CN110658046B - 染色体c显带方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种染色体C显带方法，包括以下对染色体标本进行处理的步骤：酸处理：用0.05‑0.15mol/L的盐酸处理8‑20min；碱处理：用55‑65℃温度的饱和的Ba(OH)₂溶液处理15‑35s；复性：使用55‑65℃的SSC缓冲液温育20‑60min；染色：吉姆萨染液染色。通过上述步骤和条件参数的配合，可以将染色时间缩短至3‑5min，且能得到清晰、明显的C带型。相对于传统方法，本发明缩短了C显带40％～50％的处理时间，提高了效率。

Description

染色体C显带方法

技术领域

本发明属于生物学领域，特别涉及一种染色体C显带方法。

背景技术

染色体分带技术是经物理、化学因素处理后，再用染料对染色体进行分化染色，使其呈现特定的深浅不同带纹的方法。染色体分带技术可以分为两大类，一类是产生染色带分布在整个染色体的长度上，如G显带、Q显带和R显带。另一类是局部性显带，它只能使少数特定区域显带，如C显带、T显带和N显带。

染色体C显带是着丝粒(Centromere)带的简称，其原理是：染色体中的DNA在碱性溶液中变性，再复原后染色，复原的区段着色深，为异染色质部位，多在着丝粒区，故称C显带。而常染色质部位只能显示较淡的轮廓。C显带虽不能对每个染色体加以鉴别，但可专门显示结构异染色质如着丝粒、次缢痕和Y染色体长臂远端部分。可用于鉴别人类1、9、16号染色体和Y染色体，做为G带型分析的补充，可鉴定性别。

传统方法中，采用5％的Ba(OH)₂溶液处理样本5-15min使DNA变性，再以SSC溶液(0.5M氯化钠和0.15M柠檬酸钠的混合液)处理90min以上使其复性后，Giemsa染色30min左右。该方法变性后的DNA所需复性时间、染色时间较长，导致耗时长、效率低，不利于快速C显带的检测，且易使DNA无差别丢失，异染色质部位复性不佳，染色效果不好。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种快速、高效、染色效果好的外周血细胞的染色体C显带方法。

具体技术方案如下：

一种染色体C显带方法，包括以下对染色体标本进行处理的步骤：

酸处理：用0.05-0.15mol/L的盐酸处理8-20min；

碱处理：用55-65℃温度的饱和的Ba(OH)₂溶液处理15-35s；

复性：使用55-65℃的SSC缓冲液温育20-60min；

染色：吉姆萨染液染色。

在其中一些实施例中，所述酸处理为：用0.08-0.12mol/L的盐酸处理10-15min。

在其中一些实施例中，所述酸处理为：用0.1mol/L的盐酸处理10-15min。

在其中一些实施例中，所述酸处理的温度为室温。

在其中一些实施例中，所述碱处理为：用58-62℃温度的饱和的Ba(OH)₂溶液处理15-35s。

在其中一些实施例中，所述碱处理为：用60℃温度的饱和的Ba(OH)₂溶液处理20-30s。

在其中一些实施例中，所述复性为：使用58-62℃的SSC缓冲液温育30-60min。

在其中一些实施例中，所述复性为：使用60℃的SSC缓冲液温育30-50min。

在其中一些实施例中，所述吉姆萨染液染色的时间为3-5min。

在其中一些实施例中，所述碱处理和所述复性之间，还包括以下步骤：用55-65℃的水清洗玻片。

基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

本发明通过在染色体C显带方法的碱处理使DNA变性的步骤前，加入了采用合适浓度的盐酸对DNA进行纯化的步骤，配合以合适浓度的Ba(OH)₂进行热处理，使DNA高度变性并易于溶解，相对于传统方法中采用5％的Ba(OH)₂处理的方法，缩短了碱处理时间的同时，还能够避免DNA的无差别丢失。最后配合热的SSC的以合适温度、时间温育处理可使DNA骨架断开，并使碎片进入溶液，有助C显带的带型清晰、背景清晰。通过上述步骤和条件参数的配合，可以将染色时间缩短至3-5min，且能得到清晰、明显的C带型。相对于传统方法，本发明缩短了C显带40％～50％的处理时间，提高了效率。

附图说明

图1为实施例1的效果图；

图2为实施例2的效果图；

图3为对比例1的效果图；

图4为对比例2的效果图；

图5为对比例3的效果图；

图6为对比例4的效果图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明的一种染色体C显带方法，包括以下步骤：

