CN110960694B - 一种用于近红外二区荧光检测的吲哚菁绿脂质体及其制备方法和用途 - Google Patents
一种用于近红外二区荧光检测的吲哚菁绿脂质体及其制备方法和用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于近红外二区荧光检测的吲哚菁绿脂质体及其制备方法和用途，具体公开了一种吲哚菁绿脂质体，其具有脂质双分子层以及嵌在脂质双分子层之间的吲哚菁绿，其通过1)将制备脂质双分子层的材料与吲哚菁绿混合形成均匀溶液，去除有机溶剂获得分散的薄膜；2)加入水相进行水化，机械力分散形成吲哚菁绿脂质体。本发明的脂质体制备方法简单，近红外二区荧光强度高，稳定性好。
Description
技术领域
本发明属于药物制剂领域，具体公开了一种吲哚菁绿脂质体及其制备方法和用途。
背景技术
当前，肿瘤的致死率是仅次于心脑血管疾病的全球第二大致死疾病，严重威胁人类的健康。我国常见癌症种类发病约为137-174人/10万人，但死亡率超过117人/10万人，绝大多数肿瘤患者就诊时已达中晚期，肿瘤切除率仅为10％～30％。相关研究报道肿瘤的尺寸大小和诊断时的临床分期与肿瘤患者生存率密切相关。若在肿瘤早期进行诊断将会极大降低肿瘤病死率。
近红外(NIR)荧光成像是一种新兴的非侵入性生物医学成像模式，与其他几种成像模式，包括磁共振成像(MRI)、X射线、计算机断层扫描(CT)、正电子发射断层扫描(PET)、超声波检查(US)等相比，具有敏感性高、成本低、高时空分辨的优点，在肿瘤诊疗中具有极大的应用潜力。近红外二区(NIR-II，1 000～1 700nm)波长范围内组织和血液对光的吸收和散射显著降低，并且几乎无生物体自发荧光干扰，使得近红外二区荧光探针具有更深的组织穿透力和空间分辨率。目前荧光发射光谱在近红外二区的材料主要有无机材料(纳米管、量子点、稀土纳米粒子)和有机材料(聚合物、有机小分子染料)。考虑到NIR-II成像剂的临床转化，具有低毒性，快速代谢性质的有机小分子荧光探针是最理想的选择。但多数NIR-II有机小分子荧光团存在水溶性差、光稳定性低、量子产率低等缺点。因此开发新型的近红外二区荧光的分子探针尤为重要。
吲哚菁绿(ICG)是目前被美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于临床的近红外荧光造影剂。有研究表明ICG在NIR-II窗口有荧光发射,具有近红外二区荧光成像的应用潜力。然而，ICG在水溶液中很不稳定、在血液循环中容易被快速清除，分子间容易形成二聚体导致荧光淬灭。这些不足严重限制了ICG在近红外二区诊疗方面的应用。
近年来，受到天然细胞的启发，人们尝试模仿天然细胞，构建仿生微纳米药物运输载体。其中，脂质体(Liposome)主要由胆固醇和天然磷脂组成，进入体内可被生物降解，不会在体内蓄积，无毒性、无致热原性、无免疫原性。脂质体被证明是一种行之有效的药物运输载体，它具有靶向性和淋巴定向性；缓慢释放，延缓肾排泄和代谢，延长作用时间；降低药物毒性；提高稳定性等优点。现已经有十几种脂质体药物载体被应用于临床医疗。虽然构成脂质体非常接近天然的细胞膜，但仍然无法完全躲避免疫清除。利用天然细胞膜伪装微纳米载体，获得的仿生微纳米载体不但具有微纳米载体自身的理化性能，而且具有类天然细胞的生物性能。细胞膜伪装的微纳米载体的研究尚处于起步阶段，开发更多的新型细胞膜伪装载体对于生物医学领域具有重要的意义。
目前，荧光增强的仿生吲哚菁绿脂质在近红外二区荧光成像的应用还未见有公开报道。本发明利用吲哚菁绿与磷脂小分子的疏水相互作用，合成吲哚菁绿被嵌入磷脂双分子壳层的脂质体，吲哚菁绿避免了与水相互作用导致的自淬灭，近红外二区荧光强度显著提高。将细胞膜通过物理挤压修饰在纳米颗粒上形成仿生脂质体，具有类天然细胞的生物性能。本发明有助于推动近红外二区荧光成像的发展，为癌症的临床诊断提供新理论和新思路。
