CN104345052B - 一种荧光负染法检测活细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种荧光负染法检测活细胞的方法，荧光染色试剂将全细胞染色，细胞吞噬有不透光的纳米粒子颗粒时，纳米粒子颗粒富集于吞噬体内，由于纳米铁颗粒阻断了检测光线，使其在荧光图像上表现为荧光负染区，根据负染区的大小可方便判断出细胞对纳米粒子的吞噬率，而不影响细胞的活性。本发明细胞标记检测方法的CFSE荧光负染法可以用于纳米铁标记细胞后标记率与标记量的检测，用于评价纳米铁类新型药物的药效学与药代动力学分析，且本方法不需对细胞进行固定，CFSE染色简单方便，保持了细胞的活力。

Description

一种荧光负染法检测活细胞的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种细胞标记检测方法，尤其涉及一种动态检测单个活细胞吞噬超顺磁性氧化铁纳米粒子的方法。

背景技术

随着纳米材料研究的快速发展，细胞磁标记成为近年来影像学领域的研究热点。超顺磁性氧化铁纳米粒子(superparamagnetic iron oxide，SPIO)是一种新型磁共振对比剂，体外加入细胞培养体系，可被细胞摄入，回输体内后用于活体示踪，借助MRI手段可以在各种损伤修复研究中观察移植后的细胞在体内的移行、定植等情况，在间充质干细胞、脐血干细胞、神经干细胞等研究中得到了广泛应用。SPIO在一定浓度下使用很安全，不影响细胞的生物学功能，并且可以通过生物降解的形式进入铁代谢循环。在体外，应用SPIO标记细胞后，对其标记情况的检测目前多通过普鲁士蓝染色方法，可以将细胞内摄取的SPIO清析地以醒目的蓝色标示出来[2-4]。但经过普鲁士蓝染色后，细胞即失去活力，不适用于珍贵细胞样本的抽样检测，并且不能进行动态观察。为此，我们尝试利用SPIO不透光的特性，以荧光染料羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记细胞，在荧光显微镜下观察其负染区域，借以判断细胞对SPIO的摄取效率。

荧光染色试剂(荧光探针)是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，可以标记活体细胞，不影响细胞的增殖能力。荧光探针CFSE(CFDA-SE)即羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯能够轻易穿透细胞膜，在活细胞内不可逆地与胞内蛋白共价结合，水解后释放出绿色荧光，用流式细胞仪或荧光显微镜在490nm激发光处可对其进行分析。荧光探针CFSE进入细胞后定位于细胞膜、细胞质和细胞核，在细胞核的荧光染色最强。CFSE标记的细胞用于体内观察可以长达数周之久，常被用来做活体细胞检测实验和用荧光电镜观察细胞长期活动的实验。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种细胞标记检测的荧光负染法。

为解决上述技术问题，本发明提供一种荧光负染法检测活细胞的方法，包括以下步骤：

(1)将不透光的磁性纳米粒子加入细胞悬液中，混合均匀，室温孵育进行标记；

(2)在标记细胞溶液中，加入活细胞荧光染色试剂进行染色，然后用PBS溶液洗涤2-4次去上清，保留沉淀部分；

(3)将前述沉淀部分的标记染色细胞在显微镜下进行检测。

本发明的优选技术方案中，所述步骤(1)中的磁性纳米粒子选自氧化铁纳米粒子、氧化钙纳米粒子。

本发明的优选技术方案中，所述步骤(1)中的室温孵育时间为6～24h。

本发明的优选技术方案中，所述步骤(2)中的荧光染色试剂选自CFSE荧光染料。

本发明的优选技术方案中，所述步骤(3)中的标记染色细胞在荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜及其配套的活细胞工作站下进行检测。

本发明的优选技术方案中，所述细胞为原代或传代培养细胞。

本发明的优选技术方案中，在所述的步骤(1)标记细胞后，当所述的磁性纳米粒子选用氧化铁纳米粒子时，可用普鲁士蓝染色法对细胞标记情况进行检验。

本发明中的“细胞培养基”是指适于培养各种动物细胞的培养基，针对不同种类的生物细胞及不同的组织的细胞，包括但不限于DMEM、PRMI-1640、F-10、MEM、F-12、DMEM/F-12等系列培养基等，且培养基的具体组份可以根据需要有所调整。

本发明中“细胞”包括现有技术中可与磁性纳米粒子标记结合的哺乳动物细胞，包括巨噬细胞、干细胞、人骨髓基质细胞、大鼠少突胶质前体细胞、小鼠纤维母细胞、小鼠肌前体细胞等。

