CN111346070A - 一种巨噬细胞囊泡包载的纳米药物制剂及其在制药中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属生物技术领域，涉及仿生纳米载体制备及关节炎靶向治疗，具体涉及一种巨噬细胞囊泡包载的纳米药物制剂及其在治疗关节炎中的用途；该纳米药物制剂通过巨噬细胞囊泡表面的粘附蛋白靶向关节炎部位，递送免疫抑制药物，用于靶向关节炎的治疗；进一步，为临床实践提供了一种新的针对关节炎靶向治疗的策略，包括将人工药物载体和天然巨噬细胞囊泡进行融合，构建稳定的巨噬细胞囊泡包载的纳米药物制剂，从而提高关节炎靶向的治疗效果。

Description

一种巨噬细胞囊泡包载的纳米药物制剂及其在制药中的用途
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及仿生纳米载体制备及关节炎靶向治疗药，具体涉及一种巨噬细胞囊泡包载的纳米药物制剂及其在制备治疗关节炎药物中的用途，特别涉及一种具有关节炎靶向性能的巨噬细胞囊泡的提取及其包载的仿生纳米药物制剂及其应用，该仿生纳米药物通过巨噬细胞囊泡表面的粘附蛋白靶向关节炎部位，递送免疫抑制药物，从而提高关节炎靶向的治疗效果。
背景技术
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种较常见的自身免疫性疾病，因其致残率高、并发症严重，RA严重威胁人类健康。其主要表现为慢性进行性的多关节炎症；关节内滑膜、软骨及骨的损伤；晚期则会导致关节功能完全丧失，患者丧失活动能力。所述RA因其致病机制复杂，尚无法治愈，其临床治疗主要方法是利用抗炎药物联合免疫抑制剂，减轻症状，并减缓关节破坏的进展；然而，由于抗炎药物及免疫抑制剂系统毒性较强，会引发如骨质酥松、肌肉萎缩、免疫功能丧失等副作用，其应用受到极大限制；因此，靶向关节炎递送药物可能促进药物在关节部位的富集，极大的减少副作用，从而促进关节炎的治疗。
有研究表明，在RA的疾病进程中，有多种炎症细胞(中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等)被募集并浸润到关节腔内，参与疾病的发展(Kinne RW,Brauer R,Stuhlmuller B,etal.Macrophages in rheumatoid arthritis.ARTHRITIS RESEARCH.2000；2:189-202.)；其中，巨噬细胞数量较多且作用明确，其可以跨越微血管抵达关节腔部位并与RA部位高表达的炎症受体结合，从而滞留于关节腔内；根据巨噬细胞该种天然的靶向作用，可基于仿生策略构建模拟巨噬细胞的给药系统，从而实现RA的靶向递药。
目前应用最广泛的仿生策略是利用细胞膜包载载药系统，赋予载药系统特定的生物功能(Li R,He Y,Zhang S,et al.Cell membrane-based nanoparticles:a newbiomimetic platform for tumor diagnosis and treatment.Acta PharmaceuticaSinica B. 2018；8:14-22.)；因此，大量高效地提取巨噬细胞膜对靶向RA的仿生载药系统的构建至关重要；然而，传统的细胞膜提取方法复杂且效率较低，针对上述问题，一种可行的方法为利用细胞囊泡替代细胞膜包载载药系统。前期研究发现，细胞松弛素B可影响细胞骨架，促进细胞高效分泌囊泡，且该细胞囊泡可较好保持细胞膜蛋白。因此采用细胞松弛素B刺激巨噬细胞分泌囊泡，进一步利用该囊泡包载载药系统，有望构建仿巨噬细胞的给药系统，实现对关节炎的靶向递药。
