CN112011513B - 基于生物正交化学法捕获高纯度循环肿瘤细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于生物正交化学法捕获高纯度循环肿瘤细胞的方法,包括以下步骤:S1.制备超顺磁性四氧化三铁纳米粒子;S2.制备仿生磁性囊泡;S3.仿生磁性囊泡的功能化修饰;S4.肿瘤细胞表面生长叠氮基因;S5.循环肿瘤细胞的捕获。本发明将超顺磁性四氧化三铁纳米粒子与巨噬细胞孵育后,可通过小鼠巨噬细胞经过类似外泌体释放的途径,产生仿生磁性囊泡,随后进行功能化修饰;肿瘤细胞则预先通过自身细胞内新陈代谢在细胞膜表面生成功能化基团,与功能化后的磁性囊泡孵育,两个功能基团通过生物正交化学结合,实现对循环肿瘤细胞的捕获,该方式具有运用到液体活检方面的潜力。
Description
技术领域
本发明属于生物医学材料技术领域,具体涉及一种基于生物正交化学法捕获高纯度循环肿瘤细胞的方法。
背景技术
循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells,CTCs)是指存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称,主要指自发或因诊疗操作脱离实体瘤原发灶或转移灶而进入外周血循环的肿瘤细胞。CTCs在逃避机体的免疫杀伤而存活下来后,可随血液播散后转运到远端组织渗出,在各类生长因子的作用下,适应新的微环境,在其他部位形成新的转移灶。循环肿瘤细胞在外周血中十分稀少,同时在形态和类别上存在一定的异质性,如肿瘤细胞在进入外周血循环的过程中会发生上皮-间质转变。由于CTCs所存在的血液环境中,含有大量的白细胞和血浆蛋白等物质,这些物质的存在经常会导致捕获平台出现诸如CTCs纯度低、灵敏度和特异性差等缺陷。
免疫磁珠分离是富集CTCs的一种重要方法,表面修饰的磁珠标记CTCs后,通过外加磁场作用,使CTCs被迅速分离。由于CTCs的异质性且存在于血液中,设计免疫磁珠平台分离CTCs时,需要考虑到免疫磁珠的抗非特异性吸附能力以及对不同类型/亚型CTCs的富集。当前,人们广泛运用单克隆抗体或适配子识别肿瘤细胞表面抗原或相关受体来捕获CTCs。一方面,抗体等物质价格昂贵,易脆弱,储存和工作条件较为苛刻;另一方面,单一的抗体或适配子不能实现对所有CTCs的识别标记。例如抗上皮细胞粘附分子(anti-EpCAM)可识别高表达上皮粘附分子的肿瘤细胞,但对于EpCAM表达下调或来源于非上皮性肿瘤的CTCs,修饰抗上皮细胞粘附分子(anti-EpCAM)的磁珠则不能实现对这一类CTCs有效的捕获和富集。
发明内容
本发明的目的在于:针对上述现有技术中存在的不足,提供一种基于生物正交化学法捕获高纯度循环肿瘤细胞的方法。
本发明采用的技术方案如下:
一种基于生物正交化学法捕获高纯度循环肿瘤细胞的方法,包括以下步骤:
S1.制备超顺磁性四氧化三铁纳米粒子;
S2.将S1所得超顺磁性四氧化三铁纳米粒子与巨噬细胞共孵育,制备仿生磁性囊泡;
S3.对S2制得的仿生磁性囊泡表面功能化修饰;
S4.将癌细胞接种在培养基中孵育70-80h,离心收集细胞,并清洗2-3次;
S5.体外样本循环肿瘤细胞捕获:将S4所得细胞制为细胞悬液再加入S3所得表面功能化的仿生磁性囊泡,或将S4所得细胞的细胞核染色并加入巨噬细胞悬液中后再向其中加入S3所得表面功能化的仿生磁性囊泡;然后在震荡条件下孵育30-50min,随后进行磁分离,用DPBS清洗2-3次,收集上清液;
