CN111996167B - 基于巨噬细胞释放仿生磁性囊泡的方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于巨噬细胞释放仿生磁性囊泡的方法和应用，包括以下步骤：S1.制备超顺磁性四氧化三铁纳米粒子；S2.培养巨噬细胞；S3.巨噬细胞与超顺磁性四氧化三铁纳米粒子共孵育；S4.巨噬细胞继续培养；S5.收集仿生磁性囊泡。本发明将超顺磁性四氧化三铁纳米粒子与巨噬细胞孵育后，通过巨噬细胞经过类似外泌体释放的途径，产生仿生磁性囊泡，囊泡外部展现出磷脂膜的性能，同时具有良好磁响应性能，具有运用到生物医学领域的潜力。
Description
技术领域
本发明属于生物医学材料技术领域，具体涉及一种基于巨噬细胞释放仿生磁性囊泡的方法和应用。
背景技术
近年来，磁性纳米粒子因其在技术和生物医学上的广泛应用而引起了人们的广泛关注。磁性纳米粒子在疾病诊断、免疫分析、磁共振成像(MRI)、生物分离和生物催化等生物医学领域具有广阔的应用前景。然而，一方面，当纳米进入生理环境时,它会迅速吸附蛋白质等生物大分子形成蛋白质晕，从而改变了纳米粒子的尺寸以及表面性质；另一方面，纳米粒子也会非特异性吸附生理环境中的细胞(如血细胞)，使其具有不同于原有材料的生物学特性，造成原有设计的功能受到影响。因此，各种抗非特异性吸附的物质被修饰在纳米粒子表面，例如聚乙二醇，牛血清白蛋白，两性离子，各类细胞膜(血小板膜，白细胞膜，肿瘤细胞膜等)。其中，细胞膜材料因其具有磷脂及细胞膜蛋白组分，一方面可以利用细胞膜特性降低非特异性吸附；另一方面，细胞膜蛋白的存在，可影响材料—细胞间的相互作用，实现对一些目标细胞的特异性靶向。
当前，各类细胞膜修饰的仿生超顺磁性四氧化三铁纳米粒子(＞10nm)已被制备出并在生物医学材料领域得到运用，这些方法通常是将细胞膜组分通过物理破坏，机械挤压等一系列操作使其与磁性纳米粒子结合。这样的结合方式必然使细胞膜的结构被破坏，同时镶嵌在细胞膜上的蛋白也会存在丢失，进而影响生理学特性。因此，将细胞膜简单地、较为完整地引入拥有快速磁响应性能的仿生磁性纳米粒子上显得十分重要。
发明内容
本发明的目的在于：针对上述现有技术中存在的不足，提供一种基于巨噬细胞释放仿生磁性囊泡的方法和应用。
本发明采用的技术方案如下：
一种基于巨噬细胞释放仿生磁性囊泡的方法，包括以下步骤：
S1.制备超顺磁性四氧化三铁纳米粒子；
S2.培养巨噬细胞；
S3.移除S2培养的巨噬细胞中的原培养液，用磷酸盐缓冲液清洗3-5次，然后加入含有S1所得超顺磁性四氧化三铁纳米粒子和柠檬酸钠的无血清DMEM培养基，孵育2-3h，去除原培养基，用无血清DMEM培养基清洗3-5次；
S4.向S3所得巨噬细胞中加入无血清DMEM培养基继续培养40-55h；
S5.取S4培养容器中的上清液，用无血清DMEM培养基清洗2-3次后离心，弃去沉淀并保留上清液，然后进行磁分离，收集磁分离产物，用磷酸盐缓冲液清洗3-5次，即得。
细胞可以释放出直径在100-1000nm的细胞外囊泡。这些细胞外囊泡含有磷脂双分子层以及蛋白和基因物质，在细胞间相互交流中具有十分重要的地位。巨噬细胞能够有效摄取纳米粒子，并且在一定条件下释放出负载纳米材料的细胞外囊泡，其细胞膜结构相对完整，功能性良好。
本发明以合成超顺磁性四氧化三铁纳米粒子为原料，通过培养巨噬细胞，与四氧化三铁纳米粒子共孵育，随后在无血清条件下培养，细胞在这期间逐步释放出磁性囊泡，最后采用磁分离回收获取。本发明的巨噬细胞释放仿生磁性囊泡的方法，超顺磁性四氧化三铁纳米粒子与巨噬细胞孵育后，可通过巨噬细胞经过类似外泌体释放的途径，产生仿生磁性囊泡，囊泡外部展现出磷脂膜的性能，同时具有良好磁响应性能。