目前荧光发射光谱在近红外二区的材料主要有无机材料(纳米管、量子点、稀土纳米粒子)和有机材料(聚合物、有机小分子染料)。考虑到NIR-II成像剂的临床转化，具有低毒性，快速代谢性质的有机小分子荧光探针是最理想的选择。但多数NIR-II有机小分子荧光团存在水溶性差、光稳定性低、量子产率低等缺点。因此开发新型的近红外二区荧光的分子探针尤为重要。为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明采用被美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于临床的近红外荧光造影剂吲哚菁绿，利用它与磷脂小分子的疏水相互作用，合成吲哚菁绿被嵌入脂质体壳层的脂质体，吲哚菁绿避免了与水相互作用导致的自淬灭，近红外二区荧光强度显著提高。将细胞膜通过物理挤压修饰在纳米颗粒上形成仿生脂质体，具有类天然细胞的生物性能。该化合物具有生物相容性好的特点，修饰不同的细胞膜可使这种高亮度的近红外二区荧光探针得到广泛应用。本发明有助于推动近红外二区荧光成像的发展，为癌症的临床诊断提供新理论和新思路。
发明内容
目前荧光发射光谱在近红外二区的材料主要有无机材料(纳米管、量子点、稀土纳米粒子)和有机材料(聚合物、有机小分子染料)。无机材料具有一定的毒性且代谢较为缓慢，多数NIR-II有机小分子荧光团存在水溶性差、光稳定性低、量子产率低等缺点。考虑到NIR-II成像剂的临床转化，具有低毒性，快速代谢性质的有机小分子荧光探针是最理想的选择。
本发明公开了一种高亮度的近红外二区吲哚菁绿仿生脂质体的合成方法，该方法利用吲哚菁绿与脂质小分子的疏水相互作用，合成吲哚菁绿被嵌入脂质双分子层的脂质体，吲哚菁绿避免了与水相互作用导致的自淬灭，近红外二区荧光强度显著提高。将细胞膜通过物理挤压修饰在纳米颗粒上形成仿生脂质体，具有类天然细胞的生物性能。该化合物具有生物相容性好的特点，修饰不同的细胞膜可使这种高亮度的近红外二区荧光探针得到广泛应用。本发明有助于推动近红外二区荧光成像的发展，为癌症的临床诊断提供理论和思路。
本发明一个方面提供了一种吲哚菁绿脂质体，其具有脂质双分子层以及嵌在脂质双分子层之间的吲哚菁绿。
在本发明的技术方案中，嵌在脂质双分子层之间的吲哚菁绿是通过将吲哚菁绿和脂质双分子层的材料在有机相混合均匀分散成薄膜后，加入水相水化形成脂质体而形成的。
在本发明的技术方案中，所述的吲哚菁绿脂质体脂质双分子层还嵌入有细胞膜蛋白。
在本发明的技术方案中，所述的磷脂双分子层由磷脂，或者磷脂和胆固醇的混合物构成。
在本发明的技术方案中，所述磷脂选自二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、二油酰基卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、二月桂酰卵磷脂、二肉豆蔻酰卵磷脂、二肉豆蔻酰卵磷脂、二月桂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰二丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰胆碱、脑磷脂酰丝氨酸、脑神经鞘磷脂、二棕榈酰神经鞘磷脂、二硬脂酰神经鞘磷脂、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的一种或几种的组合。
在本发明的技术方案中，磷脂双分子层由二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、二油酰基卵磷脂和胆固醇构成，优选地，其摩尔比例为二棕榈酰磷脂酰胆:二硬脂酰基磷脂酰胆碱:二油酰基卵磷脂:胆固醇＝5:3:1:1。
在本发明的技术方案中，磷脂双分子层与吲哚菁绿的摩尔量比为25-1000:1，优选地为100-500:1，更优选为200-300:1。
本发明另一个方面提供了吲哚菁绿脂质体的制备方法，其包括如下步骤：
1)将制备磷脂双分子层的材料与吲哚菁绿在有机相混合形成均匀溶液，去除有机溶剂获得分散的薄膜；
2)加入水相进行水化，机械力分散形成吲哚菁绿脂质体。
在本发明的技术方案中，吲哚菁绿脂质体的制备方法还包括步骤3)在吲哚菁绿脂质体的表面镶嵌细胞膜蛋白。
在本发明的技术方案中，机械力分散指通过超声分散、脂质体挤出器反复挤出的方式进行分散。
在本发明的技术方案中，步骤1)中去除溶剂的方法选自，以减压方式去除溶剂或在常压下气体吹拂的方式去除。
