CN113332951B - 一种高效富集循环肿瘤细胞的磁性纳米材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高效富集循环肿瘤细胞的磁性纳米材料及其制备方法，属于癌症诊断材料技术领域，解决了传统技术中价格昂贵、容易失活、破坏细胞活性的问题，其包括以下步骤：步骤A：将无水三氯化铁、柠檬酸三钠、乙二醇剧烈搅拌15分钟；步骤B：称取1.2g乙酸钠加入步骤A的混合物中，加热搅拌30分钟至完全溶解；步骤C：将步骤B中的混合物聚四氟乙烯衬里高压反应釜中，缓慢升温至200℃，保持反应10小时；步骤D：将步骤C中的混合物的黄色上清液与下层黑色产物取出，反复清洗得到Fe3O4纳米颗粒溶液；步骤E：将CuCl2、TA滴加入步骤D得到的Fe3O4纳米颗粒溶液中，得到磁性纳米颗粒Fe3O4@TA/CuII，实现了对肿瘤细胞的高效分离与无损释放。

Description

一种高效富集循环肿瘤细胞的磁性纳米材料及其制备方法
技术领域
本发明属于癌症诊断材料技术领域，具体涉及一种高效富集循环肿瘤细胞的磁性纳米材料及其制备方法。
背景技术
循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells,CTCs)是指从原发肿瘤病灶脱离进入人体外周循环系统并且在循环血液中存活的肿瘤细胞。它作为肿瘤转移的第一环节，不仅携带着原发肿瘤细胞的全部基因信息，并且在癌症发生的早期就已经存在于外周循环系统，被认为是癌症早期诊断和肿瘤转移检测中一类重要的生物标记物。然而，由于其数量稀少且具有异质性，从复杂血液成分中高效捕获并温和释放CTCs仍充满挑战。
目前，免疫磁分离法由于具有制备简单和易于操作等特点而被广泛应用于CTCs富集，然而该方法采用的识别配体(抗体、适配体、多肽等)存在价格昂贵、容易失活等缺点，并且由于CTCs本身的异质性特点容易引起漏检现象发生。除此之外，目前基于酶解、温控、化学竞争结合等释放CTCs的方法是侵入性的，会破坏细胞活性。
发明内容
针对现有技术中价格昂贵、容易失活、破坏细胞活性的问题，本发明提供一种高效富集循环肿瘤细胞的磁性纳米材料，其目的在于：实现对肿瘤细胞的高效分离与无损释放。
本发明采用的技术方案如下：
一种高效富集循环肿瘤细胞的磁性纳米材料，其特征在于，含有TA-CuII络合物与Fe3O4纳米颗粒，通过TA-CuII络合物修饰在Fe3O4纳米颗粒表面，得到可富集与无损释放循环肿瘤细胞的磁性纳米颗粒。
采用上述方案，其中TA可以与CuII发生螯合作用形成涂层结构，这些涂层结构在细胞培养环境中呈现pH依赖讲解行为，从而实现了无损释放细胞的目的，TA-CuII络合物修饰在Fe3O4纳米颗粒表面的过程中加入TA，其中TA能够对肿瘤细胞呈现强亲和力，而且还能够有效抵抗血液中白细胞和血小板的非特异性粘附，实现了对肿瘤细胞的高效分离。
优选的，所述TA-CuII络合物通过自组装螯合作用吸附于所述Fe3O4纳米颗粒表面
一种高效富集循环肿瘤细胞的磁性纳米颗粒材料的制备方法，包括以下步骤：
步骤A：将无水三氯化铁、柠檬酸三钠、乙二醇剧烈搅拌15分钟；
步骤B：称取1.2g乙酸钠加入步骤A的混合物中，加热搅拌30分钟至完全溶解；
步骤C：将步骤B中的混合物聚四氟乙烯衬里高压反应釜中，缓慢升温至200℃，保持反应10小时；
步骤D：将步骤C中的混合物的黄色上清液与下层黑色产物取出，反复清洗得到Fe3O4纳米颗粒溶液；
