CN107648667A - 一种磁控蛋白复合细胞膜片的制备方法 - Google Patents

一种磁控蛋白复合细胞膜片的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种磁控蛋白复合细胞膜片的制备方法，以及磁性纳米颗粒在制备蛋白复合细胞膜片中的应用，所述磁性纳米颗粒呈分散状态，直径大小为5‑500nm，磁性纳米颗粒表面含有纳米孔、化学键或者电荷以吸附蛋白，通过磁场控制蛋白和细胞的沉淀以构建蛋白复合细胞膜片。本发明提出了磁控蛋白复合细胞膜片的概念和制备方法，蛋白质可被高效固载于细胞膜片中并发挥生物学效应，可显著提高体内再生修复效果，为体外构建复杂组织结构提供一种新方法。并提供了一种可控的、分散的、8‑12nm大小的nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒的制备方法，磁性纳米颗粒不仅可以被细胞吞噬而标记细胞，还可以吸附结合蛋白。

Description

一种磁控蛋白复合细胞膜片的制备方法
技术领域
本发明属于组织工程与再生医学领域，更具体地讲，涉及一种磁控蛋白复合细胞膜片的制备方法，可用于组织再生修复和体外微组织构建及研究。
背景技术
细胞膜片制备无需支架材料、通过细胞连接和细胞外基质构成一整体，更接近组织细胞的天然生理状态，该技术在干细胞为基础的再生治疗方面具有诸多优势。从制备方法来讲，传统的使用温敏型培养皿和直接诱导成膜技术存在培养周期长、细胞膜片厚度受限、多种细胞直接叠加困难等缺点，另外，温敏型培养皿价格较贵，也进一步限制了相关研究和应用。磁控技术制备细胞膜片周期更短、可反复叠加多种细胞制备超厚细胞膜片，并无需受温敏型培养皿的限制，更具优势。为了进一步提高再生修复效果，拟将具有不同生物活性的生长因子掺入细胞膜片中，构建磁控生长因子复合细胞膜片，该方面研究尚未见文献报道。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供磁性纳米颗粒在制备蛋白复合细胞膜片中的应用。
本发明的第二个目的在于提供一种磁控蛋白复合细胞膜片的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供分散的氧化石墨烯外壳包裹的磁性纳米颗粒的制备方法。
为实现本发明第一个目的，本发明公开以下技术方案：磁性纳米颗粒在制备蛋白复合细胞膜片中的应用，其特征在于，所述磁性纳米颗粒呈分散状态，直径大小为5-500nm，磁性纳米颗粒表面可含有纳米孔、化学键或者电荷以吸附蛋白，通过磁场控制蛋白和细胞的沉淀以构建蛋白复合细胞膜片。
作为一个优选方案，所述细胞是间充质干细胞、胚胎干细胞、iPS细胞或成体细胞，所述蛋白是生长因子、促进再生修复功能的其他蛋白质、多肽、外泌体、核酸或小分子药物。
作为一个优选方案，细胞与1-100μg/mL所述磁性纳米颗粒共培养实现细胞吞噬标记；50-200μg/mL蛋白与1-100μg/mL所述磁性纳米颗粒孵育实现结合。
作为一个优选方案，所述磁性纳米颗粒为分散的氧化石墨烯外壳包裹的磁性纳米颗粒nGO@Fe3O4或介孔二氧化硅包裹的磁性纳米颗粒mSiO2@Fe3O4。
作为一个优选方案，所述分散的氧化石墨烯外壳包裹的磁性纳米颗粒nGO@Fe3O4通过以下方法制备，首先采用金属离子切割方法获得60-120nm大小的氧化石墨烯，然后通过水热法制备分散的氧化石墨烯包裹的磁性纳米颗粒nGO@Fe3O4，直径大小为8-12nm，所述金属离子包括Ag离子、Fe离子、Co离子、Ni离子、Ca离子和Ba离子。
为实现本发明第二个目的，本发明公开以下技术方案：一种磁控蛋白复合细胞膜片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备呈分散状态，直径大小为5-500nm，表面含有纳米孔、化学键或者电荷的磁性纳米颗粒；
(2)利用分散的磁性纳米颗粒分别标记细胞、结合蛋白，通过磁场控制二者沉淀以构建蛋白复合细胞膜片。
作为一个优选方案，所述磁性纳米颗粒为分散的氧化石墨烯外壳包裹的磁性纳米颗粒nGO@Fe3O4，通过以下方法制备，首先采用金属离子切割方法获得60-120nm大小的氧化石墨烯，然后通过水热法制备分散的氧化石墨烯包裹的磁性纳米颗粒nGO@Fe3O4，直径大小为8-12nm，所述金属离子包括Ag离子、Fe离子、Co离子、Ni离子、Ca离子和Ba离子。