进一步地，S1具体制备方式为：将六水三氯化铁溶解在乙二醇中，边搅拌边加入柠檬酸钠，最后加入醋酸铵，室温下磁搅拌1-3h后置于180-250℃条件下保温15-20h，冷却，再采用磁分离法收集沉积物，并用乙醇和去离子水清洗3-5次，最后再次磁分离，即得。
进一步地，S1具体制备方式为：将六水三氯化铁溶解在乙二醇中，边搅拌边加入柠檬酸钠，最后加入醋酸铵，室温下磁搅拌1h后置于200℃条件下保温16h，冷却，再采用磁分离法收集沉积物，并用乙醇和去离子水清洗4次，最后再次磁分离，即得。
进一步地，六水三氯化铁、柠檬酸钠和醋酸铵的质量比为2-3:1:8-9。
进一步地，六水三氯化铁、柠檬酸钠和醋酸铵的质量比为2.89:1:8.26。
进一步地，S2具体培养方式为：采用含有10wt％胎牛血清和1wt％链霉素-青霉素的DMEM培养基培养巨噬细胞，培养过程中将细胞置于37℃、5％CO2的培养箱中，培养40-55h。
进一步地，S2中巨噬细胞为小鼠巨噬细胞J774A.1、P338D1、S774A.1或RAW264.7，也可采用其他巨噬细胞。
进一步地，S3中超顺磁性四氧化三铁纳米粒子的浓度为0.2-0.3mg/mL,柠檬酸钠的浓度为1.2-1.35mg/mL。
进一步地，超顺磁性四氧化三铁纳米粒子的浓度为0.28mg/mL，柠檬酸钠的浓度为1.29mg/mL。
进一步地，S5中离心条件为800-3000rpm离心3-15min。
进一步地，S3-S5的培养过程中，培养条件均为37℃、5％CO2。
采用上述的方法得到的仿生磁性囊泡。
上述的仿生磁性囊泡在制备医用材料方面的应用。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明利用水热法合成超顺磁四氧化三铁纳米粒子，具有良好的磁响应行为，粒径分布较为均一，水相中分散性良好；
2、本发明通过将超顺磁性四氧化三铁纳米粒子与巨噬细胞共孵育，通过巨噬细胞经过类似外泌体释放的途径，产生仿生磁性囊泡；
3、本发明由巨噬细胞通过类似细胞外泌体形成途径进行构建，在更换培养基后静置即可让细胞自主释放磁性囊泡，无需其他人工操作；
4、本发明方法得到的仿生磁性囊泡，最终通过磁分离收集，所需条件简单，回收效率高，操作便捷；
5、本发明方法得到的仿生磁性囊泡，表面具有生物膜(如细胞膜)的一些基本性质，具有良好的磁响应性能，还具有潜在良好的生物抗污性能，能够被应用到生物医学领域。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为巨噬细胞释放仿生磁性囊泡示意图；
图2为超顺磁性四氧化三铁纳米粒子的粒径分布图；
图3为超顺磁性四氧化三铁纳米粒子的磁滞回线图；
图4为仿生磁性囊泡的扫描电镜图；
图5为超顺磁性四氧化三铁纳米粒子和仿生磁性囊泡的粒径大小图；
图6为超顺磁性四氧化三铁纳米粒子和仿生磁性囊泡表面电位图；
图7为仿生磁性囊泡的透射电镜图及其元素扫描；
图8为PKH26对超顺磁性四氧化三铁纳米粒子和仿生磁性囊泡的染色成像图；
图9为J774A.1细胞样品(J774A.1)，J774A.1细胞膜样品(M)以及仿生磁性囊泡(Fe3O4MVs)的SDS-PAGE图；
图10为仿生磁性囊泡的磁响应性及回收效率图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，术语“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本发明较佳的实施例提供一种基于巨噬细胞释放仿生磁性囊泡的方法，具体步骤如下：