步骤E：将CuCl2、TA滴加入步骤D得到的Fe3O4纳米颗粒溶液中，得到磁性纳米颗粒Fe3O4@TA/CuII
优选的，所述步骤E的具体步骤为：
步骤E1：将CuCl2溶液滴加至Fe3O4纳米颗粒溶液中，缓慢搅拌1分钟
步骤E2：将TA滴加入步骤E1得到的混合物中；
步骤E3：将步骤E2得到的混合物的pH值调节至碱性；
步骤E4：将步骤E3中调制碱性的混合物进行磁铁吸附清洗与RO水清洗，得到磁性纳米颗粒Fe3O4@TA/CuII。
采用上述方案，通过水热法合成Fe3O4纳米磁性颗粒具备快速磁响应性能，加入的TA与CuII，在碱性条件下可利用TA与CuII之间的配位自组装作用快速形成络合物涂层，并物理吸附于表面，其络合物涂层能够分离肿瘤细胞与血小板、白细胞等血液组分，通过该种方法制备出的磁性纳米颗粒Fe3O4@TA/CuII不仅拥有良好的磁响应性能，还能够实现肿瘤细胞的广谱捕获与无损释放，该种反应调节简单且材料成本低廉，能够在生物材料制备过程中得到广泛实用
优选的，所述步骤E3中通过滴加三羟甲基氨基甲烷缓冲液进行pH调节。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1.其中TA可以与CuII离子发生螯合作用形成涂层结构，这些涂层结构在细胞培养环境中呈现pH依赖降解行为，从而实现了无损释放细胞的目的，TA-CuII络合物修饰在Fe3O4纳米颗粒表面的过程中加入TA，其中TA能够对肿瘤细胞呈现强亲和力，而且还能够有效抵抗血液中白细胞和血小板的非特异性粘附，实现了对肿瘤细胞的高效分离。
2.通过水热法合成Fe3O4纳米磁性颗粒具备快速磁响应性能，加入的TA与CuII，在碱性条件下可利用TA与CuII之间的配位自组装作用快速形成络合物涂层，并物理吸附于表面，其络合物涂层能够分离肿瘤细胞与血小板、白细胞等血液组分，通过该种方法制备出的磁性纳米颗粒Fe3O4@TA/CuII不仅拥有良好的磁响应性能，还能够实现肿瘤细胞的广谱捕获与无损释放，该种反应调节简单且材料成本低廉，能够在生物材料制备过程中得到广泛实用
附图说明
本发明将通过例子并参照附图的方式说明，其中：
图1是；本发明的一种实施方式的透射电镜图
图2是：本发明的一种实施方式的修饰涂层前后材料的傅里叶变换红外光谱图；
图3是：本发明的一种实施方式的应用于不同癌细胞的捕获效率图；
图4是：本发明的一种实施方式的捕获细胞后的释放效率图。
具体实施方式
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
下面结合图1-图4对本发明作详细说明。
实施例一：
一种高效富集循环肿瘤细胞的磁性纳米材料，其特征在于，含有TA-CuII络合物与Fe3O4纳米颗粒，通过在TA-CuII络合物修饰在Fe3O4纳米颗粒表面，得到可富集与无损释放循环肿瘤细胞的磁性纳米颗粒。
所述TA-CuII络合物通过自组装螯合作用吸附于所述Fe3O4纳米颗粒表面
一种高效富集循环肿瘤细胞的磁性纳米颗粒材料的制备方法，包括以下步骤：
步骤A：将无水三氯化铁、柠檬酸三钠、乙二醇剧烈搅拌15分钟；
步骤B：称取1.2g乙酸钠加入步骤A的混合物中，加热搅拌30分钟至完全溶解；
步骤C：将步骤B中的混合物聚四氟乙烯衬里高压反应釜中，缓慢升温至200℃，保持反应10小时；
步骤D：将步骤C中的混合物的黄色上清液与下层黑色产物取出，反复清洗得到Fe3O4纳米颗粒溶液；