为实现本发明第三个目的，本发明公开以下技术方案：分散的氧化石墨烯外壳包裹的磁性纳米颗粒nGO@Fe3O4的制备方法，其特征在于，首先采用金属离子切割方法获得60-120nm大小的氧化石墨烯，然后通过水热法制备分散的氧化石墨烯包裹的磁性纳米颗粒nGO@Fe3O4，直径大小为8-12nm，所述金属离子包括Ag离子、Fe离子、Co离子、Ni离子、Ca离子和Ba离子。
本发明制备了nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒，并进行了系列表征；检测了牙髓干细胞(DPSCs)对nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒的吞噬行为，评估了细胞的生物活性；评价了nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒用于蛋白缓释的能力和效率；制备了BMP2蛋白复合的DPSCs细胞膜片，移植于体内观察骨再生效果。研究结果表明：(1)成功制备了平均直径大小为8-12nm的nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒，颗粒被覆氧化石墨烯外壳，仍具有较高的饱和磁化强度；(2)牙髓干细胞可快速吞噬nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒，细胞生存及增殖活性未受影响；(3)具有氧化石墨烯外壳的nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒可以快速结合蛋白(包括BMP2蛋白等生长因子)，蛋白结合量具有一定的浓度依赖性；(4)蛋白可在细胞膜片中均匀分布，在制备的BMP2蛋白复合的DPSCs细胞膜片中，BMP2蛋白可被大量固载，并可激活DPSCs的Smad1/5/8信号通路，促进体内骨再生。
本发明的优点在于：本发明提出了磁控生长因子复合细胞膜片的概念和制备方法，生长因子可被高效固载于细胞膜片中并发挥生物学效应，可显著提高体内再生修复效果，为体外构建复杂组织结构提供一种新方法。并提供了一种可控的、分散的、8-12nm大小的nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒的制备方法，磁性纳米颗粒不仅可以被细胞吞噬而标记细胞，还可以吸附结合蛋白。
附图说明
图1：(a)nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒的制备过程；(b)Ag+切割后，氧化石墨烯碎片的AFM照片及高度图；(c)离心分离获得尺寸大小为60-120nm的氧化石墨烯碎片的AFM照片及高度图；(d)nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒的TEM照片；(e)放大观察nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒；(f)nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒的磁化强度，及磁颗粒受磁力作用从溶液中分离情况。
图2：不同离子切割获得的氧化石墨烯颗粒的AFM照片。
图3：(a)牙髓干细胞与不同浓度的nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒共培养2小时，普鲁士蓝染色观察细胞被标记情况，可见细胞内被染成蓝色的磁颗粒；(b)细胞凋亡流式细胞检测结果；(c)凋亡细胞所占百分比；(d)坏死细胞所占百分比；(e)MTT检测结果。
图4：(a)磁控细胞膜片制备示意图；(b)通过改变磁铁组合图案精确控制细胞膜片形状；(c)通过分次添加不同细胞，可以获得分层复合细胞膜片；(d)通过单次添加细胞制备的具有均一厚度的细胞膜片，HE染色观察；(e)通过反复添加细胞，可以获得超厚细胞膜片，普鲁士蓝染色观察；(f)细胞膜片厚度统计结果(★★，p<0.01)。
图5：(a)NIH3T3细胞与nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒共培养2小时，普鲁士蓝染色观察细胞被标记情况，也可见细胞内染成蓝色的磁颗粒；(b)受磁性纳米颗粒标记的细胞可以通过磁力控制形成特定形状的细胞膜片。