在本发明的技术方案中，制备过程中以惰性气体进行保护。
在本发明的技术方案中，吲哚菁绿脂质体与细胞膜蛋白的质量比为200-400:1，优选为250-300:1。
在本发明的技术方案中，磷脂双分子层的材料选自磷脂，或者磷脂和胆固醇的混合物。
在本发明的技术方案中，所述的细胞膜蛋白选自癌细胞膜蛋白、红细胞膜蛋白、中性粒细胞膜蛋白、血小板细胞膜蛋白、巨噬细胞膜蛋白、自然杀伤细胞膜蛋白或以二聚体或四聚体的形式存在的葡萄糖转运蛋白1、Neurothelin/HT7、血清γ谷氨酰转肽酶、P-糖蛋白、PD-1配体PDL1/PDL2、Fas配体FasL、免疫共刺激蛋白B7-H4、膜相关补体调控蛋白CRRY以及非经典MHC I类分子。
在本发明的技术方案中，步骤3)的方法为将膜蛋白与脂质体分散均匀，然后以脂质体挤出器进行挤出，制备具细胞膜蛋白的脂质体。
在本发明的技术方案中，去除游离细胞膜蛋白的方法为透析或超速离心过滤。
本发明所述的脂质体在制备近红外二区荧光检测试剂中的用途。
在本发明的技术方案中，近红外二区荧光检测试剂能够应用于水溶液、磷酸盐缓冲液、培养基或人体或动物体体内外体液或血液中。
在本发明的方案中，所述的近红外二区为是指波长位于1000-1700nm的光波区段。
优选地，近红外二区选自波长位于1000-1400nm的光波区段。
本发明再一个方面提供了一种近红外二区检测试剂，其包括本发明所述的脂质体。
有益效果
该化合物具有生物相容性好的特点，修饰不同的细胞膜可使这种高亮度的近红外二区荧光探针得到广泛应用。这种探针的优点体现在高亮度、低剂量、反应条件温和、重现性好、低毒、单分散的、生物相容性好、快速代谢等，本发明有助于推动近红外二区荧光成像的发展，为癌症的临床诊断提供理论和思路。
附图说明
图1为吲哚菁绿与磷脂疏水作用后形成脂质体的横截面示意图。
图2为实施例1至实施例7的溶液图。
图3近红外二区荧光亮度对比图。图注(1、LIPO:ICG为脂质体：吲哚菁绿2、LIPO-ICG为吲哚菁绿脂质体3、ICG-INPUT为相同投入量的吲哚菁绿4、ICG-OD为相同紫外吸收的吲哚菁绿5、PBS为磷酸盐缓冲液6、CULTURE为无血清培养基溶液7、10％FBS为10％胎牛血清溶液)。
图4近红外二区荧光亮度变化图。图注(1、LIPO:ICG＝250:1为脂质体：吲哚菁绿摩尔比为250:1 2、LIPO-ICG为吲哚菁绿仿生脂质体3、SAME INPUT为相同投入量的吲哚菁绿4、SAME OD为相同紫外吸收的吲哚菁绿5、PBS为磷酸盐缓冲液6、CULTURE为无血清培养基溶液7、10％FBS为10％胎牛血清溶液)。
图5为溶解在无水甲醇的吲哚菁绿与脂质体原材料混合吹膜制备的脂质体的近红外二区荧光光谱。
图6为在磷酸盐缓冲溶液中近红外二区荧光强度定量图。
图7为在细胞无血清培养基溶液溶液中近红外二区荧光强度定量图。
图8为在10％的胎牛血清溶液中近红外二区荧光强度定量图。
图9为不同处理组小鼠右腿血管成像示意图，其中ICG-INPUT，ICG-OD为游离的吲哚菁绿(相同投入量和相同紫外吸收)LIPO-ICG为吲哚菁绿脂质体，RLIPO-ICG为修饰了红细胞膜的吲哚菁绿脂质体，在体内的血液循环时间相较于游离的吲哚菁绿大大提高。
具体实施方式
为了使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
实施例1：
1、精确称取0.3152mg二棕榈酰磷脂酰胆碱、0.072mg二硬脂酰基磷脂酰胆碱、0.216mg二油酰基卵磷脂DOPC和0.108mg胆固醇分别溶于三氯甲烷中(摩尔量比例为5:3:1:1)，准确称取0.434112mg吲哚菁绿溶于无水甲醇。(脂质体原材料与吲哚菁绿摩尔量比为25:1)将混合溶液于65℃水浴加热并充分混匀，在涡旋器上涡旋，同时向试管中充入速率适中且流速稳定的氮气，直至有机溶液挥发完全形成均匀薄膜，试管内无液体残留。
2、用封口膜将试管口封口，并用利器在封口膜上戳孔，保证试管内气体可与外界连通，将试管置于真空器皿中避光抽真空4h，使试管中的有机溶剂挥发完全。
3、用2mL 0.01M PBS(pH＝7.4-7.5)在65℃水浴条件下对薄膜进行水化至试管壁上的脂质膜完全脱落后，将试管置于超声清洗机中(水温65℃)水浴超声5min。