动物血液样本循环肿瘤细胞捕获:将S4所得细胞打入动物体内,建立动物模型,收集动物血液,再向血液中立即加S3所得表面功能化的仿生磁性囊泡,在37℃孵育1-2h,采用磁分离收集细胞,并用PBS清洗。
进一步地,体外样本循环肿瘤细胞捕获包括:
细胞系捕获:将S4所得细胞计数并制成细胞悬液,加入S3所得表面功能化的仿生磁性囊泡,震荡条件下孵育30-50min,随后进行磁分离,用DPBS清洗2-3次,收集上清液,对上清液中的细胞进行计数,通过以下公式计算捕获效率:
其中,N0代表初始细胞悬液中细胞总数,N1代表磁分离后上清液中细胞总数目;
极少量细胞捕获:将S4所得细胞的细胞核染色,用DPBS稀释后加入巨噬细胞悬液中并涡旋均匀,再加入S3所得表面功能化的仿生磁性囊泡,振荡孵育30-50min后磁分离,并用DPBS清洗2-3次,对磁分离细胞悬液,通过标记的细胞核荧光信号识别肿瘤细胞并计数,捕获效率计算方式如下:
其中,A0代表最初加入到巨噬细胞悬液中的肿瘤细胞数目,A1代表在捕获得到的肿瘤细胞数目。
进一步地,动物血液样本循环肿瘤细胞捕获具体为:
将S4所得细胞分别打入Balb/c裸鼠背部,建立小鼠皮下瘤模型;在肿瘤部位注射Ac4ManNAz,随后通过摘除眼球取血的方式收集小鼠血液,再向血液中立即加S3所得表面功能化的仿生磁性囊泡,在37℃孵育1-2h,采用磁分离收集细胞,用PBS清洗,对细胞核染色,然后分析循环肿瘤细胞的数目。
在生物正交化学中,通过活细胞自身的生物化学过程实现在细胞膜上特定生物分子的形成。肿瘤细胞与Ac4ManNAz孵育后,可在肿瘤细胞表面形成大量的叠氮基团,生长出的叠氮基团可以和环辛炔类化合物(如DBCO)通过点击反应进行结合,从而在忽略肿瘤细胞表型差异的基础上,为肿瘤细胞的识别和标记提供一种新的思路。
细胞膜修饰的磁珠捕获平台能够有效提升富集后CTCs的纯度。将尺寸固定的磁性纳米粒子与细胞孵育后,伴随细胞外囊泡的释放,磁球被包裹在细胞外囊泡中一同被释放,形成磁性囊泡,这种在超顺磁性四氧化三铁纳米粒子外围修饰细胞膜的新途径,使得磁球表面具有与母细胞细胞膜类似的特性,继承了母细胞细胞膜的磷脂结构、膜蛋白和糖苷等,与传统的通过机械外力提取细胞膜,再与磁球挤出结合的方式相比,这种程序化形成细胞膜的方法表现出更好的表面结构完整性,更有利于保护内部物质不被降解和生理屏障的跨越等,从而将抗非特异性吸附功能最大发挥。
进一步地,S1具体制备方式为:将六水三氯化铁溶解在乙二醇中,边搅拌边加入柠檬酸钠,最后加入醋酸铵,室温下磁搅拌1-3h后置于180-250℃条件下保温15-20h,冷却,再采用磁分离法收集沉积物,并用乙醇和去离子水清洗3-5次,最后再次磁分离,即得。
进一步地,六水三氯化铁、柠檬酸钠和醋酸铵的质量比为2-3:1:8-9;优选为2.89:1:8.26。
进一步地,S2具体制备方式为:将巨噬细胞接种在含有10wt%胎牛血清和1wt%链霉素-青霉素的DMEM培养基中,于37℃、5%CO2的条件下培养40-50h;移除原培养液,用磷酸盐缓冲液清洗2-3次,加入含有S1制得的超顺磁性四氧化三铁纳米粒子和柠檬酸钠的无血清DMEM培养基孵育2-3h,再用无血清DMEM培养基清洗2-3次,再加入无血清DMEM培养基继续培养45-55h,取上清液,用无血清DMEM培养基清洗2-3次,离心并弃去沉淀,对上清液进行磁分离,收集磁分离产物,并用磷酸盐缓冲液清洗2-3次,即得。
进一步地,巨噬细胞为小鼠巨噬细胞J774A.1、P338D1、S774A.1或RAW264.7;超顺磁性四氧化三铁纳米粒子的浓度为0.2-0.3mg/mL,柠檬酸钠的浓度为1.2-1.35mg/mL。
