CN108330054B - 一种用于全血中循环肿瘤细胞的特异性捕获的石墨烯芯片及其制备方法和应用 - Google Patents

一种用于全血中循环肿瘤细胞的特异性捕获的石墨烯芯片及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于全血中循环肿瘤细胞的特异性捕获的石墨烯芯片及其制备方法和应用。所述石墨烯芯片的制备是利用无机化合物粉末重结晶得到具有立体几何形状的单晶结构做为模板，通过引入碳源，使其高温热解得到具有立体结构的石墨烯颗粒溶液，将该溶液通过抽滤或旋涂得到表面具有立体几何微纳结构的石墨烯基片，最后在石墨烯基片上修饰对特异识别性抗体得到针对循环肿瘤细胞特异性捕获的石墨烯芯片。该抗体修饰的立体几何状的微纳结构的石墨烯芯片可显著增强对循环肿瘤细胞的捕获效率。本发明制备工艺简单易行且成本低，可规模化制备，可实现对循环肿瘤细胞进行高效富集检测。

Description

一种用于全血中循环肿瘤细胞的特异性捕获的石墨烯芯片及 其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体地，本发明涉及一种用于全血中循环肿瘤细胞的特异性捕获的石墨烯芯片及其制备方法和应用。
背景技术
循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells,CTCs)是指从肿瘤原发病灶部位脱落，进入到血液循环的肿瘤细胞。由于在癌症发生的早期，就有循环肿瘤细胞的出现，因此将循环肿瘤细胞做为生物标记物，通过检测，监视以及分析血液中循环肿瘤细胞的数量，对癌症进行早期检测意义重大。目前捕获循环肿瘤细胞的方法主要有以下几种，分别是基于特异性抗体修饰的磁珠的免疫磁性分离技术；基于增加细胞与基底接触频率的微流体技术；基于细胞尺寸差别的微过滤技术；基于密度的密度梯度离心技术；以及将几种技术结合联合起来使用。然而这些方法仍然存在着捕获效率低，分离纯度低以及捕获时间长等缺点。
2009年，中科院理化所王树涛研究员团队(Angew.Chem.Int.Ed.,2009,48,8970-8973)利用三维的硅纳米线阵列，从全血样品中实现了对循环肿瘤细胞的有效分离。该方法是利用三维的纳米结构与靶向细胞的表面的纳米结构(纤毛/伪足)之间的相互作用，即结构识别作用，以及阵列表面修饰的抗体(anti-EpCAM)与肿瘤细胞表面高表达的抗原(EpCAM)之间特异性的分子识别作用，增强了三维的硅纳米线对于循环肿瘤细胞的亲和力，显著提高了对于循环肿瘤细胞的捕获效率。此后，利用材料表面微纳结构来分离循环肿瘤细胞受到了广泛的关注，大量的材料如PEDOT导电聚合物(Adv.Mater.2011,23,4788-4792)、PDMS(Cancer 2012,118,1145-1154)、TiO2纳米纤维(Adv.Mater.2012,24,2756-2760)，石英纳米线阵列(Nano Lett.2012,12,2697-2704)以及Fe3O4纳米粒子修饰的基片(Small 2012,8,1657-1663)等都是利用三维纳米结构的构建从而增强循环肿瘤细胞的捕获效率。但上述方法仍存在着一定的不足，比如材料制备成本高，制备方法较为复杂，制备工艺较为复杂。同时，缺少一个确实存在的理论模型来指导我们进行进一步的研究。因此，开发新型的循环肿瘤细胞检测技术，实现低成本、高效率的检测已成为当前癌症检测所需亟待解决的重要问题。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种用于全血中循环肿瘤细胞的特异性捕获的石墨烯芯片制备新方法，该方法制备工艺简单，成本低廉，适于工业化批量生产。该芯片有望解决当前在癌症早期检测、术后监测等方面存在的检测效率低和检测费用高等难题。
为达到上述目的，本发明采用了如下的技术方案：
一种石墨烯芯片，所述石墨烯芯片包括具有立体几何微纳结构的石墨烯基片以及固定在所述石墨烯基片表面的特异性识别循环肿瘤细胞的分子。
本发明提供了一种石墨烯芯片的制备方法，所述方法包括以下步骤：
1)利用无机化合物粉末重结晶得到具有立体几何形状的单晶，所述立体几何形状是由经过结晶过程而形成的无机化合物晶体所具有规则的几何外形结构；
2)在步骤1)得到的单晶表面上构筑具有立体几何结构的石墨烯层；将石墨烯层覆盖的单晶溶解得到含石墨烯的溶液，去除单晶并干燥得到石墨烯粉末，石墨烯粉末溶解并将溶解后得到的溶液添加到基片上抽滤或者旋涂得到具有立体几何微纳结构的石墨烯基片；
3)通过在具有立体几何微纳结构的石墨烯基片表面上固定循环肿瘤细胞表面的特异性抗体。
优选地，所述石墨烯基片由具有立体几何形状的石墨烯颗粒构成。
优选地，所述石墨烯颗粒具有选自立方体、斜方锥、斜方柱和八面体中的一种或多种的立体几何形状。
优选地，所述无机化合物选自氯化钠、氯化钾、氯化铜、硫酸铜、钨酸锰、氧化钒、氧化钨和氯化钴中的一种或多种。
优选地，所述石墨烯颗粒的大小为1μm～30μm。
优选地，所述分子为抗上皮细胞粘附分子抗体。
优选地，所述分子在所述石墨烯表面的固定量不少于0.1μg/cm2。
本发明还提供了上述的石墨烯芯片用于分离液体中循环肿瘤细胞的应用。
优选地，在步骤2)中，所述的基片的材料是不导电的无机非金属材料，优选自晶体硅、普通玻璃、石英或微孔滤膜。
优选地，具有立体几何微纳结构的石墨烯基片表面上固定循环肿瘤细胞表面的特异性抗体的方法具体为：
a)将具有立体几何微纳结构的石墨烯基片真空加热还原，放至室温；室温下，将高温处理后的具有立体几何微纳结构的石墨烯基片浸泡在浓度为1～10％的1-芘羧酸的甲醇溶液中，室温下放置；取出用甲醇和二甲基亚砜润洗，吹干；
b)将5～20μg/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液，加入含有N-羟基琥珀酰亚胺和N-(3-二甲基胺基丙基)-N'-乙基碳二亚胺的二甲基亚砜溶液中，然后将步骤a)吹干后的石墨烯基片浸泡在上述溶液中，室温下放置，取出用磷酸盐缓冲液洗涤；
c)将循环肿瘤细胞表面的特异性抗体用磷酸盐缓冲液稀释至浓度为5～20μg/mL，然后滴加到步骤b)用磷酸盐缓冲液洗涤后得到的石墨烯的表面上，室温下放置，得到用于全血中循环肿瘤细胞的特异性捕获的石墨烯芯片。
更进一步优选地，具有立体几何微纳结构的石墨烯基片表面上固定循环肿瘤细胞表面的特异性抗体的方法为：
a)将具有立体几何微纳结构的石墨烯真空加热还原，放至室温；将1-芘羧酸与乙醇按体积比混合配制成浓度为1～10％的1-芘羧酸的甲醇溶液；室温下，将高温处理后的具有立体几何微纳结构的石墨烯浸泡在上述浓度为1～10％的1-芘羧酸的甲醇溶液中，室温下放置(优选室温下放置45分钟左右)；取出，分别用甲醇和二甲基亚砜(DMSO)润洗，吹干；
b)将链霉亲和素用磷酸盐缓冲液稀释为浓度为5～20μg/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液，加入含有N-羟基琥珀酰亚胺和N-(3-二甲基胺基丙基)-N'-乙基碳二亚胺的二甲基亚砜溶液中，然后将步骤a)吹干后得到的石墨烯浸泡在上述溶液中，室温下放置(优选室温下放置30分钟左右)；取出，用磷酸盐缓冲液洗涤；
c)将循环肿瘤细胞表面的特异性抗体用磷酸盐缓冲液稀释至浓度为5～20μg/mL，然后滴加到步骤b)用磷酸盐缓冲液洗涤后得到的石墨烯的表面上，室温下放置，得到用于全血中循环肿瘤细胞的特异性捕获的石墨烯芯片。
所述的循环肿瘤细胞表面的特异性抗体为生物素化抗EpCAM抗体。
所述的1-芘羧酸、N-羟基琥珀酰亚、N-(3-二甲基胺基丙基)-N'-乙基碳二亚胺、链霉亲和素与生物素化抗EpCAM抗体均为市售产品。
本发明还另外提供了上述用于全血中循环肿瘤细胞的特异性捕获的石墨烯芯片在全血中循环肿瘤细胞的捕获中的应用。
本发明所述石墨烯芯片的表面具有立体几何微纳结构，即复制的无机化合物单晶模板的立体几何结构，与循环肿瘤细胞表面的结构相匹配，同时该抗体修饰的具有立体几何微纳结构的石墨烯芯片具有特异性识别循环肿瘤细胞功能。利用该芯片特异性捕获循环肿瘤细胞，可以在体外模拟淋巴细胞捕获循环肿瘤细胞的过程，极大的增强了对循环肿瘤细胞的捕获效率。本发明所制备的石墨烯芯片表面的立体几何微纳结构和特异性抗体的识别通过协同作用，提高对循环肿瘤细胞捕获效率。
本发明模拟淋巴细胞捕获循环肿瘤细胞的过程，对外周血中存在的循环肿瘤细胞进行快速的富集和分离。由于该材料具有良好的生物相容性，可将捕获的循环肿瘤细胞用于进一步的培养，药物检测分析。
本发明的实现是利用表面具有不同表面微纳结构的石墨烯芯片上的立体几何微纳结构与循环肿瘤细胞表面的结构相匹配作用，结合表面抗原-抗体特异性识别原理，提高对靶向细胞的高效特异性捕获。
本发明利用表面具有不同立体几何微纳结构的石墨烯芯片进行循环肿瘤细胞的特异性捕获，可用于癌症相关的细胞的捕获，可以有效提高循环肿瘤细胞的捕获效率，成本低廉，操作简单，可用于临床检测。
附图说明
图1：实施例1中所制备的石墨烯芯片表面扫描电镜图；
图2：实施例1中所制备的石墨烯芯片捕获癌细胞的荧光显微镜表征图；
图3：实施例1中所制备的石墨烯芯片对癌细胞的捕获效率图。
具体实施方式
以下结合实施例及附图对本发明进行进一步的说明，然而，本发明可以以不同形式进行体现，并不应理解成受限于文中所述实施方式。相反，提供这些实施方式可以使得本发明公开彻底而完整，并完整地将本发明的范围传达给本领域的技术人员。
实施例1
本实施例所制备的氯化钠为模板制备的立方体石墨烯平均尺寸为20μm；以循环肿瘤细胞EpCAM特异性细胞和EpCAM非特异性细胞为待捕获的循环肿瘤细胞为例，对本发明的捕获体系作进一步阐述和验证。利用所制备的石墨烯芯片表面微纳结构和特异性识别分子协同作用，进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法包括以下步骤：
(1)基于氯化钠为模板的立方体石墨烯的制备
(a)制备立方体氯化钠单晶
将商业用氯化钠粉末溶于水中配成氯化钠饱和溶液，控制温度为25度，静置、析出晶体，过滤、干燥得到边长平均为20μm的立方体氯化钠单晶粉末。
(b)制备由立方体石墨烯组成的薄膜芯片
在管式炉中，在石英管的一端(约20cm)保持温度为850度，通入碳源(乙烯)；另一端约20cm长温度为700度并放置立方体氯化钠单晶粉末。通过乙烯的热裂解，使得低温端的氯化钠单晶粉末表面覆盖石墨烯层。将得到的产物溶于水中，去除氯化钠单晶；高温干燥，得到石墨烯颗粒粉末。将粉末溶解，抽滤或旋涂，得到具有立方体微纳结构的石墨烯薄膜。所制备的石墨烯芯片表面扫描电镜图如图1所示，从图1可以看出，所得到的石墨烯芯片主要是有立方体形的石墨烯颗粒组成。
(2)由立方体石墨烯组成的薄膜的特异性抗体修饰
(a)羧酸化石墨烯
将上述薄膜置于真空箱中在100度以上加热还原约12小时。室温条件下，将该薄膜浸泡在浓度为1～10％的1-芘羧酸的甲醇溶液中，室温下放置；取出用甲醇和二甲基亚砜润洗，吹干，得到羧酸化的薄膜；然后将该薄膜固定在玻璃片上，得到羧酸化的石墨烯薄膜芯片。
(b)将肿瘤细胞表面的生物素化抗EpCAM抗体固定在上述石墨烯芯片表面上，制备得到表面固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体的石墨烯芯片。
(i)将(a)中所述石墨烯薄膜芯片置于六孔板内，加入含有N-羟基琥珀酰亚胺、N-(3-二甲基胺基丙基)-N'-乙基碳二亚胺的二甲基亚砜溶液中，室温下反应2小时。
(ii)将该芯片置于链霉亲和素用磷酸盐缓冲液稀释为浓度为20μg/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置(优选室温下放置30分钟左右)；取出基片，用磷酸盐缓冲液洗涤；