4、在液氮和65℃环境水浴条件下反复冻融，循环进行5次。
5、溶液用装有200nm聚碳酸酯膜的脂质体挤出器反复挤压20次，得吲哚菁绿脂质体，4℃避光条件下透析12h除去未装载的吲哚菁绿和细胞膜蛋白，得到纯化的吲哚菁绿脂质体。
实施例2：
1、精确称取0.3289mg二棕榈酰磷脂酰胆碱、0.072mg二硬脂酰基磷脂酰胆碱、0.216mg二油酰基卵磷脂DOPC和0.108mg胆固醇分别溶于三氯甲烷中(摩尔量比例为5:3:1:1)，准确称取0.217056mg吲哚菁绿溶于无水甲醇。(脂质体原材料与吲哚菁绿摩尔量比为50:1)将混合溶液于65℃水浴加热并充分混匀，在涡旋器上涡旋，同时向试管中充入速率适中且流速稳定的氮气，直至有机溶液挥发完全形成均匀薄膜，试管内无液体残留。
2、用封口膜将试管口封口，并用利器在封口膜上戳孔，保证试管内气体可与外界连通，将试管置于真空器皿中避光抽真空4h，使试管中的有机溶剂挥发完全。
3、用2mL 0.01M PBS(pH＝7.4-7.5)在65℃水浴条件下对薄膜进行水化至试管壁上的脂质膜完全脱落后，将试管置于超声清洗机中(水温65℃)水浴超声5min。
4、在液氮和65℃环境水浴条件下反复冻融，循环进行5次。
5、溶液用装有200nm聚碳酸酯膜的脂质体挤出器反复挤压20次，得吲哚菁绿脂质体，4℃避光条件下透析12h除去未装载的吲哚菁绿，得到纯化的吲哚菁绿脂质体。
实施例3：
1、精确称取0.3357mg二棕榈酰磷脂酰胆碱、0.072mg二硬脂酰基磷脂酰胆碱、0.216mg二油酰基卵磷脂DOPC和0.108mg胆固醇分别溶于三氯甲烷中(摩尔量比例为5:3:1:1)，准确称取0.108528mg吲哚菁绿溶于无水甲醇。(脂质体原材料与吲哚菁绿摩尔量比为100:1)将混合溶液于65℃水浴加热并充分混匀，在涡旋器上涡旋，同时向试管中充入速率适中且流速稳定的氮气，直至有机溶液挥发完全形成均匀薄膜，试管内无液体残留。
2、用封口膜将试管口封口，并用利器在封口膜上戳孔，保证试管内气体可与外界连通，将试管置于真空器皿中避光抽真空4h，使试管中的有机溶剂挥发完全。
3、用2mL 0.01M PBS(pH＝7.4-7.5)在65℃水浴条件下对薄膜进行水化至试管壁上的脂质膜完全脱落后，将试管置于超声清洗机中(水温65℃)水浴超声5min。
4、在液氮和65℃环境水浴条件下反复冻融，循环进行5次。
5、溶液用装有200nm聚碳酸酯膜的脂质体挤出器反复挤压20次，得吲哚菁绿脂质体，4℃避光条件下透析12h除去未装载的吲哚菁绿，得到纯化的吲哚菁绿脂质体。
实施例4：
1、精确称取0.33988mg二棕榈酰磷脂酰胆碱、0.072mg二硬脂酰基磷脂酰胆碱、0.216mg二油酰基卵磷脂DOPC和0.108mg胆固醇分别溶于三氯甲烷中(摩尔量比例为5:3:1:1)，准确称取0.043411mg吲哚菁绿溶于无水甲醇。(脂质体原材料与吲哚菁绿摩尔量比为250:1)将混合溶液于65℃水浴加热并充分混匀，在涡旋器上涡旋，同时向试管中充入速率适中且流速稳定的氮气，直至有机溶液挥发完全形成均匀薄膜，试管内无液体残留。
2、用封口膜将试管口封口，并用利器在封口膜上戳孔，保证试管内气体可与外界连通，将试管置于真空器皿中避光抽真空4h，使试管中的有机溶剂挥发完全。
3、用2mL 0.01M PBS(pH＝7.4-7.5)在65℃水浴条件下对薄膜进行水化至试管壁上的脂质膜完全脱落后，将试管置于超声清洗机中(水温65℃)水浴超声5min。
4、在液氮和65℃环境水浴条件下反复冻融，循环进行5次。
5、溶液用装有200nm聚碳酸酯膜的脂质体挤出器反复挤压20次，得吲哚菁绿脂质体，4℃避光条件下透析12h除去未装载的吲哚菁绿，得到纯化的吲哚菁绿脂质体。
实施例5：
1、精确称取0.3412mg二棕榈酰磷脂酰胆碱、0.072mg二硬脂酰基磷脂酰胆碱、0.216mg二油酰基卵磷脂DOPC和0.108mg胆固醇分别溶于三氯甲烷中(摩尔量比例为5:3:1:1)，准确称取0.021705mg吲哚菁绿溶于无水甲醇。(脂质体原材料与吲哚菁绿摩尔量比为500:1)将混合溶液于65℃水浴加热并充分混匀，在涡旋器上涡旋，同时向试管中充入速率适中且流速稳定的氮气，直至有机溶液挥发完全形成均匀薄膜，试管内无液体残留。
