CN114778838B - 一种快速广谱检测细菌的试剂盒、制备方法及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速广谱检测细菌的试剂盒、制备方法及其检测方法，本发明采用聚乳酸‑羟基乙酸共聚物基近红外荧光纳米球和超顺磁性纳米球，联合生物正交反应，用于细菌感染的检测。与抗原抗体结合的方法相比，基于生物正交反应的病原菌检测能实现对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的广谱和选择性检测，具有普适性；并且与传统的膜过滤或离心的分离策略相比，基于Fe3O4纳米颗粒的病原菌检测具有更省时、简单、方便、成本低等优点；与目前报道的基于可见光的荧光检测方法相比，基于近红外荧光纳米颗粒的病原体检测具有更强的抗干扰能力。

Description

一种快速广谱检测细菌的试剂盒、制备方法及其检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测的技术领域，具体而言，涉及一种快速广谱检测细菌的试剂盒、制备方法及其检测方法。
背景技术
细菌感染可以导致多种疾病，例如结核病，胃癌，食物中毒，尿路感染和伤口感染，败血症等。对人们生活影响很大，是导致人类死亡的主要原因之一。人体被细菌侵袭后是否发病，一方面与其自身免疫力有关，另一方面也取决于细菌致病性的强弱和数量的多少。一般来说，细菌类型不同，症状也会有所差异，数量越大，发病的可能性越大。因此，快速准确的检测病原菌具有重要意义。
传统的细菌检测方法比如平板培养法是目前临床上检测细菌的金标准，存在时间长的缺点，不能帮助早期诊断。还有应用广泛的生物化学鉴定法，可以鉴定细菌种类，但是耗时长，检测限高，分子和免疫分析技术比如PCR和ELISA等，容易实现自动化和高通量检测。缺点是检测过程干扰因素较多，并且成本较高。一些基于电化学等的生物传感器检测速度很快但是不能识别细菌类型。
基于传统检测方法的缺点，研究人员发展了很多其他的检测方法，比如，利用细菌分泌的酶活性，细菌引起的pH变化，利用细菌的表面物理性质如粗糙程度等以及利用抗生素进行检测，但是这些方法普遍面临着干扰因素多，广谱性差等问题。
如果没有准确的微生物分析结果，医生通常会做最坏情况的假设，即使用广谱抗生素。但这种做法极有可能导致不适当和不必要的治疗，破坏病人的微生物组成，并出现细菌多药耐药的情况。因此，快速准确的微生物分析技术对于正确管理细菌感染和对抗多药耐药细菌至关重要。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种快速广谱检测细菌的试剂盒，本发明的第二个目的在于提供一种快速广谱检测细菌的试剂盒的制备方法，本发明的第三个目的在于提供一种非诊断目的的快速广谱检测细菌的方法；以达到快速、灵敏、方便地检测细菌的目的。
本发明的实施例通过以下技术方案实现：
一种快速广谱检测细菌的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
步骤C1，收集红细胞膜，形成红细胞膜溶液B；
步骤C2，通过利用吲哚菁绿、聚乳酸-羟基乙酸共聚物与红细胞膜溶液B混合，再通过离心制得近红外荧光纳米球；
步骤C3，制备Fe3O4水溶液，加入红细胞膜溶液B，分离制得超顺磁性纳米球。
在本发明的一实施例中，步骤C1包括：
采集无菌血，去除血浆、白细胞和血小板后收集得到红细胞沉淀，用磷酸缓冲盐溶液洗涤红细胞沉淀至上清液澄清，然后悬浮在磷酸缓冲盐溶液中静置，等待红细胞破裂，再离心、收集红细胞膜沉淀，形成红细胞膜溶液B。
在本发明的一实施例中，将吲哚菁绿溶解于二甲基亚砜形成溶液D，将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶解于丙酮形成溶液E，将溶液D和溶液E混合形成溶液F；