图6：(a)红色荧光蛋白标记二抗(2Ab-PE)可以与nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒结合并被磁铁吸附；(b)通过磁场控制，2Ab-PE可被均匀放置于细胞膜片中；(c)随着蛋白浓度的提高，更多的BSA蛋白可被nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒结合。
图7：(a)通过磁控颗粒可将大量BMP2蛋白添加至细胞膜片中，并可激活Smad1/5/8信号通路；(b)移植于裸鼠体内，免疫荧光结果示磁颗粒标记DPSCs被诱导分化为Osterix+成骨细胞；(c)裸鼠皮下埋植一个月，HE染色结果示成骨情况；(d)新骨面积统计结果(★★，p<0.01)。
图8：(a)mSiO2@Fe3O4磁性纳米颗粒也能结合蛋白，但其结合的蛋白量明显少于nGO@Fe3O4组；(b)细胞核使用DAPI复染后于荧光显微镜下观察，mSiO2@Fe3O4组的蛋白量明显少于nGO@Fe3O4组。
图9：(a)磁性颗粒可被各种不用细胞吞噬而实现细胞标记；(b)将磁颗粒标记后的细胞加入培养液中，在磁铁控制下吸附固载4小时以形成细胞膜片，培养24小时后制备垂直面冰冻切片，分别进行细胞骨架和细胞核染色后于荧光显微镜下观察，各组均可形成超过10层的超厚细胞膜片。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所推荐的条件进行实验。
实施例1.nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒的制备与表征
步骤一、制备纳米尺寸氧化石墨烯(nGO)
根据图1a所示，为了制备nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒，首先制备纳米尺寸氧化石墨烯。将20mL的AgNO3溶液加入等体积的0.5mg/mL的氧化石墨烯溶液中，室温搅拌30分钟，然后静置48小时(AFM表征结果如图1b所示，氧化石墨烯颗粒大小不一)。使用2000rpm离心10分钟，收集上清与10mL硝酸溶液(2mM)混合，旋转真空蒸发器中浓缩处理5小时以溶解银颗粒。浓缩液使用6000rpm离心10分钟，去除含有大块氧化石墨烯的沉淀物。将上清进一步使用10000rpm离心30分钟，去除含有银离子的上清、收集含有纳米尺寸氧化石墨烯的沉淀物并使用去离子水溶解备用(AFM表征结果如图1c所示，可见大小为60-120nm的氧化石墨烯颗粒)。
除了使用Ag离子切割大块的石墨烯片外，我们还可以使用Fe、Co、Ni、Ca、Ba等金属离子将石墨烯切割成不同大小的纳米颗粒(见图2)。
步骤二、制备nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒
根据图1a所示，继续制备nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒。将0.5g的FeCl3.6H2O溶于20mL乙二醇，室温搅拌30分钟，加入1mL的NaOH溶液(10mM)搅拌混匀。之后加入4mL纳米尺寸氧化石墨烯(1mg/mL)，搅拌混匀10分钟。转入40mL容量的聚四氟乙烯衬里不锈钢高压釜，置于200℃反应10小时，冷却至室温，产物经去离子水和乙醇交替清洗，备用。
所得nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒大小为8-12nm，并呈现壳核结构(图1d-e)，颗粒在溶液中分散性极佳，并具有较高的磁化强度，与单纯的Fe3O4磁性纳米颗粒相当，在磁场作用下颗粒可被快速从溶液中分离出来(图1f)。
实施例2.干细胞吞噬nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒进行细胞标记
步骤一、细胞与nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒共培养
使用无血清DMEM培养液配制200μg/mL磁性纳米颗粒溶液备用。牙髓干细胞提取自临床阻生齿拔除换牙。当牙髓干细胞培养至约50％汇合时，更换无血清DMEM培养液，分别加入终浓度为0、1、5、10、50和100μg/mL的磁性纳米颗粒共培养2小时，普鲁士蓝染色观察细胞吞噬颗粒情况。如图3a所示，随着颗粒浓度增高，细胞吞噬更多颗粒，且主要分布于细胞核周边。
