CN106244669A - 一种快速鉴别水中10‑50微米活体生物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，特别涉及快速鉴别水中10‑50微米活体生物的方法,提取压载水样本，并将样本的生物密度进行调整，制得调整后样本；将调整后样本摇匀，分别加入FDA和CMFDA染剂，常温避光染色得到染色后的样本；将染色后的样本移至玻璃材质的计数框中，利用正置荧光显微镜，在荧光激发下，即可观察到的活体生物数量。本发明的有益效果是克服现有方法中存在的不准确、耗时长、不能准确辨识细胞死活且对检测员技术能力要求较高的问题，本方法对活体生物进行高比例染色后，然后通过荧光显微镜对其进行观察后，测出相应的数据。本发明提供一种易操作、可快速鉴别10‑50微米粒径活体生物的方法。

Description

一种快速鉴别水中10-50微米活体生物的方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种快速鉴别水中10-50微米活体生物的方法。
背景技术
国际海事组织(IMO)在2004年颁发的《国际船舶压载水及其沉积物控制和管理公约》中明确规定了压载水排放时最大允许的存活生物密度。其中，10-50微米存活生物在排放时的最大允许密度为每毫升里不超过10个细胞。
国际到港船舶压载水的检测难点在于到达目的港后排放时活体生物数量的快速检测。一般意义上，人们认为能够运动的完整个体可以看做是一个活体。绝大多数≥50微米生物为动物，它们是可以自由活动的，因此很容易辨认其死活。10-50微米生物(主要指浮游植物)因个体小、运动现象不明显且对鉴定人员的技术要求较高等原因，一直被看作是压载水活体生物检测中的难点。另外，许多传统的浮游植物活体计数方法为间接计数法或者检测周期较长都不适用于压载水中。如，放射性元素标记法(14CO2)是一种很好的间接方法，通过测定放射性标记分子的产生换算出活体生物数量。但不同物种的换算系数不同，所以此方法仅适用于纯种生物的活体计数，不适合于测定压载水中10-50微米生物群落的数量。传统的显微镜法在10-50微米活体生物的检测中是必要的。有专家提出，利用叶绿素荧光法来计数细胞，但缺陷是被福尔马林固定后的细胞也可被染色，即死细胞也可被染色。因此该方法的计数结果不完全代表活体细胞的数量，但这种利用荧光染色来计数活体的方法还是值得借鉴的。
发明内容
针对现有技术的这些问题，本发明的目的是拟利用一种细胞原生质体染色剂(荧光素二乙酸酯(FDA))与另一种细胞核染色剂(5-氯甲基二乙酸酯(CMFDA))相结合的荧光染色方法，来检测压载水活体10-50微米生物的数量，以实现到港船舶压载水中活体生物的快速检测。本发明是通过如下步骤实现：
(1)提取压载水样本，并将样本的生物密度进行调整，制得调整后样本；
(2)将步骤(1)中的调整后样本摇匀，分别加入FDA和CMFDA染剂，常温避光染色得到染色后的样本；在荧光激发的条件可观察到双荧光染色法能很好的区分细胞的死活，活细胞染色后，可观察到绿色荧光，而死细胞不发荧光。
(3)将步骤(2)中的染色后的样本移至玻璃材质的计数框中，利用正置荧光显微镜，在荧光激发下，即可观察到的活体生物数量。
其中，所述步骤(1)将样本的生物密度进行调整，调整后的生物密度为103-104cell/mL。藻液中藻细胞密度在103-104cell/mL时，染色效果最佳，特别是细胞密度在104cell/mL，各组染色率均超过95％。藻液中藻细胞密度高于或低于104cell/mL，荧光染色效果均不佳，其中当藻细胞密度达到106cell/mL时，染色率最低，均低于70％，且随着染色时间的延长染色率变动较小。
其中，所述步骤(2)染剂的最终浓度分别为4～6μmol/L和2～3μmol/L。优选的,最终浓度分别为5μmol/L和2.5μmol/L。此浓度效果最好。
其中，所述步骤(2)染剂的常温避光染色5-10min。染色时长为5-10min时，各组染色率最高，当染色时间增加到15min时，染色率开始下降，并且随着染色时间的不断增加，染色率降低，当染色时间增加到30min时，染色率出现最低值。由此可知，染色时长为5-10min是荧光染色的最佳时间。
其中，所述步骤(3)中的荧光激发的条件为，激发光为465-495nm，吸收光为515-555nm。在此条件下活细胞可观察到绿色荧光，而死细胞不发荧光
其中，所述步骤(3)中的荧光激发的曝光时间应为40-50ms,可根据样本的背景荧光量进行适当调整。曝光时间越长经双荧光染色后藻细胞荧光的淬灭越快，同时曝光时间增强还伴随着背景荧光的增加，两方面影响都不利于准确观察。利用双荧光染色法观察活体细胞时，曝光时间应不超过50微秒，以控制背景荧光亮度和保证足够的观察计数时间。
其中，所述步骤(3)中的观察记录的时间为10-20min。
本发明的有益效果是克服现有方法中存在的不准确、耗时长、不能准确辨识细胞死活且对检测员技术能力要求较高的问题，本方法对活体生物进行高比例染色后，然后通过荧光显微镜对其进行观察后，测出相应的数据。本发明提供一种易操作、可快速鉴别10-50微米粒径活体生物的方法。
附图说明
图1.有荧光染色和没有经过荧光染色效果比较结果(其中，左图为没有荧光染色的样品，右图为经过荧光染色之后的样本。)
图2.不同藻类密度与染色时长条件下藻类的染色率
具体实施方式
下面结合以下实施例，对本发明作进一步说明：
实施例1
1.材料与方法
1.1实验样本与荧光染色剂
实验所用藻类样本有两种类型，分别是指数生长期的纯种人工培养莱茵衣藻样本和野外自然水体中藻类样本。其中人工纯种样本用于确认本染色方法最适染色浓度、染色时间、样本密度等参数。野外自然样本用于观察和评估不同种藻类对该种染色方法的上色效果差异。
配置不同浓度梯度的藻类样品：
C1 3.5×106cells/mL
C2 3.5×105cells/mL
C3 3.5×104cells/mL
C4 3.5×103cells/mL
实验使用的染色剂FDA(二乙酸荧光素)，CMFDA(5-氯甲基二乙酸)以及有机溶剂DMSO(二甲基亚砜)均为美国Life Technologies公司Molecular ProbesTM系列产品。
1.2染色剂配置
根据FDA和CMFDA的最终浓度及实验用量，将粉末状药品溶于DMSO溶剂，配置实验待用染剂FDA和CMFDA的浓度为1mmol/L和250umol/L，摇匀后保存于4℃的避光环境中。
1.3样本染色
1)双染色：本实验染色方法如下，将样品摇匀后取1mL样品，加入染色剂FDA和CMFDA剂量终浓度分别为5μmol/L和2.5μmol/L，摇匀后在避光条件下染色10分钟。
2)FDA染色：本实验染色方法如下，将样品摇匀后取1mL样品，加入染色剂FDA染剂，使得该染剂在样品溶液中的终浓度为5μmol/L，摇匀后在避光条件下染色10分钟。
3)CMFDA染色：本实验染色方法如下，将样品摇匀后取1mL样品，加入染色剂CMFDA染剂，使得该染剂在样品溶液中的终浓度为2.5μmol/L，摇匀后在避光条件下染色10分钟。
1.4样本的显微观察条件
观察样品使用OLYMPUS bx53生物显微镜以及DP73数码成像系统。显微镜的所有荧光滤色镜部件都采用了超高性能的滤色片,荧光照明器为F.N.22、8孔滤色镜转盘、4个安装ND滤色镜的位置。宽蓝带激发荧光镜组U-FBW，激发光波长450-480nm,二向色镜波长500nm,吸收滤光片515nm。成像系统实时图像采集速度为15幅/秒,分辨率高达1600×1200像素。进行测试分析后，确定了本实验曝光时间应设置在50微秒或少保持低背景荧光。可观察到：
1)部分藻细胞经FDA或CMFDA单染时无荧光或荧光较弱，在荧光显微镜下难以辨认其荧光，但经过双染时，荧光效果明显增强。
2)双荧光染色法能很好的区分细胞的死活，活细胞染色后，可观察到绿色荧光，而死细胞不发荧光。见图1。左图为没有荧光染色的样品，右图为经过荧光染色之后的样本。可见通过荧光染色，右图中白色的为已上色的活体藻细胞，可见，通过荧光染色的方法能够明晰的区分出样本中活体藻细胞。
2.不同染色时长的染色效果差异
将配置好不同浓度梯度的藻类样品分别染色5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分，30分钟时，其实验样品中藻细胞的计数后计算染色率，由不同染色时长染色率折线图(见图2)可得出：当染色5-10分钟，染色率增加至最高值；当染色时间段为10-15分钟，染色率几乎不变动，但染色超过15分钟后，染色率开始逐渐减小；由此可知，染色时长为10-15分钟时染色率最高，但染色10分钟的染色率略高于15分钟的染色率。染色时间过长染色率减小可能是由荧光自身淬灭引起的。
3.不同浓度梯度的藻类样品的染色效果差异
由表格可见，C3和C4组当藻细胞密度分别是104cell/mL和103cell/mL时浓度的藻类，染色效果较好。特别是C3组，藻细胞密度在104cell/mL时，染色效果最佳，染色率均超过95％。
不同染色时长的染色率
Table Rates of staining under different staining time
由此可见，103-104cell/mL时浓度的藻类，特别是藻细胞密度在104cell/mL时，染色时长为10-15分钟时染色率最高，然后通过荧光显微镜对其进行观察，可观察到绿色荧光的活细胞，并测出相应的数据，实现了易操作、快速鉴别10-50微米粒径活体生物的目的。
以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。