将溶液F滴入RO水中形成溶液G，搅拌溶液G使二甲基亚砜和丙酮挥发形成溶液H，将溶液H透析得到溶液I，将溶液I与步骤C1得到的红细胞膜溶液B混合得到混合物J，将混合物J用冰浴处理，获得红细胞膜纳米球溶液K；
将红细胞膜纳米球溶液K离心得到红细胞纳米球沉淀，再用磷酸缓冲盐溶液分散红细胞纳米球沉淀得到溶液L；将活性酯-聚乙二醇-二苯基环辛炔溶液加入溶液L中形成溶液M，将溶液M离心5分钟，得到近红外荧光纳米球。
在本发明的一实施例中，在六水合三氯化铁和柠檬酸三钠的混合物中，再加入乙二醇，然后加入乙酸钠加热溶解，形成混合物N；高压高温后形成沉淀物四氧化三铁；
用乙醇和RO水分别清洗若干次得到Fe3O4纳米颗粒溶液P，将Fe3O4纳米颗粒溶液P加入到聚乙烯亚胺水溶液中形成溶液Q；再收集Fe3O4，将Fe3O4重分散至1mL水里，制得Fe3O4水溶液。
在本发明的一实施例中，在Fe3O4水溶液加入与步骤C1得到的红细胞膜溶液B混合得到混合液R；用磁铁收集，用RO水洗涤若干次获得Fe3O4红细胞膜纳米球溶液S，将活性酯-聚乙二醇-二苯基环辛炔溶液加入Fe3O4红细胞膜纳米球溶液S中，通过磁分离收集，得到超顺磁性纳米球。
一种快速广谱检测细菌的试剂盒，包括通过上述制备方法制得的近红外荧光纳米球和超顺磁性纳米球。
在本发明的一实施例中，近红外荧光纳米球和超顺磁性纳米球的质量比为3:1。
一种非诊断目的的快速广谱检测细菌的方法，将使用上述的试剂盒与被测样品混合、孵育，再通过透射电镜或荧光显微镜观察近红外荧光纳米球、超顺磁性纳米球捕获的细菌的形态和结合情况，得出检测结果。
本发明实施例的技术方案至少具有如下优点和有益效果：
本发明的聚乳酸-羟基乙酸共聚物基近红外荧光纳米球和超顺磁性纳米球联合生物正交反应近红外荧光纳米球和超顺磁性纳米球联合生物正交反应可以同时实现对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的快速捕获和广谱检测，具有普适性；与传统的膜过滤或离心的分离策略相比，基于Fe3O4纳米颗粒的病原菌检测具有更省时、简单、方便、成本低等优点；与基于可见光的荧光检测方法相比，基于近红外荧光纳米颗粒的病原体检测具有更强的抗干扰能力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明的实验例1的近红外荧光纳米球的透射电镜图；
图2为本发明的实验例1的超顺磁性纳米球的透射电镜图；
图3为本发明的实验例1的纳米球捕获的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的透射电镜图；
图4为本发明的实验例1的分别在牛奶、尿样和血液样本中纳米球捕获的细菌的数量与荧光强度之间的关系；
图5为本发明的实验例1的分别在牛奶、尿样和血液样本中捕获的细菌的荧光显微镜图；
图6为Fe3O4@M-DBCO的紫外-可见吸收光谱图与FP@M-DBCO和IP@M-DBCO的荧光发射光谱图；
图7为S.aureus和E.coli的自发荧光光谱图；
图8为选择性检测革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的荧光显微镜图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。
在本发明的描述中，需要说明的是，若出现术语“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，或者是该发明产品使用时惯常摆放的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
在本发明的描述中，还需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，若出现术语“设置”、“安装”、“配置”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
实施例一：
一种快速广谱检测细菌的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