步骤E：将CuCl2、TA滴加入步骤D得到的Fe3O4纳米颗粒溶液中，得到磁性纳米颗粒Fe3O4@TA/CuII
优选的，所述步骤E的具体步骤为：
步骤E1：将CuCl2溶液滴加至Fe3O4纳米颗粒溶液中，缓慢搅拌1分钟
步骤E2：将TA滴加入步骤E1得到的混合物中；
步骤E3：将步骤E2得到的混合物的pH值调节至碱性；
步骤E4：将步骤E3中调制碱性的混合物进行磁铁吸附清洗与RO水清洗，得到磁性纳米颗粒Fe3O4@TA/CuII。
所述步骤E3中通过滴加三羟甲基氨基甲烷缓冲液进行pH调节。
在上述实施例一中，在制备Fe3O4纳米颗粒时，将0.65g无水三氯化铁、0.20g柠檬酸三钠和20mL乙二醇剧烈搅拌15分钟至溶液澄清透明；称取1.20g乙酸钠加入烧杯中，继续加热搅拌30分钟至完全溶解；将溶解完全的混合物转移至50mL的聚四氟乙烯衬里不锈钢高压反应釜中，在恒温鼓风干燥箱中缓慢升温至200℃并且保持反应10h；反应结束后，将未完全反应的黄色上清液移除，并将沉淀在下层的黑色产物取出。借助磁铁用乙醇和RO水分别反复清洗多次,得到Fe3O4纳米颗粒；
在完成Fe3O4纳米颗粒制备后，进行磁性纳米颗粒Fe3O4@TA/CuII制备，将5mL/4.73mg·mL-1的CuCl2溶液滴加至含有0.10gFe3O4纳米颗粒的溶液中缓慢搅拌1min，再滴加5mL/20mg·mL-1的TA溶液；接着加入0.06g三羟甲基氨基甲烷缓冲液调节溶液pH值至碱性，缓慢搅拌10min后将磁铁放于烧杯侧面，用RO水反复清洗后即可得到修饰TA-CuII自组装涂层的磁性纳米颗粒Fe3O4@TA/CuII，其中调节溶液pH值至碱性能够增加TA-CuII涂层的稳定性。
制备得到的修饰TA-CuII自组装涂层的磁性纳米颗粒Fe3O4@TA/CuII形貌可由透射电镜观察，结果见图1。
由图1可知修饰涂层后的纳米颗粒分散性良好，并且颗粒表面有一层衬度不同的、非常粗糙的涂层。
Fe3O4@TA/CuII的化学成分可由傅里叶变换红外光谱进行表征分析，结果见图2。
由图2可知，TA的FTI R光谱在1041cm-1、1199/1348cm-1、1427/1483/1577cm-1、1691cm-1处有吸收峰出现，分别对应于-OH、C-O、C＝C和C＝O的特征峰。对于Fe3O4纳米颗粒，在590cm-1处有一个明显的属于Fe-O的伸缩振动。而在涂覆不同次数涂层后，纳米颗粒与原Fe3O4纳米颗粒相比，在1427/1483/1577cm-1处出现了新的特征峰，这是TA的C＝C特征峰，而在1041cm-1、1199/1348cm-1、1691cm-1处的峰强也明显增强，分别对应于-OH、C-O和C＝O的特征峰，这充分表明涂层的成功涂覆。
将实施例中得到样品应用于不同异质CTCs的捕获。将传代后的细胞用血细胞计数板计数，用PBS缓冲液稀释至1.5×105个细胞/mL。将细胞加入修饰涂层的磁性纳米颗粒中，最终使管中纳米颗粒的浓度为250μg/mL，置于摇床中共孵育20min。借助磁铁吸出含未捕获细胞的上清液，再利用PBS缓冲液轻轻清洗三次并吸出上清液。将四次吸出的上清液收集用血细胞计数板在显微镜下计数未捕获的细胞数量，捕获效率定义为：(总细胞数量-上清液中未捕获的细胞数量)/总细胞数量；其中，总细胞数量为1.5×105个细胞。统计结果如图3所示。