(iii)取20μL 20μg/mL生物素化的抗EpCAM抗体的PBS溶液，滴加到步骤(ii)得到的芯片表面，室温放置30分钟，然后用PBS润洗三次，洗去未连接的生物素化的抗EpCAM抗体，制备得到表面固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体的石墨烯芯片。
(3)捕获并处理待测样品中的循环肿瘤细胞
(a)分别取乳腺癌细胞MCF7细胞悬浮液10μL，用细胞计数器计数并计算其浓度，取一定量上述细胞悬浮液，用RPMI1640细胞培养基稀释至1×105个细胞/mL，混合均匀，室温下保存。
(b)分别将混合均匀后得到的细胞悬浮液3mL滴加到放置在细胞培养板(直径3.5cm)中的步骤(2)得到的表面固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体的石墨烯芯片，然后置于细胞培养箱中，由于肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与石墨烯立体几何结构的协同作用，可以特异性捕获循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整石墨烯表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。
(c)将捕获了循环肿瘤细胞的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。
(d)倒置放置在载玻片上，放置在荧光显微镜样品台上进行观测，先通过眼睛可观测的模式，在目镜处观测，通过调节焦距找到肿瘤细胞所在的平面。调节模式为电脑显示，曝光时间设置为100ms，用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，结果如图2所示，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。捕获了循环肿瘤细胞的平整石墨烯表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率，结果如图3所示。
(e)实验结果表明，该芯片对MCF7细胞的捕获效率为94％；对照实验中平整表面的MCF7细胞的捕获效率仅为0.9％，这些数据表明该方法可以实现循环肿瘤细胞的高效特异性捕获。
(4)作为对照组1，将步骤(2)得到的芯片置于六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的前列腺癌细胞PC3悬浮液，置于细胞培养箱中，由于肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与石墨烯立体几何结构的协同作用，可以特异性捕获循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整石墨烯表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。将捕获了循环肿瘤细胞的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。捕获了循环肿瘤细胞的平整石墨烯表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率，结果如图3所示。
(5)作为对照组2，将步骤(2)得到的芯片置于六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的人淋巴B细胞癌细胞Daudi悬浮液，置于细胞培养箱中，由于肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与石墨烯立体几何结构的协同作用，可以特异性捕获循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整石墨烯表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。将捕获了循环肿瘤细胞的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。捕获了循环肿瘤细胞的平整石墨烯表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率，结果如图3所示。
(6)作为对照组3，将步骤(2)得到的芯片置于六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的人淋巴癌细胞Jurkat悬浮液，置于细胞培养箱中，由于肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与石墨烯立体几何结构的协同作用，可以特异性捕获循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整石墨烯表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。将捕获了循环肿瘤细胞的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。捕获了循环肿瘤细胞的平整石墨烯表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率，结果如图3所示。
(7)作为对照组4，将步骤(2)得到的芯片置于六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的子宫癌细胞Hela悬浮液，置于细胞培养箱中，由于肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与石墨烯立体几何结构的协同作用，可以特异性捕获循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整石墨烯表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。将捕获了循环肿瘤细胞的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。捕获了循环肿瘤细胞的平整石墨烯表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率，结果如图3所示。
(8)从图2和图3可以得到，本发明的石墨烯芯片对MCF7细胞的捕获效率为94％，前列腺癌细胞PC3细胞的捕获效率为90.5％，人淋巴B细胞癌细胞Daudi细胞的捕获效率为0.02％，人淋巴癌细胞Jurkat细胞的捕获效率为0.02％，子宫癌细胞Hela细胞的捕获效率为0.02％。这些数据表明该方法可以实现循环肿瘤细胞的高效特异性捕获，并实现极低的非特异性吸附。
实施例2
本实施例所制备的氯化钾为模板的立方体结构的石墨烯平均尺寸为20μm；以循环肿瘤细胞EpCAM特异性细胞和EpCAM非特异性细胞为待捕获的循环肿瘤细胞为例，对本发明的捕获体系作进一步阐述和验证。利用具有立体几何结构的石墨烯表面进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法包括以下步骤：
(1)基于氯化钾为模板的石墨烯芯片的制备
(a)制备立方体氯化钾单晶
将商业用氯化钾粉末溶于水中配成氯化钾饱和溶液，控制温度为25度，静置、析出晶体，过滤、干燥得到边长平均为20μm的立方体结构的氯化钾单晶粉末。
(b)制备由立方体石墨烯组成的薄膜芯片
在管式炉中，在石英管的一端(约20cm)保持温度为850度，通入碳源(乙烯)；另一端约20cm长温度为600度并放置立方体氯化钾单晶粉末。通过乙烯的热裂解，使得低温端的氯化钾单晶粉末表面覆盖石墨烯层。将得到的产物溶于水中，去除氯化钾单晶；高温干燥，得到石墨烯颗粒粉末。将粉末溶解，抽滤或旋涂，得到具有立方体微纳结构的石墨烯薄膜。
(2)由立方体石墨烯组成的薄膜芯片的特异性抗体修饰
(a)羧酸化石墨烯芯片
将上述薄膜置于真空箱中在100度以上加热还原约12小时。室温条件下，将该薄膜浸泡在浓度为1～10％的1-芘羧酸的甲醇溶液中，室温下放置；取出用甲醇和二甲基亚砜润洗，吹干，得到羧酸化的薄膜；然后将该薄膜固定在玻璃片上，得到羧酸化的石墨烯薄膜芯片。
(b)将肿瘤细胞表面的生物素化抗EpCAM抗体固定在石墨烯芯片表面上，制备得到表面固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体的具有立体几何结构的石墨烯芯片。
(i)将(a)中所述芯片置于六孔板内，加入含有N-羟基琥珀酰亚胺和N-(3-二甲基胺基丙基)-N'-乙基碳二亚胺的二甲基亚砜溶液中，室温下反应2小时。
(ii)将该芯片置于链霉亲和素用磷酸盐缓冲液稀释为浓度为20μg/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置(优选室温下放置30分钟左右)；取出基片，用磷酸盐缓冲液洗涤；
(iii)取20μL 20μg/mL生物素化的抗EpCAM抗体的PBS溶液，滴加到步骤(ii)得到的芯片表面，室温放置30分钟，然后用PBS润洗三次，洗去未连接的生物素化的抗EpCAM抗体，制备得到表面固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体的石墨烯芯片。
(3)捕获并处理待测样品中的循环肿瘤细胞
(a)分别取乳腺癌细胞MCF7细胞悬浮液10μL，用细胞计数器计数并计算其浓度，取一定量上述细胞悬浮液，用RPMI1640细胞培养基稀释至1×105个细胞/mL，混合均匀，室温下保存。
(b)分别将混合均匀后得到的细胞悬浮液3mL滴加到放置在细胞培养板(直径3.5cm)中的步骤(2)得到的表面固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体的石墨烯芯片，然后置于细胞培养箱中，由于肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与石墨烯立体几何结构的协同作用，可以特异性捕获循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整石墨烯表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。
(c)将捕获了循环肿瘤细胞的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。
(d)倒置放置在载玻片上，放置在荧光显微镜样品台上进行观测，先通过眼睛可观测的模式，在目镜处观测，通过调节焦距找到肿瘤细胞所在的平面。调节模式为电脑显示，曝光时间设置为100ms，用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。捕获了循环肿瘤细胞的平整石墨烯表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
(e)实验结果表明，该芯片对MCF7细胞的捕获效率为94％；对照实验中平整表面的MCF7细胞的捕获效率仅为0.9％，这些数据表明该方法可以实现循环肿瘤细胞的高效特异性捕获。