步骤C1，收集红细胞膜；
采集无菌血，在4℃、800g离心5min，去除血浆、白细胞和血小板后收集得到红细胞沉淀，用磷酸缓冲盐溶液洗涤红细胞沉淀1次至上清液澄清，然后悬浮在磷酸缓冲盐溶液中静置(温度4℃)，等待红细胞破裂30min，再在6000g离心20min收集红细胞膜沉淀,形成红细胞膜溶液B；
步骤C2，制备近红外荧光纳米球；
将吲哚菁绿溶解于二甲基亚砜形成溶液D，将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶解于丙酮形成溶液E，将溶液D和溶液E混合形成溶液F，溶液F中的吲哚菁绿和聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为1:10；
使用注射器缓慢地将溶液F滴入RO水中形成溶液G，搅拌溶液G使二甲基亚砜和丙酮挥发形成溶液H，将溶液H转入分子截流量为1000Da的透析袋中透析2天得到溶液I，将溶液I与步骤C1得到的红细胞膜溶液B混合得到混合物J，将混合物J用超声(10W)冰浴处理，获得红细胞膜纳米球溶液K；
将红细胞膜纳米球溶液K离心得到红细胞纳米球沉淀，离心力10000g、离心时间5min；再用磷酸缓冲盐溶液分散红细胞纳米球沉淀得到溶液L；将活性酯-聚乙二醇-二苯基环辛炔溶液加入溶液L中在37℃反应2小时形成溶液M，将溶液M在10000g的离心力下离心5分钟，得到近红外荧光纳米球；
步骤C3，制备超顺磁性纳米球；
称取0.57g六水合三氯化铁和0.37g柠檬酸三钠到烧杯中，再加入25mL乙二醇，37℃的恒温水浴锅中搅拌30min，然后加入1.20g乙酸钠(CH3COONa·3H2O)继续加热搅拌40min至完全溶解，形成混合物N；
将混合物N转移至聚四氟乙烯内衬中，再将聚四氟乙烯内衬置于不锈钢高压反应釜中，升温至200℃并且保持10小时；取出沉淀物四氧化三铁；
借助磁铁用乙醇和RO水分别反复清洗若干次后得到Fe3O4纳米颗粒溶液P，将Fe3O4纳米颗粒溶液P加入到8mg/mL的聚乙烯亚胺水溶液中形成溶液Q；用磁铁在溶液Q中收集Fe3O4，并用RO水清洗若干次后，将Fe3O4重分散至1mL水里然后加入与步骤C1得到的红细胞膜溶液B混合得到混合液R；用磁铁收集，用RO水洗涤若干次获得Fe3O4红细胞膜纳米球溶液S，将活性酯-聚乙二醇-二苯基环辛炔溶液加入Fe3O4红细胞膜纳米球溶液S中在37℃轻摇处理2小时，通过磁分离收集，得到超顺磁性纳米球。
实施例二：
一种快速广谱检测细菌的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
步骤C1，收集红细胞膜；
采集无菌血，在4℃、1000g离心10min，去除血浆、白细胞和血小板后收集得到红细胞沉淀，用磷酸缓冲盐溶液洗涤红细胞沉淀3次至上清液澄清，然后悬浮在磷酸缓冲盐溶液中静置(温度4℃)，等待红细胞破裂60min，再在7000g离心30min收集红细胞膜沉淀,形成红细胞膜溶液B；
步骤C2，制备近红外荧光纳米球；
将吲哚菁绿溶解于二甲基亚砜形成溶液D，将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶解于丙酮形成溶液E，将溶液D和溶液E混合形成溶液F，溶液F中的吲哚菁绿和聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为1:10；
使用注射器缓慢地将溶液F滴入RO水中形成溶液G，搅拌溶液G使二甲基亚砜和丙酮挥发形成溶液H，将溶液H转入分子截流量为1000Da的透析袋中透析3天得到溶液I，将溶液I与步骤C1得到的红细胞膜溶液B混合得到混合物J，将混合物J用超声(10W)冰浴处理，获得红细胞膜纳米球溶液K；
将红细胞膜纳米球溶液K离心得到红细胞纳米球沉淀，离心力12000g、离心时间10min；再用磷酸缓冲盐溶液分散红细胞纳米球沉淀得到溶液L；将活性酯-聚乙二醇-二苯基环辛炔溶液加入溶液L中在37℃反应2小时形成溶液M，将溶液M在12000g的离心力下离心10分钟，得到近红外荧光纳米球；