根据以上背景，本发明构建了巨噬细胞囊泡包被的仿生纳米颗粒(MNP)，并利用MNP包载免疫抑制药物他克莫司，通过静脉注射给药，实现药物靶向递送至RA炎症关节部位，提高治疗效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种巨噬细胞囊泡包载的纳米药物制剂及其在制备治疗关节炎药物中的用途，尤其涉及一种具有关节炎靶向性能的巨噬细胞囊泡的提取及其包载的仿生纳米药物制剂及其应用，该仿生纳米药物通过巨噬细胞囊泡表面的粘附蛋白靶向关节炎部位，递送免疫抑制药物，从而提高关节炎靶向的治疗效果。
本发明中，将人工药物载体和天然巨噬细胞囊泡进行融合，构建稳定的巨噬细胞囊泡包载的纳米药物制剂，并用于靶向关节炎的治疗，能为临床实践提供一种新的针对关节炎靶向治疗的策略。
本发明中，所述巨噬细胞囊泡包载的纳米药物制剂，包括聚合物纳米颗粒和巨噬细胞囊泡；其中，聚合物材料为PLGA，或PLA，或磷脂材料等；
本发明中，所述纳米药物制剂为表面包被巨噬细胞囊泡、内部包载纳米载药系统；
本发明中，所述巨噬细胞囊泡通过细胞松弛素B刺激巨噬细胞制备；
本发明中，所述纳米药物制剂的纳米载体材料为聚乙酸-羟基乙酸；
本发明中，所述纳米载体为聚乙酸-羟基乙酸通过沉淀法制备的纳米粒；
所述的纳米粒的粒径为100-200nm。
本发明提供了所述纳米药物制剂的制备方法，其包括步骤：
(1)制备载他克莫司纳米载药系统；
(2)提取巨噬细胞囊泡并制备巨噬细胞囊泡膜；
(3)将巨噬细胞囊泡包被于纳米载药系统表面，制得所述纳米药物制剂。
进一步，本发明通过以下技术方案实现巨噬细胞囊泡的提取及其包载的纳米药物制剂靶向治疗关节炎的策略研究：
(1)利用细胞松弛素B处理巨噬细胞，进一步提取巨噬细胞囊泡；
(2)采用荧光显微镜技术、蛋白质谱等方法对巨噬细胞囊泡进行了表征；
(3)利用巨噬细胞囊泡包载PLGA聚合物纳米颗粒(MNP)，并对其理化性质进行表征，如采用透射电镜观察其形态，Zeta/激光粒度仪测定其粒径、电位及稳定性，并考察了其载药及缓释药物的能力；
(4)考察MNP的表面蛋白及体内动力学；
(5)采用荧光染料DiD标记MNP后，通过与血管内皮细胞体外模型的结合实验评价MNP与炎症血管内皮细胞间的亲和作用；
(6)采用荧光标记MNP，通过活体成像、组织分布、免疫荧光评价其体内炎症关节部位靶向性和靶向机制；
(7)考察MNP包载免疫抑制剂他克莫司对小鼠CIA模型的治疗效果；
(8)考察MNP的体内安全性。
本发明提供了一种巨噬细胞囊泡包载的纳米药物制剂，其通过巨噬细胞囊泡表面的粘附蛋白靶向关节炎部位，递送免疫抑制药物，从而提高关节炎靶向的治疗效果；该纳米药物制剂可用于治疗类风湿关节炎。
为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。
附图说明
图1，图1A为巨噬细胞膜囊泡提取及包载纳米药物靶向关节炎示意图：通过细胞松弛素B刺激巨噬细胞分泌囊泡(简称MMV)，然后制备PLGA纳米药物载体(MNP)，通过超声的方法包载形成仿生纳米载体；该纳米载体会通过受体识别(如ICAM-1/P-selectin)从而粘附在关节炎血管上，达到靶向的效果。
MMV的表征：图1B为细胞松弛素B刺激之后，巨噬细胞形态的变化，可以观察到大量囊泡的产生；图1C为相同细胞数量的巨噬细胞(107)可提取的囊泡数量(以膜蛋白含量表示)，以传统方法提取的细胞膜作为对比，可见细胞松弛素B刺激可更有效的提取MMV；图1D通过蛋白质谱对提取的MMV进行分析，对检测到的膜蛋白进行位置分类；图1E对检测到的膜蛋白进行功能分类；图1F对检测到的膜蛋白中的几个巨噬细胞特异性功能蛋白进行半定量分析，以提取的MMV和传统方法提取的细胞膜(M-membrane)作对比，发现MMV较好的保持了巨噬细胞功能蛋白；上述结果表明MMV可以替代M-membrane作为仿生材料包被纳米药物。