步骤二、细胞凋亡和细胞增殖活性检测
当牙髓干细胞培养至约80％汇合时，更换无血清DMEM培养液，分别加入终浓度为0、1、5、10、50和100μg/mL的磁性纳米颗粒共培养2小时。收集细胞，进行Annexin V-FITC/PI染色，上机流式检测(图3b)，并统计凋亡(图3c)及坏死(图3d)细胞数量，结果显示各组间无显著性差异。或收集细胞接种于96孔板中，分别于第1、3、5和7天进行MTT检测(图3e)，结果显示各组间无显著性差异。
实施例3.nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒标记干细胞的磁控效果
步骤一、细胞与nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒共培养
细胞标记操作步骤同实施例二：当牙髓干细胞培养至约80％汇合时，更换无血清DMEM培养液，加入终浓度为100μg/mL的磁性纳米颗粒共培养2小时。如图4a所示，磁颗粒标记后的细胞加入培养液中，在磁铁控制下吸附固载4小时以形成细胞膜片。
除了牙髓干细胞外，我们也使用了其他细胞也可被磁颗粒标记，例如NIH3T3细胞系(图5a)。同时磁颗粒标记的NIH3T3细胞亦可被磁力吸附形成特定形状的细胞膜片(图5b)。
步骤二、细胞膜片形状的控制
将牙髓干细胞分别使用Lenti-GFP和Lenti-RFP标记，之后按照步骤一所述使用100μg/mL的磁性纳米颗粒进行细胞标记。分别将2个或4个直径3mm的磁铁组合在一起，以控制吸附GFP和磁性颗粒共同标记的干细胞，4小时后荧光显微镜下观察，可形成与磁铁图案一致形状的细胞膜片(图4b)。另外还可以根据图4c所示，将RFP和GFP标记的干细胞按顺序分别被磁铁控制吸附，继续培养24小时后行冰冻切片观察，形成一体化的分成叠加细胞膜片。
步骤三、细胞膜片厚度的控制
按照步骤一所述使用100μg/mL的磁性纳米颗粒进行细胞标记。之后使用磁铁控制吸附被标记干细胞以形成细胞膜片(行石蜡包埋切片、HE染色观察，如图4d所示，厚度约100μm)。另外，还尝试每四小时添加一次干细胞，以增加细胞膜片厚度，行石蜡包埋切片、普鲁士蓝染色观察(图4e)，膜片厚度随添加次数增加而逐渐增厚，厚度之间存在显著性差异(图4f，p<0.01)。
实施例4.nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒结合蛋白
步骤一、nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒与红色荧光二抗结合
配制含100μg/mL的磁性纳米颗粒与100μg/mL的红色荧光(2Ab-PE)混合液，置于4℃孵育2小时，无需其他任何额外处理，之后使用磁铁吸附颗粒并清洗后，荧光显微镜下观察(如图6a所示，仅有nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒组可见被磁铁吸附的红色荧光二抗)。
将上述制备的结合有2Ab-PE的nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒加入细胞膜片中，观察在其中的分布情况。具体操作步骤如下：在细胞膜片制备过程中，待GFP标记的牙髓干细胞(按实施例三步骤二所述方法处理)加入2小时后，再加入结合红色二抗的nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒，继续吸附2小时后进行固定并行激光共聚焦断层扫描观察，重建结果可见红色二抗近乎均匀地分布于细胞膜片中(图6b)。
步骤二、nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒与BSA蛋白结合
使用100μg/mL的磁性纳米颗粒与不同浓度(50、100和200μg/mL)的BSA蛋白进行混合，置于4℃孵育2小时，之后使用磁铁吸附收集结合蛋白的磁颗粒，进行凝胶电泳，考马斯亮蓝染色观察(如图6c所示，仅有nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒组可见被磁铁吸附的BSA蛋白，并且显示蛋白量随BSA结合反应浓度的提高而增加)。