2、用封口膜将试管口封口，并用利器在封口膜上戳孔，保证试管内气体可与外界连通，将试管置于真空器皿中避光抽真空4h，使试管中的有机溶剂挥发完全。
3、用2mL 0.01M PBS(pH＝7.4-7.5)在65℃水浴条件下对薄膜进行水化至试管壁上的脂质膜完全脱落后，将试管置于超声清洗机中(水温65℃)水浴超声5min。
4、在液氮和65℃环境水浴条件下反复冻融，循环进行5次。
5、溶液用装有200nm聚碳酸酯膜的脂质体挤出器反复挤压20次，得吲哚菁绿脂质体，4℃避光条件下透析12h除去未装载的吲哚菁绿，得到纯化的吲哚菁绿脂质体。
实施例6：
1、精确称取0.3417mg二棕榈酰磷脂酰胆碱、0.072mg二硬脂酰基磷脂酰胆碱、0.216mg二油酰基卵磷脂DOPC和0.108mg胆固醇分别溶于三氯甲烷中(摩尔量比例为5:3:1:1)，准确称取0.014108mg吲哚菁绿溶于无水甲醇。(脂质体原材料与吲哚菁绿摩尔量比为750:1)将混合溶液于65℃水浴加热并充分混匀，在涡旋器上涡旋，同时向试管中充入速率适中且流速稳定的氮气，直至有机溶液挥发完全形成均匀薄膜，试管内无液体残留。
2、用封口膜将试管口封口，并用利器在封口膜上戳孔，保证试管内气体可与外界连通，将试管置于真空器皿中避光抽真空4h，使试管中的有机溶剂挥发完全。
3、用2mL 0.01M PBS(pH＝7.4-7.5)在65℃水浴条件下对薄膜进行水化至试管壁上的脂质膜完全脱落后，将试管置于超声清洗机中(水温65℃)水浴超声5min。
4、在液氮和65℃环境水浴条件下反复冻融，循环进行5次。
5、溶液用装有200nm聚碳酸酯膜的脂质体挤出器反复挤压20次，得吲哚菁绿脂质体，4℃避光条件下透析12h除去未装载的吲哚菁绿，得到纯化的吲哚菁绿脂质体。
实施例7：
1、精确称取0.3419mg二棕榈酰磷脂酰胆碱、0.072mg二硬脂酰基磷脂酰胆碱、0.216mg二油酰基卵磷脂DOPC和0.108mg胆固醇分别溶于三氯甲烷中(摩尔量比例为5:3:1:1)，准确称取0.010852mg吲哚菁绿溶于无水甲醇。(脂质体原材料与吲哚菁绿摩尔量比为1000:1)将混合溶液于65℃水浴加热并充分混匀，在涡旋器上涡旋，同时向试管中充入速率适中且流速稳定的氮气，直至有机溶液挥发完全形成均匀薄膜，试管内无液体残留。
2、用封口膜将试管口封口，并用利器在封口膜上戳孔，保证试管内气体可与外界连通，将试管置于真空器皿中避光抽真空4h，使试管中的有机溶剂挥发完全。
3、用2mL 0.01M PBS(pH＝7.4-7.5)在65℃水浴条件下对薄膜进行水化至试管壁上的脂质膜完全脱落后，将试管置于超声清洗机中(水温65℃)水浴超声5min。
4、在液氮和65℃环境水浴条件下反复冻融，循环进行5次。
5、溶液用装有200nm聚碳酸酯膜的脂质体挤出器反复挤压20次，得吲哚菁绿脂质体，4℃避光条件下透析12h除去未装载的吲哚菁绿，得到纯化的吲哚菁绿脂质体。
实施例8：
1、精确称取0.33988mg二棕榈酰磷脂酰胆碱、0.072mg二硬脂酰基磷脂酰胆碱、0.216mg二油酰基卵磷脂DOPC和0.108mg胆固醇分别溶于三氯甲烷中(摩尔量比例为5:3:1:1)，准确称取0.043411mg吲哚菁绿溶于无水甲醇。(脂质体原材料与吲哚菁绿摩尔量比为250:1)将混合溶液于65℃水浴加热并充分混匀，在涡旋器上涡旋，同时向试管中充入速率适中且流速稳定的氮气，直至有机溶液挥发完全形成均匀薄膜，试管内无液体残留。
2、用封口膜将试管口封口，并用利器在封口膜上戳孔，保证试管内气体可与外界连通，将试管置于真空器皿中避光抽真空4h，使试管中的有机溶剂挥发完全。
3、用2mL 0.01M PBS(pH＝7.4-7.5)在65℃水浴条件下对薄膜进行水化至试管壁上的脂质膜完全脱落后，将试管置于超声清洗机中(水温65℃)水浴超声5min。
4、在液氮和65℃环境水浴条件下反复冻融，循环进行5次。
5、溶液用装有200nm聚碳酸酯膜的脂质体挤出器反复挤压20次，得到普通的吲哚菁绿脂质体。
6、加入SW1990胰腺癌细胞膜蛋白(蛋白与脂质体质量比为1:300)，移液枪吹打混合均匀后用装有200nm和100nm聚碳酸酯膜的脂质体挤出器反复挤压20次，4℃避光条件下透析12h除去未装载的吲哚菁绿和细胞膜蛋白，得到吲哚菁绿仿生脂质体。
