CN103382498A

CN103382498A - 一种用于染色体核型分析的dna和rna鉴别染色显带法

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Publication number: CN103382498A
Application number: CN2012101419174A
Authority: CN
Inventors: 黄荷凤; 翁炳焕; 李晓; 杨红卫; 徐晨明; 朱瑞建; 陈松长
Original assignee: 翁炳焕
Priority date: 2012-05-01
Filing date: 2012-05-01
Publication date: 2013-11-06

Abstract

本发明涉及医疗领域的一种用于染色体核型分析的DNA和RNA鉴别染色显带法，其主要特征是制备甲基绿-派洛宁混合染液并浸染按常规细胞培养、终止生长、中期细胞分离、低渗、固定及胰蛋白酶消化制备的染色体标本片，经醋酸缓冲液浸洗、丙酮分化、二甲苯脱水透明、中性树胶封固后，在同一条染色体上显示深染和淡染相间的DNA蓝绿色(区带)带纹，而少量的RNA组成区(点)显红色，形成明显的对比颜色，用以常规分析染色体核型，与经典的姬姆萨染色G显带方法相比，具有结果更清晰、鉴别判断染色体各区段(带纹)DNA和RNA的相对含量、比例、固定组分变化及其组成区位置改变的优点，有助于发现新病种和了解其发病机制。

Description

一种用于染色体核型分析的DNA和RNA鉴别染色显带法

本发明涉及一种用于染色体核型分析的DNA和RNA鉴别染色显带法，主要应用于医学领域的生殖遗传及出生缺陷实验室，作为分析染色体核型的DNA和RNA鉴别染色显带。

染色体是细胞核中的遗传物质，人类有23对染色体，其中22对为常染色体，1对为决定男女性别的性染色体。染色体上载有遗传信息的基因，其中DNA占90％以上，RNA含量随细胞周期及生长情况而有所变化，一般占1％～10％。

染色体结构或数目的异常，临床上表现为染色体病，属于常见的出生缺陷，如先天愚型、原发性闭经、两性畸型等。目前分析染色体核型的常规方法是用被检的组织或细胞，经过常规细胞培养、0.02μl/ml秋水仙素终止细胞生长、分离中期细胞、0.075mol/L KCl低渗、甲醛-冰乙酸(3∶1)固定等染色体制片程序后，最后用胰酶消化、染色显带，从而作出染色体结构和数目是否异常的判断。

在染色体核型分析中，需作染色体组份的染色显带，涉及一种染色试剂。目前采用姬姆萨(Giemsa)染色G显带方法，Giemsa染料是由噻嗪和曙红组成的，着色时DNA先与2个噻嗪分子结合，然后再与一个曙红分子结合，形成沉淀物。染色体的化学成份是核酸和蛋白质两部分，核酸以DNA为主，蛋白质有组蛋白和非组蛋白两种，染色体经蛋白水解酶类物质水解后，蛋白质已被水解而使DNA分子中碱基暴露，由于碱基中G/C和A/T组合的比例不同，对染料结合的程度不一，如果某一段A/T碱基的成份多，则Giemsa染料易与它结合成深染；如果另一段G/C碱基的成份多，则Giemsa染料不易与其结合，结果成淡染，由于整条染色体上A/T和G/C的分布不匀，这样在染色体上呈现出深浅不一的条纹或者称带纹，该技术用Giemsa染色，故其带型称为G带。

姬姆萨(Giemsa)染色结果是染色体显示深、浅相间或在不同染色体区段深度不同的紫红色带纹，显示的是同一种颜色，未显示DNA和RNA的不同颜色，不能判定是DNA还是RNA显色或带纹，不能区分两者的性质和位置，无法判断在正常与非正常情况下DNA和RNA含量、组成比例、组成区位置的变化，而且，如果实验人员长期在显微镜下分析始终如一的紫红色物，则有损于视力和身心健康，而交互观看不同颜色，特别是多看绿色物，则有利于视力保养、减轻紧张感，减少心血管疾病和脂肪肝等的发病。实际上，至今还没有一种可用于分析染色体核型的DNA和RNA鉴别染色显带方法。

