叶全株可提炼牛樟精油，木材是雕刻家具的上等材料。此外，牛樟是牛樟芝(Antrodiacamphorata) 的唯一宿主，牛樟芝在医学上被称为“药芝之王”，常用来醒酒与缓解疲劳，具有免疫调节、保护肝脏等作用。
有关牛樟的研究起步晚，研究方向单一且以宏观研究为主，主要集中在牛樟的组培快繁、扦插、引种等方面。近几年来，在牛樟分子生物学遗传多态上的研究取得了一些进展。但有关牛樟细胞学上的研究至今仍旧空白。
染色体核型分析主要通过研究其染色体数目及形态特征，反映不同物种或品种之间存在的染色体细胞学差异。不同物种的染色体核型模式在进化的过程中不受外界环境因素干扰和影响，在一定程度上反馈出了其进化的基本特征。因此，植物核型的研究不仅能为种间遗传变异、系统演化以及亲缘关系提供证据，而且还可以为杂交育种选育及杂种后代鉴定等提供理论依据。
樟科植物核型的研究已取得些进展，已报道过核型研究的樟科植物共有42 种，主要类型为“1A”,“1B”“2A”“2B”四种类型，属于较为原始的类型；且染色体基数均为12，但染色体数目和倍性不同。至今，有关牛樟的染色体核型分析的研究仍未见报道。因此，本研究以尖叶牛樟为材料，对其染色体制片技术进行优化并对其进行核型分析，为牛樟的演化、进化特征和遗传规律的研究提供重要的细胞学佐证。
发明内容
针对目前尖叶牛樟的染色体核型分析方法、染色体数目、核型等还未见报道且牛樟的基础研究起步晚、薄弱的现状。本发明提供了一种基于根尖的尖叶牛樟染色体核型分析方法，该方法不仅能得到清晰可利于核型分析的染色体，还适用于后期原位PCR、FISH等基因定位的研究。为牛樟的起源，演化及遗传育种提供一定的理论依据和技术基础。
本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的：
S1:取材
在晴朗的上午9：00-11:00采集牛樟组培苗健壮、白嫩的根尖(0.5-1cm)； S2：预处理
把刚采集的茎尖进行预处理；
S3:固定与保存
倒掉预处理液，清水冲洗后转入卡诺固定液(无水乙醇∶冰乙酸＝3∶1)，在黑暗4℃环境下固定24h，移弃固定液，直接用来染色体制片，若需保存，把固定过的茎尖依次在75％，90％，95％乙醇溶液各脱水3min，最后保存在75％乙醇中保存备用；
S4:染色体标本制备
(1)前低渗:把S3固定的茎尖置于蒸馏水中进行前低渗30min；
(2)酶解:把步骤(1)的茎尖置于盛有5％纤维素酶和4％果胶酶混合液的1ml 离心管中，并置于37℃的恒温水浴锅中酶解3-5h；
(3)后低渗:吸取酶液，缓缓地沿着管壁加入蒸馏水，后低渗30min；
(4)后固定:吸取蒸馏水，滴加临时配制的固定液(3乙醇：1冰醋酸)，后固定15min；
(5)涂片：把玻片、固定液均置于冰面上，取一张玻片，先滴3滴固定液，再夹取1-2个根尖置于玻片上，用解剖针挑取白白的根尖分生组织，并迅速捣碎再均匀涂抹在载玻片上，再从一端滴加一滴固定液使细胞扩散，接着在火焰上迅速烘烤，自然风干；
S5:染色
将缓冲液(甲液、乙液)与吉姆萨原液按比例配制成工作液，再把干燥的制片置于吉姆萨染色液中染色10-20min，清水冲洗干净，置于烘箱37℃烘干；
S6:镜检
用POTIKA正立显微镜观察，Optika Vision pro拍照系统拍照，在40X物镜下对单位视野面积内处于分裂中期的细胞进行计数，选择30个染色体分散且形态较好的细胞进行染色体数目统计，选取5个染色体形态清晰且无重叠的细胞用Photoshop图像软件进行核型分析。
本发明通过对照实验表明采用0.002mol/L 8-羟基喹啉液的效果最佳，且预处2h能取得较佳的制片效果。结合以往经验，本发明采用的是酶解去壁低渗法来制片，比常规压片法得出的细胞要分散，清晰。且该方法制备的染色体标本有易保存、细胞紧贴玻片、不用盖玻片的特点，能直接为后期原位PCR.FISH等基因定位等技术提供优质的染色体制片。实验证明采用5％纤维素酶和4％果胶酶混合液酶解5h制片效果比较好。
优选的，S1所述的采集的牛樟组培苗出装嫩白根尖，长度为0.5-1cm。
优选的，S2所述的预处理为0.002mol/L 8-羟基喹啉处理2h、饱和对二甲苯处理2h或冰水混合物处理24h，预处理最佳方式为：0.002mol/L 8-羟基喹啉处理2h。
优选的，S4所述的染色体制片方法采用酶解去壁低渗法。
优选的，S4所述的步骤(2)采用纤维素酶和果胶酶酶解的最佳时间为5h。
优选的，S5所述的用吉姆萨染色最佳时间为15min。
优选的，步骤S5所述的甲液为KH2PO4 PH＝6.8缓冲液、乙液为PH＝6.8Na2HPO4缓冲液，甲液：乙液：吉姆萨原液的比例为22:27:1。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.采用本发明提供的牛樟染色体核型分析方法制片能获得清晰的核型分析图，首次报道了尖叶牛樟的染色体核型分析方法和核型，表明牛樟有24条染色体，核型公式为2n＝2x＝24＝22m+2sm。第10对染色体带有随体，核型不对称系数 55.81％，属于2B类型，为牛樟的起源，演化及遗传育种提供一定理论依据。