(4)作为对照组1，将步骤(2)得到的芯片置于六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的前列腺癌细胞PC3悬浮液，置于细胞培养箱中，由于肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与石墨烯立体几何结构的协同作用，可以特异性捕获循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整石墨烯表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。将捕获了循环肿瘤细胞的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。捕获了循环肿瘤细胞的平整石墨烯表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
(5)作为对照组2，将步骤(2)得到的芯片置于六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的人淋巴B细胞癌细胞Daudi悬浮液，置于细胞培养箱中，由于肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与石墨烯立体几何结构的协同作用，可以特异性捕获循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整石墨烯表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。将捕获了循环肿瘤细胞的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。捕获了循环肿瘤细胞的平整石墨烯表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
(6)作为对照组3，将步骤(2)得到的芯片置于六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的人淋巴癌细胞Jurkat悬浮液，置于细胞培养箱中，由于肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与石墨烯立体几何结构的协同作用，可以特异性捕获循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整石墨烯表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。将捕获了循环肿瘤细胞的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。捕获了循环肿瘤细胞的平整石墨烯表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
(7)作为对照组4，将步骤(2)得到的芯片置于六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的子宫癌细胞Hela悬浮液，置于细胞培养箱中，由于肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与石墨烯立体几何结构的协同作用，可以特异性捕获循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整石墨烯表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。将捕获了循环肿瘤细胞的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。捕获了循环肿瘤细胞的平整石墨烯表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
(8)实验结果表明，本发明的石墨烯芯片对MCF7细胞的捕获效率为94％，前列腺癌细胞PC3细胞的捕获效率为88.6％，人淋巴B细胞癌细胞Daudi细胞的捕获效率为0.01％，人淋巴癌细胞Jurkat细胞的捕获效率为0.02％，子宫癌细胞Hela细胞的捕获效率为0.01％。这些数据表明该方法可以实现循环肿瘤细胞的高效特异性捕获，并实现极低的非特异性吸附。
实施例3
本实施例所制备的氯化铜为模板的石墨烯立体几何结构平均尺寸为20μm；以循环肿瘤细胞EpCAM特异性细胞和EpCAM非特异性细胞为待捕获的循环肿瘤细胞为例，对本发明的捕获体系作进一步阐述和验证。利用具有立体几何结构的石墨烯表面进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法包括以下步骤：
(1)基于氯化铜为模板的的由斜方锥石墨烯组成的薄膜芯片的制备
(a)制备斜方锥氯化铜单晶
将商业用氯化铜粉末溶于水中配成氯化铜饱和溶液，控制温度为25度，静置、析出晶体，过滤、干燥得到边长平均为20μm的氯化铜单晶粉末。
(b)制备由斜方锥石墨烯组成的薄膜芯片
在管式炉中，在石英管的一端(约20cm)保持温度为850度，通入碳源(乙烯)；另一端约20cm长温度为550度并放置斜方锥氯化铜单晶粉末。通过乙烯的热裂解，使得低温端的氯化铜单晶粉末表面覆盖石墨烯层。将得到的产物溶于水中，去除氯化铜单晶；高温干燥，得到石墨烯颗粒粉末。将粉末溶解，抽滤或旋涂，得到具有立体几何结构的石墨烯薄膜。
(2)由斜方锥石墨烯组成的薄膜芯片表面的特异性抗体修饰
(a)羧酸化石墨烯芯片
将上述薄膜置于真空箱中在100度以上加热还原约12小时。室温条件下，将该薄膜浸泡在浓度为1～10％的1-芘羧酸的甲醇溶液中，室温下放置；取出用甲醇和二甲基亚砜润洗，吹干，得到羧酸化的薄膜；然后将该薄膜固定在玻璃片上，得到羧酸化的石墨烯薄膜芯片。
(b)将肿瘤细胞表面的生物素化抗EpCAM抗体固定在石墨烯芯片表面上，制备得到表面固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体的具有立体几何结构的石墨烯芯片。
(i)将(a)中所述芯片置于六孔板内，加入含有N-羟基琥珀酰亚胺和N-(3-二甲基胺基丙基)-N'-乙基碳二亚胺的二甲基亚砜溶液中，室温下反应2小时。
(ii)将该芯片置于链霉亲和素用磷酸盐缓冲液稀释为浓度为20μg/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置(优选室温下放置30分钟左右)；取出基片，用磷酸盐缓冲液洗涤；
(iii)取20μL 20μg/mL生物素化的抗EpCAM抗体的PBS溶液，滴加到步骤(ii)得到的芯片表面，室温放置30分钟,然后用PBS润洗三次，洗去未连接的生物素化的抗EpCAM抗体，制备得到表面固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体的石墨烯芯片。
(3)捕获并处理待测样品中的循环肿瘤细胞
(a)分别取乳腺癌细胞MCF7细胞悬浮液10μL，用细胞计数器计数并计算其浓度，取一定量上述细胞悬浮液，用RPMI1640细胞培养基稀释至1×105个细胞/mL，混合均匀，室温下保存。
(b)分别将混合均匀后得到的细胞悬浮液3mL滴加到放置在细胞培养板(直径3.5cm)中的步骤(2)得到的表面固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体的石墨烯芯片，然后置于细胞培养箱中，由于肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与石墨烯立体几何结构的协同作用，可以特异性捕获循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整石墨烯表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。
(c)将捕获了循环肿瘤细胞的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。
(d)倒置放置在载玻片上，放置在荧光显微镜样品台上进行观测，先通过眼睛可观测的模式，在目镜处观测，通过调节焦距找到肿瘤细胞所在的平面。调节模式为电脑显示，曝光时间设置为100ms，用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。捕获了循环肿瘤细胞的平整石墨烯表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
(e)实验结果表明，该芯片对MCF7细胞的捕获效率为94.4％；对照实验中平整表面的MCF7细胞的捕获效率仅为0.9％，这些数据表明该方法可以实现循环肿瘤细胞的高效特异性捕获。
(4)作为对照组1，将步骤(2)得到的芯片置于六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的前列腺癌细胞PC3悬浮液，置于细胞培养箱中，由于肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与石墨烯立体几何结构的协同作用，可以特异性捕获循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整石墨烯表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。将捕获了循环肿瘤细胞的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。捕获了循环肿瘤细胞的平整石墨烯表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
(5)作为对照组2，将步骤(2)得到的芯片置于六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的人淋巴B细胞癌细胞Daudi悬浮液，置于细胞培养箱中，由于肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与石墨烯立体几何结构的协同作用，可以特异性捕获循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整石墨烯表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。将捕获了循环肿瘤细胞的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。捕获了循环肿瘤细胞的平整石墨烯表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
(6)作为对照组3，将步骤(2)得到的芯片置于六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的人淋巴癌细胞Jurkat悬浮液，置于细胞培养箱中，由于肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与石墨烯立体几何结构的协同作用，可以特异性捕获循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整石墨烯表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。将捕获了循环肿瘤细胞的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。捕获了循环肿瘤细胞的平整石墨烯表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