图2，MNP的制备及表征。(图2A)MNP的透射电镜图片；(图2B)MNP， MMV，未包被MMV的PLGA纳米颗粒(NP)的粒径和电位分析；(图2C) MNP在PBS中的稳定性；(图2D)MNP和NP在血清中的稳定性；(图2E) 包载他克莫司的MNP(T-MNP)和NP(T-NP)的释药行为；(图2F)MNP和 MMV的表面蛋白分析(SDS-PAGE)；(图2G)MNP和MMV的功能性蛋白分析(Western-blot)；(图2H)MNP和NP的体内药动学研究。
图3，载药T-MNP的处方优化过程。根据不同他克莫司的投药量，测定包封率和载药量。
图4，MNP和RNP的比较；图4A为MNP和RNP的粒径、电位；图4B 为MNP和RNP的蛋白表达。
图5，MNP粘附炎症血管内皮细胞；图5A为红细胞膜包载纳米颗粒(RNP) 和MNP分别在炎症(TNF-α处理)及非炎症血管内皮细胞上的粘附效果，以及血管内皮细胞粘附分子(P-selectin)的表达；图5B为图A的半定量结果；图5C 为红细胞膜包载纳米颗粒(RNP)和MNP分别在炎症(TNF-α处理)及非炎症血管内皮细胞上的粘附效果，以及血管内皮细胞粘附分子(ICAM-1)的表达；图5D为图5C半定量结果；结合图4说明MNP的粘附效果与其表面CD44,Mac-1 表达相关，此外还与炎症血管的ICAM-1，P-selectin表达相关。
图6，MNP体内靶向性研究；图6(A)不同时间，游离DID、NP、RNP、 MNP在关节炎CIA小鼠关节部位的聚集；图6(B)为游离DID、NP、RNP、 MNP在不同组织的分布情况的聚集；图6(C)为组织分布的半定量结果；图6 (D)为MNP在小鼠CIA模型和正常小鼠滑膜组织的滞留及与ICAM-1/P-selectin 的共定位情况；图6(E)为游离Tacrolimus、载药T-NP、T-RNP、T-MNP在CIA 小鼠关节炎部位的药物释放情况。
图7，体内药效评价；图7(A)为游离Tacrolimus、载药T-NP、T-RNP、 T-MNP各治疗组对小鼠关节炎治疗效果的指数评分；图7(B)为各治疗组小鼠后肢CT图；图7(C)为各治疗组小鼠后肢炎症情况照片；图7(D)为各治疗组小鼠关节腔部位的H&E染色及免疫组化(TNF-α、IL-1β、IL-6)；图7(E-G) 为各炎症因子的半定量结果。
图8，MNP的体内安全性评价，包括给药后动物的血常规，以及主要脏器切片H&E染色结果。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
以下实施例制备了一种巨噬细胞囊泡包被的他克莫司仿生纳米颗粒，探讨其对类风湿关节炎炎症部位的靶向能力及靶向治疗类风湿关节炎的治疗效果。
以下实施例采用的实验数据统计方法：所有数据用Mean±SD或Mean± SEM，用GraphPad Prism 6.0进行分析。两组间统计分析采用Student's t检验，多组间统计分析采用单因素方差分析(One Way ANOVA)。
实施例1：巨噬细胞囊泡的提取及表征