2.本发明采用的是酶解去壁低渗法制备染色体标本，比常规压片法得出的细胞要分散，清晰。且该方法制得染色体标本有易保存、细胞紧贴玻片、不用盖玻片的特点，能直接为后期原位PCR.FISH等基因定位等技术提供优质的染色体制片。
附图说明
图1为在不同酶解时间下的牛樟中期细胞图；A2：酶解3h的牛樟中期细胞；B2：酶解4h的牛樟中期细胞；C2：酶解5h的牛樟中期细胞；
图2为染色体核型分析图。
具体实施方法
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1
不同预处理方法对染色体制片效果的影响
于晴朗的上午8：00-10:00采集牛樟组培苗根尖，采用三种预处理方法进行预处理实验。清水冲洗后转入卡诺固定液(无水乙醇∶冰乙酸＝3∶1)，固定24 h,70％乙醇4℃冰箱保存备用。按照酶解去壁低渗法通过固定、前低渗、酶解、后低渗、后固定和涂片制备染色体标本，再用吉姆萨染色，用POTIKA正立显微镜观察，Optika Vision pro拍照系统拍照。
3种不同预处理方法对牛樟根尖处理的结果表明(表1)：不同预处理方法对中期细胞数目及染色体分散效果及清晰度都有一定的影响。8-羟基喹啉预处理2 h所得的中期细胞所占比率为14.37％，明显高于其他处理组。其相对应的处理效果也是最佳，染色体较分散、聚缩程度适中、形态和溢痕清晰，很适合用于核型分析研究。其次是饱和对二甲苯预处理2h，染色体分散、聚缩，但有拖尾现象，溢痕不够清晰，不适合进行核型分析。而冰水混合物处理效果最差，染色体不够分散和聚缩、形态不清晰，不利于染色体计数和核型分析。
表1不同预处理方法对牛樟染色体制片的影响
实施例2
不同的酶解时间对染色体制片效果的影响
于晴朗的上午9：00-11:00采集牛樟组培苗根尖，置于0.002mol/L 8-羟基喹啉液预处理2h，清水冲洗后转入卡诺固定液(无水乙醇∶冰乙酸＝3∶1)，固定24h，70％乙醇4℃冰箱保存备用。按照酶解去壁低渗法通过前低渗、酶解(3个时间梯度)、后低渗、后固定和涂片制备染色体标本，再用吉姆萨染色，用POTIKA正立显微镜观察，Optika Vision pro拍照系统拍照。不同酶解时间对牛樟染色体制片效果影响的结果表明(图1)：酶解时间对牛樟染色体制片效果的影响主要体现在制片背景和染色体的清晰度上。酶解5h的细胞效果最佳 (图1 C2)，没有细胞壁，细胞质很稀薄，背景干净，染色体分散，有利于进行核型分析。酶解4h细胞效果一般(图1 B2)，没有细胞壁，但细胞质比较厚，背景不够干净。酶解3h制片效果最差(图1 A2)，细胞壁没有溶解完，且细胞质浓厚，背景不干净，不利于染色体扣取进行核型分析。
实施例3
尖叶牛樟染色体核型分析
于晴朗的上午9：00-11:00采集牛樟组培苗根尖，置于0.002mol/L 8-羟基喹啉液预处理2h，清水冲洗后转入卡诺固定液(无水乙醇∶冰乙酸＝3∶1)，固定24h，70％乙醇4℃冰箱保存备用。按照酶解去壁低渗法通过前低渗、酶解、后低渗、后固定和涂片制备染色体标本，再用吉姆萨染色，用POTIKA正立显微镜观察，Optika Vision pro拍照系统拍照。
臂比(r)＝长臂(S)/短臂(L)
染色体相对长度(％)＝染色体长度/染色体组总度×100％
平均长度核型不对称系数(As.k，％)＝长臂总长/全组染色体总长×100％。尖叶牛樟的染色体参数(表3)及染色体核型分析图(图2)的分析结果表明，尖叶牛樟的核型公式为2n＝2x＝24＝22m+2sm，且第10对染色体上有随体；有11对中部着丝粒染色体(m)，1对(第8对)染色体为近中部着丝点染色体(sm)。其染色体相对长度范围为12.22％-5.35％，最长与最短染色体长度比值为2.28，臂比值范围为1.1-2.3，其中臂比大于2的染色体有1对，为第 8对染色体；核不对称系数为55.81％，为2B型。
表3尖叶牛樟染色体核型参数
实施例4
一种基于根尖的尖叶牛樟染色体核型分析方法，具体步骤如下：
S1:取材
在晴朗的上午9：00-11:00采集牛樟组培苗健壮、白嫩的根尖0.5-1cm；
S2：预处理
把刚采集的根尖迅速投入0.002mol/L 8-羟基喹啉液预处理2h；
S3:固定与保存
倒掉预处理液，清水冲洗后转入卡诺固定液(无水乙醇∶冰乙酸＝3∶1)，在黑暗4℃环境下固定24h，移弃固定液，直接用来染色体制片，若需保存，把固定过的根尖依次在75％，90％，95％乙醇溶液各脱水3min，最后保存在75％乙醇中保存备用；
S4:染色体标本制备