(7)作为对照组4，将步骤(2)得到的芯片置于六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的子宫癌细胞Hela悬浮液，置于细胞培养箱中，由于肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与石墨烯立体几何结构的协同作用，可以特异性捕获循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整石墨烯表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。将捕获了循环肿瘤细胞的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。捕获了循环肿瘤细胞的平整石墨烯表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
(8)实验结果表明，本发明的石墨烯芯片对MCF7细胞的捕获效率为94.4％，前列腺癌细胞PC3细胞的捕获效率为90.6％，人淋巴B细胞癌细胞Daudi细胞的捕获效率为0.02％，人淋巴癌细胞Jurkat细胞的捕获效率为0.02％，子宫癌细胞Hela细胞的捕获效率为0.02％。这些数据表明该方法可以实现循环肿瘤细胞的高效特异性捕获，并实现极低的非特异性吸附。
实施例4
本实施例所制备的硫酸铜为模板的斜方柱石墨烯的平均尺寸为20μm；以循环肿瘤细胞EpCAM特异性细胞和EpCAM非特异性细胞为待捕获的循环肿瘤细胞为例，对本发明的捕获体系作进一步阐述和验证。利用具有立体几何结构的石墨烯表面进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法包括以下步骤：
(1)基于硫酸铜为模板的由斜方柱石墨烯组成的薄膜芯片的制备
(a)制备斜方柱硫酸铜单晶
将商业用硫酸铜粉末溶于水中配成氯化铜饱和溶液，控制温度为25度，静置、析出晶体，过滤、干燥得到边长平均为20μm的硫酸铜单晶粉末。
(b)制备由斜方柱石墨烯组成的薄膜芯片
在管式炉中，在石英管的一端(约20cm)保持温度为850度，通入碳源(乙烯)；另一端约20cm长温度为550度并放置斜方柱硫酸铜单晶粉末。通过乙烯的热裂解，使得低温端的硫酸铜单晶粉末表面覆盖石墨烯层。将得到的产物溶于水中，去除硫酸铜单晶；高温干燥，得到石墨烯颗粒粉末。将粉末溶解，抽滤或旋涂，得到具有立体几何结构的石墨烯薄膜。
(2)由斜方柱石墨烯组成的薄膜芯片表面的特异性抗体修饰
(a)羧酸化石墨烯芯片
将上述薄膜置于真空箱中在100度以上加热还原约12小时。室温条件下，将该薄膜浸泡在浓度为1～10％的1-芘羧酸的甲醇溶液中，室温下放置；取出用甲醇和二甲基亚砜润洗，吹干，得到羧酸化的薄膜；然后将该薄膜固定在玻璃片上，得到羧酸化的石墨烯薄膜芯片。
(b)将肿瘤细胞表面的生物素化抗EpCAM抗体固定在石墨烯芯片表面上，制备得到表面固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体的具有立体几何结构的石墨烯芯片。
(i)将(a)中所述芯片置于六孔板内，加入含有N-羟基琥珀酰亚胺和N-(3-二甲基胺基丙基)-N'-乙基碳二亚胺的二甲基亚砜溶液中，室温下反应2小时。
(ii)将该芯片置于链霉亲和素用磷酸盐缓冲液稀释为浓度为20μg/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置(优选室温下放置30分钟左右)；取出基片，用磷酸盐缓冲液洗涤；
(iii)取20μL 20μg/mL生物素化的抗EpCAM抗体的PBS溶液，滴加到步骤(ii)得到的芯片表面，室温放置30分钟,然后用PBS润洗三次，洗去未连接的生物素化的抗EpCAM抗体，制备得到表面固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体的石墨烯芯片。
(3)捕获并处理待测样品中的循环肿瘤细胞
(a)分别取乳腺癌细胞MCF7细胞悬浮液10μL，用细胞计数器计数并计算其浓度，取一定量上述细胞悬浮液，用RPMI1640细胞培养基稀释至1×105个细胞/mL，混合均匀，室温下保存。
(b)分别将混合均匀后得到的细胞悬浮液3mL滴加到放置在细胞培养板(直径3.5cm)中的步骤(2)得到的表面固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体的石墨烯芯片，然后置于细胞培养箱中，由于肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与石墨烯立体几何结构的协同作用，可以特异性捕获循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整石墨烯表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。
(c)将捕获了循环肿瘤细胞的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。
(d)倒置放置在载玻片上，放置在荧光显微镜样品台上进行观测，先通过眼睛可观测的模式，在目镜处观测，通过调节焦距找到肿瘤细胞所在的平面。调节模式为电脑显示，曝光时间设置为100ms，用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。捕获了循环肿瘤细胞的平整石墨烯表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
(e)实验结果表明，该芯片对MCF7细胞的捕获效率为93.4％；对照实验中平整表面的MCF7细胞的捕获效率仅为0.9％，这些数据表明该方法可以实现循环肿瘤细胞的高效特异性捕获。
(4)作为对照组1，将步骤(2)得到的芯片置于六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的前列腺癌细胞PC3悬浮液，置于细胞培养箱中，由于肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与石墨烯立体几何结构的协同作用，可以特异性捕获循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整石墨烯表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。将捕获了循环肿瘤细胞的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。捕获了循环肿瘤细胞的平整石墨烯表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
(5)作为对照组2，将步骤(2)得到的芯片置于六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的人淋巴B细胞癌细胞Daudi悬浮液，置于细胞培养箱中，由于肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与石墨烯立体几何结构的协同作用，可以特异性捕获循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整石墨烯表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。将捕获了循环肿瘤细胞的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。捕获了循环肿瘤细胞的平整石墨烯表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
(6)作为对照组3，将步骤(2)得到的芯片置于六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的人淋巴癌细胞Jurkat悬浮液，置于细胞培养箱中，由于肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与石墨烯立体几何结构的协同作用，可以特异性捕获循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整石墨烯表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。将捕获了循环肿瘤细胞的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。捕获了循环肿瘤细胞的平整石墨烯表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
(7)作为对照组4，将步骤(2)得到的芯片置于六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的子宫癌细胞Hela悬浮液，置于细胞培养箱中，由于肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与石墨烯立体几何结构的协同作用，可以特异性捕获循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整石墨烯表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。将捕获了循环肿瘤细胞的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。捕获了循环肿瘤细胞的平整石墨烯表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
(8)实验结果表明，本发明的石墨烯芯片对MCF7细胞的捕获效率为93.4％，前列腺癌细胞PC3细胞的捕获效率为90.1％，人淋巴B细胞癌细胞Daudi细胞的捕获效率为0.01％，人淋巴癌细胞Jurkat细胞的捕获效率为0.01％，子宫癌细胞Hela细胞的捕获效率为0.01％。这些数据表明该方法可以实现循环肿瘤细胞的高效特异性捕获，并实现极低的非特异性吸附。
实施例5
本实施例所制备的钨酸锰为模板的斜方锥石墨烯立体几何结构平均尺寸为20μm；以循环肿瘤细胞EpCAM特异性细胞和EpCAM非特异性细胞为待捕获的循环肿瘤细胞为例，对本发明的捕获体系作进一步阐述和验证。利用具有立体几何结构的石墨烯表面进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法包括以下步骤：
(1)基于钨酸锰为模板的由斜方锥石墨烯组成的薄膜芯片的制备
(a)制备斜方锥钨酸锰单晶
将商业用钨酸锰粉末溶于水中配成钨酸锰饱和溶液，控制温度为25度，静置、析出晶体，过滤、干燥得到边长平均为20μm的钨酸锰单晶粉末。
(b)制备由斜方锥石墨烯组成的薄膜芯片
在管式炉中，在石英管的一端(约20cm)保持温度为850度，通入碳源(乙烯)；另一端约20cm长温度为700度并放置硫酸铜单晶粉末。通过乙烯的热裂解，使得低温端的钨酸锰单晶粉末表面覆盖石墨烯层。将得到的产物溶于水中，去除钨酸锰单晶；高温干燥，得到石墨烯颗粒粉末。将粉末溶解，抽滤或旋涂，得到具有立体几何结构的斜方锥石墨烯薄膜。
(2)由斜方锥石墨烯组成的薄膜芯片表面特异性抗体的修饰
(a)羧酸化石墨烯芯片
将上述薄膜置于真空箱中在100度以上加热还原约12小时。室温条件下，将该薄膜浸泡在浓度为1～10％的1-芘羧酸的甲醇溶液中，室温下放置；取出用甲醇和二甲基亚砜润洗，吹干，得到羧酸化的薄膜；然后将该薄膜固定在玻璃片上，得到羧酸化的石墨烯薄膜芯片。