实施例9：
1、精确称取0.33988mg二棕榈酰磷脂酰胆碱、0.072mg二硬脂酰基磷脂酰胆碱、0.216mg二油酰基卵磷脂DOPC和0.108mg胆固醇分别溶于三氯甲烷中(摩尔量比例为5:3:1:1)，准确称取0.043411mg吲哚菁绿溶于无水甲醇。(脂质体原材料与吲哚菁绿摩尔量比为250:1)将混合溶液于65℃水浴加热并充分混匀，在涡旋器上涡旋，同时向试管中充入速率适中且流速稳定的氮气，直至有机溶液挥发完全形成均匀薄膜，试管内无液体残留。
2、用封口膜将试管口封口，并用利器在封口膜上戳孔，保证试管内气体可与外界连通，将试管置于真空器皿中避光抽真空4h，使试管中的有机溶剂挥发完全。
3、用2mL 0.01M PBS(pH＝7.4-7.5)在65℃水浴条件下对薄膜进行水化至试管壁上的脂质膜完全脱落后，将试管置于超声清洗机中(水温65℃)水浴超声5min。
4、在液氮和65℃环境水浴条件下反复冻融，循环进行5次。
5、溶液用装有200nm聚碳酸酯膜的脂质体挤出器反复挤压20次，得到普通的吲哚菁绿脂质体。
6、加入红细胞膜蛋白(蛋白与脂质体质量比为1:300)，移液枪吹打混合均匀后用装有200nm和100nm聚碳酸酯膜的脂质体挤出器反复挤压20次，4℃避光条件下透析12h除去未装载的吲哚菁绿和细胞膜蛋白，得到吲哚菁绿仿生脂质体。
实施例10：
1、精确称取0.33988mg二棕榈酰磷脂酰胆碱、0.072mg二硬脂酰基磷脂酰胆碱、0.216mg二油酰基卵磷脂DOPC和0.108mg胆固醇分别溶于三氯甲烷中(摩尔量比例为5:3:1:1)，准确称取0.043411mg吲哚菁绿溶于无水甲醇。(脂质体原材料与吲哚菁绿摩尔量比为250:1)将混合溶液于65℃水浴加热并充分混匀，在涡旋器上涡旋，同时向试管中充入速率适中且流速稳定的氮气，直至有机溶液挥发完全形成均匀薄膜，试管内无液体残留。
2、用封口膜将试管口封口，并用利器在封口膜上戳孔，保证试管内气体可与外界连通，将试管置于真空器皿中避光抽真空4h，使试管中的有机溶剂挥发完全。
3、用2mL 0.01M PBS(pH＝7.4-7.5)在65℃水浴条件下对薄膜进行水化至试管壁上的脂质膜完全脱落后，将试管置于超声清洗机中(水温65℃)水浴超声5min。
4、在液氮和65℃环境水浴条件下反复冻融，循环进行5次。
5、溶液用装有200nm聚碳酸酯膜的脂质体挤出器反复挤压20次，得到普通的吲哚菁绿脂质体。
6、加入中性粒细胞膜蛋白(蛋白与脂质体质量比为1:300)，移液枪吹打混合均匀后用装有200nm和100nm聚碳酸酯膜的脂质体挤出器反复挤压20次，4℃避光条件下12h透析除去未装载的吲哚菁绿和细胞膜蛋白，得到吲哚菁绿仿生脂质体。
对比例1
1、精确称取0.33988mg二棕榈酰磷脂酰胆碱、0.072mg二硬脂酰基磷脂酰胆碱、0.216mg二油酰基卵磷脂DOPC和0.108mg胆固醇分别溶于三氯甲烷中(摩尔量比例为5:3:1:1)，将混合溶液于65℃水浴加热并充分混匀，在涡旋器上涡旋，同时向试管中充入速率适中且流速稳定的氮气，直至有机溶液挥发完全形成均匀薄膜，试管内无液体残留。
2、用封口膜将试管口封口，并用利器在封口膜上戳孔，保证试管内气体可与外界连通，将试管置于真空器皿中避光抽真空4h，使试管中的有机溶剂挥发完全。
3、准确称取0.043411mg吲哚菁绿溶于2mL 0.01M PBS(pH＝7.4-7.5)中获得吲哚菁绿PBS溶液，在65℃水浴条件下将吲哚菁绿PBS溶液对薄膜进行水化至试管壁上的脂质膜完全脱落后，将试管置于超声清洗机中(水温65℃)水浴超声5min。
4、在液氮和65℃环境水浴条件下反复冻融，循环进行5次。
5、溶液用装有200nm聚碳酸酯膜的脂质体挤出器反复挤压20次，4℃避光条件下透析12h除去未装载的吲哚菁绿，得到纯化的吲哚菁绿脂质体。
对比例2
准确称取吲哚菁绿溶于2mL 0.01M PBS中获得与实施例4相同浓度的吲哚菁绿溶液。
效果例1光谱检测
分别对实施例1-7，对比例1-2的样品进行紫外光谱，荧光光谱检测。
通过检测发现，对比实施例以及对比例1的紫外光谱可知，本发明实施例脂质体的紫外光谱相对于对比例1-2发生了红移。