酸处理：对染色体标本玻片用0.05-0.15mol/L的盐酸处理8-20min；

碱处理：用55-65℃温度的饱和的Ba(OH)₂溶液处理15-35s；

复性：使用55-65℃的2×SSC缓冲液温育20-60min；

染色：吉姆萨染液染色。

优选地，所述酸处理为：用0.08-0.12mol/L的盐酸处理10-15min。更优选地，用0.1mol/L的盐酸处理10-15min。盐酸水解，使DNA纯化，有利于碱处理使DNA高度变形并促使DNA的溶解，使一般活跃的染色质更易受碱和盐类的破坏，从而减少处理时间，也避免处理时间过长导致着丝粒区的异染色质遭受破坏。如果盐处理时间太短会因为玻片的老化程度而出现波动，导致C显带因复性不够导致失败或者背景不够清晰。

优选地，所述酸处理的温度为室温。

优选地，所述碱处理为：用58-62℃温度的饱和的Ba(OH)₂溶液处理15-35s。更优选地，用60℃温度的饱和的Ba(OH)₂溶液处理20-30s。碱处理使DNA高度变性并促使DNA的溶解。其中，基于前序的盐酸水解步骤后，碱处理的碱温度、碱浓度和碱处理时间需严格控制，超过30s时，会导致染色所需的时间延长，且由于碱处理时间太长导致DNA的无差别丢失，最后染色效果差。而Ba(OH)₂溶液的温度偏低会导致有Ba(OH)₂DNA变性不够充分。

优选地，所述复性为：使用58-62℃的SSC缓冲液温育30-60min。更优选为使用60℃的SSC缓冲液温育30-50min。处理时间较短时，非C带区的染色质未能充分破坏，可能导致标本背景不够清晰，而处理时间较长时，对于着色效果没有明显影响，但是影响效率，耗时。

优选地，所述吉姆萨染液染色的时间为3-5min。该染色时间长度，取决于前述各步骤之间的相互配合，若一些参数没有合理配合，染色时间将会需要延长才能保证染色效果，从而降低效率。而染色时间太短，则会影响着色效果，C显带效果不清晰。

优选地，所述碱处理和所述复性之间，还包括以下步骤：用55-65℃的水清洗玻片，可以冲洗掉附着在玻片上的Ba(OH)₂溶液，避免温度降低析出Ba(OH)₂附着在玻片上导致玻片背景模糊。在这个环节清洗，有助于玻片染色时的背景清晰。

以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1外周血细胞的染色体C显带方法

溶液配制：

2×SSC配制：氯化钠(NaCl)17.55g柠檬酸钠(Na₃C₆H₃O₇·5H₂O)8.82g加水至1000ml，室温保存。

Giemsa染液原液配制：Giemsa粉末1g加少许甘油混合研碎→共计加入甘油66ml，充分混匀→倒入烧杯中在55-60℃水浴中加热2小时→冷却→加入甲醇66ml，充分混合→在室温中静置2-3周，过滤贮存于棕色瓶中，可长期使用。