(b)将肿瘤细胞表面的生物素化抗EpCAM抗体固定在石墨烯芯片表面上，制备得到表面固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体的具有立体几何结构的石墨烯芯片。
(i)将(a)中所述芯片置于六孔板内，加入含有N-羟基琥珀酰亚胺和N-(3-二甲基胺基丙基)-N'-乙基碳二亚胺的二甲基亚砜溶液中，室温下反应2小时。
(ii)将该芯片置于链霉亲和素用磷酸盐缓冲液稀释为浓度为20μg/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置(优选室温下放置30分钟左右)；取出基片，用磷酸盐缓冲液洗涤；
(iii)取20μL 20μg/mL生物素化的抗EpCAM抗体的PBS溶液，滴加到步骤(ii)得到的芯片表面，室温放置30分钟,然后用PBS润洗三次，洗去未连接的生物素化的抗EpCAM抗体，制备得到表面固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体的石墨烯芯片。
(3)捕获并处理待测样品中的循环肿瘤细胞
(a)分别取乳腺癌细胞MCF7细胞悬浮液10μL，用细胞计数器计数并计算其浓度，取一定量上述细胞悬浮液，用RPMI1640细胞培养基稀释至1×105个细胞/mL，混合均匀，室温下保存。
(b)分别将混合均匀后得到的细胞悬浮液3mL滴加到放置在细胞培养板(直径3.5cm)中的步骤(2)得到的表面固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体的石墨烯芯片，然后置于细胞培养箱中，由于肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与石墨烯立体几何结构的协同作用，可以特异性捕获循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整石墨烯表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。
(c)将捕获了循环肿瘤细胞的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。
(d)倒置放置在载玻片上，放置在荧光显微镜样品台上进行观测，先通过眼睛可观测的模式，在目镜处观测，通过调节焦距找到肿瘤细胞所在的平面。调节模式为电脑显示，曝光时间设置为100ms，用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。捕获了循环肿瘤细胞的平整石墨烯表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
(e)实验结果表明，该芯片对MCF7细胞的捕获效率为92.7％；对照实验中平整表面的MCF7细胞的捕获效率仅为0.9％，这些数据表明该方法可以实现循环肿瘤细胞的高效特异性捕获。
(4)作为对照组1，将步骤(2)得到的芯片置于六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的前列腺癌细胞PC3悬浮液，置于细胞培养箱中，由于肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与石墨烯立体几何结构的协同作用，可以特异性捕获循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整石墨烯表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。将捕获了循环肿瘤细胞的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。捕获了循环肿瘤细胞的平整石墨烯表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
(5)作为对照组2，将步骤(2)得到的芯片置于六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的人淋巴B细胞癌细胞Daudi悬浮液，置于细胞培养箱中，由于肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与石墨烯立体几何结构的协同作用，可以特异性捕获循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整石墨烯表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。将捕获了循环肿瘤细胞的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。捕获了循环肿瘤细胞的平整石墨烯表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
(6)作为对照组3，将步骤(2)得到的芯片置于六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的人淋巴癌细胞Jurkat悬浮液，置于细胞培养箱中，由于肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与石墨烯立体几何结构的协同作用，可以特异性捕获循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整石墨烯表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。将捕获了循环肿瘤细胞的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。捕获了循环肿瘤细胞的平整石墨烯表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
(7)作为对照组4，将步骤(2)得到的芯片置于六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的子宫癌细胞Hela悬浮液，置于细胞培养箱中，由于肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与石墨烯立体几何结构的协同作用，可以特异性捕获循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整石墨烯表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。将捕获了循环肿瘤细胞的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。捕获了循环肿瘤细胞的平整石墨烯表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
(8)实验结果表明，本发明的石墨烯芯片对MCF7细胞的捕获效率为92.7％，前列腺癌细胞PC3细胞的捕获效率为88.8％，人淋巴B细胞癌细胞Daudi细胞的捕获效率为0.01％，人淋巴癌细胞Jurkat细胞的捕获效率为0.01％，子宫癌细胞Hela细胞的捕获效率为0.01％。这些数据表明该方法可以实现循环肿瘤细胞的高效特异性捕获，并实现极低的非特异性吸附。
实施例6
本实施例所制备的氧化钒为模板的斜方柱石墨烯立体几何结构平均尺寸为20μm；以循环肿瘤细胞EpCAM特异性细胞和EpCAM非特异性细胞为待捕获的循环肿瘤细胞为例，对本发明的捕获体系作进一步阐述和验证。利用具有立体几何结构的石墨烯表面进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法包括以下步骤：
(1)基于氧化钒为模板的由斜方柱石墨烯组成的薄膜芯片的制备
(a)制备斜方柱氧化钒单晶
将商业用氧化钒粉末溶于水中配成氧化钒饱和溶液，控制温度为25度，静置、析出晶体，过滤、干燥得到边长平均为20μm的氧化钒单晶粉末。
(b)制备由斜方柱石墨烯组成的薄膜芯片
在管式炉中，在石英管的一端(约20cm)保持温度为850度，通入碳源(乙烯)；另一端约20cm长温度为550度并放置氧化钒单晶粉末。通过乙烯的热裂解，使得低温端的氧化钒单晶粉末表面覆盖石墨烯层。将得到的产物溶于水中，去除氧化钒单晶；高温干燥，得到石墨烯颗粒粉末。将粉末溶解，抽滤或旋涂，得到具有立体几何结构的石墨烯薄膜。
(2)由斜方柱石墨烯组成的薄膜芯片特异性抗体的修饰
(a)羧酸化石墨烯芯片
将上述薄膜置于真空箱中在100度以上加热还原约12小时。室温条件下，将该薄膜放入1-芘甲酸溶液中，得到羧酸化的薄膜；然后将该薄膜固定在玻璃片上，得到由斜方柱石墨烯组成石墨烯芯片。
(b)将肿瘤细胞表面的生物素化抗EpCAM抗体固定在石墨烯芯片表面上，制备得到表面固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体的具有立体几何结构的石墨烯芯片。
(i)将(a)中所述芯片置于六孔板内，加入含有N-羟基琥珀酰亚胺和N-(3-二甲基胺基丙基)-N'-乙基碳二亚胺的二甲基亚砜溶液中，室温下反应2小时。
(ii)将该芯片置于链霉亲和素用磷酸盐缓冲液稀释为浓度为20μg/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置(优选室温下放置30分钟左右)；取出基片，用磷酸盐缓冲液洗涤；
(iii)取20μL 20μg/mL生物素化的抗EpCAM抗体的PBS溶液，滴加到步骤(ii)得到的芯片表面，室温放置30分钟,然后用PBS润洗三次，洗去未连接的生物素化的抗EpCAM抗体，制备得到表面固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体的石墨烯芯片。
(3)捕获并处理待测样品中的循环肿瘤细胞
(a)分别取乳腺癌细胞MCF7细胞悬浮液10μL，用细胞计数器计数并计算其浓度，取一定量上述细胞悬浮液，用RPMI1640细胞培养基稀释至1×105个细胞/mL，混合均匀，室温下保存。
(b)分别将混合均匀后得到的细胞悬浮液3mL滴加到放置在细胞培养板(直径3.5cm)中的步骤(2)得到的表面固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体的石墨烯芯片，然后置于细胞培养箱中，由于肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与石墨烯立体几何结构的协同作用，可以特异性捕获循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整石墨烯表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。
(c)将捕获了循环肿瘤细胞的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。
(d)倒置放置在载玻片上，放置在荧光显微镜样品台上进行观测，先通过眼睛可观测的模式，在目镜处观测，通过调节焦距找到肿瘤细胞所在的平面。调节模式为电脑显示，曝光时间设置为100ms，用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。捕获了循环肿瘤细胞的平整石墨烯表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
(e)实验结果表明，该芯片对MCF7细胞的捕获效率为90.2％；对照实验中平整表面的MCF7细胞的捕获效率仅为0.9％，这些数据表明该方法可以实现循环肿瘤细胞的高效特异性捕获。