(1)前低渗:把S3固定的根尖置于蒸馏水中进行前低渗30min；
(2)酶解:把步骤(1)的根尖置于盛有5％纤维素酶和4％果胶酶混合液的1ml离心管中，并置于37℃的恒温水浴锅中酶解5h；
(3)后低渗:吸取酶液，缓缓地沿着管壁加入蒸馏水，后低渗30min；
(4)后固定:吸取蒸馏水，滴加临时配制的固定液(3乙醇：1冰醋酸)，后固定15min；
(5)涂片：把玻片、临时配制的固定液均置于冰面上，取一张玻片，先滴3滴固定液，再夹取1-2个根尖置于玻片上，用解剖针挑取白色的根尖分生组织，并迅速捣碎再均匀涂抹在载玻片上，再从一端滴加一滴固定液使细胞扩散，接着在火焰上迅速烘烤，自然风干；
S5:染色
先把甲液PH＝6.8的KH2PO4缓冲液、乙液PH＝6.8的Na2HPO4缓冲液和吉姆萨原液按比例22:27:1配制成工作液，再把干燥的制片置于吉姆萨染色液中染色 10-20min，清水冲洗干净，置烘箱37℃烘干；
S6:镜检
用POTIKA正立显微镜观察，Optika Vision pro拍照系统拍照，在40X 物镜下对单位视野面积内处于分裂中期的细胞进行计数。选择30个染色体分散且形态较好的细胞进行染色体数目统计，选取5个染色体形态清晰且无重叠的细胞用Photoshop图像软件进行核型分析。
Claims (10)
1.一种基于根尖的尖叶牛樟染色体核型分析方法，其特征在于：所述的分析方法具体步骤如下：
S1:取材
在晴朗的上午采集牛樟组培苗健壮、白嫩的根尖；
S2：预处理
把刚采集的根尖进行预处理；
S3:固定与保存
倒掉预处理液，清水冲洗后转入卡诺固定液，在黑暗4℃环境下固定24h，移弃固定液，直接用来染色体制片；
S4:染色体标本制备
(1)前低渗:把S3固定的根尖置于蒸馏水中进行前低渗30min；
(2)酶解:把步骤(1)的根尖置于盛有5％纤维素酶和4％果胶酶混合液的1ml离心管中，并置于37℃的恒温水浴锅中酶解3-5h；
(3)后低渗:吸取酶液，缓缓地沿着管壁加入蒸馏水，后低渗30min；
(4)后固定:吸取蒸馏水，滴加临时配制的固定液，后固定15min；
(5)涂片：把玻片、临时配制的固定液均置于冰面上，取一张玻片，先滴固定液，再夹取根尖置于玻片上，用解剖针挑取白色的根尖分生组织，并迅速捣碎再均匀涂抹在载玻片上，再从一端滴加固定液使细胞扩散，接着在火焰上迅速烘烤，自然风干。
S5:染色
将缓冲液甲液、乙液与吉姆萨原液按比例配制成工作液，再把干燥的制片置于吉姆萨染色液中染色10-20min，清水冲洗干净，置烘箱37℃烘干；
S6:镜检
用POTIKA正立显微镜观察，Optika Vision pro拍照系统拍照，在40X物镜下对单位视野面积内处于分裂中期的细胞进行计数，选择30个染色体分散且形态较好的细胞进行染色体数目统计，选取5个染色体形态清晰且无重叠的细胞用Photoshop图像软件进行核型分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S1所述的采集的组培生根苗根尖，挑选粗壮，白嫩且长度为0.5-1cm的根尖。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S2所述的预处理为：0.002mol/L8-羟基喹啉处理2h、饱和对二甲苯处理2h或冰水混合物处理24h。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤S2所述的预处理最佳方式为：0.002mol/L8-羟基喹啉处理2h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S4所述的染色体制片方法采用酶解去壁低渗法。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S4所述的步骤(2)采用纤维素酶和果胶酶酶解的最佳时间为5h。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S5所述的采用吉姆萨染色的最佳时间为15min。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S3所述的卡诺固定液为无水乙醇∶冰乙酸＝3∶1。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S4的(4)所述固定液为乙醇：冰醋酸＝3∶1。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S5所述的甲液为KH2PO4PH＝6.8缓冲液、乙液为PH＝6.8Na2HPO4缓冲液，甲液：乙液：吉姆萨原液的比例为22:27:1。
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