步骤C3，制备超顺磁性纳米球；
称取0.57g六水合三氯化铁和0.37g柠檬酸三钠到烧杯中，再加入25mL乙二醇，37℃的恒温水浴锅中搅拌30min，然后加入1.20g乙酸钠(CH3COONa·3H2O)继续加热搅拌60min至完全溶解，形成混合物N；
将混合物N转移至聚四氟乙烯内衬中，再将聚四氟乙烯内衬置于不锈钢高压反应釜中，升温至200℃并且保持10小时；取出沉淀物四氧化三铁；
借助磁铁用乙醇和RO水分别反复清洗若干次后得到Fe3O4纳米颗粒溶液P，将Fe3O4纳米颗粒溶液P加入到10mg/mL的聚乙烯亚胺水溶液中形成溶液Q；用磁铁在溶液Q中收集Fe3O4，并用RO水清洗若干次后，将Fe3O4重分散至1mL水里然后加入与步骤C1得到的红细胞膜溶液B混合得到混合液R；用磁铁收集，用RO水洗涤若干次获得Fe3O4红细胞膜纳米球溶液S，将活性酯-聚乙二醇-二苯基环辛炔溶液加入Fe3O4红细胞膜纳米球溶液S中在37℃轻摇处理2小时，通过磁分离收集，得到超顺磁性纳米球。
实施例三：
一种快速广谱检测细菌的试剂盒，包括通过上述制备方法制得的近红外荧光纳米球和超顺磁性纳米球，近红外荧光纳米球和超顺磁性纳米球的质量比为3:1。
实施例四：
一种非诊断目的的快速广谱检测细菌的方法，包括以下步骤：将使用上述的试剂盒与被测样混合、孵育，再通过透射电镜或荧光显微镜观察近红外荧光纳米球、超顺磁性纳米球捕获的细菌的形态和结合情况，得出检测结果。
实施例五：
一种非诊断目的的快速广谱检测细菌的方法，包括以下步骤：
在被测样中加入1mL磷酸盐缓冲液振荡混合均匀形成样品悬液，取100μL样品悬液稀释10倍后接种于固体琼脂板上培养并计数。再向1mL样品中加入3.84mM的D-丙氨酸(D-Ala-N3)和1.25mM的3-去氧-D-甘露-2-辛酮糖酸(Kdo-N3)在37℃孵育60min后，混合入上述的试剂盒(质量比为3:1的近红外荧光纳米球和超顺磁性纳米球)孵育60min，借助磁铁吸出上清液，再用磷酸盐缓冲液轻轻清洗三次后重分散在1mL磷酸盐缓冲液中。
再通过透射电镜或荧光显微镜观察近红外荧光纳米球、超顺磁性纳米球捕获的细菌的形态和结合情况，得出检测结果。
实施例六：
一种非诊断目的的快速广谱检测细菌的方法，包括以下步骤：
在被测样中加入1mL磷酸盐缓冲液振荡混合均匀形成样本悬液，取100μL样本悬液稀释108倍后接种于固体琼脂板上培养并计数。再向1mL样本中加入3.84mM的D-丙氨酸(D-Ala-N3)和1.25mM的3-去氧-D-甘露-2-辛酮糖酸(Kdo-N3)在37℃孵育60min后，混合入上述的试剂盒(质量比为3:1的近红外荧光纳米球和超顺磁性纳米球)孵育60min，借助磁铁吸出上清液，再用磷酸盐缓冲液轻轻清洗三次后重分散在1mL磷酸盐缓冲液中。
再通过透射电镜或荧光显微镜观察近红外荧光纳米球、超顺磁性纳米球捕获的细菌的形态和结合情况，得出检测结果。
需要说明的是：荧光检测和成像是常见的用于病原体诊断的手段。将近红外荧光染料吲哚菁绿包载在纳米材料中，不仅提高了它的光稳定性和有利于进行靶向功能化。还能有效避免散射信号和细菌自发荧光背景的干扰，提高检测的灵敏度。细菌存在的环境往往很复杂，快速富集对于细菌检测来说是很有必要的。Fe3O4纳米球由于其具有超顺磁性、优异的单分散性、较高的分离速度等优点，近年来被用作在微生物分析领域进行细菌磁性免疫分离和富集的载体，提高了分析方法的选择性和灵敏度。本发明的近红外荧光纳米球和超顺磁性纳米球联合生物正交反应可以同时实现对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的快速捕获和广谱检测，具有普适性；并且与传统的膜过滤或离心的分离策略相比，基于Fe3O4纳米颗粒的病原菌检测具有更省时、简单、方便、成本低等优点。
实验例1：
步骤D1，收集红细胞膜；