对比实施例与比例2以及对比对比例1-2的荧光光谱可知，本发明实施例在近红外一区窗口荧光光谱红移了约15nm，且荧光强度提高。对比例1在近红外一区窗口荧光光谱与游离吲哚菁绿保持一致，荧光强度降低。通过实验结果可知，本发明方法制备的脂质体能够增强吲哚菁绿的荧光发射，原因可能为疏水的双分子层限制了吲哚菁绿自聚集，导致荧光强度实现了累积增强的效果。而对比例1的方法制备获得脂质体，由于吲哚菁绿是限制在脂质体水溶性核心的，因此与水发生相互作用导致自聚集的荧光猝灭，同理游离的吲哚菁绿也面临相同的问题。
相对于游离的吲哚菁绿溶液，本发明方法制备获得的吲哚菁绿脂质体荧光光谱发生红移使更多的荧光信号进入近红外二区窗口，近红外一区荧光强度的提高让本发明方法制备获得的吲哚菁绿脂质体在近红外二区窗口的荧光光谱整体抬高，从而近红外二区窗口显示显著提高的荧光强度。综上所述，本发明的脂质体吲哚菁绿在近红外荧光二区可作为一种高亮度的成像探针。
效果例2荧光强度检测
将不同比例的脂质体吲哚菁绿加入96孔板，以相同投入量的吲哚菁绿或相同紫外吸收的吲哚菁绿为对照，每孔体积100mL在近红外二区荧光成像仪上检测荧光强度，(仪器参数采用1000的滤光片，高度为220，激发光为808nm，曝光时间为15ms)实验结果参见图3，6-8，可知本发明制备脂质体的近红外二区荧光强度远高于游离的吲哚菁绿，在不同的溶剂中仍保持相当的稳定亮度。
通过对比不同的磷脂膜材与吲哚菁绿的合成比例的近红外二区荧光强度，实验现象揭示：一定范围内，荧光强度随着吲哚菁绿浓度的增加而上升，但超出范围后荧光强度随着吲哚菁绿浓度的增加而降低，这说明本发明的脂质体中的磷脂膜双层中嵌入的吲哚菁绿剂量存在最佳的上限。
效果例3荧光强度稳定性检测
具体实验方法及参数与效果例2相同，96孔板里的样品用锡纸避光保存，在60天内去检测近红外二区荧光强度的变化。通过荧光强度检测实验结果(参见图4)，可知本发明制备脂质体可以在不同介质中60天内近红外二区荧光强度衰减很慢，保持一定的荧光稳定。
效果例4体内实验
对不同组小鼠进行体内实验，检测其荧光强度和维持时间，其中，RLIPO-ICG为修饰了红细胞膜的吲哚菁绿脂质体组，即实施例9的脂质体。ICG-INPUT组为相同投入量游离的吲哚菁绿组，ICG-OD为相同紫外吸收的游离的吲哚菁绿组，LIPO-ICG为吲哚菁绿脂质体组。小鼠尾静脉注射200μl不同处理组的试剂，相同投入量的游离吲哚菁绿浓度为44μg/mL，相同紫外吸收的游离吲哚菁绿浓度为132μg/mL。吲哚菁绿脂质体合成注射浓度为合成原液浓度。用近红外荧光二区成像仪进行检测。实验结果证明，在体内的血液循环时间相较于游离的吲哚菁绿以及未包覆红细胞膜的脂质体大大提高。
Claims (20)
1.一种用于近红外二区荧光检测的吲哚菁绿脂质体在制备近红外二区荧光检测试剂中的用途，
所述吲哚菁绿脂质体具有磷脂双分子层以及嵌在磷脂双分子层之间的吲哚菁绿，所述的吲哚菁绿脂质体外侧还附有细胞膜蛋白；磷脂双分子层与吲哚菁绿的摩尔量比为25-1000:1
所述吲哚菁绿脂质体以薄膜分散法制备，其包括如下步骤：
1)将制备磷脂双分子层的材料与溶于有机溶剂的吲哚菁绿混合形成均匀溶液，去除有机溶剂获得分散的薄膜；
2)加入水相进行水化，机械力分散形成吲哚菁绿脂质体；
3)在吲哚菁绿脂质体的表面附着细胞膜蛋白。
2.根据权利要求1所述的用途，所述磷脂双分子层与吲哚菁绿的摩尔量比为100-500:1。
3.根据权利要求1所述的用途，所述的磷脂双分子层由磷脂，或者磷脂和胆固醇的混合物构成。
4.根据权利要求3所述的用途，所述磷脂选自二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、二油酰基卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、二月桂酰卵磷脂、二肉豆蔻酰卵磷脂、二月桂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰二丝氨酸、脑磷脂酰丝氨酸、脑神经鞘磷脂、二棕榈酰神经鞘磷脂、二硬脂酰神经鞘磷脂、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的一种或几种的组合。