进一步地,S3具体制备方式为:将S2所得仿生磁性囊泡分散在含有DSPE-PEG-DBCO的磷酸盐缓冲液中,室温下震荡2h,再通过磁分离回收,并用PBS清洗三次,即得。
进一步地,S4中人肺癌细胞和人肝癌细胞分别为A549和HepG2,也可采用其他肿瘤细胞;分别接种在含有Ac4ManNAz的培养基中进行孵育。
进一步地,S5中细胞悬液浓度为1×105-1×107/mL,优选为1×106/mL。
进一步地,S5中采用Hoechst33342染色细胞核。
进一步地,S5中建立动物肿瘤模型后向动物肿瘤部位注射50mM的Ac4ManNAz50μL,每天一次,共注射四次,然后再收集动物血液。
综上所述,由于采用了上述技术方案,本发明的有益效果是:
1、本发明利用水热法合成超顺磁性四氧化三铁纳米粒子,具有良好的磁响应行为,粒径分布较为均一,水相中分散性良好;
2、本发明制备的仿生磁性囊泡,由巨噬细胞通过类似细胞外泌体形成途径进行构建,在更换培养基后静置即可让细胞自主释放磁性囊泡,无需其他人工操作;
3、本发明制备的仿生磁性囊泡,捕获细胞后,通过磁分离收集细胞,所需条件简单,回收效率高,操作便捷;
4、本发明制备的仿生磁性囊泡,表面具有细胞膜的一些基本性质,具有潜在良好的生物抗污性能,在血液样本中具有抗非特异性吸附的功能;
5、本发明中通过加入Ac4ManNAz与细胞孵育,不同类型肿瘤细胞表面均可生长出叠氮基团以作为标志物,即人造靶点,这有利于克服捕获不同类型和不同亚型的肿瘤细胞时因本身表型差异带来的困难;
6、本发明中仿生磁性囊泡表面修饰的DBCO,可与细胞表面生长的叠氮基团通过点击反应结合,可用于捕获不同类型和亚型肿瘤细胞,且反应过程无需其他有机试剂和催化剂,反应效率高;
7、本发明采用的生物正交策略,避免了传统的单一免疫亲和(如抗原-抗体结合)作用受到的表型变化的局限,依然具有高效捕获效率的同时,扩大了捕获肿瘤细胞的范围。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为基于生物正交化学捕获循环肿瘤细胞示意图;
图2为仿生磁性囊泡(Fe3O4 MVs)的透射电镜图;
图3为功能化的磁性囊泡(Fe3O4 MVs-DBCO)与FITC-PEG-N3结合后荧光成像图;
图4为功能化的磁性囊泡(Fe3O4 MVs-DBCO)的粒径分布图;
图5为功能化的磁性囊泡(Fe3O4 MVs-DBCO)的磁回收效率图;
图6为不同细胞表面生长叠氮示意图及验证;
图7为图为Fe3O4 NPs,Fe3O4 MVs,Fe3O4 MVs-DBCO对A549和HepG2的捕获效率统计对比图;(*P<0.01)
图8为Fe3O4 NPs,Fe3O4 MVs,Fe3O4 MVs-DBCO对极少量肿瘤细胞的捕获效率统计图;
图9为荷瘤小鼠血液与Fe3O4 MVs-DBCO孵育后,肿瘤细胞扫描电镜图;
图10为荷瘤小鼠血液与Fe3O4 MVs-DBCO孵育后,白细胞扫描电镜图;
图11为分别从肝癌和肺癌荷瘤小鼠血液中捕获得到的循环肿瘤细胞(免疫染色后荧光图);
图12为分别从肝癌和肺癌荷瘤小鼠血液中捕获得到的CTCs数目统计和非特异性吸附的白细胞数目统计;