由图3可知，Fe3O4@TA/CuII磁性纳米颗粒对MCF-7细胞、HepG2细胞和HeLa细胞的捕获效率分别为88.14±2.32％、81.21±2.92％、83.01±3.78％。这表明，涂覆有TA涂层的磁性纳米颗粒具有广谱捕获性能，这在未来临床的实际应用具有巨大潜在的应用前景。
最后将实施例中得到样品应用于CTCs的释放。将捕获后的细胞转移至pH＝5.5的DMEM-高糖培养基中，放入37℃、800rpm的摇床中继续共孵育1h、2h、3h、6h、12h后用PBS缓冲液清洗，并将上清液中释放的细胞收集，在倒置相差显微镜下用血细胞计数板计数。释放效率定义为上清液中释放的细胞数量/(总细胞数量-未捕获的细胞数量)；其中，总细胞数量为1.5×105个细胞。统计结果如图4所示。
由图4可知，将捕获后的细胞放入培养基中再培养1h后，释放效率仅为32.72±4.86％；随着时间延长再培养6h后，释放效率能够达到68.38±6.06％；而再培养释放12h后，释放效率为67.65±5.63％，与再培养6h的释放效率相差不大，这说明结合在纳米颗粒上的CTCs随着涂层的降解与磁性纳米颗粒逐渐分离，从而实现了CTCs的释放。
综上所述，本发明提供的一种高效富集循环肿瘤细胞的磁性纳米材料及其制备方法，其通过水热法合成具有快速磁响应性能的Fe3O4纳米颗粒，并且利用自组装螯合作用将TA-CuII络合物涂层修饰在Fe3O4纳米颗粒表面，形成一种多功能磁性纳米颗粒(Fe3O4@TA/CuII)。
需要说明的是，本发明中提到的TA为单宁酸，为本技术领域人员熟知的组分缩写，本发明中不再进阐述。
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。

Claims (3)

1.一种高效富集循环肿瘤细胞的磁性纳米材料的制备方法，其特征在于，含有TA-CuII络合物、TA（单宁酸）与Fe3O4纳米颗粒，通过TA-CuII络合物修饰在Fe3O4纳米颗粒表面，得到可富集与无损释放循环肿瘤细胞的磁性纳米颗粒；
所述磁性纳米颗粒的制备方法包括以下步骤：
步骤A：将无水三氯化铁、柠檬酸三钠、乙二醇剧烈搅拌15分钟；
步骤B：称取1.2g乙酸钠加入步骤A的混合物中，加热搅拌30分钟至完全溶解；
步骤C：将步骤B中的混合物放入聚四氟乙烯衬里高压反应釜中，缓慢升温至200℃，保持反应10小时；
步骤D：将步骤C中的混合物的黄色上清液与下层黑色产物取出，反复清洗得到Fe3O4纳米颗粒溶液；
步骤E：将CuCl2、TA滴加入步骤D得到的Fe3O4纳米颗粒溶液中，得到磁性纳米颗粒Fe3O4@TA/CuII；
所述步骤E的具体步骤为：
步骤E1：将CuCl2溶液加至Fe3O4纳米颗粒溶液中，缓慢搅拌1分钟
步骤E2：将TA滴加入步骤E1得到的混合物中；
步骤E3：将步骤E2得到的混合物的pH值调节至碱性；
步骤E4：将步骤E3中调制碱性的混合物进行磁铁吸附清洗与RO水（反渗透水）清洗，得到磁性纳米颗粒Fe3O4@TA/CuII。
2.根据权利要求1所述的一种高效富集循环肿瘤细胞的磁性纳米材料的制备方法，其特征在于，所述TA-CuII络合物通过自组装螯合作用吸附于所述Fe3O4纳米颗粒表面。
3.根据权利要求1所述的一种高效富集循环肿瘤细胞的磁性纳米材料的制备方法，其特征在于，所述步骤E3中通过滴加三羟甲基氨基甲烷缓冲液进行pH调节。
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