(4)作为对照组1，将步骤(2)得到的芯片置于六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的前列腺癌细胞PC3悬浮液，置于细胞培养箱中，由于肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与石墨烯立体几何结构的协同作用，可以特异性捕获循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整石墨烯表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。将捕获了循环肿瘤细胞的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。捕获了循环肿瘤细胞的平整石墨烯表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
(5)作为对照组2，将步骤(2)得到的芯片置于六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的人淋巴B细胞癌细胞Daudi悬浮液，置于细胞培养箱中，由于肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与石墨烯立体几何结构的协同作用，可以特异性捕获循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整石墨烯表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。将捕获了循环肿瘤细胞的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。捕获了循环肿瘤细胞的平整石墨烯表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
(6)作为对照组3，将步骤(2)得到的芯片置于六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的人淋巴癌细胞Jurkat悬浮液，置于细胞培养箱中，由于肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与石墨烯立体几何结构的协同作用，可以特异性捕获循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整石墨烯表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。将捕获了循环肿瘤细胞的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。捕获了循环肿瘤细胞的平整石墨烯表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
(7)作为对照组4，将步骤(2)得到的芯片置于六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的子宫癌细胞Hela悬浮液，置于细胞培养箱中，由于肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与石墨烯立体几何结构的协同作用，可以特异性捕获循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整石墨烯表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。将捕获了循环肿瘤细胞的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。捕获了循环肿瘤细胞的平整石墨烯表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
(8)实验结果表明，本发明的石墨烯芯片对MCF7细胞的捕获效率为90.2％，前列腺癌细胞PC3细胞的捕获效率为89.1％，人淋巴B细胞癌细胞Daudi细胞的捕获效率为0.01％，人淋巴癌细胞Jurkat细胞的捕获效率为0.01％，子宫癌细胞Hela细胞的捕获效率为0.01％。这些数据表明该方法可以实现循环肿瘤细胞的高效特异性捕获，并实现极低的非特异性吸附。
实施例7
本实施例所制备的氧化钨为模板的八面体石墨烯立体几何结构平均尺寸为20μm；以循环肿瘤细胞EpCAM特异性细胞和EpCAM非特异性细胞为待捕获的循环肿瘤细胞为例，对本发明的捕获体系作进一步阐述和验证。利用具有立体几何结构的石墨烯表面进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法包括以下步骤：
(1)基于氧化钨为模板的由八面体石墨烯组成的薄膜芯片的制备
(a)制备八面体氧化钨单晶
将商业用氧化钨粉末溶于水中配成氧化钨饱和溶液，控制温度为25度，静置、析出晶体，过滤、干燥得到边长平均为20μm的氧化钨单晶粉末。
(b)制备由八面体石墨烯组成的薄膜芯片
在管式炉中，在石英管的一端(约20cm)保持温度为850度，通入碳源(乙烯)；另一端约20cm长温度为700度并放置氧化钨单晶粉末。通过乙烯的热裂解，使得低温端的氧化钨单晶粉末表面覆盖石墨烯层。将得到的产物溶于水中，去除氧化钨单晶；高温干燥，得到石墨烯颗粒粉末。将粉末溶解，抽滤或旋涂，得到具有立体几何结构的石墨烯薄膜。
(2)由八面体石墨烯组成的石墨烯芯片的特异性抗体修饰
(a)羧酸化石墨烯芯片
将上述薄膜置于真空箱中在100度以上加热还原约12小时。室温条件下，将该薄膜浸泡在浓度为1～10％的1-芘羧酸的甲醇溶液中，室温下放置；取出用甲醇和二甲基亚砜润洗，吹干，得到羧酸化的薄膜；然后将该薄膜固定在玻璃片上，得到羧酸化的石墨烯薄膜芯片。
(b)将肿瘤细胞表面的生物素化抗EpCAM抗体固定在石墨烯芯片表面上，制备得到表面固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体的具有立体几何结构的石墨烯芯片。
(i)将(a)中所述芯片置于六孔板内，加入含有N-羟基琥珀酰亚胺和N-(3-二甲基胺基丙基)-N'-乙基碳二亚胺的二甲基亚砜溶液中，室温下反应2小时。
(ii)将该芯片置于链霉亲和素用磷酸盐缓冲液稀释为浓度为20μg/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置(优选室温下放置30分钟左右)；取出基片，用磷酸盐缓冲液洗涤；
(iii)取20μL20μg/mL生物素化的抗EpCAM抗体的PBS溶液，滴加到步骤(ii)得到的芯片表面，室温放置30分钟,然后用PBS润洗三次，洗去未连接的生物素化的抗EpCAM抗体，制备得到表面固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体的石墨烯芯片。
(3)捕获并处理待测样品中的循环肿瘤细胞
(a)分别取乳腺癌细胞MCF7细胞悬浮液10μL，用细胞计数器计数并计算其浓度，取一定量上述细胞悬浮液，用RPMI1640细胞培养基稀释至1×105个细胞/mL，混合均匀，室温下保存。
(b)分别将混合均匀后得到的细胞悬浮液3mL滴加到放置在细胞培养板(直径3.5cm)中的步骤(2)得到的表面固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体的石墨烯芯片，然后置于细胞培养箱中，由于肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与石墨烯立体几何结构的协同作用，可以特异性捕获循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整石墨烯表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。
(c)将捕获了循环肿瘤细胞的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。
(d)倒置放置在载玻片上，放置在荧光显微镜样品台上进行观测，先通过眼睛可观测的模式，在目镜处观测，通过调节焦距找到肿瘤细胞所在的平面。调节模式为电脑显示，曝光时间设置为100ms，用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。捕获了循环肿瘤细胞的平整石墨烯表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
(e)实验结果表明，该芯片对MCF7细胞的捕获效率为95.3％；对照实验中平整表面的MCF7细胞的捕获效率仅为0.9％，这些数据表明该方法可以实现循环肿瘤细胞的高效特异性捕获。
(4)作为对照组1，将步骤(2)得到的芯片置于六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的前列腺癌细胞PC3悬浮液，置于细胞培养箱中，由于肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与石墨烯立体几何结构的协同作用，可以特异性捕获循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整石墨烯表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。将捕获了循环肿瘤细胞的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。捕获了循环肿瘤细胞的平整石墨烯表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
(5)作为对照组2，将步骤(2)得到的芯片置于六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的人淋巴B细胞癌细胞Daudi悬浮液，置于细胞培养箱中，由于肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与石墨烯立体几何结构的协同作用，可以特异性捕获循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整石墨烯表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。将捕获了循环肿瘤细胞的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。捕获了循环肿瘤细胞的平整石墨烯表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
(6)作为对照组3，将步骤(2)得到的芯片置于六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的人淋巴癌细胞Jurkat悬浮液，置于细胞培养箱中，由于肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与石墨烯立体几何结构的协同作用，可以特异性捕获循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整石墨烯表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。将捕获了循环肿瘤细胞的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。捕获了循环肿瘤细胞的平整石墨烯表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