从雄性SD大鼠采集新鲜肝素化全血，在4℃、1000g离心10min，去除血浆、白细胞和血小板后收集得到红细胞沉淀，用磷酸缓冲盐溶液洗涤红细胞沉淀3次至上清液澄清，然后悬浮在磷酸缓冲盐溶液中静置(温度4℃)，等待红细胞破裂30min，再在7000g离心30min收集红细胞膜沉淀,形成红细胞膜溶液B；
步骤D2，制备近红外荧光纳米球；
将吲哚菁绿溶解于二甲基亚砜形成溶液D，将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶解于丙酮形成溶液E，将溶液D和溶液E混合形成溶液F，溶液F中的吲哚菁绿和聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为1:10；
使用注射器缓慢地将溶液F滴入RO水中形成溶液G，搅拌溶液G使二甲基亚砜和丙酮挥发形成溶液H，将溶液H转入分子截流量为1000Da的透析袋中透析3天得到溶液I，将溶液I与步骤C1得到的红细胞膜溶液B混合得到混合物J，将混合物J用超声(10W)冰浴处理，获得红细胞膜纳米球溶液K；
将红细胞膜纳米球溶液K离心得到红细胞纳米球沉淀，离心力12000g、离心时间10min；再用磷酸缓冲盐溶液分散红细胞纳米球沉淀得到溶液L；将活性酯-聚乙二醇-二苯基环辛炔溶液加入溶液L中在37℃反应2小时形成溶液M，将溶液M在12000g的离心力下离心10分钟，得到近红外荧光纳米球。
制备得到的近红外荧光纳米球的大小和形貌可由透射电镜观察，结果参照附图1。由附图1可知，包载ICG的近红外荧光纳米球分散良好，颗粒表面有一膜层，膜层的厚度约为10nm。
步骤D3，制备超顺磁性纳米球；
称取0.57g六水合三氯化铁和0.37g柠檬酸三钠到烧杯中，再加入25mL乙二醇，37℃的恒温水浴锅中搅拌30min，然后加入1.20g乙酸钠(CH3COONa·3H2O)继续加热搅拌60min至完全溶解，形成混合物N；
将混合物N转移至聚四氟乙烯内衬中，再将聚四氟乙烯内衬置于不锈钢高压反应釜中，升温至200℃并且保持10小时；取出沉淀物四氧化三铁；
借助磁铁用乙醇和RO水分别反复清洗若干次后得到Fe3O4纳米颗粒溶液P，将Fe3O4纳米颗粒溶液P加入到10mg/mL的聚乙烯亚胺水溶液中形成溶液Q；用磁铁在溶液Q中收集Fe3O4，并用RO水清洗若干次后，将Fe3O4重分散至1mL水里然后加入与步骤C1得到的红细胞膜溶液B混合得到混合液R；用磁铁收集，用RO水洗涤若干次获得Fe3O4红细胞膜纳米球溶液S，将活性酯-聚乙二醇-二苯基环辛炔溶液加入Fe3O4红细胞膜纳米球溶液S中在37℃轻摇处理2小时，通过磁分离收集，得到超顺磁性纳米球。
制备得到的超顺磁性纳米球的大小和形貌可由透射电镜观察，结果参照附图2，由附图2可知超顺磁性纳米球呈规则的球形，分散均匀。发现颗粒边缘有低对比度的薄层，厚度约为10nm。
步骤D4，细菌的捕获和检测；
将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌按数量比为1:1分别加入至1mL牛奶、尿液和血液中，再分别加入1mL的PBS溶液振荡混合均匀制得三种样品悬液。取100μL样品悬液稀释10倍后接种于固体琼脂板上培养并计数。再向三种剩余的样品中分别加入3.84mM的D-丙氨酸(D-Ala-N3)和1.25mM的3-去氧-D-甘露-2-辛酮糖酸(Kdo-N3)在37℃孵育60min后，加入质量比为3:1的近红外荧光纳米球、超顺磁性纳米球混合物共4mg孵育60min，借助磁铁吸出上清液，再分别用PBS溶液轻轻清洗三次后重分散在1mL的PBS溶液中。
将捕获到的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌样品滴加到超薄碳膜上，并用磷钨酸溶液进行负染，待溶剂挥发干。然后将超薄碳膜放入透射电子显微镜中进行观察。