图13为不同肿瘤体积的荷瘤小鼠CTCs数目分布图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明,即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此,以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围,而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例,本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
需要说明的是,术语“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来,而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且,术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含,从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素,而且还包括没有明确列出的其他要素,或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下,由语句“包括一个……”限定的要素,并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本发明较佳的实施例提供一种基于生物正交化学法捕获高纯度循环肿瘤细胞的方法,具体步骤如下:
(1)超顺磁性四氧化三铁纳米粒子(Fe3O4 NPs)的制备
将FeCl3·6H2O溶解在乙二醇中,搅拌过程中继续加入柠檬酸钠(Na3CT),最后加入醋酸铵(NH4Ac),磁搅拌1h后将混合物转移至不锈钢高压釜中,在200℃条件下保温16h。冷却后采用磁分离法收集沉积物,并用乙醇和去离子水彻底清洗四次,最后磁分离获取Fe3O4纳米粒子超顺磁性四氧化三铁纳米粒子。其中FeCl3·6H2O,Na3CT,NH4Ac的质量比为2.89:1:8.26。通过马尔文激光粒度仪测定载药杂化纳米粒子的粒径及表面电位,Fe3O4 NPs的水合粒径在380nm左右,分布范围较窄,尺寸大小较为均一。Fe3O4 NPs的饱和磁化强度在60emug-1左右。
(2)仿生磁性囊泡的制备
小鼠巨噬细胞(J774A.1)采用含有10wt%胎牛血清和1wt%链霉素-青霉素的DMEM完全培养基培养,培养过程中需将细胞置于37℃、5%CO2的培养箱中。将1×106的J774A.1细胞接种在培养皿(φ=100mm)中,在上述培养条件下培养48h。移除原培养液,用磷酸盐缓冲液清洗三次,加入10mL含有Fe3O4 NPs(2.8mg)和柠檬酸钠(12.9mg)的无血清DMEM培养基孵育两小时。孵育完毕后吸走培养基,加入无血清培养基清洗三次。细胞清洗完毕后,再次加入无血清培养基继续在培养箱中培养48h。小心吸取培养皿中上清液,用无血清DMEM培养基清洗两次,保留上清。所有上清液离心(1200rpm,5min)后,弃去沉淀,保留上清液。上清液用永磁铁进行磁分离,收集磁分离产物,并用磷酸盐缓冲液清洗三次,最后分散在磷酸盐缓冲液中低温保存。
由图2透射电镜图结果可知,放大囊泡局部发现其边缘存在低对比度薄层,厚度约为20nm,表明磁性囊泡的有效制备。
(3)仿生磁性囊泡的功能化修饰
将仿生磁性囊泡分散在含有DSPE-PEG-DBCO(50μM)的磷酸盐缓冲液中,室温下震荡2h。通过磁分离回收表面功能化的磁性囊泡(Fe3O4 MVs-DBCO),并用PBS清洗三次,最后加入新的PBS分散,低温保存。