实施例5.磁控BMP2复合DPSCs细胞膜片的成骨效果评价
步骤一、磁控BMP2复合DPSCs细胞膜片的制备
使用100μg/mL的磁性纳米颗粒与200μg/mL的BSA蛋白进行混合，置于4℃孵育2小时以便结合；牙髓干细胞与100μg/mL的磁性纳米颗粒共培养2小时以进行细胞标记。磁控BMP2复合DPSCs细胞膜片的制备按实施例四步骤一所述方法处理：待磁颗粒标记的牙髓干细胞加入2小时后，再加入结合BMP蛋白的磁性纳米颗粒，继续吸附2小时以将蛋白固载于细胞膜片中。
步骤二、磁控BMP2复合DPSCs细胞膜片的蛋白固载能力分析
待BMP2复合DPSCs细胞膜片制备后，于体外继续维持磁场控制培养2天。之后收集细胞总蛋白，WB检测BMP2蛋白的固载和存留情况(如图7a所示，BMP2复合细胞膜片组的BMP2蛋白量明显高于另外两组)；另外收集了细胞核蛋白，WB检测SMAD1/5/8信号通路激活情况(如图7a所示，BMP2复合细胞膜片组的SMAD1/5/8的磷酸化水平明显高于另外两组)。
步骤三、磁控BMP2复合DPSCs细胞膜片的成骨性能检测
待BMP2复合DPSCs细胞膜片制备后，于体外继续维持磁场控制培养2天。之后移植于8周龄裸鼠皮下，标本取出后进行固定、脱钙、石蜡包埋、切片等处理，最后进行Osterix免疫荧光染色观察，同时染普鲁士蓝进行细胞示踪并综合分析(如图7b所示，磁颗粒标记细胞被诱导分化为Osterix阳性的成骨细胞)；另外于术后一个月取出标本，进行固定、脱钙、石蜡包埋、切片、HE染色观察(如图7c所示)，分析成骨情况(如图7d所示，BMP2复合细胞膜片组的成骨面积显著性增高，p<0.01)。
实施例5.介孔二氧化硅包裹的磁性纳米颗粒(mSiO2@Fe3O4)结合蛋白
所使用介孔二氧化硅包裹的磁性纳米颗粒(mSiO2@Fe3O4)表面孔径大小为5-10nm，配制含100μg/mL的mSiO2@Fe3O4与100μg/mL的红色荧光(2Ab-PE)混合液，置于4℃孵育2小时，无需其他任何额外处理，之后使用磁铁吸附颗粒并清洗后，荧光显微镜下观察，如图8a所示：mSiO2@Fe3O4磁性纳米颗粒也能结合蛋白，但其结合的蛋白量明显少于nGO@Fe3O4组。
将上述制备的结合有2Ab-PE的磁性纳米颗粒加入细胞膜片中，观察在其中的分布情况。具体操作步骤如下：在细胞膜片制备过程中，待牙髓干细胞(按实施例三步骤二所述方法处理)加入2小时后，再加入结合红色二抗的磁性纳米颗粒，继续吸附2小时后制备垂直面冰冻切片，细胞核使用DAPI复染后于荧光显微镜下观察，mSiO2@Fe3O4组的蛋白量明显少于nGO@Fe3O4组(图8b)。
介孔二氧化硅包裹的磁性纳米颗粒(mSiO2@Fe3O4)可以用来结合蛋白，但其结合蛋白的效果明显不如nGO@Fe3O4，对于蛋白量要求不是很高的细胞膜片可以使用mSiO2@Fe3O4，但对于生长因子等的含量要求较高以实现再生修复功能的细胞膜片来说，使用mSiO2@Fe3O4的效果较差，无法达到预期目标。
实施例6.多种细胞使用nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒制备细胞膜片
除了牙髓干细胞外，多种细胞均可使用nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒制备细胞膜片。如使用MC3T-E1细胞系、大鼠骨髓干细胞(BMSCs)、大鼠软骨细胞(Chondrocytes)以及人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，但细胞培养至约80％汇合时，更换无血清DMEM培养液，加入终浓度为100μg/mL的磁性纳米颗粒共培养2小时。如图9a所示，磁性颗粒可被各种不用细胞吞噬而实现细胞标记。将磁颗粒标记后的细胞加入培养液中，在磁铁控制下吸附固载4小时以形成细胞膜片，培养24小时后制备垂直面冰冻切片，分别进行细胞骨架和细胞核染色后于荧光显微镜下观察，各组均可形成超过10层的超厚细胞膜片(图9b)。