Giemsa工作液：40ml蒸馏水中加入3％Tris调节PH值到7.2-7.4，加Giemsa原液2ml混合，用于染色体标本的染色。

染色体C显带步骤：

1、染色体标本玻片在室温下通过0.1mol/L的盐酸水解10分钟，以去除非组蛋白和非酸性蛋白，使DNA纯化而DNA骨架未断；

2、利用60℃的饱和Ba(OH)₂溶液处理30秒，使DNA高度变性并促使DNA的溶解；

3、用60℃的热水清洗干净，有助于玻片染色时的背景清晰；

4、60℃的2×SSC温育30分钟，以促使DNA骨架断开，并使碎片进入溶液，有助于带型的清晰；

5、Giemsa染液染色5分钟。

实施例2

一种外周血细胞的染色体C显带方法，具体步骤如下：

1、染色体标本玻片在室温下通过0.1mol/L的盐酸水解15分钟，以去除非组蛋白和非酸性蛋白，使DNA纯化而DNA骨架未断；

2、利用60℃的饱和Ba(OH)₂溶液处理20秒，使DNA高度变性并促使DNA的溶解；

3、用60℃的热水清洗干净，有助于玻片染色时的背景清晰；

4、60℃的2×SSC温育50分钟，以促使DNA骨架断开，并使碎片进入溶液，有助于带型的清晰；

5、Giemsa染液染色3分钟。

对比例1

一种外周血细胞的染色体C显带方法，具体步骤如下：

1、利用60℃的饱和Ba(OH)₂溶液处理10.5分钟；

2、用60℃的热水清洗干净；

3、用60℃的2×SSC处理90分钟；

4、Giemsa染液染色30分钟。

与实施例2的区别在于，未采用0.1mol/L的盐酸水解10分钟，而是直接采用60℃的饱和Ba(OH)₂溶液处理10.5min，使DNA变性。

对比例2

一种外周血细胞的染色体C显带方法，具体步骤如下：

1、利用60℃的饱和Ba(OH)₂溶液处理30秒；

2、用60℃的热水清洗干净；

3、60℃的2×SSC温育30分钟；

4、Giemsa染液染色5分钟。

与实施例2的区别在于，未采用0.1mol/L的盐酸水解10分钟，直接采用60℃的饱和Ba(OH)₂溶液处理30秒，使DNA变性。

对比例3

一种外周血细胞的染色体C显带方法，具体步骤如下：

1、染色体标本玻片在室温下通过0.1mol/L的盐酸水解10分钟，以去除非组蛋白和非酸性蛋白，使DNA纯化而DNA骨架未断；

2、利用60℃的饱和的Ba(OH)₂溶液处理40秒，使DNA高度变性并促使DNA的溶解；

3、用60℃的热水清洗干净，有助于玻片染色时的背景清晰；

4、60℃的2×SSC温育30分钟，以促使DNA骨架断开，并使碎片进入溶液，有助于带型的清晰；

5、Giemsa染液染色5分钟。

与实施例2的区别在于，60℃的饱和的Ba(OH)₂溶液处理时间较长，为40秒。

对比例4

一种外周血细胞的染色体C显带方法，具体步骤如下：

1、染色体标本玻片在室温下通过0.3mol/L的盐酸水解10分钟，以去除非组蛋白和非酸性蛋白，使DNA纯化而DNA骨架未断；

2、利用60℃的饱和的Ba(OH)₂溶液处理30秒，使DNA高度变性并促使DNA的溶解；

3、用60℃的热水清洗干净，有助于玻片染色时的背景清晰；

4、60℃的2×SSC温育30分钟，以促使DNA骨架断开，并使碎片进入溶液，有助于带型的清晰；

5、Giemsa染液染色5分钟。

与实施例2的区别在于，盐酸的浓度较高，为0.3mol/L。

上述实施例、对比例的C显带染色效果及耗费时长，如表1所示：

表1实施例和对比例的C显带染色效果

由以上结果可知：对比例1中，其没有经过酸化处理，直接采用碱进行变性，着色效果较差，其原因可能是Ba(OH)₂处理时间过长，使DNA高度变性过程中DNA无差别的丢失，是导致染色体C显带难以着色。而且，由于碱变性时间较长，使得使用2×SSC温育复性所需的时间、染色时间等也需要更长时间，处理过程耗时长、效率低。

对比例2中，没有经过酸化处理，直接采用碱进行变性，且时间为30s，热碱变性处理时间很短，其导致C显带失败，非着丝粒区和非着丝粒区同时深染。

对比例3中染色效果较差，其可能的原因是，碱处理时间过长，容易导致DNA的无差别丢失，具有难以着色的风险。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种染色体C显带方法，其特征在于，包括以下对染色体标本进行处理的步骤：

酸处理：用0.05-0.15mol/L的盐酸处理8-20min；

碱处理：用55-65℃温度的饱和的Ba(OH)₂溶液处理15-35s；

复性：使用55-65℃的SSC缓冲液温育20-60min；

染色：吉姆萨染液染色，所述吉姆萨染液染色的时间为3-5min。

2.根据权利要求1所述的染色体C显带方法，其特征在于，所述酸处理为：用0.08-0.12mol/L的盐酸处理10-15min。

3.根据权利要求2所述的染色体C显带方法，其特征在于，所述酸处理为：用0.1mol/L的盐酸处理10-15min。

4.根据权利要求1所述的染色体C显带方法，其特征在于，所述酸处理的温度为室温。

5.根据权利要求1所述的染色体C显带方法，其特征在于，所述碱处理为：用58-62℃温度的饱和的Ba(OH)₂溶液处理15-35s。

6.根据权利要求5所述的染色体C显带方法，其特征在于，所述碱处理为：用60℃温度的饱和的Ba(OH)₂溶液处理20-30s。

7.根据权利要求1所述的染色体C显带方法，其特征在于，所述复性为：使用58-62℃的SSC缓冲液温育30-60min。

8.根据权利要求7所述的染色体C显带方法，其特征在于，所述复性为：使用60℃的SSC缓冲液温育30-50min。

9.根据权利要求1-8任一项所述的染色体C显带方法，其特征在于，所述碱处理和所述复性之间，还包括以下步骤：用55-65℃的水清洗玻片。

Images