(1)超顺磁性四氧化三铁纳米粒子(Fe3O4 NPs)的制备
将FeCl3·6H2O溶解在乙二醇中，搅拌过程中继续加入柠檬酸钠(Na3CT)，最后加入醋酸铵(NH4Ac)，磁搅拌1h后将混合物转移至不锈钢高压釜中，在200℃条件下保温16h。冷却后采用磁分离法收集沉积物，并用乙醇和去离子水彻底清洗4次，最后磁分离获取Fe3O4纳米粒子超顺磁性四氧化三铁纳米粒子；其中FeCl3·6H2O，Na3CT，NH4Ac的质量比为2.89：1：8.26。通过马尔文激光粒度仪测定载药杂化纳米粒子的粒径及表面电位，Fe3O4 NPs的粒径分布如图2所示，Fe3O4 NPs的水合粒径在380nm左右，分布范围较窄，尺寸大小较为均一。Fe3O4 NPs的磁滞回线图如图3，由图3可知Fe3O4 NPs的饱和磁化强度在60emu g-1左右。
(2)小鼠巨噬细胞(J774A.1)的培养
小鼠巨噬细胞J774A.1采用含有10wt％胎牛血清和1wt％链霉素-青霉素的DMEM完全培养基培养，培养过程中将细胞置于37℃、5％CO2的培养箱中；将1×106的J774A.1细胞接种在培养皿(φ＝100mm)中，在上述培养条件下培养48h。
(3)小鼠巨噬细胞与超顺磁性四氧化三铁纳米粒子的共孵育
对上述步骤(2)中的细胞，移除原培养液，用磷酸盐缓冲液清洗3次，加入10mL含有Fe3O4 NPs(2.8mg)和柠檬酸钠(12.9mg)的无血清DMEM培养基孵育2h；孵育完毕后吸走培养基，加入无血清培养基清洗3次。
(4)小鼠巨噬细胞的无血清培养
上述(3)中的细胞清洗完毕后，再次加入无血清培养基继续在培养箱中培养48h。
(5)仿生磁性囊泡的收集
吸取培养皿中上清液，用无血清DMEM培养基清洗2次，保留上清，离心(1200rpm，5min)后，弃去沉淀，保留上清液；上清液用永磁铁进行磁分离，收集磁分离产物，并用磷酸盐缓冲液清洗3次，最后分散在磷酸盐缓冲液中低温保存。
实施例2
本发明较佳的实施例提供一种基于巨噬细胞释放仿生磁性囊泡的方法，具体步骤如下：
(1)超顺磁性四氧化三铁纳米粒子(Fe3O4 NPs)的制备
将FeCl3·6H2O溶解在乙二醇中，搅拌过程中继续加入柠檬酸钠(Na3CT)，最后加入醋酸铵(NH4Ac)，磁搅拌2h后将混合物转移至不锈钢高压釜中，在200℃条件下保温18h。冷却后采用磁分离法收集沉积物，并用乙醇和去离子水彻底清洗3次，最后磁分离获取Fe3O4纳米粒子超顺磁性四氧化三铁纳米粒子；其中FeCl3·6H2O，Na3CT，NH4Ac的质量比为2.93：1：8.51。
(2)小鼠巨噬细胞(J774A.1)的培养
小鼠巨噬细胞J774A.1采用含有10wt％胎牛血清和1wt％链霉素-青霉素的DMEM完全培养基培养，培养过程中将细胞置于37℃、5％CO2的培养箱中；将1×107的J774A.1细胞接种在培养皿(φ＝100mm)中，在上述培养条件下培养48h。
(3)小鼠巨噬细胞与超顺磁性四氧化三铁纳米粒子的共孵育
对上述步骤(2)中的细胞，移除原培养液，用磷酸盐缓冲液清洗3次，加入10mL含有Fe3O4 NPs(2.9mg)和柠檬酸钠(13.1mg)的无血清DMEM培养基孵育2h；孵育完毕后吸走培养基，加入无血清培养基清洗3次。
(4)小鼠巨噬细胞的无血清培养
上述(3)中的细胞清洗完毕后，再次加入无血清培养基继续在培养箱中培养48h。
(5)仿生磁性囊泡的收集
吸取培养皿中上清液，用无血清DMEM培养基清洗2次，保留上清，离心(1200rpm，5min)后，弃去沉淀，保留上清液；上清液用永磁铁进行磁分离，收集磁分离产物，并用磷酸盐缓冲液清洗3次，最后分散在磷酸盐缓冲液中低温保存。