将Fe3O4 MVs-DBCO分散在含有FITC-PEG-N3(50μM)的PBS溶液中,振荡孵育1h后,磁分离清洗三次,用新的PBS重新分散,置于荧光成像仪下成像(Fe3O4 MVs为对照)。
如图3所示,与Fe3O4 MVs相比,Fe3O4 MVs-DBCO呈现出明显绿色荧光信号,表明磁性囊泡表面存在大量DBCO,且可与叠氮基团发生反应。
利用马尔文激光粒度仪测试Fe3O4 MVs-DBCO粒径分布,如图4所示,水合粒径在600nm左右。
(4)功能化仿生磁性囊泡(Fe3O4 MVs-DBCO)的磁响应性及回收效率
将2mLFe3O4 MVs-DBCO分散液(1mg/mL)置于石英皿中,一侧放置永磁铁,在设定时间取少量体积分散液测定紫外吸收值,根据标准曲线计算分散液中Fe3O4 MVs-DBCO含量,计算60s时间内Fe3O4 MVs的回收效率,并记录30s时刻的图像。如图5所示,与最初时刻相比,30s后分散液已澄清透明,棕色物质吸附在靠近磁铁一侧,一分钟后回收效率超过90%。
(5)肿瘤细胞生长叠氮基团
将人肺癌细胞A549和人肝癌细胞HepG2分别接种在超低吸附培养皿中,加入含有Ac4ManNAz的培养基,使其最终浓度为50μM,放入培养箱中孵育72h,最后1200rpm离心5min收集细胞,并用DPBS清洗三次。
如图6所示,肿瘤细胞在加入甘露糖胺Ac4ManNAz孵育后,通过细胞内的新陈代谢糖工程化过程,最终在表面生长出叠氮。
将Cy5标记的DBCO(20μM)加入到上述培养液中,30min后取出并用DPBS清洗三次,在共聚焦显微镜下进行观察。如图6所示,预先与Ac4ManNAz作用过的A549和HepG2细胞呈现出明显荧光信号,未与Ac4ManNAz孵育的肿瘤细胞膜表面未见荧光信号。
(6)1.肿瘤细胞系的捕获
将(5)中的细胞通过细胞计数仪计数,准备成1×106/mL的细胞悬液,加入40μg的表面功能化磁性囊泡(Fe3O4 MVs-DBCO),震荡条件下孵育40min,随后对细胞-材料混合液进行磁分离,用DPBS清洗三次,收集磁分离后的上清液,对上清液中的细胞进行计数,通过下方公式计算捕获效率:
其中,N0代表初始细胞悬液中细胞总数,N1代表磁分离后上清液中细胞总数目。Fe3O4NPs,Fe3O4 MVs为对照组。
如图7所示,与Fe3O4 NPs,Fe3O4 MVs相比,Fe3O4 MVs-DBCO呈现出明显高的捕获效率,且对A549和HepG2两种类型细胞均有较高捕获效率。值得注意的是,Fe3O4 MVs捕获效率低于Fe3O4 NPs,表明仿生磁性囊泡有利于降低非特异性吸附。
(6)2.肿瘤细胞系的捕获
将(5)中的肿瘤细胞利用Hoechst 33342将细胞核染色,用DPBS分别稀释至每20μL含有5,10,20,100,200个细胞,随后加入到1×106/mL的J774A.1细胞悬液中并涡旋均匀。向上述混合细胞中加入30μg Fe3O4 MVs-DBCO,振荡孵育40min后磁分离,并用DPBS清洗三次,对磁分离细胞悬液,在倒置荧光显微镜下通过Hoechst 33342标记的细胞核荧光信号识别肿瘤细胞并计数。捕获效率计算方式如下:
其中,A0代表最初加入到J774A.1细胞悬液中的肿瘤细胞数目,A1代表捕获得到的肿瘤细胞数目。
如图8所示,在J774A.1细胞悬液中加入5-200个肿瘤细胞后,Fe3O4 MVs-DBCO均能捕获到一定数量的肿瘤细胞,捕获效率(~75%)高于Fe3O4 NPs(2.0%)和Fe3O4 MVs(1.3%),在肿瘤细胞数目仅为5个时,仍能捕获到CTC。
(6)3.荷瘤小鼠血液样本循环肿瘤细胞捕获