采用透射电镜观察纳米球捕获的细菌的形态以及近红外荧光纳米球、超顺磁性纳米球与细菌的结合情况。参照附图3，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌形态完整且表面都存在两种纳米球，衬度低的为近红外荧光纳米球，衬度高的为超顺磁性纳米球，都紧紧结合在细菌表面。
将步骤D4得到的样品置于荧光分光光度计中，在激发波长为740nm，发射波长900nm的条件下测量荧光强度，建立荧光强度与细菌数量的关系。参照附图4，在牛奶、尿液和血液的三种样本中，细菌数量在1×104－1×108CFU mL-1范围内，荧光强度ΔF与细菌数量N都具有线性关系。
同时，将三种样品分别均匀涂抹在共聚焦皿上，使用荧光显微镜观察。参照附图5，在荧光显微镜下可以通过近红外荧光纳米球的近红外荧光信号观察细菌并计数。
实验例二：
针对荧光纳米球的抗干扰性能做以下实验。
实验步骤包括：
步骤E1，将近红外荧光纳米球内包载的ICG换成FITC，并在RO水中加1％-2％的聚乙烯醇作为稳定剂,制备了FP@M-DBCO纳米球。
步骤E2，取1mg/mL的FP@M-DBCO溶液2-3mL置于荧光分光光度计中，在激发波长为420-470nm的条件下测量荧光发射光谱。
步骤E3，取1mg/mL的Fe3O4@M-DBCO溶液2-3mL置于紫外-可见光分光光度计中在300-1000nm范围内测量紫外吸收光谱。
结果分析：参照附图6，Fe3O4@M-DBCO在400-700nm之间有吸收，FP@M-DBCO在400-600nm之间的发射荧光可能会被Fe3O4@M-DBCO吸收，而IP@M-DBCO的发射荧光在850-1000nm，与Fe3O4@M-DBCO的吸收波长无重叠。
步骤E4，取1mLOD＝0.5-0.6的S.aureus和E.coli菌液在3500rpm条件下离心5min，用PBS洗涤3次，用2-3mL PBS分散，置于荧光分光光度计中测量发射光谱。
结果分析：参照附图7，S.aureus和E.coli在400-500nm之间有荧光发射。如果用FP@M-DBCO进行细菌的检测，由于细菌自发绿色荧光的干扰，可能会出现假阳性，然而用IP@M-DBCO可以避免这种情况，因为细菌的自发荧光没有出现在近红外波段。说明我们的策略具有良好的抗干扰性。
利用生物正交反应实现广谱检测：细菌与人体细胞一样，需要从外界获得它需要的成分来维持生长分裂等过程。革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌结构存在差异，因此它们需要的成分有差别。革兰氏阳性菌最外层是肽聚糖，D-Ala是肽聚糖的重要成分之一，可以利用D-Ala-N3实现对革兰氏阳性菌的肽聚糖的叠氮标记。革兰氏阴性菌最外层是脂多糖，Kdo是脂多糖的重要组成成分之一，利用Kdo-N3可以实现对革兰氏阴性菌的脂多糖的叠氮标记。D-Ala-N3和Kdo-N3联合使用可以实现对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的广谱标记。本发明中制备的近红外荧光纳米球和磁性纳米球上的DBCO可与细菌表面标记的叠氮基团通过点击反应结合，用于捕获和检测细菌，反应过程无需其他有机试剂和催化剂，反应效率高。
实验例三：
为了进一步验证生物正交法对革兰氏阳性和阴性细菌的检测，做以下实验。
实验步骤包括：
步骤F1，取S.aureus和E.coli的混合菌液1mL加入3.84mM的D-Ala-N3、1.25mMKdo-N3以及3.84mM D-Ala-N3和1.25mM Kdo-N3混合物，孵育60-70min，3500rpm离心5-10min，用PBS洗涤3次，加入近红外荧光纳米球2-3mg孵育60min，离心洗涤。
步骤F2，将步骤F1获得的混合液与IP@M-DBCO孵育60min进行点击反应，加入Hoechst 33342染细菌DNA,20min后在3500rpm条件下离心5min。
步骤F3，将步骤F2获得的混合液用PBS洗涤三次，用少量PBS分散，取20μL均匀涂抹在共聚焦皿上，使用荧光显微镜观察Hoechst 33342和IP@M-DBCO定位情况。