本发明人为了解决上述问题，提出了本发明。

本发明的目的是要提供一种能有效地用于染色体核型分析的、使同一条染色体中DNA和RNA染成显明对比颜色的DNA和RNA鉴别染色显带方法及其染色剂。

本发明的目的是这样实现的：被检组织或细胞经细胞培养、中期细胞分离、低渗、固定等常规染色体制片程序后，以胰酶液消化，分别置蒸馏水、醋酸缓冲液中浸洗，以甲基绿-派洛宁染色液浸染20～25分钟，用醋酸缓冲液清洗，软滤纸吸干，迅速经丙酮分化30S，再用纯丙酮、二甲苯等量混合液分化、脱水30S，二甲苯透明，中性树胶封固，在染色体上，DNA显蓝绿色区带，RNA显红色区带。

本发明的染色结果，在成形的染色体上，DNA显示深、浅相间的蓝绿色(区)带纹，其中少量的RNA显红色，与仅显示同一种紫红色的、DNA和RNA不能分别显色的原方法相比，具有的优点是：能有效地使染色体显带以用于染色体核型分析并同时使同一条染色体中DNA和RNA分别显示不同颜色，可判断染色体各区段(带纹)的DNA或RNA的相对含量、比例及其固定组分变化、位置改变；另外，实验人员长期分析绿色物或带有少量红色的绿色物比长期分析单一的紫红色物更有利于视力保养、减轻紧张感，减少心血管疾病和脂肪肝等的发病。

图1是根据本发明提出的一条第1号染色体(正常人体总共有22对、46条染色体)的染色结果图。

下面结合图1，对本发明所提出的染色体DNA和RNA组成区的鉴别染色显带方法作详细的描述。

如图1所示，1是指一条1号染色体，2是指染成绿色的1号染色体DNA组成区(带)，3是指染成红色的1号染色体RNA组成区(带)，正常人体的22对、46条染色体具有类似的染色结果，在非正常情况下显色结果与正常各不相同。本发明的具体实施方法如下：

1、待染色、显带的染色体标本片的制备：分离秋水仙素终止后的中期细胞，经0.075mol/L KCl低渗、甲醛-冰乙酸(3∶1)固定(可用酒精和醋酸固定，能较好地保存核蛋白)，分离细胞悬液，滴加于载玻片上，37℃干燥后，制备染色体标本片。

2、消化：将25mL生理盐水和25mL0.02％的EDTA溶液倒入立式染色缸内，取25％胰蛋白酶溶液1mL加人上液内混匀，滴入1～2滴氢氧化钠溶液至上液中，调整pH7.0～7.2，将配好的胰蛋白酶置37℃水浴中预热，取染色体标本片，置于胰蛋白酶溶液中，轻轻摇动5～20S，立即在生理盐水中洗2次。

3、染色剂的配制：①3％甲基绿水溶液：称取甲基绿(methyl green)1.5g加蒸馏水至50ml(甲基绿水溶液的抽提：甲基绿为绿色粉末，属三苯甲烷染料，这种染料是由氯代甲烷作用于结晶紫而形成的一种化合物，由于甲基化作用，甲基连接得并不牢固，容易从甲基绿中脱失，另外，在甲基化过程中，有一部分结晶紫并没有生成甲基绿，常有少量的甲基紫或结晶紫成份，因此，在配制试剂时，必须先将甲基绿所含的甲基紫或结晶紫抽提出来，才能使细胞核内的脱氧核糖核酸染成绿色，抽提方法是取2％甲基绿水溶液20ml倾入洁净分液漏斗，加入三氯甲烷20ml充分摇荡混合，使其内的甲基紫溶于三氯甲烷中而呈紫红色。旋动分液漏斗下部的砂塞，慢慢分离试剂，如此反复更换三氯甲烷，直到三氯甲烷无紫红色为止，即可得到纯的甲基绿溶液)，不同染色体含量的标本，甲基绿的浓度可为0.5％～10％，可用醋酸缓冲液配制；②5％派洛宁水溶液：取派洛宁(pyronine G)1g加蒸馏水至20ml(要注意试剂的质量，特别是派洛宁，常常不同批号的染料，染色的效果不同，甲基绿和派洛宁二者的比例要恰当)，不同染色体含量的标本，派洛宁的浓度可为1％～15％，可用醋酸缓冲液配制；③0.2M醋酸盐缓冲液：0.2M醋酸液与0.2M醋酸钠液混合，使pH 4.8(染色液的pH应为4.8左右，如pH过低，甲基绿染色效果差；pH偏高，则派洛宁染色效果不良)；④甲基绿-派洛宁染液：3％甲基绿水溶液(经抽提)加5％派洛宁水溶液(配妥的甲基绿-派洛宁染液用后放冰箱保存，约可使用数周)。不同染色体含量的标本，选择不同浓度的甲基绿和派洛宁溶液。