将A549细胞和HepG2细胞分别打入Balb/c裸鼠背部,建立小鼠皮下瘤模型。待肿瘤生长至一定体积大小后,在肿瘤部位注射Ac4ManNAz(50mM,50μL,每天一次,共注射四次),随后通过摘除眼球取血的方式收集小鼠血液,随后向血液中立即加入Fe3O4 MVs-DBCO,在37℃环境中孵育1h,磁分离收集细胞。将富集得到的细胞用PBS清洗后转移至载玻片上,依次进行固定、破膜、染色、封片等操作。其中染色步骤中,加入Anti-CK-FITC antibody以标记循环肿瘤细胞(CTCs),加入Alexaanti-mouse-H-2Kd antibody以标记来自血液的白细胞(WBCs),最后利用Hoechst 33342对细胞核染色。获取的细胞爬片在共聚焦显微镜下进行区域扫描,根据荧光信号特点分析CTCs和WBCs的数目。
将制备的细胞爬片置于扫描电镜下观察,如图9所示,肿瘤细胞表面存在大量磁球,表明CTCs与Fe3O4 MVs-DBCO有效结合,Fe3O4 MVs-DBCO可识别并富集CTCs;图10中细胞表面并无大量磁球存在,表明Fe3O4 MVs-DBCO可特异性识别CTCs,抗非特异性性能良好。
如图11所示,分别从肝癌和肺癌荷瘤小鼠血液中捕获得到的循环肿瘤细胞,其免疫荧光染色特征为DAPI+,CK+,CD45-,图11为荧光信号叠加结果;
如图12所示,从肺癌荷瘤小鼠血液中捕获得到的CTCs数目为3-70,白细胞数目(WBC)为14-651,从肝癌荷瘤小鼠血液中捕获得到的CTCs数目为4-63,白细胞(WBC)数目为5-757。Fe3O4 MVs-DBCO通过生物正交化学捕获不同类型的CTCs。
实施例2
本发明较佳的实施例提供一种基于生物正交化学法捕获高纯度循环肿瘤细胞的方法,具体步骤如下:
(1)超顺磁性四氧化三铁纳米粒子(Fe3O4 NPs)的制备
将FeCl3·6H2O溶解在乙二醇中,搅拌过程中继续加入柠檬酸钠(Na3CT),最后加入醋酸铵(NH4Ac),磁搅拌1h后将混合物转移至不锈钢高压釜中,在220℃条件下保温18h。冷却后采用磁分离法收集沉积物,并用乙醇和去离子水彻底清洗三次,最后磁分离获取Fe3O4纳米粒子超顺磁性四氧化三铁纳米粒子。其中FeCl3·6H2O,Na3CT,NH4Ac的质量比为2.92:1:8.31。
(2)仿生磁性囊泡的制备
小鼠巨噬细胞(J774A.1)采用含有10wt%胎牛血清和1wt%链霉素-青霉素的DMEM完全培养基培养,培养过程中需将细胞置于37℃、5%CO2的培养箱中。将1×106的J774A.1细胞接种在培养皿(φ=100mm)中,在上述培养条件下培养48h。移除原培养液,用磷酸盐缓冲液清洗三次,加入10mL含有Fe3O4 NPs(2.7mg)和柠檬酸钠(12.8mg)的无血清DMEM培养基孵育两小时。孵育完毕后吸走培养基,加入无血清培养基清洗三次。细胞清洗完毕后,再次加入无血清培养基继续在培养箱中培养48h。小心吸取培养皿中上清液,用无血清DMEM培养基清洗两次,保留上清。所有上清液离心(1200rpm,5min)后,弃去沉淀,保留上清液。上清液用永磁铁进行磁分离,收集磁分离产物,并用磷酸盐缓冲液清洗三次,最后分散在磷酸盐缓冲液中低温保存。
(3)仿生磁性囊泡的功能化修饰
将仿生磁性囊泡分散在含有DSPE-PEG-DBCO(50μM)的磷酸盐缓冲液中,室温下震荡2h。通过磁分离回收表面功能化的磁性囊泡(Fe3O4 MVs-DBCO),并用PBS清洗三次,最后加入新的PBS分散,低温保存。