Claims (7)

1.一种快速鉴别水中10-50微米活体生物的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)提取压载水样本，并将样本的生物密度进行调整，制得调整后样本；
(2)将步骤(1)中的调整后样本摇匀，分别加入FDA和CMFDA染剂，常温避光染色得到染色后的样本；
(3)将步骤(2)中的染色后的样本利用正置荧光显微镜，在荧光激发下，即可观察到的活体生物数量。
2.根据权利要求1的快速鉴别水中10-50微米活体生物的方法,其特征在于:所述步骤(1)将样本的生物密度进行调整，调整后的生物密度为103-104cell/mL。
3.根据权利要求1的快速鉴别水中10-50微米活体生物的方法,其特征在于:所述步骤(2)分别加入FDA和CMFDA染剂的添加量为使样本中染剂的最终浓度分别为4～6μmol/L和2～3μmol/L。
4.根据权利要求1的快速鉴别水中10-50微米活体生物的方法,其特征在于:所述步骤(2)染剂的常温避光染色5-10min。
5.根据权利要求1的快速鉴别水中10-50微米活体生物的方法,其特征在于:所述步骤(3)中的荧光激发的条件为，激发光为465-495nm，吸收光为515-555nm。
6.根据权利要求1的快速鉴别水中10-50微米活体生物的方法,其特征在于:所述步骤(3)中的荧光激发的曝光时间应控制在40～50ms。
7.根据权利要求1的快速鉴别水中10-50微米活体生物的方法,其特征在于:所述步骤(3)中的观察记录的时间为10-20min。
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