(7)作为对照组4，将步骤(2)得到的芯片置于六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的子宫癌细胞Hela悬浮液，置于细胞培养箱中，由于肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与石墨烯立体几何结构的协同作用，可以特异性捕获循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整石墨烯表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。将捕获了循环肿瘤细胞的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。捕获了循环肿瘤细胞的平整石墨烯表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
(8)实验结果表明，本发明的石墨烯芯片对MCF7细胞的捕获效率为95.3％，前列腺癌细胞PC3细胞的捕获效率为91.7％，人淋巴B细胞癌细胞Daudi细胞的捕获效率为0.01％，人淋巴癌细胞Jurkat细胞的捕获效率为0.02％，子宫癌细胞Hela细胞的捕获效率为0.02％。这些数据表明该方法可以实现循环肿瘤细胞的高效特异性捕获，并实现极低的非特异性吸附。
实施例8
本实施例所制备的氯化钠为模板的立方体石墨烯立体几何结构平均尺寸为20μm；以乳腺癌病人血液中乳腺癌细胞的捕获为例，对本发明的捕获体系作进一步阐述和验证。利用具有立体几何结构的石墨烯表面进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法包括以下步骤：
(1)基于氯化钠为模板的由立方体石墨烯组成的薄膜芯片的制备
(a)制备立方体氯化钠单晶
将商业用氯化钠粉末溶于水中配成氯化钠饱和溶液，控制温度为25度，静置、析出晶体，过滤、干燥得到边长平均为20μm的氯化钠单晶粉末。
(b)制备由立方体石墨烯组成的薄膜芯片
在管式炉中，在石英管的一端(约20cm)保持温度为850度，通入碳源(乙烯)；另一端约20cm长温度为700度并放置氯化钠单晶粉末。通过乙烯的热裂解，使得低温端的氯化钠单晶粉末表面覆盖石墨烯层。将得到的产物溶于水中，去除氯化钠单晶；高温干燥，得到石墨烯颗粒粉末。将粉末溶解，抽滤或旋涂，得到具有立体几何结构的石墨烯薄膜。
(2)由立方体石墨烯组成的薄膜芯片的特异性抗体修饰
(a)羧酸化石墨烯芯片
将上述薄膜置于真空箱中在100度以上加热还原约12小时。室温条件下，将该薄膜浸泡在浓度为1～10％的1-芘羧酸的甲醇溶液中，室温下放置；取出用甲醇和二甲基亚砜润洗，吹干，得到羧酸化的薄膜；然后将该薄膜固定在玻璃片上，得到羧酸化的石墨烯薄膜芯片。
(b)将肿瘤细胞表面的生物素化抗EpCAM抗体固定在石墨烯芯片表面上，制备得到表面固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体的具有立体几何结构的石墨烯芯片。
(i)将(a)中所述芯片置于六孔板内，加入含有N-羟基琥珀酰亚胺和N-(3-二甲基胺基丙基)-N'-乙基碳二亚胺的二甲基亚砜溶液中，室温下反应2小时。
(ii)将该芯片置于链霉亲和素用磷酸盐缓冲液稀释为浓度为20μg/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置(优选室温下放置30分钟左右)；取出基片，用磷酸盐缓冲液洗涤；
(iii)取20μL20μg/mL生物素化的抗EpCAM抗体的PBS溶液，滴加到步骤(ii)得到的芯片表面，室温放置30分钟,然后用PBS润洗三次，洗去未连接的生物素化的抗EpCAM抗体，制备得到表面固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体的石墨烯芯片。
(3)将步骤(2)得到的芯片置于芯片培养皿中，加入1mL乳腺癌病人的血液，置于细胞培养箱中，由于肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与石墨烯立体几何结构的协同作用，可以特异性捕获循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。将捕获了循环肿瘤细胞的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。
(4)实验结果表明，本发明的石墨烯芯片应用于全血捕获癌细胞的捕获个数为3。这些结果表明本发明的石墨烯芯片具有高效灵敏的捕获性能和极低的非特异性吸附。临床实验结果显著。
实施例9
本实施例所制备的氯化钠为模板的立方体石墨烯立体几何结构平均尺寸为20μm；以正常人血液中乳腺癌细胞的捕获为例，对本发明的捕获体系作进一步阐述和验证。利用具有立体几何结构的石墨烯表面进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法包括以下步骤：
(1)基于氯化钠为模板的由立方体石墨烯组成的薄膜芯片的制备
(a)制备立方体氯化钠单晶
将商业用氯化钠粉末溶于水中配成氯化钠饱和溶液，控制温度为25度，静置、析出晶体，过滤、干燥得到边长平均为20μm的氯化钠单晶粉末。
(b)制备由立方体石墨烯组成的薄膜芯片
在管式炉中，在石英管的一端(约20cm)保持温度为850度，通入碳源(乙烯)；另一端约20cm长温度为700度并放置氯化钠单晶粉末。通过乙烯的热裂解，使得低温端的氯化钠单晶粉末表面覆盖石墨烯层。将得到的产物溶于水中，去除氯化钠单晶；高温干燥，得到石墨烯颗粒粉末。将粉末溶解，抽滤或旋涂，得到具有立体几何结构的石墨烯薄膜。
(2)由立方体石墨烯组成的薄膜芯片的特异性抗体修饰
(a)羧酸化石墨烯芯片
将上述薄膜置于真空箱中在100度以上加热还原约12小时。室温条件下，将该薄膜浸泡在浓度为1～10％的1-芘羧酸的甲醇溶液中，室温下放置；取出用甲醇和二甲基亚砜润洗，吹干，得到羧酸化的薄膜；然后将该薄膜固定在玻璃片上，得到羧酸化的石墨烯薄膜芯片。
(b)将肿瘤细胞表面的生物素化抗EpCAM抗体固定在石墨烯芯片表面上，制备得到表面固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体的具有立体几何结构的石墨烯芯片。
(i)将(a)中所述芯片置于六孔板内，加入含有N-羟基琥珀酰亚胺和N-(3-二甲基胺基丙基)-N'-乙基碳二亚胺的二甲基亚砜溶液中，室温下反应2小时。
(ii)将该芯片置于链霉亲和素用磷酸盐缓冲液稀释为浓度为20μg/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置(优选室温下放置30分钟左右)；取出基片，用磷酸盐缓冲液洗涤；
(iii)取20μL 20μg/mL生物素化的抗EpCAM抗体的PBS溶液，滴加到步骤(ii)得到的芯片表面，室温放置30分钟,然后用PBS润洗三次，洗去未连接的生物素化的抗EpCAM抗体，制备得到表面固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体的石墨烯芯片。
(3)将步骤(2)得到的芯片置于芯片培养皿中，加入1mL正常人的血液，置于细胞培养箱中，由于肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与石墨烯立体几何结构的协同作用，可以特异性捕获循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。将捕获了循环肿瘤细胞的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。
(4)实验结果表明，本发明的石墨烯芯片应用于全血捕获癌细胞的捕获个数为0。这些结果表明本发明的石墨烯芯片具有高效灵敏的捕获性能和极低的非特异性吸附。临床实验结果显著。
实施例10
本实施例所制备的硫酸铜为模板的斜方柱石墨烯立体几何结构平均尺寸为20μm；以乳腺癌病人血液中乳腺癌细胞细胞为例，对本发明的捕获体系作进一步阐述和验证。利用具有立体几何结构的石墨烯表面进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法包括以下步骤：
(1)基于硫酸铜为模板的由斜方柱石墨烯组成的薄膜芯片的制备
(a)制备硫酸铜单晶
将商业用硫酸铜粉末溶于水中配成硫酸铜饱和溶液，控制温度为25度，静置、析出晶体，过滤、干燥得到边长平均为20μm的硫酸铜单晶粉末。
(b)制备由斜方柱石墨烯组成的薄膜芯片
在管式炉中，在石英管的一端(约20cm)保持温度为850度，通入碳源(乙烯)；另一端约20cm长温度为550度并放置硫酸铜单晶粉末。通过乙烯的热裂解，使得低温端的硫酸铜单晶粉末表面覆盖石墨烯层。将得到的产物溶于水中，去除硫酸铜单晶；高温干燥，得到石墨烯颗粒粉末。将粉末溶解，抽滤或旋涂，得到具有立体几何结构的石墨烯薄膜。
(2)由斜方柱石墨烯组成的薄膜芯片的特异性抗体修饰
(a)羧酸化石墨烯芯片
将上述薄膜置于真空箱中在100度以上加热还原约12小时。室温条件下，将该薄膜浸泡在浓度为1～10％的1-芘羧酸的甲醇溶液中，室温下放置；取出用甲醇和二甲基亚砜润洗，吹干，得到羧酸化的薄膜；然后将该薄膜固定在玻璃片上，得到羧酸化的石墨烯薄膜芯片。
(b)将肿瘤细胞表面的生物素化抗EpCAM抗体固定在石墨烯芯片表面上，制备得到表面固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体的具有立体几何结构的石墨烯芯片。
(i)将(a)中所述芯片置于六孔板内，加入含有N-羟基琥珀酰亚胺和N-(3-二甲基胺基丙基)-N'-乙基碳二亚胺的二甲基亚砜溶液中，室温下反应2小时。
(ii)将该芯片置于链霉亲和素用磷酸盐缓冲液稀释为浓度为20μg/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置(优选室温下放置30分钟左右)；取出基片，用磷酸盐缓冲液洗涤；
(iii)取20μL 20μg/mL生物素化的抗EpCAM抗体的PBS溶液，滴加到步骤(ii)得到的芯片表面，室温放置30分钟,然后用PBS润洗三次，洗去未连接的生物素化的抗EpCAM抗体，制备得到表面固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体的石墨烯芯片。
(3)将步骤(2)得到的芯片置于芯片培养皿中，加入1mL乳腺癌病人的血液，置于细胞培养箱中，由于肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与石墨烯立体几何结构的协同作用，可以特异性捕获循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。将捕获了循环肿瘤细胞的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。
(4)实验结果表明，本发明的石墨烯芯片应用于全血捕获癌细胞的捕获个数为3。这些结果表明本发明的石墨烯芯片具有高效灵敏的捕获性能和极低的非特异性吸附。临床实验结果显著。
实施例11
本实施例所制备的硫酸铜为模板的斜方柱石墨烯立体几何结构平均尺寸为20μm；以正常人血液中乳腺癌细胞细胞为例，对本发明的捕获体系作进一步阐述和验证。利用具有立体几何结构的石墨烯表面进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法包括以下步骤：