将Fe3O4 MVs-DBCO分散在含有FITC-PEG-N3(50μM)的PBS溶液中,振荡孵育1h后,磁分离清洗三次,用新的PBS重新分散,置于荧光成像仪下成像(Fe3O4 MVs为对照)。
(4)功能化仿生磁性囊泡(Fe3O4 MVs-DBCO)的磁响应性及回收效率
将2mLFe3O4 MVs-DBCO分散液(1mg/mL)置于石英皿中,一侧放置永磁铁,在设定时间取少量体积分散液测定紫外吸收值,根据标准曲线计算分散液中Fe3O4 MVs-DBCO含量,计算60s时间内Fe3O4 MVs的回收效率,并记录30s时刻的图像。
(5)肿瘤细胞生长叠氮基团
将人肺癌细胞A549和人肝癌细胞HepG2分别接种在超低吸附培养皿中,加入含有Ac4ManNAz的培养基,使其最终浓度为50μM,放入培养箱中孵育72h,最后1200rpm离心5min收集细胞,并用DPBS清洗三次。
将Cy5标记的DBCO(20μM)加入到上述培养液中,30min后取出并用DPBS清洗三次,在共聚焦显微镜下进行观察。
(6)1.肿瘤细胞系的捕获
将(5)中的细胞通过细胞计数仪计数,准备成1×106/mL的细胞悬液,加入40μg的表面功能化磁性囊泡(Fe3O4 MVs-DBCO),震荡条件下孵育40min,随后对细胞-材料混合液进行磁分离,用DPBS清洗三次,收集磁分离后的上清液,对上清液中的细胞进行计数,通过下方公式计算捕获效率:
其中,N0代表初始细胞悬液中细胞总数,N1代表磁分离后上清液中细胞总数目。Fe3O4NPs,Fe3O4 MVs为对照组。
(6)2.肿瘤细胞系的捕获
将(5)中的肿瘤细胞利用Hoechst 33342将细胞核染色,用DPBS分别稀释至每20μL含有5,10,20,100,200个细胞,随后加入到1×106/mL的J774A.1细胞悬液中并涡旋均匀。向上述混合细胞中加入30μg Fe3O4 MVs-DBCO,振荡孵育40min后磁分离,并用DPBS清洗三次,对磁分离细胞悬液,在倒置荧光显微镜下通过Hoechst 33342标记的细胞核荧光信号识别肿瘤细胞并计数。捕获效率计算方式如下:
其中,A0代表最初加入到J774A.1细胞悬液中的肿瘤细胞数目,A1代表捕获得到的肿瘤细胞数目。
(6)3.荷瘤小鼠血液样本循环肿瘤细胞捕获
将A549细胞和HepG2细胞分别打入Balb/c裸鼠背部,建立小鼠皮下瘤模型。待肿瘤生长至一定体积大小后,在肿瘤部位注射Ac4ManNAz(50mM,50μL,每天一次,共注射四次),随后通过摘除眼球取血的方式收集小鼠血液,随后向血液中立即加入Fe3O4 MVs-DBCO,在37℃环境中孵育1h,磁分离收集细胞。将富集得到的细胞用PBS清洗后转移至载玻片上,依次进行固定、破膜、染色、封片等操作。其中染色步骤中,加入Anti-CK-FITC antibody以标记循环肿瘤细胞(CTCs),加入Alexaanti-mouse-H-2Kd antibody以标记来自血液的白细胞(WBCs),最后利用Hoechst 33342对细胞核染色。获取的细胞爬片在共聚焦显微镜下进行区域扫描,根据荧光信号特点分析CTCs和WBCs的数目。
实验例
将实施例1(6)3.荷瘤小鼠按照肿瘤体积大小各分两组,统计每只小鼠对应的CTCs数目,并结合肿瘤体积大小作图分析。
如图13所示,A549荷瘤小鼠血液中CTCs随肿瘤体积增大而减少,HepG2荷瘤小鼠血液中CTCs随肿瘤体积增大而增多。Fe3O4 MVs-DBCO通过生物正交化学有效捕获CTCs,不受肿瘤发展可能带来的CTCs异质性影响。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种基于生物正交化学法捕获高纯度循环肿瘤细胞的方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1.制备超顺磁性四氧化三铁纳米粒子;