实施例3
本发明较佳的实施例提供一种基于巨噬细胞释放仿生磁性囊泡的方法，具体步骤如下：
(1)超顺磁性四氧化三铁纳米粒子(Fe3O4 NPs)的制备
将FeCl3·6H2O溶解在乙二醇中，搅拌过程中继续加入柠檬酸钠(Na3CT)，最后加入醋酸铵(NH4Ac)，磁搅拌1h后将混合物转移至不锈钢高压釜中，在200℃条件下保温17h。冷却后采用磁分离法收集沉积物，并用乙醇和去离子水彻底清洗4次，最后磁分离获取Fe3O4纳米粒子超顺磁性四氧化三铁纳米粒子；其中FeCl3·6H2O，Na3CT，NH4Ac的质量比为2.86：1：8.37。
(2)小鼠巨噬细胞(J774A.1)的培养
小鼠巨噬细胞J774A.1采用含有10wt％胎牛血清和1wt％链霉素-青霉素的DMEM完全培养基培养，培养过程中将细胞置于37℃、5％CO2的培养箱中；将1×105的J774A.1细胞接种在培养皿(φ＝100mm)中，在上述培养条件下培养48h。
(3)小鼠巨噬细胞与超顺磁性四氧化三铁纳米粒子的共孵育
对上述步骤(2)中的细胞，移除原培养液，用磷酸盐缓冲液清洗3次，加入10mL含有Fe3O4 NPs(2.8mg)和柠檬酸钠(12.7mg)的无血清DMEM培养基孵育2h；孵育完毕后吸走培养基，加入无血清培养基清洗3次。
(4)小鼠巨噬细胞的无血清培养
上述(3)中的细胞清洗完毕后，再次加入无血清培养基继续在培养箱中培养48h。
(5)仿生磁性囊泡的收集
吸取培养皿中上清液，用无血清DMEM培养基清洗2次，保留上清，离心(1200rpm，5min)后，弃去沉淀，保留上清液；上清液用永磁铁进行磁分离，收集磁分离产物，并用磷酸盐缓冲液清洗3次，最后分散在磷酸盐缓冲液中低温保存。
实验例
(1)采用扫描电镜观察实施例1方法释放的仿生磁性囊泡Fe3O4 MVs的形貌及大小：
将Fe3O4 MVs分散在水中，滴加在硅片上，自然干燥后利用扫描电镜观察形貌大小。如图4所示，Fe3O4 MVs呈球形，直径在400nm左右。
(2)实施例1方法释放的仿生磁性囊泡Fe3O4 MVs的水合粒径及表面电位测定：
用马尔文激光粒度仪测试仿生磁性囊泡的粒径大小及表面电位，以Fe3O4 NPs作为对照。如图5所示，与Fe3O4 NPs相比，Fe3O4 MVs的水合粒径明显变大，马尔文激光粒度仪测试结果与扫描电镜结果有较大差异，这是因为，Fe3O4 MVs分散在水相中，表面磷脂膜结构舒展，使得水合粒径结果较大；而扫描电镜是在样品干燥状态下测试，Fe3O4 MVs表面结构收缩，尺寸大小与Fe3O4 NPs接近。图6所示，Fe3O4 MVs电位变化明显，经过巨噬细胞摄取和再释放后，四氧化三铁表面的电位由-16mV变化至-8mV。
(3)采用透射电镜对实施例1方法释放的仿生磁性囊泡Fe3O4 MVs进行观察：
将Fe3O4 MVs分散在水中，滴加在铜网上，自然干燥后利用透射电镜观察仿生磁性囊泡形貌并进行元素扫描。如图7所示，四氧化三铁纳米粒子外围存在低对比度物质层，即为膜结构层的存在。元素扫描结果显示，磁性囊泡存在N，P，Fe，O元素，P即代表磷脂层组分的存在，P，Fe扫描图重叠后显示出磷脂层厚度在20nm左右。
(4)利用PKH26试剂盒对实施例1方法释放的仿生磁性囊泡Fe3O4 MVs和超顺磁性四氧化三铁纳米粒子Fe3O4 NPs进行染色，并在共聚焦显微镜下进行观察。
如图8所示，Fe3O4 MVs组材料上存在明显的阳性信号，Fe3O4 NPs组材料上则无阳性信号出现。