5.根据权利要求3所述的用途，磷脂双分子层由二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、二油酰基卵磷脂和胆固醇构成。
6.根据权利要求1-5任一项所述的用途，吲哚菁绿脂质体与细胞膜蛋白的质量比为200-400:1。
7.根据权利要求6所述的用途，所述的细胞膜蛋白选自癌细胞膜蛋白、红细胞膜蛋白、中性粒细胞膜蛋白、凝血调节蛋白、以二聚体或四聚体的形式存在的葡萄糖转运蛋白1、Neurothelin/HT7、血清γ谷氨酰转肽酶、P-糖蛋白、PD-1配体PDL1/PDL2、Fas配体FasL、免疫共刺激蛋白B7-H4、膜相关补体调控蛋白CRRY以及非经典MHC I类分子。
8.根据权利要求1所述的用途，机械力分散指通过超声分散、脂质体挤出器反复挤出的方式进行分散。
9.根据权利要求1所述的用途，步骤3)的方法为将膜蛋白与脂质体分散均匀，然后以脂质体挤出器进行挤出，分离出具细胞膜蛋白的脂质体。
10.根据权利要求9所述的用途，分离出具细胞膜蛋白的脂质体的方法为透析或离心。
11.一种近红外二区用检测试剂，其包括吲哚菁绿脂质体；
所述吲哚菁绿脂质体具有磷脂双分子层以及嵌在磷脂双分子层之间的吲哚菁绿，所述的吲哚菁绿脂质体外侧还附有细胞膜蛋白；磷脂双分子层与吲哚菁绿的摩尔量比为25-1000:1
所述吲哚菁绿脂质体以薄膜分散法制备，其包括如下步骤：
1)将制备磷脂双分子层的材料与溶于有机溶剂的吲哚菁绿混合形成均匀溶液，去除有机溶剂获得分散的薄膜；
2)加入水相进行水化，机械力分散形成吲哚菁绿脂质体；
3)在吲哚菁绿脂质体的表面附着细胞膜蛋白。
12.根据权利要求11所述的近红外二区用检测试剂，所述磷脂双分子层与吲哚菁绿的摩尔量比为100-500:1。
13.根据权利要求11所述的近红外二区用检测试剂，所述的磷脂双分子层由磷脂，或者磷脂和胆固醇的混合物构成。
14.根据权利要求13所述的近红外二区用检测试剂，所述磷脂选自二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、二油酰基卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、二月桂酰卵磷脂、二肉豆蔻酰卵磷脂、二月桂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰二丝氨酸、脑磷脂酰丝氨酸、脑神经鞘磷脂、二棕榈酰神经鞘磷脂、二硬脂酰神经鞘磷脂、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的一种或几种的组合。
15.根据权利要求13所述的近红外二区用检测试剂，磷脂双分子层由二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、二油酰基卵磷脂和胆固醇构成。
16.根据权利要求11-15任一项所述的近红外二区用检测试剂，吲哚菁绿脂质体与细胞膜蛋白的质量比为200-400:1。
17.根据权利要求16所述的近红外二区用检测试剂，所述的细胞膜蛋白选自癌细胞膜蛋白、红细胞膜蛋白、中性粒细胞膜蛋白、凝血调节蛋白、以二聚体或四聚体的形式存在的葡萄糖转运蛋白1、Neurothelin/HT7、血清γ谷氨酰转肽酶、P-糖蛋白、PD-1配体PDL1/PDL2、Fas配体FasL、免疫共刺激蛋白B7-H4、膜相关补体调控蛋白CRRY以及非经典MHC I类分子。
18.根据权利要求11所述的近红外二区用检测试剂，机械力分散指通过超声分散、脂质体挤出器反复挤出的方式进行分散。
19.根据权利要求11所述的近红外二区用检测试剂，步骤3)的方法为将膜蛋白与脂质体分散均匀，然后以脂质体挤出器进行挤出，分离出具细胞膜蛋白的脂质体。
20.根据权利要求19所述的近红外二区用检测试剂，分离出具细胞膜蛋白的脂质体的方法为透析或离心。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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