本实施例中首先培养巨噬细胞RAW264.7，再通过药物刺激的方法高效提取巨噬细胞囊泡。具体操作如下：RAW264.7细胞培养在DMEM完全培养基中，加入10μg/mL细胞松弛素B，37度孵育1h后，移去培养基，加入5mL无血清培养基吹打收集细胞，涡旋5min后加入5mL血清，1000rpm离心5min，除去细胞，收集上清液4000rpm离心15min即得巨噬细胞囊泡MMV。用0.25％ EDTA溶液冲洗2次，可去除该囊泡内容物，即得巨噬细胞囊泡膜(图1B)。然后通过BCA定量，对巨噬细胞囊泡蛋白含量进行分析，发现MMV膜蛋白含量远高于传统方法提取的巨噬细胞膜(图1C)。进一步通过蛋白质谱的方法对MMV 的膜蛋白进行表征，发现其膜蛋白组成与巨噬细胞膜完全相同(图1D-E)，其中功能性蛋白表达量也相似(图1F)，表明其可替代巨噬细胞膜作为仿生材料。
实施例2：巨噬细胞囊泡包载纳米粒
本实施例采用常见的可降解生物材料PLGA，载他克莫司(Tacrolimus)的PLGA纳米粒(T-NPs)制备方法为纳米沉淀法，具体操作如下：称取适量的PLGA (0.67dL/g，50:50，羧基封端)溶解至丙酮中，配成浓度为10mg/ml的PLGA 储备液。并加入10％(w/w)Tacrolimus，溶解完全。在西林瓶中加入1ml纯水，迅速注入0.5ml含Tacrolimus的PLGA丙酮溶液，置通风橱中将丙酮完全挥发，可得到5mg/ml Tacrolimus PLGA纳米粒(T-NP)溶液。4℃冰箱保存待用。为了筛选最优处方，分别加入不同投药量的Tacrolimus，结果发现投药量超过15％会发生沉淀(图3B)。
取新制得的巨噬细胞囊泡，按质量比1:10(蛋白：PLGA)与T-NP溶液混合，水浴超声，制备载他克莫司的巨噬细胞囊泡包纳米粒(T-MNP)。18,000g， 4℃条件下离心20min，弃去上清，并用纯水洗涤，可以除去游离药物。荧光标记的纳米药物(MNP)制备方法同上，只需要将一定量的荧光素替代他克莫司用丙酮溶解后同法制备。
实施例3：巨噬细胞囊泡包载纳米粒的表征
采用醋酸铀负染后透射电镜下观察，MNP呈规则球形，具明显的核壳结构，大小均一，分散性好(图2A)。电位/激光粒度仪测定结果显示，MNP平均粒径为130nm(图2B)，比PLGA纳米粒核心增大约30nm，与细胞膜厚度一致。，电位为-25mV与MMV电位一致。通过离心测定纳米沉淀中的药物含量确定该纳米粒的包封率及载药量，包封率为98.5％，载药量为9.1％。
MNP的稳定性考察。将MNP分散于PBS中，每天测定记录MNP的平均粒径，连续测定一周。结果显示(图2C)，随着时间推移，MNP粒径无明显变化。进一步考察了MNP在胎牛血清(FBS)中稳定性，置于37℃孵育，150rpm震荡，用酶标仪在不同时间点测定并记录纳米粒悬液在560nm处的吸光度的变化。结果显示(图2D)，NP在15min内发生明显聚集，吸光度显著增大。而MNP 在6h内仍然较为稳定。
MNP的蛋白成分分析。取新制得的MNP悬液，18,000g,4℃条件下离心 20min，弃去上清得到MNP纳米粒。以MMV为对照，加入裂解缓冲液对样品进行裂解来释放蛋白。各样品需用BCA法测定蛋白质含量，将不同样品的蛋白浓度调节一致。而后再加入SDS上样缓冲液，90℃干式恒温器加热5min。配制10％分离胶，上样，于浓缩胶内在80V的电压下运行电泳仪，接着于8％分离胶在120V电压下运行电泳仪。电泳完成后，切下分离胶，使用考马斯亮蓝进行染色，脱色后使用电泳成像仪拍摄记录结果。结果显示(图2F)，MMV蛋白成分在MNP上有较好的保留。采用Western Blot技术对MMV表面靶向相关蛋白 (CD44/Mac-1)进行分析，验证其是否在MNP上得到保留。在上述SDS-PAGE 实验方法基础上，接着用5％牛奶封闭1h。完成后，加入适当浓度的一抗(用 5％牛血清白蛋白稀释)室温孵育1h。再用HRP标记二抗(用5％牛血清白蛋白稀释)室温孵育1h。最后加入底物，扫描并分析结果。结果显示(图2G)，CD44,Mac-1在MNP上都有较好的保留。