综上所述，成功制备了既可以标记细胞，又可以结合蛋白的nGO@Fe3O4磁性纳米颗粒，通过磁控方法可以方便制备形状及厚度可控的细胞膜片，并能够将蛋白均匀地固载于细胞膜片中；通过磁控制备的BMP2复合DPSCs细胞膜片体内骨再生效果显著提高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，例如扩大磁颗粒表面修饰材料范围以达到装载蛋白的目的以及扩大标记细胞和结合蛋白的应用范围或应用于其他研究，包括胚胎干细胞、脂肪干细胞、骨髓干细胞等其他种类的干细胞和成骨细胞、软骨细胞、内皮细胞等成体细胞等，以及使用其它已知的可以与氧化石墨烯相结合的蛋白因子和药物，还包括用于其他组织再生修复或用于体外微组织构建和相关研究等，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.磁性纳米颗粒在制备蛋白复合细胞膜片中的应用，其特征在于，所述磁性纳米颗粒呈分散状态，直径大小为5-500nm，磁性纳米颗粒表面含有纳米孔、化学键或者电荷以吸附蛋白，通过磁场控制蛋白和细胞的沉淀以构建蛋白复合细胞膜片。
2.根据权利要求1所述的磁性纳米颗粒在制备蛋白复合细胞膜片中的应用，其特征在于，所述细胞是间充质干细胞、胚胎干细胞、iPS细胞或成体细胞，所述蛋白是生长因子、促进再生修复功能的其他蛋白质、多肽、外泌体、核酸或小分子药物。
3.根据权利要求1所述的磁性纳米颗粒在制备蛋白复合细胞膜片中的应用，其特征在于，细胞与1-100μg/mL所述磁性纳米颗粒共培养实现细胞吞噬标记；50-200μg/mL蛋白与1-100μg/mL所述磁性纳米颗粒孵育实现结合。
4.根据权利要求1所述的磁性纳米颗粒在制备蛋白复合细胞膜片中的应用，其特征在于，所述磁性纳米颗粒为分散的氧化石墨烯外壳包裹的磁性纳米颗粒nGO@Fe3O4或介孔二氧化硅包裹的磁性纳米颗粒mSiO2@Fe3O4。
5.根据权利要求4所述的磁性纳米颗粒在制备蛋白复合细胞膜片中的应用，其特征在于，所述分散的氧化石墨烯外壳包裹的磁性纳米颗粒nGO@Fe3O4通过以下方法制备，首先采用金属离子切割方法获得60-120nm大小的氧化石墨烯，然后通过水热法制备分散的氧化石墨烯包裹的磁性纳米颗粒nGO@Fe3O4，直径大小为8-12nm，所述金属离子包括Ag离子、Fe离子、Co离子、Ni离子、Ca离子和Ba离子。
6.一种磁控蛋白复合细胞膜片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备呈分散状态，直径大小为5-500nm，表面含有纳米孔、化学键或者电荷的磁性纳米颗粒；
(2)利用分散的磁性纳米颗粒分别标记细胞、结合蛋白，通过磁场控制二者沉淀以构建蛋白复合细胞膜片。
7.根据权利要求6所述的一种磁控蛋白复合细胞膜片的制备方法，其特征在于，所述磁性纳米颗粒为分散的氧化石墨烯外壳包裹的磁性纳米颗粒nGO@Fe3O4，通过以下方法制备，首先采用金属离子切割方法获得60-120nm大小的氧化石墨烯，然后通过水热法制备分散的氧化石墨烯包裹的磁性纳米颗粒nGO@Fe3O4，直径大小为8-12nm，所述金属离子包括Ag离子、Fe离子、Co离子、Ni离子、Ca离子和Ba离子。
8.权利要求4所述分散的氧化石墨烯外壳包裹的磁性纳米颗粒nGO@Fe3O4的制备方法，其特征在于，首先采用金属离子切割方法获得60-120nm大小的氧化石墨烯，然后通过水热法制备分散的氧化石墨烯包裹的磁性纳米颗粒nGO@Fe3O4，直径大小为8-12nm，所述金属离子包括Ag离子、Fe离子、Co离子、Ni离子、Ca离子和Ba离子。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111471649A (zh) * 2020-04-13 2020-07-31 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种干细胞微组织的构建方法
CN111840328A (zh) * 2020-06-24 2020-10-30 中国人民解放军总医院 用于周围神经损伤修复的磁力响应性外泌体及其制备方法
CN112755925A (zh) * 2020-12-25 2021-05-07 南通大学 一种神经组织来源外泌体的提取方法
CN113069532A (zh) * 2021-04-30 2021-07-06 北京岳昊科技发展有限公司 含有外泌体的美白和抗衰老药物、保健品或者化妆品