SPIO标记细胞后，对其标记率的检测手段单一，目前多通过普鲁士蓝染色方法。普鲁士蓝反应检测细胞内铁的原理是：细胞经4％多聚甲醛固定后，细胞内源性铁，如幼红细胞胞浆内的铁、网状细胞及造血岛内铁粒，及细胞内外源性铁，如SPIO标记的MSC，在酸性条件下，可与亚铁氰化钾起反应，产生蓝色普鲁士蓝沉积。普鲁士蓝染色检测细胞内铁的方法较为成熟，但其不利之处在于该方法不能用于观察活细胞对SPIO的摄取。

理论上，细胞吞噬的纳米铁越多，对检测光线的阻断率越高。CFSE将全细胞染为绿色，细胞内吞噬有SPIO时，SPIO富集于吞噬体内，由于SPIO阻断了检测光线，使其在荧光图像上表现为荧光负染区，根据负染区的大小可方便判断出细胞对SPIO的吞噬率，而不影响细胞的活性。CFSE荧光负染法检测细胞对纳米铁的摄取量则是对单个细胞的分析，因此不受体系中细胞数量的影响，且体系中的细胞外残余铁不会影响检测结果。

本发明的优点：(1)本发明的一种荧光负染法检测活细胞的方法，荧光染色试剂将全细胞染色，细胞吞噬有不透光的纳米粒子颗粒时，纳米粒子颗粒富集于吞噬体内，由于纳米铁颗粒阻断了检测光线，使其在荧光图像上表现为荧光负染区，根据负染区的大小可方便判断出细胞对纳米粒子的吞噬率，而不影响细胞的活性，因此可以用于纳米粒子标记细胞后标记率与标记量的检测，用于评价不透光的磁性纳米粒子类新型药物的药效学与药代动力学分析。

(2)本发明细胞标记检测方法的荧光负染法用于检测单个活细胞吞噬磁性纳米粒子最大的优点是不需对细胞进行固定，染色简单方便，保持了细胞的活力。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

图1A1为对照组(没有吞噬纳米铁粒子的细胞)CFSE荧光染色检测的成像，图1A2为放大图；图1B1为本发明对实验组(吞噬纳米铁粒子的细胞)进行CFSE荧光负染法的成像，图1B2为放大图；图1C1为普鲁士蓝染色法检测细胞对纳米铁粒子的吞噬情况，图1C2为放大图。

图2A,2B为对照组(没有吞噬纳米铁粒子的细胞)CFSE荧光染色情况,图2C,2D为实验组SPIO标记好的细胞CFSE荧光负染后的图像，荧光显微镜观察细胞断面(白色虚线)的荧光强度曲线；其中绿色曲线的波谷代表CFSE荧光负染区(白色箭头示)。

图3为台盼蓝染色法检测吞噬了纳米铁粒子并经CFSE染色的细胞的活性；黑色箭头代表台盼蓝染色阳性的死细胞。

图4为应用激光共聚焦显微镜进行荧光负染法检测细胞对纳米铁的摄取；白色箭头指示的荧光负染区代表细胞所摄取的SPIO。

图5本发明的CFSE荧光负染法检测原理示意图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书所详细描述的本发明。

实验材料及仪器：

RAW264.7细胞(上海博谷)，CFSE(东仁化学)，SPIO(SINEREM)。

荧光显微镜(FM)TE2000-E型(日本Nikon公司)；激光扫描共聚焦显微镜(德国Leica公司)。

实施例1：SPIO标记小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞

取生长良好的RAW264.7细胞，将SPIO(终浓度为25～50μg/ml)加入细胞培养体系，置37℃、5％CO₂培养箱孵育6～24h，SPIO对细胞的标记率接近100％，对细胞的活力、生长、分化及其他生物活性无不利影响，且无明显细胞毒性。

实施例2：细胞爬片的普鲁士蓝染色方法

将无菌盖玻片置于六孔培养皿内，加入SPIO标记好的RAW264.7细胞，制备细胞爬片，经4％多聚甲醛固定10min；蒸馏水洗涤2次，每次2min，洗后晾干；将细胞爬片置入Perls液(配制：20％亚铁氰化钾水溶液25ml，2％盐酸水溶液25ml。两液分别配制贮存，临用前等量混合，过滤后使用)浸染30min；蒸馏水充分冲洗；0.2％核固红(配制：硫酸铝10g溶于蒸馏水100ml中，待溶解后加入核固红0.2g混匀，并放在37℃水浴箱内1小时，时时振荡使其充分溶解后过滤使用)复染20～30min，蒸馏水冲洗，晾干。染色结果判断：阴性(－)，未见蓝色铁颗粒；阳性(+)，含蓝色铁颗粒1-2颗；阳性(++)，含蓝色铁颗粒3-5颗；强阳性(+++)，含蓝色铁颗粒6-10颗，或1-4个粗大颗粒；强阳性(++++)，含蓝色铁颗粒10颗以上，或5个以上粗大颗粒。