S2.将巨噬细胞接种在含有10wt%胎牛血清和1wt%链霉素-青霉素的DMEM培养基中,于37℃、5%CO2的条件下培养40-50h;移除原培养液,用磷酸盐缓冲液清洗2-3次,加入含有S1制得的超顺磁性四氧化三铁纳米粒子和柠檬酸钠的无血清DMEM培养基孵育2-3h,再用无血清DMEM培养基清洗2-3次,再加入无血清DMEM培养基继续培养45-55h,取上清液,用无血清DMEM培养基清洗2-3次,离心并弃去沉淀,对上清液进行磁分离,收集磁分离产物,并用磷酸盐缓冲液清洗2-3次,制备仿生磁性囊泡;
S3.对S2制得的仿生磁性囊泡表面功能化修饰,具体方式为:将S2所得仿生磁性囊泡分散在含有DSPE-PEG-DBCO的磷酸盐缓冲液中,室温下震荡2h,再通过磁分离回收,并用PBS清洗三次,即得;
S4.将癌细胞接种在含有Ac4ManNAz的培养基中孵育70-80h,离心收集细胞,并清洗2-3次;
S5.体外样本循环肿瘤细胞捕获:将S4所得细胞制为细胞悬液再加入S3所得表面功能化的仿生磁性囊泡,或将S4所得细胞的细胞核染色并加入巨噬细胞悬液中后再向其中加入S3所得表面功能化的仿生磁性囊泡;然后在震荡条件下孵育30-50min,随后进行磁分离,用DPBS清洗2-3次,收集上清液;
动物血液样本循环肿瘤细胞捕获:将S4所得细胞注射入动物体内,建立动物肿瘤模型,然后向动物肿瘤部位注射Ac4ManNAz后再收集动物血液,再向血液中立即加S3所得表面功能化的仿生磁性囊泡,在37℃孵育1-2h,采用磁分离收集细胞,并用PBS清洗。
2.根据权利要求1所述的基于生物正交化学法捕获高纯度循环肿瘤细胞的方法,其特征在于,所述S1具体制备方式为:将六水三氯化铁溶解在乙二醇中,边搅拌边加入柠檬酸钠,最后加入醋酸铵,室温下磁搅拌1-3h后置于180-250℃条件下保温15-20h,冷却,再采用磁分离法收集沉积物,并用乙醇和去离子水清洗3-5次,最后再次磁分离,即得。
3.根据权利要求2所述的基于生物正交化学法捕获高纯度循环肿瘤细胞的方法,其特征在于,所述六水三氯化铁、柠檬酸钠和醋酸铵的质量比为2-3:1:8-9。
4.根据权利要求1所述的基于生物正交化学法捕获高纯度循环肿瘤细胞的方法,其特征在于,所述巨噬细胞为小鼠巨噬细胞J774A.1、P338D1、S774A.1或RAW264.7;超顺磁性四氧化三铁纳米粒子的浓度为0.2-0.3mg/mL,柠檬酸钠的浓度为1.2-1.35mg/mL。
5.根据权利要求1所述的基于生物正交化学法捕获高纯度循环肿瘤细胞的方法,其特征在于,所述S4中癌细胞为人肺癌细胞A549和人肝癌细胞HepG2。
6.根据权利要求1所述的基于生物正交化学法捕获高纯度循环肿瘤细胞的方法,其特征在于,所述S5中细胞悬液浓度为1×105-1×107/mL。
7.根据权利要求1所述的基于生物正交化学法捕获高纯度循环肿瘤细胞的方法,其特征在于,所述S5中采用Hoechst33342染色细胞核。
8.根据权利要求1所述的基于生物正交化学法捕获高纯度循环肿瘤细胞的方法,其特征在于,所述S5中建立动物肿瘤模型后向动物肿瘤部位注射50mM的Ac4ManNAz50μL,每天一次,共注射四次,然后再收集动物血液。
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