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101256864A (zh) * 2008-01-07 2008-09-03 吉林大学 一种超顺磁性介孔二氧化硅复合球及其制备方法
CN104888275A (zh) * 2015-04-29 2015-09-09 陕西瑞盛生物科技有限公司 一种软骨细胞膜片的构建方法
CN105215353A (zh) * 2015-11-09 2016-01-06 山东大学 一种金属/石墨烯复合材料及其制备方法
WO2016076590A1 (ko) * 2014-11-11 2016-05-19 서울대학교산학협력단 세포 시트 제조용 장치 및 이의 제조 방법
CN105642347A (zh) * 2016-02-25 2016-06-08 华南师范大学 一种氧化石墨烯/CdS磁性复合微球光催化剂的制备方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101256864A (zh) * 2008-01-07 2008-09-03 吉林大学 一种超顺磁性介孔二氧化硅复合球及其制备方法
WO2016076590A1 (ko) * 2014-11-11 2016-05-19 서울대학교산학협력단 세포 시트 제조용 장치 및 이의 제조 방법
CN104888275A (zh) * 2015-04-29 2015-09-09 陕西瑞盛生物科技有限公司 一种软骨细胞膜片的构建方法
CN105215353A (zh) * 2015-11-09 2016-01-06 山东大学 一种金属/石墨烯复合材料及其制备方法
CN105642347A (zh) * 2016-02-25 2016-06-08 华南师范大学 一种氧化石墨烯/CdS磁性复合微球光催化剂的制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SHUKUI ZHOU ET AL.: "Labeling adipose derived stem cell sheet by ultrasmall super-paramagnetic Fe3O4 nanoparticles and magnetic resonance tracking in vivo", 《SCIENTIFIC REPORTS》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111471649A (zh) * 2020-04-13 2020-07-31 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种干细胞微组织的构建方法
CN111840328A (zh) * 2020-06-24 2020-10-30 中国人民解放军总医院 用于周围神经损伤修复的磁力响应性外泌体及其制备方法
CN111840328B (zh) * 2020-06-24 2021-07-02 中国人民解放军总医院 用于周围神经损伤修复的磁力响应性外泌体及其制备方法
CN112755925A (zh) * 2020-12-25 2021-05-07 南通大学 一种神经组织来源外泌体的提取方法
WO2022134246A1 (zh) * 2020-12-25 2022-06-30 南通大学 一种神经组织来源外泌体的提取方法
AU2021212125B2 (en) * 2020-12-25 2022-11-10 Nantong University Method for extracting nerve tissue-derived exosomes
US11731098B2 (en) 2020-12-25 2023-08-22 Nantong University Method for extracting nerve tissue-derived exosomes
JP7424712B2 (ja) 2020-12-25 2024-01-30 南通大学 神経組織由来エクソソームの抽出方法
CN113069532A (zh) * 2021-04-30 2021-07-06 北京岳昊科技发展有限公司 含有外泌体的美白和抗衰老药物、保健品或者化妆品

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