结果如图2C所示，普鲁士蓝将细胞内吞噬的SPIO标记为醒目的蓝色，核固红将细胞核标记为红色。每个细胞内含蓝色铁颗粒在10颗以上，染色结果呈强阳性(++++)。

实施例3：CFSE荧光负染检测活细胞摄取SPIO

准备SPIO标记好的RAW264.7细胞悬液，用合适的培养基调整细胞浓度至约107个/ml。取1ml细胞悬液至试管中，加入适量CFSE工作液，轻轻搅拌混匀(CFSE的终浓度设定终浓度为0.1～2μM，具体由预实验结果确定最佳染色浓度)，在37℃培养箱中培养15～30分钟。离心后去上清，加入2mlPBS溶液，再离心后去上清，重复此操作一次。加入合适的培养基制成细胞悬液。滴10μl的细胞悬液在载玻片上，用荧光显微镜观察。结果判定标准：阴性(－)，未见荧光负染区；阳性(+)，含荧光负染区1-2个；阳性(++)，含荧光负染区3-5个；强阳性(+++)，含荧光负染区6-10个，或1-4个粗大荧光负染区；强阳性(++++)，含荧光负染区10个以上，或5个以上粗大荧光负染区。

对照组(没有吞噬纳米铁粒子的细胞)染色结果如图1A2所示，CFSE将对照组全细胞染为绿色，荧光分布均匀。实验组(SPIO标记好的RAW264.7细胞)染色结果如图1B2所示，细胞吞噬有纳米铁颗粒时，纳米铁颗粒富集于吞噬体内，由于纳米铁颗粒阻断了检测光线，使其在荧光图像上表现为荧光负染区，呈筛孔状。每个细胞内含荧光负染区在10个以上，染色结果呈强阳性(++++)。CFSE荧光负染法与普鲁士蓝染色法的检测结果具有很好的对应性。

图2B所示为对照组经CFSE染色后，荧光显微镜观察细胞断面(白色虚线)的荧光强度曲线(绿色曲线)，其波型较为平滑。图2D所示为实验组(SPIO标记好的RAW264.7细胞)经CFSE荧光负染后，荧光显微镜观察细胞断面(白色虚线)的荧光强度曲线(绿色曲线)，其波形呈波动剧烈的指状，波谷即对应CFSE荧光负染区(白色箭头示)，代表细胞所吞噬的SPIO。根据荧光强度曲线的形态，可以方便的识别细胞对SPIO的摄取。

实施例4：台盼蓝染色法检测CFSE荧光负染细胞活力

台盼蓝主要用来鉴定原代培养细胞时，细胞分离后的存活情况，用0.4％台盼蓝直接染色，在显微镜下观察即可。细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA结合，使其着色。而活细胞能阻止染料进入细胞内。故可以鉴别死细胞与活细胞。4％台盼蓝母液配置：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4℃保存。使用时，用PBS稀释至0.4％。染色方法：制备单细胞悬液，适当稀释(106细胞/ml)；将细胞悬液与0.4％台盼蓝溶液以9:1混合混匀；在三分钟内，在显微镜下观察，用计数板分别计数活细胞和死细胞，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。根据下式计算细胞活力：活细胞率(％)＝活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100。

结果如图3所示，RAW264.7细胞经过SPIO和CFSE双重标记后，对细胞活力的影响较小，死细胞比例较低，活细胞率为95～98％。

实施例5：应用激光扫描共聚焦显微镜进行荧光负染法检测RAW264.7细胞对SPIO的摄取

按实施例1和实施例2所述方法对RAW264.7细胞进行SPIO和CFSE双重标记，将标记好的细胞转移置激光扫描共聚焦显微镜专用培养皿，应用激光扫描共聚焦显微镜观察荧光负染情况。

结果如图4所示，应用激光扫描共聚焦显微镜进行荧光负染法检测RAW264.7细胞对SPIO的摄取，结果更为清晰，荧光染色区与荧光负染区对比强烈，代表SPIO吞噬泡的荧光负染区呈明显的筛孔状。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实例的限制，上述实例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (4)

1.一种荧光负染法检测小鼠巨噬细胞RAW264.7摄取SPIO的方法，包括以下步骤：

(1)将不透光的超顺磁性氧化铁纳米粒子SPIO加入细胞悬液中，混合均匀，室温孵育进行标记；

(2)在标记细胞溶液中，加入活细胞荧光染色试剂CFSE荧光染料进行染色，然后用PBS溶液洗涤2-4次去上清，保留沉淀部分；

(3)将前述沉淀部分的标记染色细胞在荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜及其配套的活细胞工作站下进行检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的室温孵育时间为6～24h。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞为原代或传代培养细胞。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述的步骤(1)标记细胞后，用普鲁士蓝染色法对细胞标记情况进行检验。