4、染色和显带：将经人胰蛋白酶溶液消化后的染色体标本片，置于生理盐水中洗2次后，吸干，置入甲基绿-派洛宁染液于室温染30～60分钟，取出标本片，不经水洗，用滤纸吸干多余染液，用丙酮迅速分化(丙酮分化时间要很好掌握，时间不宜太长)，转入丙酮二甲苯(1∶1)稍洗，二甲苯透明2～3次，中性树胶封固。

5、染色和显带结果：①甲基绿-派洛宁(methyl green-pyronin)为碱性染料，它能分别与细胞内的DNA、RNA结合呈现不同颜色。当甲基绿与派洛宁作为混合染料时，甲基绿与DNA选择性结合显示绿色或蓝色；派洛宁与RNA选择性结合显示红色，其原因是两种染料的混合染液中有竞争作用，同时两种核酸分子都是多聚体，而其聚合程度有所不同。甲基绿易与聚合程度高的DNA结合呈现绿色，而派洛宁则与聚合程度较低的RNA结合呈现红色(但解聚的DNA也能和派洛宁结合呈现红色)；②如图1所示，染色体经甲基绿-派洛宁染色后，DNA被染成绿色，RNA被染成红色；在同一条染色体中，DNA和RNA分别显示不同颜色。因为RNA含量很少(一般为1％左右)，且整条染色体上A/T和G/C的分布不匀(如果某一段A/T碱基的成份多，则染料易与它结合成深染；如果另一段G/C碱基的成份多，则染料不易与其结合，结果成淡染)，所以对染料结合的程度不一，所以在同一条染色体上呈现深、浅相间的蓝绿色带纹，其中少量的RNA显红色。

7、应用：本发明能有效地使染色体显带以用于染色体核型分析并可同时判断染色体各区段(带纹)的DNA或RNA的相对含量、比例、固定组分变化及位置改变。

Claims

1.一种用于染色体核型分析的DNA和RNA鉴别染色显带法，其主要特征是制备甲基绿-派洛宁混合染液并浸染常规制备的染色体，在同一条染色体上显示深染和淡染相间的DNA蓝绿色(区带)带纹，而少量的RNA组成区(点)显红色，形成明显的对比颜色，用以常规分析染色体核型并同时判断染色体各区段(带纹)的DNA和RNA的相对含量、比例、固定组分变化及其组成区(点)的位置改变。

2.根据权利要求1所述的一种用于染色体核型分析的DNA和RNA鉴别染色显带法，其特征是使用丙酮、二甲苯分化、透明。

3.根据权利要求1所述的一种用于染色体核型分析的DNA和RNA鉴别染色显带法，其特征是染色过程在pH 4.8、0.2M醋酸盐缓冲液的介质中进行。

4.根据权利要求1所述的一种用于染色体核型分析的DNA和RNA鉴别染色显带法，其特征是使用中性树胶封固。

5.根据权利要求1所述的一种用于染色体核型分析的DNA和RNA鉴别染色显带法，其特征是使用0.5％的胰蛋白酶消化染色体。

6.根据权利要求1所述的一种用于染色体核型分析的DNA和RNA鉴别染色显带法，染色剂的浓度随染色体含量而改变，甲基绿的浓度为0.5％～10％，派洛宁的浓度为1％～15％，可以用醋酸缓冲液或蒸馏水配制。