(1)基于硫酸铜为模板的由斜方柱石墨烯组成的薄膜芯片的制备
(a)制备硫酸铜单晶
将商业用硫酸铜粉末溶于水中配成硫酸铜饱和溶液，控制温度为25度，静置、析出晶体，过滤、干燥得到边长平均为20μm的硫酸铜单晶粉末。
(b)制备由斜方柱石墨烯组成的薄膜芯片
在管式炉中，在石英管的一端(约20cm)保持温度为850度，通入碳源(乙烯)；另一端约20cm长温度为550度并放置硫酸铜单晶粉末。通过乙烯的热裂解，使得低温端的硫酸铜单晶粉末表面覆盖石墨烯层。将得到的产物溶于水中，去除硫酸铜单晶；高温干燥，得到石墨烯颗粒粉末。将粉末溶解，抽滤或旋涂，得到具有立体几何结构的石墨烯薄膜。
(2)由斜方柱石墨烯组成的薄膜芯片的特异性抗体修饰
(a)羧酸化石墨烯芯片
将上述薄膜置于真空箱中在100度以上加热还原约12小时。室温条件下，将该薄膜浸泡在浓度为1～10％的1-芘羧酸的甲醇溶液中，室温下放置；取出用甲醇和二甲基亚砜润洗，吹干，得到羧酸化的薄膜；然后将该薄膜固定在玻璃片上，得到羧酸化的石墨烯薄膜芯片。
(b)将肿瘤细胞表面的生物素化抗EpCAM抗体固定在石墨烯芯片表面上，制备得到表面固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体的具有立体几何结构的石墨烯芯片。
(i)将(a)中所述芯片置于六孔板内，加入含有N-羟基琥珀酰亚胺和N-(3-二甲基胺基丙基)-N'-乙基碳二亚胺的二甲基亚砜溶液中，室温下反应2小时。
(ii)将该芯片置于链霉亲和素用磷酸盐缓冲液稀释为浓度为20μg/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置(优选室温下放置30分钟左右)；取出基片，用磷酸盐缓冲液洗涤；
(iii)取20μL 20μg/mL生物素化的抗EpCAM抗体的PBS溶液，滴加到步骤(ii)得到的芯片表面，室温放置30分钟,然后用PBS润洗三次，洗去未连接的生物素化的抗EpCAM抗体，制备得到表面固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体的石墨烯芯片。
(3)将步骤(2)得到的芯片置于芯片培养皿中，加入1mL正常人的血液，置于细胞培养箱中，由于肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与石墨烯立体几何结构的协同作用，可以特异性捕获循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。将捕获了循环肿瘤细胞的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。
(4)实验结果表明，本发明的石墨烯芯片应用于全血捕获癌细胞的捕获个数为0。这些结果表明本发明的石墨烯芯片具有高效灵敏的捕获性能和极低的非特异性吸附。临床实验结果显著。
实施例12
本实施例所制备的平整石墨烯芯片，以乳腺癌病人血液中乳腺癌细胞细胞为例，对本发明的捕获体系作进一步阐述和验证。利用具有平整石墨烯芯片表面进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法包括以下步骤：
(1)基于平整石墨烯芯片的制备
(a)制备石墨烯芯片
在管式炉中，在石英管的一端(约20cm)保持温度为850度，通入碳源(乙烯)；另一端约20cm长温度为600度并放置玻璃片。通过乙烯的热裂解，得到石墨烯粉末。将粉末溶解，抽滤或旋涂，得到具有平整石墨烯薄膜。
(2)基于平整石墨烯芯片的化学修饰特异性抗体
(a)羧酸化石墨烯芯片
将上述薄膜置于真空箱中在100度以上加热还原约12小时。室温条件下，将该薄膜浸泡在浓度为1～10％的1-芘羧酸的甲醇溶液中，室温下放置；取出用甲醇和二甲基亚砜润洗，吹干，得到羧酸化的薄膜；然后将该薄膜固定在玻璃片上，得到羧酸化的石墨烯薄膜芯片。
(b)将肿瘤细胞表面的生物素化抗EpCAM抗体固定在石墨烯芯片表面上，制备得到表面固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体的平整石墨烯芯片。
(i)将(a)中所述芯片置于六孔板内，加入含有N-羟基琥珀酰亚胺和N-(3-二甲基胺基丙基)-N'-乙基碳二亚胺的二甲基亚砜溶液中，室温下反应2小时。
(ii)将该芯片置于链霉亲和素用磷酸盐缓冲液稀释为浓度为20μg/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置(优选室温下放置30分钟左右)；取出基片，用磷酸盐缓冲液洗涤；
(iii)取20μL 20μg/mL生物素化的抗EpCAM抗体的PBS溶液，滴加到步骤(ii)得到的芯片表面，室温放置30分钟,然后用PBS润洗三次，洗去未连接的生物素化的抗EpCAM抗体，制备得到表面固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体的平整石墨烯芯片。
(3)将步骤(2)得到的芯片置于芯片培养皿中，加入1mL乳腺癌病人血液，置于细胞培养箱中，由于肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与石墨烯立体几何结构的协同作用，可以特异性捕获循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。将捕获了循环肿瘤细胞的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。
(4)实验结果表明，本发明的石墨烯芯片应用于全血捕获癌细胞的捕获个数为0。这些结果表明本发明的石墨烯芯片具有高效灵敏的捕获性能和极低的非特异性吸附。临床实验结果显著。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (1)

1.一种石墨烯芯片，其特征在于，
(1)基于氯化钠为模板的立方体石墨烯的制备：
(a)制备立方体氯化钠单晶：
将商业用氯化钠粉末溶于水中配成氯化钠饱和溶液，控制温度为25度，静置、析出晶体，过滤、干燥得到边长平均为20μm的立方体氯化钠单晶粉末；
(b)制备由立方体石墨烯组成的薄膜芯片：
在管式炉中，在石英管的一端保持温度为850度，通入乙烯；另一端20cm长温度为700度并放置立方体氯化钠单晶粉末，通过乙烯的热裂解，使得低温端的氯化钠单晶粉末表面覆盖石墨烯层；将得到的产物溶于水中，去除氯化钠单晶；高温干燥，得到石墨烯颗粒粉末，将粉末溶解，抽滤或旋涂，得到具有立方体微纳结构的石墨烯薄膜；
(2)由立方体石墨烯组成的薄膜的特异性抗体修饰：
(a)羧酸化石墨烯：
将石墨烯薄膜置于真空箱中在100度以上加热还原12小时，室温条件下，将该薄膜浸泡在浓度为1～10％的1-芘羧酸的甲醇溶液中，室温下放置；取出用甲醇和二甲基亚砜润洗，吹干，得到羧酸化的薄膜；然后将该薄膜固定在玻璃片上，得到羧酸化的石墨烯薄膜芯片；
(b)将肿瘤细胞表面的生物素化抗EpCAM抗体固定在羧酸化的石墨烯薄膜芯片表面上，制备得到表面固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体的石墨烯芯片；
(i)将(a)中所述石墨烯薄膜芯片置于六孔板内，加入含有N-羟基琥珀酰亚胺、N-(3-二甲基胺基丙基)-N'-乙基碳二亚胺的二甲基亚砜溶液中，室温下反应2小时；
(ii)将反应后的芯片置于链霉亲和素用磷酸盐缓冲液稀释为浓度为20μg/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置；取出基片，用磷酸盐缓冲液洗涤；
(iii)取20μL 20μg/mL生物素化的抗EpCAM抗体的PBS溶液，滴加到步骤(ii)得到的芯片表面，室温放置30分钟，然后用PBS润洗三次，洗去未连接的生物素化的抗EpCAM抗体，制备得到表面固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体的石墨烯芯片。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110407197B (zh) * 2019-07-23 2023-08-18 北京大学 一种利用石墨烯包覆层改善生物材料及器械血液相容性的方法
CN111610155B (zh) * 2020-06-02 2022-04-05 西安交通大学 一种用于循环肿瘤细胞捕获与检测的太赫兹器件
CN113009138B (zh) * 2020-06-17 2022-08-30 山东大学 一种用于乳腺癌肿瘤标志物检测的试剂盒及方法
CN112011435B (zh) * 2020-09-11 2023-03-21 徐州工程学院 一种用于精准捕获循环肿瘤细胞的微流控系统及制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103018231A (zh) * 2012-12-27 2013-04-03 济南大学 一种复合纳米材料纸芯片电化学发光免疫传感器的制备方法及应用
US20130256139A1 (en) * 2012-03-30 2013-10-03 International Business Machines Corporation Functionalized graphene or graphene oxide nanopore for bio-molecular sensing and dna sequencing

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104714013B (zh) * 2015-04-12 2017-04-26 北京天恒盛通科技发展有限公司 一种全血捕获癌细胞的石墨烯芯片及其制备方法
CN106148315B (zh) * 2015-04-14 2019-02-01 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 一种基于壳聚糖纳米粒子的ctc捕获与纯化基底及其制备方法
CN106075440B (zh) * 2015-07-01 2019-04-12 哈尔滨医科大学 一种肝癌靶向光热治疗剂及其制备方法与应用
CN105771015B (zh) * 2016-02-24 2019-02-05 西安交通大学 一种用于循环肿瘤细胞捕获的三维仿生纳米材料及其制备方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130256139A1 (en) * 2012-03-30 2013-10-03 International Business Machines Corporation Functionalized graphene or graphene oxide nanopore for bio-molecular sensing and dna sequencing
CN103018231A (zh) * 2012-12-27 2013-04-03 济南大学 一种复合纳米材料纸芯片电化学发光免疫传感器的制备方法及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"血液中循环肿瘤细胞捕获与释放方法研究进展";陆宁宁等;《分析科学学报》;20150630;第31卷(第3期);第416-426页 *

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