(5)将实施例1释放的仿生磁性囊泡Fe3O4 MVs样本(约40μg)上样至10％SDS聚丙烯酰胺凝胶上，设置电压值为90V，电泳时间为2h，最后用考马斯亮蓝染色后成像。
小鼠巨噬细胞J774A.1裂解液，小鼠巨噬细胞J774A.1细胞膜样本(M)作为对照。如图9所示，Fe3O4 MVs样本条带与J774A.1以及J774A.1细胞膜样本所呈现的部分条带相似，展现出了对J774A.1细胞特征蛋白的保留。
(6)实施例1方法释放的仿生磁性囊泡Fe3O4 MVs的磁响应性及回收效率：
将2mL Fe3O4 MVs分散液(1mg/mL)置于石英皿中，一侧放置永磁铁，在设定时间取少量体积分散液测定紫外吸收值，根据标准曲线计算分散液中Fe3O4 MVs含量，计算60s时间内Fe3O4 MVs的回收效率。如图10所示，与最初时刻相比，1分钟后分散液已澄清透明，棕色物质吸附在靠近磁铁一侧，回收效率接近100％。
上述实验表明，本发明的磁性囊泡是巨噬细胞通过细胞外泌体释放途径形成的，其表面具备磷脂膜组分与结构，同时保留良好的磁响应性能。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种基于巨噬细胞释放仿生磁性囊泡的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将六水三氯化铁溶解在乙二醇中，边搅拌边加入柠檬酸钠，最后加入醋酸铵，室温下磁搅拌1-3h后置于180-250℃条件下保温15-20h，冷却，再采用磁分离法收集沉积物，并用乙醇和去离子水清洗3-5次，最后再次磁分离，制得超顺磁性四氧化三铁纳米粒子；
S2.培养巨噬细胞；
S3.移除S2培养的巨噬细胞中的原培养液，用磷酸盐缓冲液清洗3-5次，然后加入含有S1所得超顺磁性四氧化三铁纳米粒子和柠檬酸钠的无血清DMEM培养基，孵育2-3h，去除原培养基，用无血清DMEM培养基清洗3-5次；
S4.向S3所得巨噬细胞中加入无血清DMEM培养基继续培养40-55h；
S5.取S4培养容器中的上清液，用无血清DMEM培养基清洗2-3次后离心，弃去沉淀并保留上清液，然后进行磁分离，收集磁分离产物，用磷酸盐缓冲液清洗3-5次，即得。
2.根据权利要求1所述的基于巨噬细胞释放仿生磁性囊泡的方法，其特征在于，所述六水三氯化铁、柠檬酸钠和醋酸铵的质量比为2-3:1:8-9。
3.根据权利要求1所述的基于巨噬细胞释放仿生磁性囊泡的方法，其特征在于，所述S2具体培养方式为：采用含有10wt％胎牛血清和1wt％链霉素-青霉素的DMEM培养基培养巨噬细胞，培养过程中将细胞置于37℃、5％CO2的培养箱中，培养40-55h。
4.根据权利要求1所述的基于巨噬细胞释放仿生磁性囊泡的方法，其特征在于，所述S2中巨噬细胞为小鼠巨噬细胞J774A.1、P338D1、S774A.1或RAW264.7。
5.根据权利要求1所述的基于巨噬细胞释放仿生磁性囊泡的方法，其特征在于，所述S3中超顺磁性四氧化三铁纳米粒子的浓度为0.2-0.3mg/mL,柠檬酸钠的浓度为1.2-1.35mg/mL。
6.根据权利要求1所述的基于巨噬细胞释放仿生磁性囊泡的方法，其特征在于，所述S5中离心条件为800-3000rpm离心3-15min。
7.根据权利要求1所述的基于巨噬细胞释放仿生磁性囊泡的方法，其特征在于，所述S3-S5的培养过程中，培养条件均为37℃、5％CO2。
8.采用权利要求1-7中任一项所述的方法得到的仿生磁性囊泡。
9.权利要求8所述的仿生磁性囊泡在制备医用材料方面的应用。
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