T-MNP的体外释放情况，释放介质为含0.5％吐温80的PBS溶液，2mg T-MNP加入1mL释放介质中，37℃，100rpm孵育(n＝3)。在不同时间点(1,2, 6,12,24,48,72,96,144和192h)取样品测定累积药物释放百分数。结果显示(图 2E)，该系统可以较好的缓释药物。
进一步考察了MNP的体内药动学。ICR小鼠(20g)，尾静脉注射200μL DiD-MNP。在不同时间点1,5,15,30min和1,3,8,24h取全血用酶标仪在 640/670nm处测定荧光值。以PLGA纳米粒核心(NP)为对照。结果显示，巨噬细胞囊泡包被纳米粒后可延长纳米粒循环时间(图2H)。
实施例4：巨噬细胞囊泡包载纳米粒体外粘附实验
用50ng/mL TNF-α诱导人脐静脉血内皮细胞细胞株(HUVEC)培养6h构建炎症血管模型。用荧光素DiD标记的MNP在4℃孵育4h进行结合实验。然后用PBS冲洗3遍。样品用4％多聚甲醛溶液室温固定30min后，分别用 P-selectin抗体和ICAM-1抗体染色，激光共聚焦观察P-selectin和ICAM-1表达情况，以及不同纳米粒MNP，RNP的粘附情况。结果表明，TNF-α可显著诱导 HUVEC表达P-selectin和ICAM-1。此外，MNP的粘附量与这些炎症粘附分子高表达正相关(图5)。RNP粘附效果显著弱于MNP的粘附效果，对RNP的表面蛋白表征后发现，相关配体CD44与Mac-1表达均显著低于MNP(图4)。表明MNP特有的炎症相关配体介导了其粘附。
实施例5：巨噬细胞囊泡包载纳米粒的关节炎靶向性
利用活体成像观察MNP的靶向性。CIA小鼠尾静脉注射200μL DIR-MNP，利用小动物活体成像仪记录荧光标记纳米粒在后肢的分布，以游离染料DIR， DIR标记的NP，RNP作为对照。结果显示(图6A)，MNP能快速聚集并长期滞留于炎症关节部位，显著强于NP和RNP纳米粒组和溶液组，并显著高于非炎症部位。小鼠处死后取主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)和后肢，利用小动物活体成像仪拍摄荧光照片并进行半定量分析。结果显示(图6B-C)，MNP在炎症后肢的分布显著高于NP、RNP和溶液组，显著高于非炎症后肢。另一部分小鼠在给予荧光标记纳米粒两小时后，处死取滑膜组织，用4％多聚甲醛固定24h，用30％蔗糖溶液脱水。进行冰冻切片，切片厚度为10μm，再用10％BSA封闭，进行免疫荧光染色(P-selectin和ICAM-1胶原)。用DAPI染细胞核。激光共聚焦显微镜观察纳米粒的分布情况。结果显示(图6D)，MNP能滞留于炎症滑膜组织，显著强于正常小鼠组，且MNP靶向关节炎部位的数量与P-selectin 和ICAM-1表达正相关，表明CD44/P-selecin和Mac-1/ICAM-1分子间相互作用可能是MNP靶向的机制。进一步，考察T-MNP在关节炎部位的释药行为，分别按1mg/kg剂量注射游离Tacrolimus，T-NP，T-RNP，T-MNP于CIA小鼠，分别于1,2,6,12和24h处死小鼠，取小鼠关节炎后肢，匀浆后测定Tacrolimus含量，结果表明(图6E)，T-MNP可以更有效释放药物到关节炎部位。
实施例6：巨噬细胞囊泡包载纳米粒的体内药效研究