结果分析：参照附图8，浅色箭头所指为革兰氏阳性菌，深色箭头所指为革兰氏阴性菌，当用D-Ala-N3预处理时，革兰氏阳性菌的蓝色荧光与IP@M-DBCO的品红色荧光重叠，说明可以通过生物正交点击反应从混合细菌中用强荧光检测和区分革兰氏阳性菌。革兰氏阴性菌可以通过用Kdo-N3对混合细菌进行预处理来识别。用D-Ala-N3和Kdo-N3的混合物对混合细菌预处理时可以同时检测到革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种快速广谱检测细菌的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤C1，收集红细胞膜，形成红细胞膜溶液B；
步骤C2，通过利用吲哚菁绿、聚乳酸-羟基乙酸共聚物与红细胞膜溶液B混合，再通过离心制得近红外荧光纳米球；
步骤C3，制备Fe3O4水溶液，加入红细胞膜溶液B，分离制得超顺磁性纳米球；
具体的，所述步骤C2中，将吲哚菁绿溶解于二甲基亚砜形成溶液D，将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶解于丙酮形成溶液E，将所述溶液D和所述溶液E混合形成溶液F；将所述溶液F滴入RO水中形成溶液G，搅拌所述溶液G使二甲基亚砜和丙酮挥发形成溶液H，将所述溶液H透析得到溶液I，将所述溶液I与步骤C1得到的红细胞膜溶液B混合得到混合物J，将混合物J用冰浴处理，获得红细胞膜纳米球溶液K；将红细胞膜纳米球溶液K离心得到红细胞纳米球沉淀，再用磷酸缓冲盐溶液分散所述红细胞纳米球沉淀得到溶液L；将活性酯-聚乙二醇-二苯基环辛炔溶液加入所述溶液L中形成溶液M，将所述溶液M离心5分钟，得到近红外荧光纳米球；
再具体的，所述步骤C3中，在Fe3O4水溶液加入与步骤C1得到的红细胞膜溶液B混合得到混合液R；用磁铁收集，用RO水洗涤若干次获得Fe3O4红细胞膜纳米球溶液S，将活性酯-聚乙二醇-二苯基环辛炔溶液加入Fe3O4红细胞膜纳米球溶液S中，通过磁分离收集，得到超顺磁性纳米球；
再具体的，利用D-Ala-N3实现对革兰氏阳性菌的肽聚糖的叠氮标记，利用Kdo-N3实现对革兰氏阴性菌的脂多糖的叠氮标记；所述近红外荧光纳米球和磁性纳米球上的DBCO可与细菌表面标记的叠氮基团通过点击反应结合，用于捕获和检测细菌。
2.根据权利要求1所述的快速广谱检测细菌的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤C1包括：
采集无菌血，去除血浆、白细胞和血小板后收集得到红细胞沉淀，用磷酸缓冲盐溶液洗涤红细胞沉淀至上清液澄清，然后悬浮在磷酸缓冲盐溶液中静置，等待红细胞破裂，再离心、收集红细胞膜沉淀，形成红细胞膜溶液B。
3.根据权利要求1所述的快速广谱检测细菌的试剂盒的制备方法，其特征在于，
在六水合三氯化铁和柠檬酸三钠的混合物中，再加入乙二醇，然后加入乙酸钠加热溶解，形成混合物N；高压高温后形成沉淀物四氧化三铁；
用乙醇和RO水分别清洗若干次得到Fe3O4纳米颗粒溶液P，将Fe3O4纳米颗粒溶液P加入到聚乙烯亚胺水溶液中形成溶液Q；再收集Fe3O4，将Fe3O4重分散至1mL水里，制得Fe3O4水溶液。
4.一种快速广谱检测细菌的试剂盒，其特征在于，包括通过权利要求1-3任一制备方法制得的近红外荧光纳米球和超顺磁性纳米球。
5.根据权利要求4所述的快速广谱检测细菌的试剂盒，其特征在于，所述近红外荧光纳米球和超顺磁性纳米球的质量比为3:1。
6.一种非诊断目的的快速广谱检测细菌的方法，其特征在于，先向样品中加入D-Ala-N3和Kdo-N3孵育，再使用权利要求5所述的试剂盒与被测样品混合、孵育，再通过透射电镜或荧光显微镜观察近红外荧光纳米球、超顺磁性纳米球捕获的细菌的形态和结合情况，得出检测结果。
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