利用小鼠CIA模型进行评价。分为四组，每组6只，分组使每组的平均类风湿关节炎指数一致。尾静脉分别注射saline，游离Tacrolimus，T-NP，T-RNP， T-MNP以及不载药的MNP，药物剂量为1mg/kg，隔天给药共两周，健康的DBA/1 小鼠作为阴性对照组。治疗过程中，按照文献报道的评分标准记录各组关节炎指数的变化(Brand,D.D.；Latham,K.A.；Rosloniec,E.F.Collagen induced arthritis. Nature Protocols 2007,2,1269-1275.)：0＝正常；1＝一个足趾发炎肿胀；2＝多个足趾肿胀，但不是整个足部发炎肿胀或者轻微的整个足部发炎肿胀；3＝红肿，中度肿胀蔓延至整个足部；4＝整个足部和踝关节最严重的红肿。每个足的评分范围为 0-4分，每只老鼠评分范围为0-16分。结果显示(图7A)，T-MNP组能显著降低模型小鼠的类风湿关节炎指数。而其余组均无明显治疗效果。
骨破坏是评价类风湿关节炎严重程度的主要病理指标之一。治疗结束后，对各组小鼠的骨破坏情况进行了分析。将小鼠处死后，分离后肢，用4％多聚甲醛固定24h后利用Micro-CT进行扫描。接着利用CTvox Version 2.7软件进行三维重建并对样品的骨密度进行分析。结果显示(图7B-C)，T-MNP具有一定的骨保护作用。
对各组小鼠脚踝关节进行了组织结构观察。离体脚踝用4％多聚甲醛固定48 h后，进行脱钙处理，完成后进行石蜡切片(组织厚度4μm)，用H&E法进行染色，显微镜观察并拍摄。结果显示(图7D-G)，T-MNP具有较好的RA治疗作用。关节切片同时进行炎症因子的免疫组化分析并进行半定量统计分析，结果显示T-MNP对于炎症因子(TNFα，IL-6，IL-1β)有不同程度的抑制作用。
实施例7：巨噬细胞囊泡包载纳米粒的安全性评价
考察了MNP的生物相容性。雄性ICR小鼠(20g)，每组6只，隔天注射 200μL不载药MNP。持续一周后，最后一次给药后第二天，取小鼠全血，用 EDTA抗凝管抗凝，测定血常规。注射等量PBS的小鼠作为对照组。结果显示 (图8A-C)，MNP组与PBS组无显著差别，具有较好的生物相容性。
考察MNP的潜在毒性。将各组治疗后小鼠处死后，取主要脏器(肝，脾和肾)，用4％多聚甲醛固定后，进行石蜡切片，H&E染色，显微镜观察并拍照。结果显示(图8D)，MNP多次给药后对主要脏器(肝、脾、肾)无明显毒性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种巨噬细胞囊泡包载的纳米药物制剂，其特征在于，所述的纳米药物制剂为表面包被巨噬细胞囊泡、内部包载纳米载药系统。
2.根据权利要求1所述的巨噬细胞囊泡包载的纳米药物制剂，其特征在于，所述的巨噬细胞囊泡通过细胞松弛素B刺激巨噬细胞制得。
3.根据权利要求1所述的巨噬细胞囊泡包载的纳米药物制剂，其特征在于，所述纳米载药系统采用聚乙酸-羟基乙酸为纳米载体材料。
4.根据权利要求3所述的巨噬细胞囊泡包载的纳米药物制剂，其特征在于，所述纳米载体是聚乙酸-羟基乙酸通过沉淀法制备的纳米粒。
5.根据权利要求4所述的巨噬细胞囊泡包载的纳米药物制剂，其特征在于，所述纳米粒的粒径为100-200nm。
6.权利要求1所述巨噬细胞囊泡包载的纳米药物制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备载他克莫司纳米载药系统；
(2)提取巨噬细胞囊泡并制备巨噬细胞囊泡膜；
(3)将巨噬细胞囊泡包被于纳米载药系统表面。
7.权利要求1-6任一所述的巨噬细胞囊泡包载的纳米药物制剂在制备治疗类风湿关节炎药物中的用途。
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